Génération et vérification fonctionnelle de cellules T à récepteur antigénique chimérique sensible à l’hypoxie

Summary

Nous présentons ici un protocole pour la génération et la vérification fonctionnelle de cellules T à récepteur antigénique chimérique (CAR)-T sensibles à l’hypoxie. Ce protocole présente la génération de cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie à l’hypoxie et leur caractérisation, y compris la validation de l’expression des CAR dépendants de l’hypoxie et de la cytotoxicité sélective.

Abstract

Des études approfondies ont prouvé le potentiel de la thérapie cellulaire à récepteur T antigénique chimérique (CAR-T) dans le traitement des hémopathies malignes. Cependant, le traitement des tumeurs solides reste difficile, comme en témoignent les problèmes de sécurité qui se posent lorsque les cellules CAR-T attaquent les cellules normales exprimant les antigènes cibles. Les chercheurs ont exploré diverses approches pour améliorer la sélectivité tumorale de la thérapie cellulaire CAR-T. Une stratégie représentative dans ce sens est la construction de cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie, qui sont conçues en fusionnant un domaine de dégradation dépendant de l’oxygène avec la fraction CAR et sont conçues pour atteindre une expression élevée de CAR uniquement dans un environnement hypoxique - le microenvironnement tumoral (TME). Cet article présente un protocole pour la génération de ces cellules CAR-T et leur caractérisation fonctionnelle, y compris des méthodes pour analyser les changements dans l’expression des CAR et la capacité de destruction en réponse à différents niveaux d’oxygène établis par une chambre d’incubation mobile. On s’attend à ce que les cellules CAR-T construites démontrent l’expression des CAR et la cytotoxicité d’une manière sensible à l’oxygène, soutenant ainsi leur capacité à distinguer les TME hypoxiques des tissus normaux normoxiques pour une activation sélective.

Introduction

La thérapie par lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR-T) a représenté une percée significative dans le traitement du cancer. Depuis que la Food and Drug Administration (FDA) a approuvé la première thérapie CAR-T pour le traitement du lymphome avancé/résistant et de la leucémie lymphoblastique aiguë en 2017, 1^{, 2, 3} et 10 thérapies CAR-T ciblant CD19 ou l’antigène de maturation des cellules B (BCMA) ont été approuvées à l’échelle^mondiale4. Cependant, malgré des recherches approfondies, la reproduction de l’efficacité remarquable de la thérapie CAR-T dans le traitement des hémopathies malignes reste difficile pour son application aux tumeurs solides 5,6,7,8.

Le microenvironnement tumoral immunosuppresseur (TME) est l’un des principaux contributeurs à la faible efficacité du CAR-T dans le cadre de la tumeur solide. L’EUT entrave l’activité et la survie des cellules CAR-T en raison d’un manque de nutriments, d’une hypoxie, d’un pH acide et de l’accumulation de déchets métaboliques 9,10,11,12. Une autre hostilité provient de l’infiltration de cellules immunosuppressives telles que les lymphocytes T régulateurs (Tregs), les cellules suppressives dérivées de myéloïdes (MDSC) et les macrophages associés à la tumeur (TAM), qui, parallèlement aux cellules tumorales, sécrètent des cytokines immunosuppressives qui provoquent une inhibition supplémentaire des cellules CAR-T une fois qu’elles pénètrent dans la tumeur^13,14.

Outre l’efficacité thérapeutique insatisfaisante, les problèmes de sécurité sont un autre talon d’Achille des cellules CAR-T lorsqu’il s’agit de tumeurs solides^15,16. Le problème de sécurité provient du fait qu’aucun des antigènes spécifiques de la tumeur (TSA) identifiés jusqu’à présent n’est strictement limité aux cellules tumorales. En d’autres termes, les antigènes associés à la tumeur (TAA) choisis comme cible de la CAR, bien que montrant une expression plus élevée dans les cellules tumorales, sont souvent également exprimés par les tissus normaux¹⁷. Des effets non tumoraux ciblés pourraient donc se produire à partir de l’activation inattendue des cellules CAR-T lorsque les cellules CAR-T reconnaissent efficacement les tissus normaux, conduisant au syndrome de libération de cytokines (CRS), au syndrome d’encéphalopathie liée aux CAR-T (CRES)¹⁸ et à d’autres résultats indésirables¹⁹.

De nombreuses stratégies ont été explorées pour éviter de tels effets, notamment la diminution de l’affinité des CAR pour permettre aux cellules CAR-T de distinguer les cellules tumorales des cellules normales en fonction des niveaux d’expression du TAA ciblé ; équiper les cellules CAR-T d’un interrupteur d’arrêt, tel qu’un gène de suicide ou un marqueur d’élimination, afin de favoriser leur élimination lors d’une activation inattendue ; partitionner les signaux CD3ζ et de co-stimulation en deux fractions CAR, dont l’engagement simultané est par conséquent nécessaire pour une activation efficace des cellules CAR-T ; l’utilisation d’un circuit synthétique basé sur Notch (synNotch) qui limite l’activité des cellules CAR-T aux cellules ciblées co-exprimant deux TAA différents ; et l’ingénierie des cellules CAR-T pour atteindre la sensibilité de l’ETM en mettant en œuvre un mécanisme permettant d’ajuster l’expression des CAR aux signaux environnementaux changeants 20,21,22,23,24,25,26.

