Un modèle modifié de douleur inflammatoire pour étudier l’effet analgésique chez la souris

Résumé

Ici, nous présentons un modèle modifié de douleur inflammatoire avec l’injection de carraghénane des deux pattes arrière pour évaluer l’effet analgésique.

Résumé

Le test de la plaque chauffante est largement utilisé pour évaluer les effets analgésiques sur la douleur inflammatoire chez la souris. Un modèle couramment utilisé de douleur inflammatoire a été induit par une injection intraplantaire de carraghénane dans une patte arrière. Cependant, les résultats de notre laboratoire ont montré que les souris ayant reçu une injection de carraghénane sur une seule patte arrière levaient leurs pattes pour éviter la nociception thermique pendant le test de la plaque chauffante. En raison de cette réponse, la méthode d’injection précédente ne peut pas refléter avec précision le seuil de douleur thermique. Ainsi, nous avons étudié une nouvelle méthode pour éviter ce problème. Dans la présente étude, nous avons modifié la méthode précédente en injectant du carraghénane dans les deux pattes arrière pour établir le modèle de la douleur inflammatoire. Les résultats ont démontré que l’injection de carraghénane sur les deux pattes arrière était sensible et qu’il s’agissait d’une meilleure méthode pour induire une douleur inflammatoire lors de l’utilisation du test de la plaque chauffante que l’injection sur une seule patte arrière. Sur la base de ces résultats, nous avons conçu d’autres expériences dans lesquelles des souris avec une injection de carraghénane à la patte arrière ou à une patte arrière ont été traitées par voie intragastrique avec du célécoxib (30 mg / kg). Les résultats de l’essai sur plaque chauffante ont montré que le célécoxib augmentait le seuil de douleur thermique chez les souris avec l’injection de carraghénane sur les deux pattes arrière, mais pas chez les souris avec l’injection de carraghénane sur une seule patte arrière. En résumé, nous avons développé une méthode supérieure pour induire un modèle de douleur inflammatoire afin d’évaluer l’effet analgésique.

Introduction

La douleur est un problème de santé publique dans le monde entier. Il est déclenché par une stimulation thermique, mécanique ou chimique nocive. Il est difficile d’effectuer des études sur la douleur chez l’homme pour des raisons éthiques. Par conséquent, l’utilisation de modèles animaux de la douleur est une approche clé pour comprendre les mécanismes de la douleur et rechercher des traitements¹. Le test de la plaque chauffante a été largement utilisé pour l’évaluation de la nociception thermique et de l’hyperalgésie². Actuellement, le modèle de douleur inflammatoire utilisé pour le test de la plaque chauffante est induit par une injection intraplantaire de carraghénane dans une patte arrière. Par exemple, pour étudier l’effet antinociceptif des microsphères chargées de rotigotine, un modèle animal de douleur inflammatoire a été préparé par injection d’une seule patte arrière³. Pour évaluer les effets des inhibiteurs de la catéchol-o-méthyl-transférase sur la nociception thermique chez la souris, le carraghénane a été administré dans la région plantaire de la patte arrière droite⁴. Pour étudier le rôle analgésique de l’extrait de Posidonia oceanica (L.) Delile, un modèle de douleur inflammatoire a été préparé chez la souris par injection intraplantaire de carraghénane dans la patte arrière droite⁵. Cependant, les résultats de notre laboratoire ont montré qu’une souris avec l’injection de carraghénane sur une seule patte arrière lèverait sa patte pour éviter la nociception thermique, ce qui prolonge de manière inexacte la réponse de l’animal à un stimulus thermique dans le test de la plaque chauffante. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que le modèle de douleur inflammatoire avec l’injection de carraghénane sur une seule patte arrière ne pouvait pas refléter avec précision le seuil de douleur thermique. Par conséquent, nous avons optimisé la méthode en injectant du carraghénane dans les deux pattes arrière pour établir un modèle de douleur inflammatoire modifié.

Les souris soumises à une injection de carraghénane sur les deux pattes arrière n’avaient aucun moyen d’éviter le stimulus thermique pour les deux pattes arrière en même temps. Le seuil de douleur a été défini comme le temps écoulé entre le moment où la souris a été placée sur la plaque chauffante et celui où la souris a léché l’une ou l’autre des pattes arrière. Les résultats ont confirmé que le modèle modifié de douleur inflammatoire est plus adapté à l’évaluation du seuil de température nociceptive. Cela pourrait améliorer l’efficacité du test de la plaque chauffante pour la recherche et le développement de médicaments analgésiques.

