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Article de méthode

Combinaison d’électroporation in vivo et de réinnervation à court terme du muscle squelettique du muscle squelettique du muscle squelettique du releveur crânien de l’auris long

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DOI :

10.3791/66706

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1 novembre 2024

 ,  ,  ,  , 
1Neuromuscular Studies Lab (NeSt Lab), Institute of Anatomy, Histology, and Pathology, Faculty of Medicine, Universidad Austral de Chile, 2Faculty of Odontology and Rehabilitation Sciences, Universidad San Sebastian, 3Department of Cell Biology, Faculty of Biological Sciences, Universidad de Concepcion

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole qui combine l’électroporation in vivo et la dénervation du muscle releveur crânien du long auris (LAL). Cette procédure permet d’étudier le rôle potentiel des protéines dérivées du muscle dans la régénération de la synapse neuromusculaire.

Résumé

La jonction neuromusculaire (JNM) est la synapse périphérique contrôlant la contraction des fibres musculaires squelettiques pour permettre le mouvement coordonné de nombreux organismes. Au niveau de la NMJ, une terminaison axonale motrice présynaptique entre en contact avec un domaine postsynaptique musculaire et est recouverte par des cellules de Schwann terminales. L’intégrité et la fonction de la JNM sont compromises dans plusieurs conditions, notamment le vieillissement, les maladies neuromusculaires et les blessures traumatiques. Pour analyser la contribution potentielle des protéines dérivées du muscle au maintien et à la régénération de la JNM, une stratégie de transfert de gènes in vivo a été combinée à la dénervation du muscle releveur crânien de l’auris long (LAL) après une lésion nerveuse mécanique. Des résultats antérieurs ont montré que l’expression forcée des protéines fluorescentes de contrôle ne modifie pas l’organisation de la JNM ou la neurotransmission. Cette procédure vise à décrire une méthode détaillée d’électroporation in vivo du muscle LAL suivie d’une section ou d’un écrasement de la branche spécifique du nerf facial innervant les muscles crâniens, conduisant respectivement à la dénervation et à la réinnervation de la NMJ. La combinaison de ces stratégies expérimentales dans le muscle LAL pratique constitue une méthode efficace pour étudier la contribution potentielle de la surexpression ou du silençage des protéines musculaires dans le contexte de la réinnervation à court terme de la NMJ.

Introduction

La jonction neuromusculaire (JNM) est la synapse périphérique qui contrôle la contraction musculaire et, indirectement, le mouvement coordonné des organismes1. Il est formé d’une terminaison axonale motrice présynaptique, d’un domaine postsynaptique musculaire enrichi en récepteurs de l’acétylcholine (AChR) et de cellules de Schwann terminales non myéliniques recouvrant la terminaison axonale 2,3,4. Lors de la dénervation de la NMJ due à une lésion nerveuse périphérique traumatique, à une maladie ou à une intervention pharmacologique, l’activité musculaire contractile est perdue 5,6. Comme certains microenvironnements permissifs permettent une récupération fonctionnelle rapide et efficace, la recherche de protéines qui pourraient aider au processus de régénération est une nécessité permanente. Ici, deux procédures ont été combinées pour évaluer spécifiquement le rôle potentiel de la manipulation de l’expression des protéines musculaires dans la régénération à court terme de la JNM après une lésion nerveuse.

Le muscle releveur du long auris (LAL), situé sur la surface dorsale du crâne, est un muscle mince et plat qui contrôle le mouvement du pavillon. Le muscle LAL est constitué de bandes rostrales et caudales, chacune contenant deux ou trois couches de fibres musculaires 7,8. La branche auriculaire postérieure du nerf facial innerve le muscle LAL, générant un schéma d’innervation bien décrit composé de cinq régions d’innervation rostrale (R1-R5) et de deux régions d’innervation caudales (C1-C2) 8,9,10. Le LAL est un muscle superficiellement exposé et facilement accessible, de sorte que son utilisation nécessite des procédures peu invasives. Cela permet de visualiser la NMJ à l’aide de la microscopie en temps réel, de l’administration de médicaments, ainsi que l’intervention de préparations musculaires complètes in vivo et ex vivo11,12. Dans l’ensemble, ces caractéristiques font du muscle LAL un excellent modèle pour étudier le comportement et la fonction de la NMJ10,13.

