Diagnostics basés sur CRISPR au point d’intervention avec réactifs prémélangés et lyophilisés

Résumé

Ici, nous présentons la préparation étape par étape de l’amplification isotherme prémélangée et lyophilisée basée sur la recombinase et des réactions basées sur CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), qui peuvent être utilisées pour la détection de biomarqueurs d’acides nucléiques d’agents pathogènes de maladies infectieuses ou d’autres marqueurs génétiques d’intérêt.

Résumé

Le diagnostic moléculaire par détection basée sur CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) a une grande précision diagnostique et des attributs qui conviennent à une utilisation sur le lieu d’intervention, tels que des délais d’exécution rapides pour les résultats, des lectures simples et pratiques et l’absence d’instruments compliqués. Cependant, les réactions peuvent être lourdes à réaliser sur le lieu d’intervention en raison de leurs nombreux composants et des étapes de manutention manuelles. Dans ce document, nous fournissons un protocole optimisé étape par étape pour la détection robuste des agents pathogènes et des marqueurs génétiques avec une amplification isotherme basée sur la recombinase et des réactifs basés sur CRISPR, qui sont prémélangés puis lyophilisés dans des formats faciles à stocker et prêts à l’emploi. Les réactifs prémélangés et lyophilisés peuvent être réhydratés pour une utilisation immédiate et conserver des efficacités d’amplification et de détection élevées. Nous fournissons également un guide de dépannage pour les problèmes couramment rencontrés lors de la préparation et de l’utilisation de réactifs prémélangés et lyophilisés pour les diagnostics basés sur CRISPR, afin de rendre la plate-forme de détection plus accessible aux communautés plus larges de diagnostic/tests génétiques.

Introduction

Le diagnostic basé sur CRISPR pour la détection de biomarqueurs d’acides nucléiques a été signalé pour la première fois en 2017 1,2,3,4, et depuis lors, il a fait ses preuves en tant que diagnostic de nouvelle génération avec des tests approuvés par la Food and Drug Administration (FDA), en particulier pour la détection de l’ARN du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2), dans plusieurs pays ^5,6,7,8. Au-delà de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), les technologies se sont avérées efficaces pour détecter divers virus et bactéries 9,10,11,12,13, des mutations et des délétions de maladies génétiques, et peuvent être modifiées pour détecter des biomarqueurs de protéines et de petites molécules ^2,12. Les diagnostics basés sur CRISPR combinent souvent des méthodes d’amplification isotherme, telles que l’amplification par polymérase recombinase (RPA) ou l’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP)^14,15, avec une détection basée sur CRISPR utilisant des enzymes associées à CRISPR (Cas) guidées par ARN avec une activité endonucléase « collatérale » après la reconnaissance de la cible³. La double utilisation de l’amplification isotherme et de la détection basée sur CRISPR confère plusieurs attributs souhaitables aux technologies, en particulier une précision de diagnostic élevée proche de celle de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) de référence, et la capacité de multiplexer et de détecter de petites différences de séquence, y compris les polymorphismes mononucléotidiques ^1,9.

Cependant, les versions les plus précises des diagnostics basés sur CRISPR contiennent plusieurs composants et étapes et peuvent être compliquées à réaliser avec des non-experts ou sur le lieu d’intervention (POC). Pour relever ce défi d’étendre l’utilisation de diagnostics basés sur CRISPR très précis aux paramètres POC, nous avons développé des protocoles pour préparer des réactions d’amplification isotherme prémélangées, lyophilisées, basées sur la recombinase et des réactions de détection basées sur CRISPR, qui sont faciles à utiliser et à stocker⁷. Ces protocoles devraient compléter les excellents protocoles existants sur les diagnostics basés sur CRISPR¹⁴, qui contiennent des informations supplémentaires sur la production de composants biochimiques nécessaires aux diagnostics basés sur CRISPR⁷, les directives de conception¹ et les formulations utilisant des techniques alternatives d’amplification isotherme 2,14,15,16 et des enzymes Cas ¹². En fin de compte, nous espérons que les diagnostics basés sur CRISPR pourront aider à réaliser une détection nucléique rapide, peu coûteuse et sensible dans des environnements où des analyses portables et sans instrument sont nécessaires ^1,9,17.

Nous utilisons principalement la combinaison de la détection basée sur la RPA et Cas13 dans nos protocoles. La RPA fonctionne à des températures proches de la température ambiante (37-42 °C) et nécessite donc peu d’énergie et d’équipement. D’autres réactions d’amplification isotherme nécessitent des températures plus élevées (LAMP, 60-65 °C ; amplification par déplacement de brin (SDA), 60 °C ; réaction d’amplification exponentielle (EXPAR), 55 °C ; et amplification dépendante de l’hélicase (HDA), 65 °C)². La conception des amorces RPA n’est pas non plus complexe, contrairement aux amorces LAMP, et peut être étendue à l’amplification multiplexée ^7,9,14. Même si le multiplexage au-delà de deux cibles avec la RPA est difficile dans la pratique, il existe des directives claires sur la façon de concevoir des amorces RPA multiplexées pour minimiser les interférences¹⁸.