L’une des principales considérations dans l’option de sensibilité aux EUT décrite ci-dessus est le faible niveau d’oxygène dans l’EUT en raison de la prolifération rapide des cellules tumorales. L’adaptation des cellules tumorales à l’hypoxie dépend de l’activation du facteur 1 inductible par l’hypoxie (HIF-1), un facteur transcriptionnel hétérodimérique composé d’une sous-unité inductible, HIF-1α, et d’une sous-unité exprimée de manière constitutive, HIF-1β²⁷. Dans des conditions normoxiques, la protéine HIF-1α subit une ubiquitination et une dégradation protéasomale rapide, en fonction de son domaine de dégradation dépendant de l’oxygène (ODD)²⁸. Lorsque l’apport cellulaire en oxygène devient limité, HIF-1 est stabilisé et active la transcription de ses gènes cibles en aval en se liant aux éléments de réponse à l’hypoxie (HRE)²⁹. Étant donné la nature de l’ODD et de l’HRE en tant qu’éléments sensibles à l’oxygène, ils ont été explorés pour réaliser l’expression conditionnelle des CAR dans l’EUT^{hypoxique 30}. Ici, nous présentons un protocole axé sur des méthodes de caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie, précédé d’une brève description de la conception des CAR et des procédures de préparation de ces cellules. Ce protocole vise à fournir une ligne directrice utile pour l’exploitation des cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie afin de générer des cellules CAR-T avec une toxicité hors tumeur limitée.

Protocol

Dans cette étude, HER2-BBz-ODD, un CAR sensible à l’hypoxie ciblant HER2 (ID du gène : 2064) a été comparé à son homologue régulier, HER2-BBz. Les schémas des deux RAC sont illustrés à la figure 1A, qui montre que HER2-BBz-ODD est dérivé de HER2-BBz en ajoutant la séquence ODD à la séquence C-terminale de CD3ξ. La construction de vecteurs lentiviraux exprimant les deux CAR, et la génération du lentivirus correspondant par transfection des cellules 293T, ont déjà été décrites³¹.

1. Génération de cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie par infection lentivirale

1. Décongelez rapidement des cellules mononucléées de sang périphérique humain (PBMC) cryopréservées à 37 °C dans un bain d’eau. Transférez les PBMC décongelés dans un tube de 15 mL contenant 9 mL de milieu de culture de lymphocytes sans sérum complété par 400 UI d’IL-2, 5 ng/mL d’IL-7 et 10 ng/mL d’IL-15 (milieu de croissance des lymphocytes T humains, appelé TGM par la suite).
2. Après avoir prélevé une aliquote pour le comptage cellulaire, centrifuger le tube à 300 × g pendant 5 min. Remettre en suspension les PBMC granulés avec du TGM à une densité de 4 × 10⁶ cellules/mL et transférer la suspension dans une plaque à 6 puits.
3. Préparez des immunobilles enrobées d’anti-hCD3/hCD28.
   1. Transférez 100 μL de billes magnétiques IgG de souris dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et lavez-les 2 fois à l’aide d’un support magnétique avec PBS.
   2. Remettre les billes en suspension dans 100 μL de PBS et ajouter 0,2 μg d’anticorps CD3 anti-humain de souris et 2 μg d’anticorps CD28 de souris. Mélangez délicatement le mélange à l’aide d’une pipette et balancez-le toute la nuit à 4 °C.
   3. Lavez les billes 2 fois à l’aide d’un support magnétique avec PBS et mettez-les en suspension dans 100 μL de PBS.
4. Ajoutez des immunobilles enrobées d’anti-hCD3/hCD28 à la plaque à l’étape 1.2 avec un rapport bille/cellule de 1:1. Placez la plaque dans un incubateur humidifié avec 5% de CO₂ à 37 °C.
5. Après 48 h d’incubation, transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml après avoir délicatement mélangé les cellules à l’aide d’une pipette. Placez le tube sur un support magnétique pendant 3 min, puis transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube de 15 ml pour éliminer les billes immunitaires des PBMC.
6. Prélever une aliquote pour le comptage des cellules, puis ensemencer les PBMC à 5 × 10⁵ cellules/puits dans 300 μL de TGM dans une plaque plate à 48 puits. Ajouter 200 μL de stock lentiviral dans les puits correspondants et ajouter du sulfate de protamine à une concentration finale de 10 μg/mL.
7. Centrifuger la plaque à 1 000 × g à 32 °C pendant 1,5 h et retirer et jeter soigneusement 300 μL de surnageant de chaque puits à l’aide d’une pipette. Ajoutez ensuite 1 ml de TGM frais à l’aide d’une pipette et placez la plaque dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ à 37 °C.
8. Ajoutez du TGM frais pour ajuster la densité cellulaire à 0,5-2 × 10⁶ cellules/ml tous les 2-3 jours. Commencez par transférer les cellules d’abord sur une plaque à 12 puits, puis sur une plaque à 6 puits. Continuez à cultiver les cellules jusqu’à ce que le nombre total atteigne 6 × 10⁶ dans un volume de 4 ml.
   REMARQUE : En parallèle, effectuer la transduction CAR des lymphocytes T Jurkat en suivant les mêmes procédures décrites ci-dessus, sauf que le TGM est remplacé par RPMI1640 milieu contenant 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS).