Protocole

Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Yantai (No. YTDX20220425). Les procédures ont suivi les directives des National Institutes of Health pour l’utilisation d’animaux de laboratoire.

1. Animaux

1. Utilisez des souris femelles ICR pesant 20 à 25 g pour les expériences.
2. Laissez les animaux s’acclimater à l’environnement de la salle d’expérimentation pendant 3 jours avant de commencer les expériences.
3. Maintenez la salle d’expérimentation avec un cycle lumière-obscurité de 12 heures et fournissez aux souris un accès gratuit à l’eau et à la nourriture.

2. Préparation de la solution de carraghénane

1. Peser 0,1 g de carraghénane. Ajouter 10 ml de solution saline normale stérilisée dans un tube.
2. Ajoutez 0,1 g de carraghénane dans le tube et agitez le tube pendant 30 s.
3. Recueillir la solution de carraghénane stérilisée à 1 %.
4. Préparez la solution de carraghénane avant les expériences.

3. Injection intraplantaire de carraghénane

1. À l’aide d’une seringue (0,05 ml, 29 g x 1/2 pouce, 0,33 mm × 12,7 mm) injectez la solution de carraghénane à 1 %.
2. Agitez la solution de carraghénane avant de l’aspirer dans la seringue. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulle dans la seringue.
3. Désinfectez le site d’injection (patte arrière) avec de l’alcool à 75 %.
4. Injecter 30 μL ^6,7 de solution de carraghénane à 1% par voie sous-cutanée dans la surface plantaire de la patte arrière. Pour les souris du groupe témoin, injecter 30 μL de solution saline normale.
   1. Insérez l’aiguille en diagonale vers le haut dans le coussinet de la patte arrière. Maintenez la stabilité de la seringue.
   2. Après l’injection, retirez lentement la seringue et appuyez sur le site d’injection pendant 2 s pour éviter les fuites.

4. Test de plaque chauffante

1. Effectuez le test de la plaque chauffante 3 h après l’injection intraplantaire.
2. Nettoyez et désinfectez la surface de la plaque chauffante.
3. Démarrez l’appareil à plaque chauffante. Cliquez sur le bouton Mode de température . Cliquez sur CONSTANT pour régler la température à 55 ± 0,2 °C.
4. Cliquez sur le bouton Démarrer l’expérience, puis sur REACH. Prenez une souris dans le conteneur d’hébergement. Saisissez doucement sa trompe. Placez la souris au centre de la plaque chauffante. Cliquez sur DÉMARRER.
5. Observez et notez le temps de léchage de la patte arrière gauche (pour les souris avec injection à une patte arrière) ou de la patte arrière (pour les souris avec injection des deux pattes arrière) en réponse à la stimulation thermique. Appuyez sur la pédale de la plaque chauffante pour voir l’heure sur l’écran de la plaque chauffante. Définissez le seuil de douleur comme le temps écoulé entre le moment où la souris est placée sur la plaque chauffante et celui où elle lèche la patte arrière.
6. Fixez une limite de 60 s pour le test de la plaque chauffante ^4,8,9. Enregistrez un seuil de douleur de 60 s si la limite est atteinte.
   REMARQUE : Nettoyez l’appareil de la plaque chauffante avec de l’alcool à 75% avant de placer la souris suivante pour éviter un biais possible dû à l’odeur résiduelle de la souris précédente.

5. Préparation de la suspension de célécoxib à 1,5 mg/mL

1. Prendre 1 gélule contenant 200 mg de célécoxib. Prenez le contenu de la capsule et broyez-la en poudre.
2. Ajouter 0,5 % de carboxyméthylcellulose de sodium. Le volume final est de 13,3 ml. Il s’agit de la suspension en magasin du célécoxib.
3. Prendre 1 mL de célécoxib, une suspension en magasin. Ajouter 9,0 mL de carboxyméthylcellulose sodique à 0,5 % pour obtenir 1,5 mg/mL de suspension de célécoxib.
4. Administrer 0,2 mL/10 g de la suspension de célécoxib par voie intragastrique aux souris.
   REMARQUE : Choisissez une aiguille de gavage de 4,0 à 4,5 cm de longueur pour les souris pesant 20 à 25 g.