Bien que la contamination par transfert reste un problème majeur dans le flux de travail en deux étapes, les amplicons générés de RPA sont de petite taille et moins susceptibles de provoquer une contamination par transfert par rapport aux grands amplicons concatémériques de LAMP¹⁴. Les amorces RPA peuvent être conçues selon les directives standard¹⁴ : elles ont généralement une longueur de 25 à 35 nucléotides avec des températures de fusion de 54 à 67 °C. La taille de l’amplicon doit être inférieure à 200 paires de bases. L’enzyme transcriptase inverse (RT) peut être ajoutée à la RPA pour permettre l’amplification de l’ARN, et dans la transcription inverse-RPA (RT-RPA), une autre enzyme Ribonuclease H (RNase H) est généralement ajoutée en petites quantités pour aider à résoudre l’hybride ARN : ADN résultant et favoriser la réaction d’amplification ^5,19. Pour permettre la transcription de T7 pour la détection basée sur Cas13, le promoteur de l’ARN polymérase T7 peut être placé à l’extrémité 5' de l’amorce RPA directe.

Une fois que les amplicons sont générés à partir de la RPA, ils peuvent être détectés avec des enzymes Cas programmées par l’ARNcr. Parmi les diverses enzymes Cas qui peuvent être utilisées pour la détection d’amplicons, nous préférons les variants de Cas13 ciblant l’ARN en raison de leur activité de clivage élevée¹ et de leurs préférences de clivage polynucléotidique bien caractérisées ^7,9, ce dernier pouvant être utilisé pour la détection multiplexée. La séquence d’ARNcr de Cas13 est conçue pour être complémentaire (complément inverse) au site cible dans l’ARN produit avec des séquences d’espacement et de répétition directe (DR). La séquence d’ARNcr et les amorces RPA ne doivent pas se chevaucher, afin d’éviter la détection indésirable de produits d’amplification hors cible, ce qui augmente le bruit de fond et les faux positifs¹⁴.

La détection basée sur le cas repose sur différentes modalités de détection pour surveiller le clivage des molécules d’acide nucléique rapporteures (ARN rapporteurs pour les réactions basées sur Cas13)^1,2,14. Les différentes modalités de détection comprennent la colorimétrie, les lectures électrochimiques, la fluorescence, les lectures de séquençage et les bandes de flux latéral². Nous nous concentrons sur la lecture de la fluorescence à partir d’une variété de fluorophores et de rapporteurs tels que la cyanine 5 (Cy5), la rhodamine X (ROX) et la carboxyfluorescéine (FAM), qui peuvent être efficacement excités à l’aide d’une seule source de lumière LED bleue, et leur fluorescence analysée par un lecteur de microplaques ou un thermocycleur en temps réel ^7,14. De plus, la lecture de la fluorescence est facile à configurer et permet une surveillance continue, ce qui permet une quantification en temps réel. La préamplification RPA multiplexée et la détection multiplexée basée sur Cas13 à l’aide d’enzymes Cas peuvent être combinées avec des lectures de fluorescence multicolores pour la détection simultanée de plusieurs cibles génétiques ^2,7.

Dans nos protocoles, nous amplifions d’abord de manière isotherme l’ARN avec le RT-RPA en ajoutant l’échantillon d’ARN à la forme lyophilisée du réactif RT-RPA (Figure 1). Au cours de la RT-RPA, le promoteur T7 est ajouté à l’amplicon d’ADN double brin généré. Par la suite, les produits RPA sont transférés vers la détection lyophilisée basée sur Cas13, qui contient également de l’ARN polymérase T7. Cette réaction de détection convertira les amplicons d’ADN en ARN (via l’ARN polymérase T7), qui peut être facilement détecté avec Cas13 programmé par l’ARNcr. Cas13 activé par la cible clivra les molécules rapporteures pour produire un signal de fluorescence détectable ^2,7,14. Bien que les protocoles ici concernent la détection par Leptotrichia wadei (LwaCas13a), ils peuvent être étendus à la détection simultanée et multiplexée d’un maximum de quatre cibles à l’aide des enzymes orthogonales Cas13 et Cas12 ^7,9. Les réactions de détection basées sur la RPA et le Cas peuvent également être combinées dans un seul tube, bien qu’avec une perte de sensibilité¹⁴.

Figure 1 : Flux de travail de détection basé sur CRISPR. Le flux de travail illustre la détection de deux gènes cibles. Tout d’abord, les régions d’intérêt au sein de la cible d’ADN sont amplifiées de manière isotherme avec la RPA ; la réaction peut être réalisée par transcription inverse (RT-RPA) lors de la détection de cibles d’ARN. Par la suite, la transcription T7 convertit les amplicons d’ADNdb en ARN, qui sont à leur tour reconnus par des complexes Cas13-crRNA capables de déclencher une activité RNase collatérale lors de la liaison à la cible. Le clivage des rapporteurs de fluorescence éteints produit des signaux de fluorescence qui peuvent être surveillés à l’aide d’un lecteur de microplaques, visualisés par un transilluminateur LED ou utilisés avec un thermocycleur en temps réel. Abréviations : CRISPR = répétitions palindromiques courtes groupées et régulièrement espacées ; RT = transcription inverse ; RPA = amplification par polymérase recombinase ; Cas = protéine associée à CRISPR ; LED = diode électroluminescente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les principales caractéristiques des protocoles présentés ici sont les formulations de prémélange pour la lyophilisation. Le prémélange simplifie l’utilisation de la réaction et améliore la reproductibilité, mais de nombreux composants de la détection basée sur la RPA et Cas, en particulier la transcription inverse et certains cofacteurs labiles tels que l’ATP, ne sont pas stables en solution. Par conséquent, nous formulons les solutions prémélangées de manière à ce qu’elles puissent être lyophilisées pour un stockage à long terme et un transport et un déploiement faciles ^1,9,20. Des réactifs prémélangés et lyophilisés contribuent également à améliorer la sensibilité de détection, car un volume d’échantillon plus élevé (et donc un apport d’ADN/ARN plus élevé) peut être ajouté pour reconstituer la réaction¹⁰. Dans nos formulations, nous utilisons principalement le tréhalose²¹ comme cryoprotecteur dans les réactions de détection lyophilisées basées sur la RPA et le cas⁷. En plus de la préservation des réactifs, le tréhalose favorise également les réactions en augmentant la stabilisation enzymatique 16,22,23,24 et en diminuant les températures de fusion de l’ADNdb 23. L’exploration d’autres stabilisants 5,7,21,25,26 au-delà du tréhalose pourrait produire des formulations encore plus optimales pour différents scénarios d’utilisation.