2. Évaluation de l’expression des CAR dépendants de l’oxygène dans les cellules CAR-T à l’aide de la cytométrie en flux

1. Placez les cellules T transduites par le CAR de l’étape 1.8 en deux plaques de 12 puits à une densité de 2,5 × 10⁶ cellules/puits dans 2 mL de TGM. Placez une plaque directement dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ à 37 °C (condition normoxique, car la condition standard pour la culture de cellules a 21 % d’O₂) et placez l’autre plaque dans une chambre d’incubation mobile de CO₂/O₂/N₂ avec le niveau de O₂ préréglé à 1 % (condition hypoxique), puis maintenez la chambre dans un Incubateur 5% CO₂/94% N₂ à 37 °C.
2. Toutes les 24 h, prélever 5 × 10⁵ cellules des plaques dans des conditions hypoxiques ou normoxiques dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml. Centrifuger les tubes à 500 × g pendant 5 min, retirer le surnageant et remettre doucement les cellules en suspension dans 1 mL de PBS par pipetage. Répétez le lavage PBS une fois de plus.
3. Remettre en suspension les cellules granulées dans 50 μL de tampon FACS (PBS complété par 2% FBS) dans chaque tube. Ajouter 50 μL d’une dilution de 1:100 d’anticorps anti-Flag conjugué au PE (0,2 μg/mL) et bien mélanger par pipetage. Incuber à l’obscurité à température ambiante pendant 20 min.
4. À la fin de l’incubation, ajoutez 1 mL de tampon FACS dans chaque tube. Bien mélanger par pipetage, puis centrifuger à 500 × g pendant 5 min.
5. Retirez et jetez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette et répétez l’étape 2.4 une fois de plus.
6. Retirez et jetez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette. Remettez les cellules en suspension dans 200 μL de tampon FACS, puis transférez la suspension cellulaire résultante dans des tubes d’écoulement de 5 mL.
7. Effectuez une cytométrie en flux sur la suspension cellulaire à l’étape 2.6 pour déterminer l’expression du CAR en surface. Inclure les lymphocytes T non transfectés comme contrôle négatif.
   1. Utilisez les portes FSC/SSC et FSC-A/FSC-H pour filtrer les cellules individuelles en direct. Collectez 1 × 10⁴ événements uniques en direct pour chaque échantillon. Gate les cellules positives pour l’EGFP (un marqueur constitutif porté dans le vecteur lentiviral comme indicateur de la transduction réussie des lymphocytes T) puis les cellules positives pour la phycoérythrine (PE) (cellules exprimant CAR) pour mesurer la positivité de la PE et l’intensité médiane de fluorescence (MFI).

3. Analyse de la dépendance à l’oxygène de l’expression des CAR dans les lymphocytes T Jurkat modifiés par CAR par western blot