L’électroporation in vivo est une technique de transfert de gènes qui permet l’incorporation d’ADN exogène dans le tissu par la perméabilisation transitoire des membranes cellulaires et la mobilité de l’ADN à l’intérieur des cellules, toutes deux générées après l’induction d’un champ électrique14,15. Cette procédure est locale et peut être effectuée à n’importe quel stade du développement de l’animal. Compte tenu des caractéristiques uniques du muscle LAL, son électroporation in vivo représente une procédure peu invasive, très efficace et rapide16, permettant d’observer une expression protéique robuste deux ou trois jours après l’électroporation.

La procédure d’écrasement du nerf facial a été largement utilisée dans la recherche car elle offre plusieurs avantages 5,17,18. Ce protocole a déjà été modifié pour cibler spécifiquement la branche auriculaire postérieure du nerf facial qui innerve les muscles crâniens, y compris le muscle LAL, afin d’éviter la paralysie faciale ; Par conséquent, les souris n’ont pas besoin de soins particuliers après la chirurgie (par exemple, une pommade oculaire lubrifiante pour la perte du réflexe de clignement). Comme la réinnervation NMJ au niveau du muscle LAL commence entre 7 et 9 jours après la blessure6, il s’agit d’un bon modèle de réinnervation à court terme par rapport au modèle de lésion par écrasement nerveux couramment utilisé du nerf sciatique pour dénerver les muscles des membres postérieurs, où la réinnervation se produit environ trois semaines après la lésion nerveuse18.

La combinaison de l’électroporation in vivo et de la lésion du nerf facial au niveau du muscle LAL permettra aux chercheurs d’évaluer le comportement des composants synaptiques contre la modulation des protéines dérivées du muscle à différents moments de la régénération de la NMJ, y compris les effets morphologiques à court et à long terme 6,16, grâce à une grande variété de techniques, y compris des tests immunohistochimiques, histologiques et fonctionnels.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales sont approuvées par le Comité de bioéthique de l’Universidad Austral de Chile, Chili (protocole n° 503/2023), et suivent les normes imposées par le Comité de bioéthique de l’Agence nationale de recherche et de développement du Chili (ANID), ainsi que les directives de la Directive du Conseil européen pour le soin des animaux de laboratoire. La présente étude a porté sur des souris CF-1 adultes (âgées de 3 à 6 mois) des deux sexes (30 à 45 g). L’euthanasie a été réalisée par surdose d’anesthésique inhalé suivie d’une exsanguination. Les réactifs et l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Électroporation musculaire LAL in vivo