Protocole

1. Préparation de réactifs prémélangés RT-RPA lyophilisés

1. Préparation de l’équipement
   1. Préparez un dewar ou un plateau d’azote liquide pour la congélation instantanée des réactions. Remplissez le dewar ou le plateau avec de l’azote liquide.
   2. Lyophilisateur
      1. Vérifiez qu’il n’y a pas d’eau condensée dans les tubes de vidange et à l’intérieur de la chambre ; Retirez l’eau si nécessaire.
      2. Nettoyez l’intérieur de la chambre et le support métallique du tube de microcentrifugation de 1,5 ml avec une solution de décontamination RNase, suivie d’éthanol à 70 %.
      3. Fermez la porte de la chambre et la soupape de décharge de vide.
      4. Allumez le lyophilisateur.
      5. Réglez manuellement la température de l’étagère sur -30 °C.
   3. Equipement de biologie moléculaire
      1. Nettoyez les éléments suivants avec une solution de décontamination RNase : des pipettes, des supports de pointes de pipettes, un mélangeur vortex, une minicentrifugeuse à visser et un marqueur permanent.
      2. Nettoyez les éléments suivants avec de l’eau du robinet, puis essuyez avec du papier chiffon de nettoyage : des supports en plastique pour les tubes de microcentrifugation et une boîte en mousse pour la glace.
      3. Préparez un bloc chauffant (utilisé pour dissoudre/resolbiliser la solution de triglycine) en le nettoyant avec une solution de décontamination RNase et de l’éthanol à 70 %. Ensuite, allumez-le et réglez la température à 60 °C.
2. Préparation de réactions RPA prémélangées
   REMARQUE : Cette formulation est pour 10 réactions (en utilisant trois pastilles de RPA).
   1. Vérifiez s’il y a du précipité dans la solution de triglycine avant utilisation. S’il y a des précipités, dissolvez-les en les incubant à 60 °C et en mélangeant soigneusement avant utilisation. Refroidissez la solution de triglycine avant d’ajouter d’autres réactifs sensibles à la chaleur.
      REMARQUE : Les précipités peuvent se former facilement si le tube est laissé à température ambiante pendant une période prolongée.
   2. Retirer trois tubes de bandes de granulés RPA du congélateur ; Tapotez les tubes de bande en les frappant doucement contre la paillasse du laboratoire pour déloger les pastilles blanches.
   3. Transférez les trois pastilles dans un tube de microcentrifugation A de 1,5 ml.
   4. Pipeter 25 μL d’eau sans nucléase pour rincer toute poudre RPA restante dans les tubes à bandelettes et transférer la solution de rinçage dans un nouveau tube de microcentrifugation B de 1,5 mL.
   5. Ajouter 10 μL de la solution de triglycine 0,57 M et 10 μL de mélange d’amorce (10 μM chacun) dans le tube mastermix B.
   6. Vortex-mix tube B; Ensuite, tournez vers le bas et placez le tube sur de la glace.
   7. Ajoutez 28,4 μL du tampon RPA 5x (préparé à partir de 500 μL de 50 % (p/v) PEG20000, 250 μL de 1 M Tris pH 7,4 et 100 μL de 100 mM de dithiothréitol (DTT)) dans le tube mastermix B et mélangez soigneusement en tapotant fortement ou en secouant plusieurs fois.
      REMARQUE : Nous fabriquons la solution de cette manière pour aider à diluer/diminuer la viscosité du PEG dans le tube mastermix, avant d’ajouter tout pour solubiliser les granulés de RPA.
   8. Transférez les granulés collectés dans le tube A de l’étape 1.2.3 dans le tube mastermix B, puis retournez le tube mastermix plusieurs fois pour mélanger. Observez si la solution semble homogène et monophasique (elle aura également l’air légèrement opaque), puis placez le tube sur de la glace.
      REMARQUE : Si le mélange n’est pas complet, le PEG peut provoquer la séparation de phase de la solution/suspension.
   9. Ajoutez 0,71 μL de RT 200 unités/μL et 2,84 μL de RNase H 5 unités/μL dans le tube mastermix. Tapotez doucement ou retournez le tube mastermix de haut en bas à plusieurs reprises. Tournez et placez le tube sur de la glace.
      REMARQUE : Nous ajoutons ces enzymes après un mélange lourd des étapes précédentes, car la RT et la RNase H sont sensibles au cisaillement dû au mélange ; plus de vortex après l’ajout de RT/RNase H.
   10. Aliquote 8,4 μL de la solution mastermix dans 10 tubes prérefroidis de 1,5 mL et placer les tubes sur de la glace. Pour ce faire, plongez la pointe de la pipette dans la solution mastermix et aspirez la solution mastermix dans la pointe lentement et régulièrement pour éviter la formation de bulles d’air et pour assurer une mesure précise du volume. Versez la solution mastermix dans un tube pré-refroidi de 1,5 ml.
       REMARQUE : Avec 8,4 μL aliquoteé, d’après notre expérience, il restera ~1-2 μL de suspension dans le tube mastermix. L’expérimentateur peut ajuster légèrement le volume d’aliquotage vers le bas pour garantir suffisamment de réactifs pour les 10 réactions. Utilisez des techniques de pipetage appropriées lorsque vous manipulez des solutions visqueuses.
   11. Une fois l’aliquotage terminé, placez les tubes dans un support métallique immergé dans de l’azote liquide pour les préparer à la lyophilisation. Laissez les tubes être immergés dans de l’azote liquide pendant 5 min.
       REMARQUE : Comme la lyophilisation élimine l’excès de solution, elle nous permet d’ajouter plus d’entrée d’ADN / ARN, ce qui aide à augmenter la sensibilité. Les réactions RPA prémélangées lyophilisées peuvent être conservées à -20 °C pendant 8 mois. La lyophilisation aide à la reproductibilité si une expérience donnée est réalisée à l’aide de mastermixes RPA préparés dans le même lot, donc la fabrication d’un lot plus important est également utile.
3. Lyophilisation
   1. Au lyophilisateur, vérifiez la température du collecteur et de l’étagère. Si nécessaire, attendez que la température du collecteur atteigne -75 ± 5 °C et que la température de l’étagère atteigne -30 ± 1 °C.
   2. Couvrez les tubes ouverts dans le support métallique avec une feuille de papier lingette de nettoyage, placez le support métallique avec les tubes ouverts dans l’étagère de la lyophilisatrice et fermez la porte de l’étagère.
   3. Sélectionnez le programme indiqué dans le Tableau 1 et appuyez sur Démarrer. Après 30 min de l’étape de séchage secondaire (20 °C, <0,1 mbar ; la température est maintenue en continu en réglant le temps de l’étape sur « infini  »), appuyez sur arrêter le programme.
      REMARQUE : Nous laissons les tubes se réchauffer dans le lyophilisateur pour éviter la condensation de l’eau.
   4. Relâchez la pression en ouvrant la soupape de décharge du vide, puis retirez le rack de l’étagère. Boucher immédiatement les tubes et stocker les réactions lyophilisées à -20 °C.
      REMARQUE : Les réactions prémélangées RPA lyophilisées et CRISPR-Cas13a peuvent être stockées à -20 °C pendant 8 mois.