1. Plaquez les cellules T Jurkat transduites CAR-transduites de la section 1 en deux plaques de 48 puits à une densité de 5 × 10⁵ cellules par puits (volume de culture de 500 μL) dans RPMI1640 milieu avec 10 % de FBS.
2. Pour une plaque, ajoutez du CoCl₂ dans les puits expérimentaux jusqu’à une concentration finale de 0 μM, 50 μM ou 200 μM. Ensuite, placez la plaque dans un incubateur humidifié à 5 % de CO₂ à 37 °C (condition normoxique). Pour l’autre plaque, n’ajoutez pas de CoCl₂ et placez-la dans une chambre d’incubation mobile de CO₂/O₂/N₂ avec le niveau d’O₂ préréglé à 1 % (condition hypoxique) avant de la transférer dans le même incubateur.
3. Après 24 h d’incubation, transférez les suspensions cellulaires dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Centrifuger les tubes à 500 × g pendant 5 min. Retirez et jetez complètement les surnageants d’abord à l’aide d’une pipette de 1 ml, puis d’une pipette de 100 μL, et remettez les granules de cellule en suspension dans 50 μL de 1x tampon d’échantillon SDS-PAGE.
4. Faites chauffer les échantillons dans un bain d’eau bouillante pendant 10 min. Placez immédiatement le tube sur de la glace pendant 30 s, puis centrifugez à 16 000 × g pendant 30 s.
5. Chargez 30 μL des échantillons nettoyés dans chaque fente d’un gel SDS PAGE à 10 puits, à 10 %, d’une épaisseur de 1,5 mm. Faites fonctionner le gel à 80 V pendant 30 min, puis augmentez la tension à 100 V et faites fonctionner pendant 1,5 h.
6. À la fin de l’électrophorèse, transférer les protéines du gel vers une membrane PVDF en utilisant la méthode de transfert humide standard, avec un courant et une durée réglés à 400 mA et 1 h, respectivement.
7. Bloquer la membrane dans le tampon de blocage (5% de lait (p/v) dans PBST (PBS+0,05% Tween-20)) pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, découpez la pièce entre 30 kD et 40 kD pour la détection du contrôle de charge GAPDH et la pièce entre 50 kD et 70k D pour la détection des molécules CAR.
8. Incuber les morceaux de 30 à 40 kD et de 50 à 70 kD avec un anticorps anti-GAPDH de souris (dilution de 1:2 000) et un anticorps anti-Flag de souris (dilution de 1:2 000), respectivement, dans 3 mL de tampon de blocage, soit à température ambiante pendant 2 h, soit à 4 °C pendant la nuit.
9. Lavez les membranes avec du PBST à température ambiante sur une plate-forme à bascule pendant 3 x 5 min.
10. Incuber les membranes avec un anticorps anti-souris de chèvre conjugué à la HRP (dilution 1:5 000) dans 3 mL de tampon bloquant à température ambiante pendant 1 h ; puis laver la membrane avec du PBST pendant 5 x 10 min.
11. Développer les membranes en les incubant avec un substrat HRP, puis visualiser les bandes de protéines détectées à l’aide d’un analyseur d’images luminescentes.

4. Évaluation in vitro de la dépendance à l’oxygène de la cytotoxicité médiée par les cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie

1. Le jour 0, ensemencer 1 × 10⁴ cellules cibles (cellules SKOV3-Luc) par puits expérimental dans 200 μL de DMEM contenant 10 % de FBS dans deux plaques de culture tissulaire noires à fond plat à 96 puits.
2. Le jour 1, retirez soigneusement 100 μL de surnageant du haut de chaque puits. Ajoutez des cellules CAR-T ou des cellules T non transduites à des rapports effecteur-cible de 1:1, 2:1 et 4:1 dans 100 μL de milieu DMEM contenant 10 % de FBS.
3. Placer une plaque dans une atmosphère à 21 % d’O₂ et l’autre dans une atmosphère à 1 % d’O₂ à l’aide d’une chambre d’incubation mobile de CO₂/O₂/N₂ , comme décrit à l’étape 2.1.
   REMARQUE : Si une chambre d’incubation mobile de CO₂/O₂/N₂ n’est pas disponible, l’ajout de CoCl₂ au milieu de culture peut être utilisé pour imiter une condition hypoxique.
4. Le jour 2, après 24 h de coculture, transférez soigneusement tout le surnageant (environ 150-200 μL) dans une nouvelle plaque à fond en U à 96 puits à l’aide d’une pipette. Conserver à -20 °C pour une détection ultérieure des cytokines, en suivant les procédures décrites à la rubrique 5.
5. Ajouter 60 μL de 1x tampon de lyse passive à chaque puits expérimental des plaques noires à fond plat à 96 puits de l’étape 4.4. Ensuite, placez les plaques sur un agitateur et agitez pendant 30 min pour assurer une lyse cellulaire efficace.
6. Ajoutez 60 μL de substrat de luciférase de luciférase dans chaque puits expérimental et mesurez immédiatement l’activité de la luciférase à l’aide d’un lecteur de microplaques.
7. Calculer la cytotoxicité normalisée (%) à l’aide de l’équation (1) :
   Cytotoxicité normalisée (%) = 100 - ×100 (1)