  1. Préparation
    1. Mettez doucement la souris sous sédatif dans une chambre d’induction en acrylique sous inhalation d’isofluorane à 2,5 % avec 0,8 L/min d’oxygène (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement). Après cela, maintenez la sédation chez la souris à l’aide d’un masque nasal relié à un appareil d’anesthésie par inhalation sous un stéréomicroscope de dissection.
      REMARQUE : Assurez-vous que la souris est en veille avant de commencer la procédure ; Testez le réflexe tactile de la souris en serrant doucement un pied avec une pince (faites cette étape à chaque fois après avoir induit une anesthésie).
    2. Désinfecter la région cervicale au niveau de la suture sagittale du crâne avec l’antiseptique gluconate de chlorhexidine à 2 % et injecter par voie sous-cutanée 20 μL de hyaluronidase à 2 mg/mL dans le PBS à l’aide d’une seringue Hamilton pour faciliter l’accès du plasmide d’ADN à la surface musculaire.
    3. Désactivez le flux d’isofluorane et laissez la souris respirer de l’oxygène pur pendant 1 min.
    4. Pesez la souris pour calculer la dose appropriée de méloxicam (voir étape 1.3.2.).
    5. Placez l’animal dans une cage vide (sans aucune litière) pour qu’il se remette de l’anesthésie.
    6. Remettez l’animal dans un logement normal pendant 30 min16.
  2. Procédure chirurgicale
    1. Réanesthésier la souris en inhalant de l’isofluorane à 2,5 % avec un mélange d’oxygène de 0,8 L/min (conformément aux protocoles approuvés par l’établissement) et la maintenir sous sédation tout au long de l’intervention chirurgicale à l’aide d’un appareil d’anesthésie par inhalation, sous un stéréomicroscope de dissection.
    2. Rasez la région cervicale à l’aide d’une lame de rasoir à double tranchant et désinfectez avec de la chlorhexidine et de l’éthanol à 70 % 3 fois.
    3. Faites une incision de 8 mm sur la suture sagittale du crâne et exposez le muscle LAL en retirant doucement la graisse et le tissu conjonctif situés juste sous la peau à l’aide de ciseaux/pinces.
      REMARQUE : Le muscle LAL est le muscle le plus superficiel de la région crânienne après une incision cutanée. Il est facilement reconnaissable à l’orientation des fibres musculaires qui partent en diagonale du milieu du crâne vers chaque pavillon 8,16.
    4. À l’aide d’une seringue Hamilton, injectez 10 μL de l’ADN obtenu commercialement (0,8-1 μg/μL) dans le PBS dans le fascia qui est distribué dans tout le muscle, formant une bulle.
    5. Placez deux électrodes à aiguille en or à 5 mm l’une de l’autre, parallèlement et sur les fibres musculaires, en occupant toute la longueur du muscle LAL (Figure 1A).
    6. À l’aide d’un électroporateur, générer cinq impulsions de 100 V/cm d’une durée de 20 ms chacune, à une fréquence de 1 Hz.
    7. Répétez l’intervention dans le muscle LAL controlatéral (en répétant les étapes 1.2.4 à 1.2.6).
  3. Suture et récupération
    1. Suture (taille de souche 5/0, aiguille HR15) la peau avec un fil d’acide polyglycolique résorbable.
    2. Injecter par voie sous-cutanée l’analgésique Méloxicam à des doses de 1 à 2 mg/kg de poids pour réduire la douleur post-opératoire.
    3. Désactivez le flux d’isofluorane et laissez la souris respirer de l’oxygène pur pendant 1 min.
    4. Placez l’animal dans une cage vide (sans aucune litière) pour qu’il se remette de l’anesthésie.
    5. Remettez l’animal dans son logement habituel et surveillez-le pendant 2 jours après la chirurgie ou jusqu’à son rétablissement. Surveiller les signes de douleur ou de stress, en attribuant des scores pour chacun des différents paramètres en tenant compte des critères d’évaluation sans cruauté décrits précédemment19.
      REMARQUE : Placez la souris dans un coussin chauffant recouvert d’un coussin chirurgical pour éviter que sa température corporelle ne baisse pendant l’opération. Essayez de ne pas prendre plus de 30 minutes pour l’intervention chirurgicale, évitant ainsi que la souris ne meure en raison d’un excès d’anesthésie. Si la protéine exprimée donne de faibles niveaux de fluorescence, il est recommandé de co-électroporate avec un traceur (par exemple, tdTomato ou GFP) dans un rapport de 1:5 (traceur : ADN d’intérêt).

2. Dénervation induite par une lésion nerveuse d’écrasement

REMARQUE : Ce protocole est une modification d’un protocole17 décrit précédemment. Effectuez cette procédure avec une différence d’au moins 3 jours par rapport à l’électroporation. Selon les questions de recherche, cette procédure peut être réalisée avant ou après l’électroporation.

  1. Anesthésie et positionnement de l’animal
    1. Effectuer la sédation animale dans une chambre d’induction acrylique sous inhalation d’isofluorane à 2,5 % avec 0,8 L/min d’oxygène (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
    2. Pesez la souris pour calculer la dose de méloxicam (voir étape 2.3.2.).
    3. Maintenez la sédation chez la souris à l’aide d’un masque nasal relié à un appareil d’anesthésie par inhalation sous un stéréomicroscope à dissection.
    4. Positionnez la souris sur son côté gauche (pour dénerver le muscle LAL droit). Collez l’oreille droite vers le nez pour exposer la zone postérieure du pavillon.
  2. Procédure chirurgicale
    1. Rasez la partie postérieure du pavillon de l’oreille à l’aide d’une lame de rasoir à double tranchant et désinfectez avec de la chlorhexidine et de l’éthanol à 70 % 3 fois.
    2. Localisez la veine auriculaire postérieure et faites une incision dans la peau, à 2 mm de celle-ci caudalement, d’environ 5 mm avec des ciseaux à ressort. Évitez de couper les vaisseaux sanguins et/ou les tissus musculaires.
    3. Coupez la graisse et les tissus conjonctifs avec des pinces et des ciseaux. Trouvez le nerf accessoire de la colonne vertébrale ; continuer jusqu’à trouver le ventre du muscle digastric et le conduit auditif cartilagineux (tissu blanchâtre semi-transparent) (Figure 2A).
    4. Localisez le début de la ramification du nerf facial juste en dessous du muscle digastrique.
    5. Suivez la branche auriculaire postérieure (la branche la plus dorsale du nerf facial) et retirez doucement le tissu conjonctif qui l’entoure, en évitant soigneusement la manipulation nerveuse directe.
    6. Écrasez la branche auriculaire postérieure du nerf facial pendant 30 secondes, en appliquant une pression constante sur le nerf à l’aide d’une pince avec une pointe inclinée à 45°.
  3. Suture et récupération
    1. Suture (taille de souche 5/0, aiguille HR15) la peau avec un fil d’acide polyglycolique résorbable.
    2. Injecter par voie sous-cutanée l’analgésique Méloxicam à des doses de 1 à 2 mg/kg de poids pour réduire la douleur post-opératoire.
    3. Retirez le ruban adhésif de l’oreille, coupez le flux d’isofluorane et laissez la souris respirer de l’oxygène pur pendant 1 min.
    4. Placez l’animal dans une cage vide (sans aucune litière) pour qu’il se remette de l’anesthésie.
    5. Remettez la souris dans son logement habituel et surveillez-la pendant 2 jours après la chirurgie ou jusqu’à ce qu’elle se rétablisse.
    6. Après la récupération, examinez la souris à la recherche de défaillances dans le mouvement de l’oreille affectée comme signe de dénervation efficace.
      REMARQUE : Chez les animaux de contrôle simulés, faites une incision dans la peau, exposez le nerf facial sans le toucher directement, puis suturez.