2. Préparation de réactifs de détection prémélangés CRISPR-Cas13a lyophilisés

REMARQUE : Suivez l’étape 1.1 pour la préparation de l’équipement.

1. Préparation de réaction prémélangée CRISPR-Cas13a (10 réactions)
   1. Retirez les articles suivants de l’entreposage et placez-les sur de la glace : 10 μL de LwaCas13a (produit en interne^{7, 8, 14}) (2 mg/mL), tampon de stockage Cas, 10 ng/μL (225 nM) d’ARNcr, 25 mM de rNTP, 50 unités/μL d’ARN polymérase T7, 2 μM de rapporteur de fluorescence FAM.
   2. Préparez une solution de travail de LwaCas13a à 126 μg/mL (900 nM) en ajoutant 148,8 μL de tampon de stockage Cas (50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 0,6 M de NaCl, 5 % de glycérol, 2 mM de DTT) à 10 μL de 2 mg/mL de LwaCas13a.
   3. Préparez la réaction du mastermix CRISPR-Cas13a comme suit : 71 μL d’eau exempte de RNase, 20 μL de 400 mM de Tris pH 7,4, 20 μL de tréhalose à 60 % (p/v), 10 μL d’ARNcr de 10 ng/μL (225 nM) (ici, ciblant les gènes s et n du SARS-CoV-2), 8 μL de mélange rNTP de 100 mM (25 mM chacun), 6 μL d’ARN polymérase T7 de 50 unités/μL, 25 μL de rapporteur de fluorescence FAM de 2 μM et 10 μL de LwaCas13a de 126 μg/mL (900 nM). Bien mélanger en inversant le tube mastermix ; Ensuite, tournez-vous.
   4. Aliquote 17 μL du mastermix dans 10 tubes de 1,5 mL placés sur de la glace. Placez les tubes dans un support immergé dans de l’azote liquide et laissez les tubes être immergés dans de l’azote liquide pendant 5 min.
2. Lyophilisation
   1. Au lyophilisateur, vérifiez la température du collecteur et de l’étagère et attendez que la température du collecteur atteigne -75 ± 5 °C et que la température de l’étagère atteigne -30 ± 1 °C.
   2. Placez les tubes dans le lyophilisateur. Sélectionnez le programme indiqué dans le Tableau 1 et appuyez sur Démarrer. Après 30 min de l’étape de séchage secondaire (25 °C, <0,1 mbar ; la température est maintenue en continu en réglant le temps de l’étape sur « infini »), arrêtez le programme.
   3. Relâchez la pression en ouvrant la soupape de décharge du vide et retirez le rack de l’étagère. Boucher immédiatement les tubes et stocker les réactions lyophilisées à -20 °C.
      REMARQUE : Les réactifs prémélangés RPA et CRISPR-Cas13a lyophilisés peuvent être conservés à -20 °C pendant 8 mois.