5. Détection de la sécrétion d’IL-2 et d’IFN-γ par les cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie

1. Le jour 0, préparer une dilution de 1:250 de l’anticorps de capture de l’IL-2 ou de l’IFN-γ dans le tampon d’enrobage. Ajouter 100 μL de l’anticorps dilué dans chaque puits d’une plaque ELISA à 96 puits et incuber la plaque à 4 °C pendant la nuit.
   REMARQUE : Le tampon d’enrobage est fabriqué en dissolvant 7,13 g de NaHCO₃ et 1,59 g de Na₂CO₃ dans 1 L d’eau distillée et en ajustant le pH à 9,5.
2. Le jour 1, retirez l’anticorps de capture non adsorbé en retournant vigoureusement la plaque, puis lavez les puits 3 fois avec 200 μL de tampon de lavage (PBS contenant 0,05 % de Tween 20).
3. Ajouter 200 μL de diluant d’essai (PBS contenant 10 % de FBS) dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 1 h.
4. Jetez la solution en retournant vigoureusement l’assiette ; ensuite, lavez les puits 3 fois avec 200 μL de tampon de lavage.
5. Décongeler les échantillons/plaques surnageants congelés de l’étape 4.4 à température ambiante. Une fois complètement décongelés, diluez les échantillons et les étalons avec le diluant d’essai. Ajouter 100 μL d’échantillons ou d’étalons dilués dans chaque puits de la plaque ELISA revêtue et incuber à température ambiante pendant 2 h.
   REMARQUE : Pour la détection de l’IL-2, une dilution de 10 fois est recommandée, tandis que pour la détection de l’IFN-γ, une dilution de 50 fois est préférable.
6. Retirez les échantillons et les étalons en retournant vigoureusement la plaque, puis lavez les puits 5 fois avec 200 μL de tampon de lavage par puits.
7. Préparez une solution de détection fonctionnelle en diluant l’anticorps de détection IL-2 ou l’anticorps de détection de l’IFN-γ/streptavidine-HRP (SAv-HRP) dans un rapport de 1:250 dans le diluant de dosage. Ajouter 100 μL de la solution de détection de travail dans chaque puits et incuber la plaque à température ambiante pendant 1 h en secouant doucement.
8. Jetez la solution et lavez les puits 7 fois avec 200 μL de tampon de lavage.
9. Ajoutez 100 μL de réactif de substrat dans chaque puits et incubez la plaque à température ambiante pendant 30 min dans l’obscurité.
10. Ajouter 50 μL de solution d’arrêt (1 M H₂SO₄) dans chaque puits. Lire immédiatement l’absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.

Results

La fusion du domaine ODD de HIF-1α avec la fraction CAR représente une stratégie primaire pour générer un CAR sensible à l’hypoxie. Le CAR ciblant HER2 sensible à l’hypoxie analysé dans cette étude, nommé HER2-BBz-ODD, a été construit à l’aide de cette stratégie en intégrant la séquence ODD dans son HER2-BBz conventionnel (Figure 1A). Dans cette étude, nous avons utilisé la transduction lentivirale pour exprimer HER2-BBz-ODD CAR ou HER2-BBz CAR et avons ensuite examiné leur sensibilité à l’oxygène dans deux types de cellules : les PBMC humaines et les cellules T Jurkat.

Le premier examen porte sur l’expression de CAR dans des conditions hypoxiques par rapport à des conditions normoxiques, qui a été réalisée à la fois dans des cellules T dérivées de PBMC transduites par CAR-transduction par cytométrie en flux et dans des cellules T Jurkat transduites par CAR-transduits par western blot. Dans le cadre de cellules T dérivées de PBMC transduites par CAR, nous avons observé que HER2-BBz-ODD CAR avait une expression significativement plus élevée sous 1 % O₂ que sous 21 % O₂ en termes de pourcentage de cellules CAR-positives et d’intensité de fluorescence médiane (MFI) (Figure 1B). L’analyse immunobuvante des lymphocytes T Jurkat transduits par CAR-CAR a également confirmé l’induction dépendante de l’hypoxie de HER2-BBz-ODD.

Il convient de noter que, dans ce contexte, l’état hypoxique peut être commodément imité en ajoutant du CoCl₂, un inducteur chimique de l’hypoxie, au milieu de culture. Comme l’illustre la figure 1C, nos résultats d’immunoblot ont démontré que l’exposition à 50 ou 200 μM CoCl₂ récapitulait l’effet de l’exposition à 1 % d’O2, induisant de manière marquée l’expression du CAR HER2-BBz-ODD mais pas celle du CAR HER2-BBz. La caractérisation fonctionnelle des cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie a été réalisée avec des cellules CAR-T dérivées de PBMC. Dans l’étude, une lignée cellulaire SKOV-3 porteuse de luciférase a été utilisée comme lignée cellulaire cible. Cette configuration nous a permis de mesurer l’activité de la luciférase associée aux cellules cibles comme indicateur pour évaluer la cytotoxicité médiée par les cellules CAR-T co-cultivées.

Comme le montre la figure 1D, les mesures ont indiqué que les cellules CAR-T HER2-BBz tuent efficacement les cellules cibles, que l’atmosphère soit normoxique ou hypoxique. En revanche, les cellules CAR-T HER2-BBz-ODD ont montré une cytotoxicité significativement plus faible dans des conditions normoxiques pour les trois rapports E :T examinés. Cependant, leur cytotoxicité était significativement accrue lorsqu’ils étaient exposés à des conditions hypoxiques. Les niveaux surnageants d’IL-2 et d’IFN-γ ont également été mesurés par ELISA après co-culture de cellules CAR-T avec des cellules cibles pendant 24 h. Pour les deux cytokines, une sécrétion plus élevée sous 1 % d’O2 par rapport à 21 % d’O2 a été observée pour les cellules CAR-T HER2-BBz-ODD, ce qui est cohérent avec les données de cytotoxicité. En revanche, les cellules CAR-T HER2-BBz ont montré une sécrétion plus faible des deux cytokines sous 1 %_d’O2 par rapport à 21 % d’O2, ce qui indique un impact négatif de l’hypoxie sur l’activité cellulaire (Figure 1E). Pris ensemble, ces résultats ont validé de manière convaincante la nature sensible à l’hypoxie de HER2-BBz-ODD CAR.