6. Évaluation du modèle modifié de douleur inflammatoire

1. Divisez au hasard les souris femelles ICR en trois groupes : les groupes témoins, modèles et célécoxib.
2. Injecter 30 μL de solution de carraghénane à 1 % par voie sous-cutanée dans la surface plantaire de la patte arrière (une patte arrière ou les deux pattes arrière). Pour les souris du groupe témoin, injecter 30 μL de solution saline normale.
3. Après l’injection de carraghénane ou de solution saline normale, effectuez le traitement immédiatement. Administrer par voie intragastrique le célécoxib à une dose de 30 mg/kg pour les souris du groupe célécoxib. Pour les souris des groupes témoin et modèle, administrer par voie intragastrique 0,5 % de carboxyméthylcellulose sodique.
4. Effectuer le test sur plaque chauffante (section 2) 3 h après l’injection de carraghénane.

7. Méthodes statistiques

1. Présentez les résultats expérimentaux sous forme de moyenne ± d’écart-type. Effectuez un test de distribution de normalité avec le test statistique de qualité de l’ajustement de Kolmogorov-Smirnov.
2. Analysez la comparaison entre les deux groupes à l’aide d’un test t non apparié. Effectuez plusieurs comparaisons de groupes à l’aide d’une analyse de variance à un facteur suivie du test de Dunnett. Considérons la valeur de p < 0,05 comme statistiquement significative.

Résultats

Le seuil de douleur dans les modèles de douleur inflammatoire
Le seuil de douleur du modèle de douleur inflammatoire avec injection de carraghénane sur une seule patte arrière était de 32,23 ± 11,11 s, tandis que le seuil de douleur du groupe témoin était de 27,73 ± 7,08 s. Par rapport au groupe témoin, le seuil de douleur du modèle d’injection à une patte arrière n’a pas montré de réduction significative (p > 0,05, Figure 1A). Le seuil de douleur du modèle de douleur inflammatoire avec injection de carraghénane sur les deux pattes arrière était de 21,84 ± 5,63 s, tandis que le seuil de douleur du groupe témoin était de 28,21 ± 8,61 s. Par rapport à celui du groupe témoin, le seuil de douleur du modèle d’injection des deux pattes arrière a diminué de manière significative (p < 0,05, Figure 1B).

L’effet analgésique du célécoxib dans différents modèles de douleur inflammatoire
Dans le modèle de douleur inflammatoire avec une injection de carraghénane sur une seule patte arrière, le seuil de douleur du groupe célécoxib (27,01 ± 10,98 s) n’a pas montré d’augmentation significative par rapport à celui du groupe modèle (29,77 ± 13,97 s, p > 0,05). Conformément aux résultats ci-dessus, le seuil de douleur du groupe modèle n’a pas montré de réduction significative par rapport à celui du groupe témoin (30,94 ± 14,54 s), ce qui indiquait que l’injection de carraghénane sur une seule patte arrière n’induisait pas de modèle de douleur inflammatoire (Figure 2A). Dans le modèle de douleur inflammatoire avec injection de carraghénane sur les deux pattes arrière, le seuil de douleur du groupe modèle (15,61 ± 4,85 s) a diminué de manière significative par rapport à celui du groupe témoin (23,55 ± 3,96 s, p < 0,05). Par rapport au groupe modèle, le seuil de douleur du groupe célécoxib (20,29 ± 3,10 s) était significativement diminué (Figure 2B).

Figure 1 : Les seuils de douleur dans les modèles de douleur inflammatoire (moyenne ±écart-type, n = 15). (A) Le seuil de douleur du modèle de douleur inflammatoire avec l’injection de carraghénane sur une patte arrière. (B) Le seuil de douleur du modèle de douleur inflammatoire avec injection de carraghénane sur les deux pattes arrière, (^#P<0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : L’effet analgésique du célécoxib dans différents modèles de douleur inflammatoire (Moyenne ± écart-type, n = 14). (A) L’effet analgésique du célécoxib dans le modèle de douleur inflammatoire avec l’injection de carraghénane sur une patte arrière. (B) L’effet analgésique du célécoxib dans le modèle de douleur inflammatoire avec injection de carraghénane sur les deux pattes arrière, ( ^#P<0.05, *P<0.05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La douleur est une réponse protectrice déclenchée par des lésions ou des lésions tissulaires. Cependant, il a également un impact négatif sur la qualité de vie¹⁰. Par conséquent, le développement d’analgésiques efficaces et l’exploration des mécanismes de la douleur restent des domaines de recherche actifs. Les méthodes d’évaluation de la douleur jouent un rôle clé dans le développement des médicaments analgésiques. L’injection de carraghénane sur une seule patte arrière est une méthode classique pour le test de la plaque chauffante. Le modèle modifié induit par l’injection de carraghénane sur les deux pattes arrière que nous présentons ici fournit un moyen fiable d’étudier l’efficacité d’agents thérapeutiques potentiels pour soulager la douleur.