3. Amplification des acides nucléiques RT-RPA

REMARQUE : Pour éviter la contamination croisée, les zones de travail et les pipettes doivent être séparées pour la préamplification, l’ajout d’échantillons et la post-amplification. Nous vous recommandons d’utiliser des pointes de pipette filtrées.

1. Préchauffez un incubateur à agitation thermique à 42 °C.
2. Ajouter 1 μL de mélange de solution d’acétate de magnésium (Mg(OAc)₂) et d’acétate de potassium (KOAc) (composé de 196 mM de Mg(OAc)₂ et de 1,5 M de KOAc) sur le côté du tube contenant la pastille de RT-RPA lyophilisée et prémélangée (voir la section 1).
   REMARQUE : Une astuce pour ajouter le mélange Mg(OAc)₂ et KOAc : la goutte doit être placée autour de la marque de volume de 1 mL du tube. Ici, la chute sera clairement visible et ne risque pas d’être perdue lors de la fermeture du tube ou d’autres actions. L’amplification commencera après avoir tourné vers le bas pour collecter la goutte au fond du tube. Lors du traitement de plus d’une réaction à la fois, l’amplification peut être initiée simultanément.
3. Remettez en suspension la pastille de RT-RPA en ajoutant 12,4 μL de l’échantillon d’ARN (ou des échantillons de contrôle).
   REMARQUE : La séquence d’addition est échantillon négatif/contrôle négatif, ARN/ADN à tester, échantillon positif/contrôle positif.
4. Pour initier la réaction RT-RPA, faites tourner brièvement la solution ajoutée des étapes 3.2 et 3.3 à l’aide d’une minicentrifugeuse à température ambiante pendant 3 s.
5. Mélangez en tapotant soigneusement le tube, puis faites un autre bref essorage pendant 3 s.
6. Incuber la réaction à 42 °C pendant 60 min en la plaçant dans un bloc chauffant préchauffé ou un incubateur à agitation thermique.
7. Après la fin de la réaction, sortez les tubes de réaction et placez-les sur de la glace avant de passer à l’étape de détection CRISPR-Cas (section 4).
   REMARQUE : Le produit amplifié par RPA peut être utilisé immédiatement dans la réaction de détection ou peut être stocké à 4 °C pendant plusieurs jours ou à -20 °C pendant plusieurs mois.

4. Détection des acides nucléiques CRISPR-Cas13

1. Allumez un lecteur de microplaques à fluorescence, réglez et préchauffez la température de chauffage à 37 °C et sélectionnez le programme indiqué dans le tableau 2.
2. Placez une assiette de 384 puits sur de la glace.
3. Remettre en suspension la réaction de détection prémélangée CRISPR-Cas lyophilisée (section 2) en ajoutant 17 μL de solution de chlorure de magnésium à 8 mM. Mélangez en tapotant soigneusement le tube ; Ensuite, tournez brièvement pendant 3 s et placez le tube sur de la glace.
4. Transférez 18 μL du mélange réactionnel remis en suspension dans chaque puits de la plaque prérefroidie à 384 puits sur de la glace.
5. Ajouter 2 μL du produit RPA préparé à la section 3 dans chaque puits de réaction.
6. Retirez la plaque de la glace, placez-la rapidement dans un lecteur de microplaques à fluorescence préchauffé et appuyez sur Démarrer.
   REMARQUE : Une plaque de 384 puits a été placée sur de la glace pour permettre la synchronisation de l’initiation de la réaction lorsque la plaque de 384 puits est transférée dans un lecteur de microplaques à fluorescence préchauffé.

Résultats

Nous mettons en évidence la cinétique de la génération du signal de fluorescence FAM à partir de la détection combinée des gènes s et n du SRAS-CoV-2, et comment l’information a été utilisée pour déterminer les conditions optimales pour les formulations de réaction lyophilisées et prémélangées. Dans tous les cas, nous avons inclus des échantillons avec des valeurs de C_t bien en deçà de la limite de détection déterminée (C_t ~31-33), ainsi que ceux avec C_t à la LoD (C_t ~35-37)⁷, afin de permettre une différenciation des protocoles avec une meilleure sensibilité.

Pour la RT-RPA lyophilisée et prémélangée, nous avons constaté que l’inclusion de KOAc dans la réaction prémélangée affectait négativement la sensibilité de la réaction (Figure 2A). Nous avons donc omis KOAc de la réaction prémélangée et l’avons ajouté avec l’initiateur de la réaction, Mg(_OAc)2, une fois l’échantillon d’ARN ajouté. Nous avons également utilisé des tests similaires pour déterminer la concentration optimale d’un tréhalose cryoprotecteur (Figure 2B) et les effets de la triglycine⁷ dans la réaction RT-RPA lyophilisée (Figure 2C). Par conséquent, des réactions RT-RPA optimisées lyophilisées et prémélangées ont été préparées avec 6% de tréhalose, sans KOAc (mais il a été ajouté plus tard après l’échantillon d’ARN), et complétées par de la triglycine, comme décrit dans la section 1 du protocole.