Figure 1 : Construction et caractérisation de cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie. (A) Représentation schématique des conceptions d’une cellule CAR-T sensible à l’hypoxie, HER2-BBz-ODD, et de son homologue conventionnel, HER2-BBz. Les deux CARs se composent d’un peptide signal CD8α N-terminal, d’une étiquette FLAG, d’un scFv humain ciblant HER2, d’une charnière CD8 et d’un domaine transmembranaire, et d’une partie intracellulaire composée d’un domaine de costimulation de 4-1BB, d’un domaine de signalisation CD3ξ, d’un IRES et d’un EGFP. HER2-BBz-ODD diffère de HER2-BBz par la fusion d’un domaine ODD avec le C-terminal du domaine de signalisation CD3ξ, permettant son expression hypoxique dépendante en favorisant sa dégradation dépendante de l’ubiquitine dans des conditions normoxiques. (B, C) Évaluations de l’expression dépendante de l’oxygène de HER2-BBz-ODD CAR. (B) Une évaluation a été réalisée avec des cellules CAR-T humaines dérivées de PBMC après culture sous 1 % ou 21 % d’O2 pendant 24, 48 ou 72 heures à l’aide de la cytométrie en flux. (C) L’autre évaluation a été réalisée avec des cellules T Jurkat transduites par CAR, où les lysats cellulaires ont été récoltés 24 h après la culture sous 21 % d’O₂, 50 ou 200 μM CoCl₂, ou 1 % d’O₂, et analysés pour l’expression de CAR à l’aide du western blot, avec des cellules HER2-BBz transduites en CAR incluses comme témoin. (D, E) Cytotoxicité in vitro et sécrétion de cytokines par les cellules CAR-T dans différentes conditions d’oxygène. (D) Les cellules CAR-T ont été co-cultivées avec des cellules SKOV3 exprimant la luciférase des luciféroses à des rapports E :T indiqués inférieurs à 1 % ou 21 % O₂. Après 24 heures de co-culture, l’efficacité de destruction des cellules cibles a été déterminée en mesurant la variation de l’activité de la luciférase associée aux lucioles associée aux cellules par rapport à celle des cellules T non transduites. (E) Les surnageants ont été collectés pour la détection de l’IL-2 et de l’IFN-γ sécrétés. Les résultats sont affichés sous la forme de la moyenne ± SEM (n = 3 donneurs sains) (****p < 0,0001). Abréviations : scFv = variable de fragment à chaîne unique ; CAR = récepteur antigénique chimérique. Les panneaux C et D sont adaptés de Liao et ^al.31. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les problèmes de sécurité sont des problèmes importants qui doivent être résolus pour que toute thérapie cellulaire CAR-T passe à l’utilisation clinique. L’utilisation des propriétés uniques des cellules tumorales ou du TME est devenue une orientation de recherche principale, axée sur le développement de cellules CAR-T qui ciblent les tissus tumoraux de manière sélective. La conception d’un CAR-T sensible à l’hypoxie est une stratégie attrayante dans cette direction, avec plusieurs approches explorées, y compris celle présentée dans cette étude, qui consiste à fusionner le groupe CAR avec le domaine de la protéine ODD naturellement sensible à l’hypoxie. Une autre approche consiste à substituer un promoteur constitutif couramment utilisé pour stimuler l’expression des CAR par un élément de réponse à l’hypoxie (HRE), ce qui s’est avéré prometteur dans des études antérieures. On pense que la combinaison d’éléments HRE et ODD (versions de type sauvage ou d’ingénierie qui offrent un contrôle plus précis de l’expression) représente une conception optimale pour un CAR induit par l’hypoxie.

Ce protocole décrit les procédures expérimentales de génération et de validation de cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie. La mise en œuvre de ce protocole comporte plusieurs considérations clés. La création de conditions hypoxiques est une considération primordiale. Entre les deux approches, l’ajout de CoCl₂ au milieu de culture a été largement utilisé dans les études précédentes liées à l’hypoxie, en grande partie grâce à sa commodité^32,33. Cependant, il est impossible de mesurer le degré d’hypoxie imité par cette approche. En revanche, l’utilisation d’une chambre d’incubation mobile de CO₂/O₂/N₂ est avantageuse dans la mesure où les niveaux d’O₂ peuvent être réglés avec précision et convient donc à une analyse fine de la sensibilité à l’hypoxie des cellules CAR-T. À cet égard, le niveau d’hypoxie dans les tumeurs varie entre différents types de tumeurs solides et différentes périodes de progression tumorale³⁴, tandis que seulement 1%_d’O2 est illustré dans le protocole. C’est une pratique optimale pour les chercheurs d’ajuster le niveau d’oxygène en fonction de la demande réelle. Si la méthode CoCl₂ est la seule approche disponible, nous recommandons d’inclure une gamme de concentrations de CoCl₂ dans le test pour simuler différents niveaux d’oxygène.