Dans la présente étude, nous avons constaté que les souris avec l’injection de carraghénane sur une seule patte arrière ne présentaient pas de diminution du seuil de douleur. Cependant, dans d’autres études, cette méthode a conduit à des réductions significatives du seuil de douleur dans le test de la plaque chauffante^11,12. La divergence des résultats entre les études précédentes et celle-ci peut s’expliquer par les différentes espèces animales utilisées dans les expériences 13,14,15,16. Une autre explication possible est que nous avons observé les souris avec l’injection de carraghénane sur une patte arrière, soulevant souvent la patte injectée ou marchant légèrement sur la plaque pour éviter le stimulus thermique. L’évaluation du seuil de douleur nécessite l’observation de la réponse nociceptive typique du léchage ou de la secousse de la patte injectée. Nous avons donc obtenu un résultat négatif, indiquant que le seuil de douleur du modèle avec l’injection de carraghénane sur une seule patte arrière ne diminuait pas significativement. Les souris avec une injection de carraghénane sur les deux pattes arrière n’ont pas été en mesure d’éviter le stimulus thermique en levant la patte ou en marchant légèrement sur la plaque. Le seuil de douleur a été considéré comme le léchage ou le tremblement de l’une ou l’autre des pattes arrière, reflétant la réponse nociceptive réelle des souris.

Pour vérifier la supériorité du modèle modifié de douleur inflammatoire, des souris ayant reçu des injections de carraghénane sur une patte arrière ou sur les deux pattes arrière ont été traitées par administration intragastrique de célécoxib. Conformément à l’hypothèse de cette étude, le célécoxib a exercé un effet analgésique dans le modèle modifié de douleur inflammatoire, mais il n’a montré aucun effet dans le modèle avec l’injection de carraghénane sur une patte arrière. Cette découverte a démontré que le modèle modifié de douleur inflammatoire est fiable pour le dépistage d’analgésiques potentiels.

Il y a des limites dans cette étude. De nombreuses souches de souris différentes ont été utilisées dans les tests de plaque chauffante. Différentes souches de souris peuvent présenter des réponses différentes aux stimuli thermiques. La présente expérience n’a utilisé que des souris ICR pour tester l’hypothèse. Par conséquent, il reste à déterminer si la méthode modifiée détecte avec précision et cohérence les seuils de douleur chez les autres souches de souris dans l’essai sur plaque chauffante. De plus, nous n’avons pas conçu d’expérience pilote pour évaluer le seuil de douleur des souris et n’avons donc exclu aucun animal ayant un seuil de douleur élevé. Toutefois, cette limitation peut également être considérée comme un avantage de la méthode modifiée actuelle. Il simplifie non seulement le processus du test analgésique, mais reflète également la gamme de réponses des souris dans le test de la plaque chauffante. De plus, la mesure du volume de la patte arrière aidera à confirmer l’induction de l’inflammation et à vérifier l’effet analgésique des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS). Cependant, notre expérience a démontré qu’il n’est pas facile de mesurer le volume de la patte des souris. La patte de la souris est trop petite pour obtenir une valeur exacte. Par conséquent, la présente étude n’a pas été conçue pour étudier le changement de volume de la patte après une inflammation.

En conclusion, en suivant les étapes décrites ci-dessus, le modèle de douleur inflammatoire avec injection de carraghénane sur les deux pattes arrière permet de déterminer les seuils thermo-nociceptifs de souris de manière fiable. De plus, lors de l’administration d’analgésiques, une augmentation du seuil de douleur a été détectée statistiquement. Le modèle modifié de douleur inflammatoire est utile pour le dépistage d’analgésiques potentiels. De plus, cette méthode peut être utilisée pour la recherche sur la biologie de la douleur, le développement de nouveaux médicaments et le traitement clinique, ainsi que pour fournir de nouvelles idées et solutions pour la gestion de la douleur.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Balance électronique AL204	Yuheng Battery Co., Ltd  ;	YH-400A
Carboxyméthylcellulose	Tianjin Chemical Co., Ltd  ;
Carrageenan	Sigma, MO, États-Unis	29H0715
Celecoxib	Pfizer Inc.
Plaque chauffante  ;	UGO Ltd. Co., Italie	PB-200  ;
Souris femelles ICR	Jinan Pengyue  ; Co., Ltd.
Saline normale	Kelun Pharmaceutical Co., Ltd  ;