Figure 2 : Optimisation des réactions RT-RPA lyophilisées et prémélangées. La réaction RT-RPA a été préparée à l’aide d’amorces ciblant le gène n du SAR-CoV-2. Le Mg(OAc)₂ a été exclu de toutes les réactions prémélangées. Les effets de (A) KOAc, (B) de tréhalose et (C) de triglycine ajoutés aux réactions prémélangées ont été évalués. La surveillance de la réaction via la fluorescence FAM générée a été effectuée à l’aide d’un thermocycleur en temps réel ou d’un lecteur de microplaques à fluorescence. Des données individuelles provenant de mesures en trois exemplaires sont présentées. Abréviations : RT = transcription inverse ; RPA = amplification par polymérase recombinase ; CRISPR = répétitions palindromiques courtes groupées et régulièrement espacées ; Cas = protéine associée à CRISPR ; SAR-CoV-2 = Coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère ; C_t = seuil de cycle ; FAM = carboxyfluorescéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour les réactions lyophilisées et prémélangées à base de Cas13a, nous avons vérifié l’importance d’avoir le bon cryoprotecteur : soit 6 % de tréhalose, soit 2 % de saccharose¹⁹ ont bien fonctionné, tandis qu’une plus faible teneur en saccharose à 1 % ou 5 % p/v PEG20000 n’a pas préservé l’efficacité de la réaction après lyophilisation (Figure 3). Le MgCl₂ a été omis de toutes les réactions et a été ajouté à l’étape de réhydratation. La réaction de détection optimale lyophilisée à base de Cas13 a été préparée avec 6 % de tréhalose, comme indiqué dans la section 2 du protocole.

Figure 3 : Optimisation des réactions de détection basées sur Cas13 lyophilisées et prémélangées. La réaction de détection a été réalisée à 37 °C à l’aide du produit RPA issu du gène n du SARS-CoV-2. Les tests ont été effectués avant et après la lyophilisation. Le MgCl₂ a été exclu de toutes les réactions prémélangées. Les capacités de (A) le tréhalose, (B) le PEG20000 et (C) le saccharose à préserver l’efficacité de la réaction après lyophilisation ont été évaluées. La surveillance de la réaction via la fluorescence FAM générée a été effectuée à l’aide d’un thermocycleur en temps réel. Les données individuelles provenant de mesures en trois exemplaires pour les conditions « après lyophilisation » et d’une répétition des conditions « avant lyophilisation » sont présentées. La figure 3A,B est tirée de Patchsung et ^al.7. Abréviations : RPA = amplification par polymérase recombinase ; SAR-CoV-2 = coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère ; FAM = carboxyfluorescéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les réactifs lyophilisés et prémélangés pour les réactions à base de RT-RPA et de Cas13 sont stables à -20 °C pendant au moins 8 mois [Figure 4].

Figure 4 : Tests de stabilité de réactifs RPA et CRISPR-Cas13a lyophilisés, prémélangés à -20 °C. Essai de stabilité à (A) 30 jours, (B) 45 jours, (C) 3 mois, (D) 5 mois, (E) 8 mois. Des données individuelles provenant de mesures en trois exemplaires sont présentées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 5 montre la LoD des réactions lyophilisées basées sur la RT-RPA et Cas13 pour la détection des gènes s et n du SARS-CoV-2. La cinétique de la génération de signaux peut être améliorée lors de la détection de deux gènes par rapport à la détection d’un seul gène.

Figure 5 : Sensibilité analytique de la détection monogénique par rapport à la détection bigénique. (A) La LoD de la détection lyophilisée monoplexe RT-RPA et Cas, ciblant le gène s du SAR-CoV-2. (B) La LoD de la détection lyophilisée monoplexe RT-RPA et basée sur Cas ciblant le gène n du SAR-CoV-2. (C) La LoD de la RT-RPA multiplexe lyophilisée et la détection double basée sur Cas ciblant les gènes s et n. La LD a été déterminée à l’aide d’ARN du SARS-CoV-2 dilués en série, dont les valeurs_{C t} ont été déterminées à l’aide d’un test RT-qPCR ciblant le gène n. Des données individuelles provenant de 3 à 6 mesures répétées sont présentées. Abréviations : LoD = limite de détection ; RT = transcription inverse ; RPA = amplification par polymérase recombinase ; CRISPR = répétitions palindromiques courtes groupées et régulièrement espacées ; Cas = protéine associée à CRISPR ; SAR-CoV-2 = Coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère ; C_t = seuil de cycle ; qPCR = réaction en chaîne par polymérase quantitative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Au-delà de la détection du virus, nous présentons un prototype d’outil de génotypage POC basé sur le diagnostic CRISPR, pour aider à identifier les espèces de serpents venimeux endémiques de Thaïlande (Figure 6). L’identification plus rapide et précise des espèces de serpents grâce à des échantillons d’ADN prélevés sur les morsures peut aider à l’administration rapide d’antivenins, améliorant ainsi les chances de survie du patient. Nous avons ciblé des régions du gène du cytochrome b mitochondrial (cytb) de huit espèces de serpents, dont Ophiophagus hannah (cobra royal) (Figure 6A) et montré que la détection de substituts d’ADN synthétique du gène cytb d’O. hannah peut atteindre le niveau de sensibilité attomolaire (Figure 6B,C).