Le choix d’une méthode appropriée pour examiner l’expression des CAR dépendants de l’hypoxie est une autre considération clé. Bien que l’analyse par immunotransfert des lymphocytes T Jurkat transduits par CAR-Transduction soit une option pratique lors de l’optimisation de la construction CAR, l’analyse de l’effet des niveaux d’oxygène sur l’expression de surface des CAR dans les PBMC humains transduits par CAR-transduction par cytométrie en flux sert de validation ultime. Il est optimal d’examiner la dynamique de l’expression des CAR en réponse à la transition des conditions hypoxiques aux conditions normoxiques, comme nous l’avons fait précédemment avec une version améliorée des CAR sensibles à l’hypoxie, à savoir HiTA-CAR³⁵. Cela démontrerait davantage l’expression des CAR restreinte par l’hypoxie.

Pour la vérification fonctionnelle des cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie, le test de cytotoxicité décrit dans le protocole implique l’utilisation de cellules cibles porteuses de luciférase de luciférase. Ce test basé sur le rapporteur peut être remplacé par d’autres méthodes d’évaluation de la destruction, telles que la méthode CCK8 et la méthode d’analyse cellulaire en temps réel (RTCA), où des cellules tumorales non modifiées peuvent être utilisées. L’analyse RTCA est également avantageuse pour mesurer la cinétique de destruction en temps réel des cellules CAR-T. Pour mesurer la cytotoxicité spécifique causée par les cellules CAR-T, les PBMC non transduits doivent être inclus comme contrôle. Une efficacité de transduction élevée des PBMC est souhaitable pour éviter les craintes que les différences de cytotoxicité détectées entre les groupes expérimentaux et les groupes témoins résultent d’une destruction non spécifique médiée par des quantités variables de cellules effectrices ajoutées.

Il existe plusieurs limitations dans ce protocole. Les conditions hypoxiques peuvent affecter la viabilité des cellules cibles et des lymphocytes T ^36,37, ce qui soulève la crainte que la mort cellulaire non liée à la cytotoxicité médiée par les cellules CAR-T puisse fausser l’interprétation des résultats du test. Il est suggéré de s’assurer que les cellules CAR-T et les cellules cibles ont une excellente viabilité immédiatement avant le test afin d’éviter ou de minimiser ces préoccupations. Il convient également de noter que la validation in vitro ne garantit pas une traduction in vivo réussie. Des évaluations in vivo sont toujours nécessaires pour confirmer si le candidat CAR-T sensible à l’hypoxie pourrait éviter de cibler les tissus normaux qui expriment l’antigène ciblé