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Résultats

Le rendement quantique élevé en fluorescence de la protéine tdTomato20 en fait un traceur approprié pour l’efficacité de l’électroporation. Par conséquent, l’expression de la protéine tdTomato dans les muscles LAL par électroporation in vivo a été évaluée (Figure 1). Les muscles LAL ont été disséqués 21 jours après l’électroporation. Les préparations montées entières montrent la fine bande caudale (cLAL, polygone cyan) du muscle LAL avec ses deux régions d’in...

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Discussion

La combinaison de l’électroporation musculaire in vivo et de la dénervation est une approche expérimentale précieuse pour étudier une niche régénérative au NMJ4. Étant donné que le muscle LAL est exposé superficiellement, ces procédures combinées peuvent être facilement complétées par l’administration de sondes ou de médicaments qui pourraient affecter l’expression ou l’activité des protéines12. De plus, l’électroporation des gènes...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions l’environnement hautement collaboratif et stimulant des membres du NeSt Lab pour les discussions et les commentaires utiles sur ce travail. Les travaux du NeSt Lab sont actuellement financés par FONDECYT 1221213. Le schéma de la figure 1A a été créé avec BioRender.com.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
#5/45 Pince Dumont  ;Outils de science fine  ;11251-35Stériliser avant utilisation
anti 2H3DSHBDilué 1 : 300
anti S100 Prêt à l’emploiDakoIR504Diluer 1 : 5
anti SV2DSHBDilué 1 : 50
Gluconate de chlorhexidine 2 %DifenPharma
Stéréomicroscope à dissection en lumière froideModèleMotic SMZ-171
DAPIInvitrogenD1306Dilué 1 : 100
Dumont #5SF PinceFine Science Tools  ;11252-00Stériliser avant utilisation
Mini pince Dumont &ndash ; Style 5Outils de science fine  ;11200-14Stériliser avant utilisation
ECM 830 ÉlectroporateurBTX Harvard Apparatus
Électrodes à aiguille dorée  ;Genetrodes, BTX45-0114
Seringue droite HamiltonHamilton80400
HyaluronidaseSigma-AldrichH3884
Appareil d’anesthésie par inhalationSciVerma ScientificM3000 Table Top
IsofluraneBaxter218-082
SourisInstituto de Salud Publica - ChiliAdulte (3-6 mois) Souris CF-1, des deux sexes (30-45 g)  ;
Lames de rasoirSchick
Suture Glicosorb 5/0TAGUMGS0812. JFil d’acide polyglycolique résorbable  ;
tdPlasmide de tomateAddgene54642tdPlasmide de tomate sous le contrôle du promoteur du CMV
Chlorhydrate de tramadol 5 % (Triamcol)Drag Pharma
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools  ;91500-09Stériliser avant utilisation
WGA Alexa Fluor 488InvitrogenW7024Diluer
&alpha ;-BTX Alexa Fluor 488  ;InvitrogenB13422Dilué 1 : 500
de 10 mm.

Références

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