Figure 6 : Un prototype de détection basée sur CRISPR pour identifier les espèces de serpents à partir de l’envenimation par morsure de serpent. (A) Conception d’amorces RPA et d’ARNcr LwaCas13a pour la détection du gène cytb d’Ophiophagus hannah. Le promoteur T7 (porte-à-faux T7) a été placé à l’extrémité 5' de l’amorce RPA avant. (B) la cinétique de la génération du signal FAM sur 60 minutes et (C) la fluorescence FAM du point final à partir de la détection médiée par LwaCas13a d’entrées d’ADNdb synthétiques correspondant aux segments du gène cytb d’O. hannah. Différentes concentrations d’entrée (0, ^10-9, ^10-12, ^10-15 et ^10-18 M) ont été utilisées. Les données sont moyennes ± écart-type à partir de mesures en trois exemplaires. Abréviations : RPA = amplification par polymérase recombinase ; CRISPR = répétitions palindromiques courtes groupées et régulièrement espacées ; Cas = protéine associée à CRISPR ; FAM = carboxyfluorescéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Lyophilisation de réactifs de détection prémélangés CRISPR-Cas13a
Pas	Taux de rampe	Température de l’étagère	Temps (hh :mm)	Vide
	(°C/min)	(°C)		(mbar)
Congeler 1	3	-30	de	-
Sec 1	3	-30	de	0
Sec 2	3	4	01:00	0
Sec 3	3	20	∞	0

Tableau 1 : Paramètres du lyophilisateur des réactifs de détection RT-RPA et CRISPR-Cas13a prémélangés. Abréviations : RT = transcription inverse ; RPA = amplification par polymérase recombinase ; CRISPR = répétitions palindromiques courtes groupées et régulièrement espacées ; Cas = protéine associée à CRISPR.

Paramètre		Réglage
Température		37 °C
Cycle cinétique	Durée	02:00 (mm :ss)
	Temps d’intervalle	02:30 (mm :ss)
Tremblant	Durée	1 seconde
	Mode	Linéaire
	Amplitude	1 millimètre
Intensité de fluorescence	Longueur d’onde d’excitation	488 milles marins
	Longueur d’onde d’émission	520 milles marins
	Mode	Retour au début
	Position Z	24470
	Gagner	71
	Temps d’intégration	20 μs
	Nombre de clignotements	25

Tableau 2 : Programme de lecture de microplaques à fluorescence pour la détection des acides nucléiques.

Discussion

Il y a des étapes critiques dans ce protocole. Pour la ségrégation de zone, il est recommandé d’utiliser des espaces séparés pour l’extraction des acides nucléiques, la préparation du mastermix (zone de préamplification), l’ajout d’échantillons et la détection d’amplicons (zone de post-amplification). Chaque zone doit être réglée à l’aide d’un ensemble distinct d’outils et d’équipements. N’apportez pas d’outils d’une zone à une autre, en particulier de la zone de post-amplification dans la zone de pré-amplification. Le nettoyage des zones de travail est nécessaire : il faut nettoyer les zones de travail, les pipettes, les vortex et les marqueurs permanents avec une solution de décontamination RNase/DNase/3% de Clorox suivie de 70% d’éthanol ou d’eau déminéralisée autoclave. Le lavage du matériel de laboratoire de base et des pièces amovibles des instruments, tels que les portoirs en plastique de tube de 1,5 ml et l’adaptateur de rotor d’une minicentrifugeuse, est nécessaire. L’eau sans nucléases est utilisée comme témoin négatif et composant réactionnel, et constitue donc un réactif sensible qui peut être contaminé s’il n’est pas manipulé avec soin. Nous vous recommandons donc de faire de petites aliquotes d’eau à n’utiliser qu’une seule fois.

Exécutez toujours une réaction de contrôle négative à l’aide des amorces de test pour vérifier la contamination. De plus, pour éviter les problèmes de contamination, nous vous recommandons de préparer la réaction de contrôle négatif en ajoutant de l’eau sans nucléase dans la zone de préamplification au lieu de la salle d’ajout d’échantillons. Le mélange d’acétate de magnésium et d’acétate de potassium doit être aliquote en petits volumes (~20 μL/tube) qui ne sont utilisés qu’une seule fois pour éviter la contamination du réactif par des amplicons de transfert. Lors de l’ajout du mélange d’acétate de magnésium-potassium à des réactions RPA de prémélange lyophilisées, nous vous recommandons de changer la pointe de la pipette à chaque fois. Pour le flux de travail des expériences, gardez le flux de travail unidirectionnel, de la pré-amplification aux expériences de post-amplification. Passez des espaces de travail « propres » (pré-amplification) à des espaces de travail plus « sales » (post-amplification).