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL Tube à centrifuger	QSP	509-GRD-Q	Supernageants et cellules cellection Protocole Étape 2,3,4
10 % ExpressCast PAGE	NCM biotech	P2012	Immunoblotting Protocole Étape 3
10x PBS	NCM biotech	20220812	Culture cellulaire Protocole Étape 4
Pipette de 10 mL	Yueyibio	YB-25H	Pipette Protocole Etape 1
10xTRIS-Glycine-SDS tampon d’électrophorèse	Epizyme	3673020	Immunoblotting Protocole Etape 3
15 mL Tube à centrifuger	Thermo Scientific	339650	Supernageants et cellules cellection Protocole Etape 1
25 cm2 EasYFlask	Thermo Scientific	156367	Culture cellulaire Protocole Etape 3,4
4x Protein SDS PAGE Loading Buffer	Takara	9173	Protocole d’immunoblotting Étape 3
Plaques de culture de tissus à fond plat à 6 puits	Thermo Scientific	140675	T Cells culture Protocole Étape 1
Plaques de culture de tissus à fond plat noires à 96 puits	Greiner	655090	Essai de cytotoxicité Protocole Étape 4
Plaques ELISA à 96 puits	Corning	3590	Protocole ELISA Étape 5
Agitateur de plaques à 96 puits	QILINBEIER	MH-2	Shake Protocole Étape 4
Plaques de culture tissulaire à fond en U à 96 puits	Thermo Scientific	268200	Supernatants cellection Protocole Étape 4,5
anticorps anti-FLAG	Sigma	F1804-50UG	Protocole immunobuvard Étape 3
Carbinol	Sinopharm	10010061	Immunoblotting Protocole Étape 3
Incubateur de dioxyde de carbone	Thermo Scientific	360	Culture cellulaire Protocole Étape 1,2,3,4
Plaque de comptage	Hausser scientific	1492	Comptage cellulaire Protocole Étape 1,3,4
CELLection Pan Mouse IgG Kit	Thermo Scientific	11531D	Mouse IgG beads magnétiques Protocole Etape 1
Centrifugeuse	Thermo Scientific	75002432	Culture cellulaire Protocole Etape 1,3,4
Système d’imagerie sur gel de chimiluminescence	BIO-RAD	12003154	Immunoblotting Protocole Etape 3
Solution de chlorure de cobalt (0,5 M)	bioleaper	BR4000203	État hypoxique Protocole Etape 2,3,4
DMEM	Corning	10-103- CV	Culture cellulaire Protocole Etape 4
Balance électronique	Sartorius	PRACTUM612-1CN	pesée Protocole Etape 5
FBS	BI	04-001-1ACS	Culture cellulaire Protocole Etape 3,4
GAPDH MAb de souris	ABclonal	AC002	Protocole d’immunobuvardage Etape 3
Appareil d’électrophorèse sur gel	BIO-RAD	1645070	Protocole Immunoblotting Étape 3
Lecteurs de microplaques GloMax	Promega	GM3000	Mesure de l’activité de la luciférase Protocole 4
Anti-Souris IgG (H+L)	Yeasen	P1126151	Immunoblotting Protocole Étape 3
Centrifugeuse de microcongélation à grande vitesse	eppendorf	5810  ; R	Culture cellulaire Protocole Étape 1
IFN-&gamma humain ; Ensemble ELISA	BD	555142	Protocole ELISA Étape 5 Éléments : IFN-&gamma humain recombinant ; étalon lyophilisé, anticorps de détection biotine anti-IFN-&gamma humain ; , Anticorps de capture anti-IFN-&gamma humain purifié, Réactif enzymatique Conjugué streptavidine-peroxydase de raifort (SAv-HRP)
Ensemble ELISA IL-2 humain	BD	555190	Protocole ELISA Étape 5 Items : IL-2 humaine recombinante étalon lyophilisée, Anticorps de détection Biotine Anti-IL-2 humaine, Anticorps de capture IL-2 purifié Anti-humain IL-2, Réactif enzymatique Conjugué streptavidine-peroxydase de raifort (SAv-HRP)
IL-15	R& D systems	P40933	Culture de cellules T Protocole Étape 1
IL-21	Novoprotéine	GMP-CC45	Culture de cellules T Protocole Étape 1
IL-7	R& D systems	P13232	Culture de cellules T Protocole Étape 1
Microscope inversé	Olympus	CKX41	Culture cellulaire Protocole Étape 1,3,4
Jurkat	ATCC	TIB-152	Construction CAR-Jurkat Protocole Étape 3
LSRFortessa	BD	LSRFortessa	Cytométrie en flux Protocole Étape 2
Système	de dosage de la luciférasePromega	E1501	luciférase rapporteur essai Protocole Étape 4 Éléments : Tampon de lyse passive, substrat de luciférase luciluciole
Lecteur de microplaques	BioTek	HTX	ELISA Protocole Étape 5
mobile CO2/O2/N2 Chambre d’incubation	China Innovation Instrument Co., Ltée.	Smartor118	Condition hypoxique Protocole Étape 2, 3, 4
Souris Anti-Hexa Histidine	tag Sigma	SAB2702218	Immunoblotting Protocole Étape 3
NcmBlot Rapid Transfer Buffer	NCM biotech	WB4600	Immunoblotting
NcmECL Ultra	NCM biotech	P10300	Protocole d’immunoblotting Étape 3 Articles : NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagent (A), NcmECL Ultra Stabilized Peroxide (B)  ;
Plaques plates à 48 puits recouvertes de NovoNectin	Novoprotein	GMP-CH38	Construction des cellules CAR-T Protocole Étape 1
OPD (dichlorhydrate d’o-phénylènediamine) ensemble de comprimés Sigma		P9187	Réactif de substrat Étape 5 Articles : Comprimé OPD (feuille d’argent),comprimé de peroxyde d’hydrogène uré (feuille d’or)
Anti-DYKDDDDK	Biolegend	637310	Cytométrie en flux Protocole Étape 2
Sulfate de protamine	Sigma	P3369-1OG	Infection par lentivirus Protocole Étape 1
Marqueur protéique 10 Kda-250 KDa	Epizyme	WJ102	Protocole d’immunobuvard Étape 3
; Souris NA/LE purifiées Anti-Human CD3	BD	566685	T CellS Protocole Etape 1
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28	BD	555725	T CellS Protocole Etape 1
Membrane PVDF	Millipore	168627	Immunoblotting Protocol Etape 3
RPMI 1640	Corning	10-040-CVRC	Culture cellulaire Protocol Etape 3
Lait écrémé en poudre	Yeasen	S9129060	Protocole d’immunobuvard Étape 3
SKOV3-Luc	ATCC	HTB-77	Essai de cytotoxicité Protocole 4
Trypsine-EDTA	NCM biotech	C125C1	Culture cellulaire Protocole Etape 4
Tween 20	Sinopharm	30189328	Protocole d’immunobuvard Étape 3 Bain-marie
		NB014467 de quillard Chauffage Protocole Étape 1
X-VIVO 15  ;	LONZA	04-418Q	Milieu de culture de lymphocytes sans sérum Protocole Étape 1