Pour les modifications et le dépannage de la méthode afin d’éviter la contamination par transfert d’amplicons, nous recommandons de séparer spatialement les trois étapes principales de l’expérience : préparation de la réaction RPA ; l’ajout d’échantillons ; et les étapes d’amplification et de détection. Le mastermix doit être préparé dans une zone du laboratoire sans modèle. Lorsque vous changez de toilette, changez également de gants et de blouses de laboratoire. Travaillez de manière unidirectionnelle de la pré à la post-amplification. Évitez d’utiliser la même pipette pour différentes étapes. Il est préférable de disposer différents jeux de pipettes pour ces étapes : préparation des mastermixes ; ajout de l’ADN/ARN matrice ; et le transfert du produit amplifié. Utilisez des embouts filtrés, essayez d’empêcher autant que possible la formation d’aérosols et évitez de toucher l’intérieur du tube lorsque vous l’ouvrez. Si les expériences d’amplification montrent une contamination, tous les réactifs doivent être changés. Si possible, rendez-vous dans un autre laboratoire avec des réactifs frais et vérifiez si la contamination persiste. Mis à part les réactifs, n’apportez rien d’autre, y compris des pipettes. Essayez les pipettes autoclavables si elles sont autoclavables.

Pour améliorer le taux d’amplification (optimisation du dos), consultez d’abord les instructions du fabricant telles que le manuel RPA de TwistDx afin de garantir des conceptions optimales. Ensuite, essayez des optimisations empiriques des réactions telles que l’ajout d’additifs réactionnels connus pour stimuler les réactions RPA et CRISPR⁷ ; l’augmentation des temps de réaction (par exemple, le temps de réaction de la RPA jusqu’à 60 min) ; ou varier les séquences et les concentrations d’amorces. Nous vous recommandons également d’ajouter autant de volume d’échantillon que possible ; L’utilisation de réactifs lyophilisés permet d’ajouter plus de volume d’échantillon. Pour réduire la fluorescence de fond, on peut effectuer une étape d’inactivation thermique (75 °C pendant 5 min) après la fin de la RPA, avant de passer à la détection, ou d’optimiser la concentration du rapporteur. Trop de journaliste donnera un arrière-plan plus élevé. De plus, l’ajout d’inhibiteurs de la RNase permet d’éviter la dégradation du rapporteur indépendante de Cas.

Au-delà de l’optimisation des conditions de réaction basées sur le (RT)-RPA et CRISPR et de leurs procédures de manipulation, il faut s’assurer que les réactifs utilisés sont de bonne qualité et que l’étape d’extraction des acides nucléiques précédant toutes les réactions est réussie. Les réactifs lyophilisés offrent une sensibilité de détection élevée, sont portables, permettent des tests POC et peuvent être appliqués à divers échantillons cliniques. De plus, le (RT)-RPA lyophilisé peut être réhydraté instantanément en ajoutant l’extrait d’acide nucléique provenant d’échantillons cliniques. Une étude précédente a montré une sensibilité plus élevée lors de l’utilisation d’un plus grand volume d’acide nucléique sans volume restreint, augmentant ainsi la quantité totale d’acide nucléique cible.

Les diagnostics basés sur CRISPR ont été adaptés pour détecter les agents pathogènes en collectant des échantillons cliniques tels que des écouvillons nasopharyngés et de gorge, de l’urine et du sérum ^7,8,11. Il a également été utilisé pour distinguer les variantes nucléotidiques uniques, identifier les gènes de résistance aux antibiotiques chez les organismes résistants aux antimicrobiens et détecter les mutations associées au cancer. L’utilité de la technologie peut être la plus grande dans les applications sur le terrain où les réactions biochimiques modifiées pour l’amplification isotherme et la détection basée sur CRISPR peuvent être combinées avec des dispositifs et des lectures prêts à l’emploi tels qu’un fluorimètre portable ou des bandes de flux latéral.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Material
Betaine solution	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
Eau traitée au DEPC	Invitrogen	AM9915G
Dithiothreitol (DTT)	Merck	3870-25GM
EpiScript reverse transcriptase	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly& nbsp ;	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	Production en interne		souche :Leptotrichia wadei, Abréviation : Lwa, Nom de la protéine : LwaCas13a
Solution de chlorure de magnésium, 1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 ARN polymérase	Lucigen	30223-2
Poly(éthylène glycol)	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Solution d’acétate de potassium, 5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Solution de riobnucléotide Mélange	NEB	N0466L
RNase H	NEB	M0297L
Saccharose	TCI	TCI-S0111-500G
Tréhalose Dihydraté	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
Solution de chlorhydrate de Trizma, 1M, pH 7,4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Kit de base	TwistDx	TABAS03KIT
Equipment
BluPAD Dual LED Transilluminateur de lumière bleue/blanche	Bio-Helix	BP001CU
Bain sec Dual Block	ELITE	4-2-EL-02-220	Modèle : EL-02
Microplaque de fluorescence lecteur	Tecan		30050303 Modèle : Infinite 200 Pro
Lyophilisateur	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad Lyophilisateur de paillasse
Microplaque 384-well	Greiner	GDE0784076	F-Bottom, petit volume, Hibase, Med. Reliure, Noir
Thermocycleur en temps réel (système de PCR en temps réel CFX Connect)	Bio-Rad	185-5201	Modèle : Module
optique CFX Connect RPA directe >
strongs	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
amorce RPA inverse du gène	S IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
amorce RPA directe à gène n	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n-gene reverse RPA	primer IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA pour le gène s	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA pour le gène n	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCA AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporter	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F Introduction RPA	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R Introduction RPA	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah  ;	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC