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Radiosynthèse automatisée de [68Ga]Ga-FAPI-46 pour une utilisation clinique de routine

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DOI :

10.3791/66708

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24 mai 2024

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1Radiopharmaceutical Production and Development Centre (RAPID), Medical Technology and Physics Department, Sir Charles Gairdner Hospital, 2National Imaging Facility, Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis, University of Western Australia, 3Department of Nuclear Medicine, Sir Charles Gairdner Hospital, 4Medical School, University of Western Australia

Dans cet article

Résumé

Ce travail décrit la production automatisée de jusqu’à 1,7 GBq de [68Ga]Ga-FAPI-46 sur le synthétiseur iPHASE MultiSyn pour l’imagerie TEP de la protéine d’activation des fibroblastes.

Résumé

[68Ga]Ga-FAPI-46 est un nouveau traceur prometteur pour l’imagerie de la protéine d’activation des fibroblastes (FAP) par tomographie par émission de positons (TEP). Les inhibiteurs de la PAF marqués (FAPI) ont démontré leur absorption dans divers types de cancers, notamment le cancer du sein, du poumon, de la prostate, du pancréas et colorectal. Le FAPI-PET possède également un avantage pratique par rapport au FDG-PET, car il n’est pas nécessaire d’être à jeun et au repos. [Calibre 68]Ga-FAPI-46 présente des propriétés pharmacocinétiques améliorées, une meilleure rétention tumorale et des images plus contrastées que les images précédemment présentées [68Ga]Ga-FAPI-02 et [68Ga]Ga-FAPI-04. Bien qu’un protocole de synthèse manuelle pour [68Ga]Ga-FAPI-46 ait été initialement décrit, ces dernières années, des méthodes automatisées utilisant différents synthétiseurs commerciaux ont été signalées.

Dans ce travail, nous décrivons le développement de la synthèse automatisée de [68Ga]Ga-FAPI-46 à l’aide du synthétiseur iPHASE MultiSyn pour des applications cliniques. Dans un premier temps, l’optimisation du temps de réaction et la comparaison des performances de quatre cartouches d’extraction en phase solide (SPE) différentes pour la purification du produit final ont été étudiées. Ensuite, le développement et la validation de la production de 0,6-1,7 GBq de [68Ga]Ga-FAPI-46 ont été réalisés à l’aide de ces paramètres optimisés. Le produit a été synthétisé en 89,8 ± rendement corrigé de la décroissance de 4,8 % (n = 6) sur 25 min. Le produit final répondait à toutes les spécifications de contrôle de qualité recommandées et était stable jusqu’à 3 h après la synthèse.

Introduction

La protéine d’activation des fibroblastes (FAP) est devenue une cible de premier plan pour l’imagerie et le traitement du cancer1,2. La FAP est un marqueur spécifique des fibroblastes associés au cancer (CAF), un type de cellule stromale constituant une grande partie du microenvironnement des cancers solides. Les CAF jouent un rôle clé dans la croissance, l’invasion et les métastases tumorales3. Ils sont trouvés dans la plupart des tumeurs solides, y compris les cancers du sein, de la prostate et du pancréas1. En ciblant la PAF avec des inhibiteurs de petites molécules marqués avec des radionucléides diagnostiques ou thérapeutiques, l’imagerie et le traitement sélectifs non invasifs de ces cancers peuvent être réalisés 4,5,6. Les molécules inhibitrices de la FAP (FAPI) telles que FAPI-02, FAPI-04, FAPI-46 et FAPI-74 marquées avec 68Ga et 18F représentent une classe d’agents ciblant la FAP à base de quinoléine qui ont été développés par des équipes de l’hôpital universitaire de Heidelberg et du Centre allemand de recherche sur le cancer (DKFZ), en Allemagne7,8,9,10,11, en s’appuyant sur des travaux antérieurs identifiant l’échafaudage très prometteur de N-(4-quinolinoyl)-glycyl-(2-cyanopyrrolidine) pour l’inhibition de la FAP 12,13. Plus récemment, des inhibiteurs de la PAF du peptide cyclique tels que FAP-228614 et 3BP-394015 ont été développés à la fois pour l’imagerie et la thérapie.

[68Ga]Ga-FAPI-04 a démontré son absorption dans 28 types de cancers différents, y compris le cancer du sein, du poumon, de la prostate, du pancréas et colorectal16. En plus de l’avantage pratique de ne pas nécessiter de jeûne et de repos9, FAPI-PET a montré un avantage diagnostique (ou un rôle complémentaire avec) la TEP-FDG, comme dans les cancers gastro-intestinaux, du sein, de l’ovaire et du foie, dans les métastases cérébrales du cancer du poumon17, et dans les cas où les résultats de FDG ne sont pas concluants18. 68La FAPI marquée au Ga a également montré des applications non oncologiques intéressantes dans les maladies inflammatoires liées au système immunitaire, telles que la fibrose et la polyarthrite rhumatoïde19,20. Le [68Ga]Ga-FAPI-46 présenté le plus récemment, une variante du [68Ga]Ga-FAPI-04, qui a une liaison modifiée avec l’acide dodécane tétraacétique (DOTA), présente des propriétés pharmacocinétiques améliorées et une meilleure rétention tumorale, ce qui permet d’obtenir des images plus contrastées que celles obtenues en utilisant [68Ga]Ga-FAPI-02 ou [68Ga]Ga-FAPI-046,10. L’utilisation d’inhibiteurs de la PAF marqués pour le diagnostic et le traitement est protégée par le brevet international 21 et l’utilisation de [68Ga]Ga-FAPI-46 est actuellement sous licence22.

Les préparations rapportées de [68Ga]Ga-FAPI-46 utilisant soit du 68Ga produit par cyclotron, soit 68Ga élué à partir d’un générateur de 68Ge/68Ga comprennent l’utilisation de protocoles manuels et de synthétiseurs automatisés. Un protocole d’étiquetage manuel pour le [68Ga]Ga-FAPI-46 a été décrit, basé sur les méthodes précédemment rapportées pour le [68Ga]Ga-FAPI-02 et le [68Ga]Ga-FAPI-0423,24. Bien que l’étiquetage manuel ne nécessite pas d’équipement spécialisé, cette approche peut entraîner une augmentation de la dose de rayonnement de l’opérateur et une variabilité potentielle au sein de la production25 ; D’où la nécessité d’automatiser la production pour les applications cliniques de routine. De plus, l’utilisation d’un synthétiseur automatisé est plus conforme aux réglementations internationales GMP. La préparation de [68Ga]Ga-FAPI-46 a été développée sur une variété de synthétiseurs commerciaux, en utilisant 68Ga provenant de différents générateurs26,27,28,29,30,31,32,33 ou produit par cyclotron68Ga34. Les particularités de ces méthodes automatisées sont résumées dans le tableau supplémentaire S1 (fichier supplémentaire 1). Des méthodes de synthèse automatisées pour d’autres inhibiteurs de la FAP marqués au Ga et 177inhibiteurs de la PAF marqués au Lu ont également été publiées ces dernières années 35,36.

Au Centre RAPID de l’hôpital Sir Charles Gairdner, nous avons développé et validé la préparation de [68Ga]Ga-FAPI-46 sur le synthétiseur iPHASE MultiSyn (ci-après dénommé synthétiseur MS). Ce synthétiseur est utilisé régulièrement dans notre laboratoire, ainsi que dans d’autres installations de production en Australie pour la préparation de produits radiopharmaceutiques marqués 68Ga, 177Lu et 89Zr37,38,39. Le synthétiseur MS fonctionne en téléchargeant une liste d’étapes de séquence Excel dans sa mémoire interne. Cette liste d’étapes de séquence est conviviale et facilement modifiable. De plus, le synthétiseur permet des interventions en cours de production, telles que la répétition d’étapes, le retour aux étapes précédentes, le saut d’étapes et la pause de la production si nécessaire. Il est équipé de détecteurs de rayonnement placés à des endroits stratégiques, permettant à l’utilisateur de surveiller le processus de production en temps réel. Le synthétiseur MS est compatible avec tous les générateurs commerciaux de 68Ga et permet l’élution d’un ou deux générateurs. La procédure décrite dans ce travail utilise 68Ga provenant d’un ou deux générateurs de 68Ge/68Ga et implique à la fois la prépurification de 68Ga et la postpurification du produit final. Dans le cadre de cette étude, le temps de réaction optimal et la comparaison des performances de trois types différents de cartouches d'extraction en phase solide (SPE) de postpurification par rapport à celle fournie dans la cassette du fournisseur ont également été évaluées.

Protocole

PRÉCAUTION : Ce protocole implique la manipulation de matières radioactives. Tous les personnels participant à ce travail doivent être correctement formés à la manipulation d'isotopes radioactifs non scellés et disposer de l'approbation de l'officier de sécurité radiologique de leur établissement. Le synthétiseur automatisé doit être installé dans une cellule chaude blindée dédiée. Les expériences manuelles doivent être réalisées dans une cellule chaude blindée ou derrière un blindage contre les radiations. Les expériences préliminaires destinées à l'optimisation du temps de réaction et à l'essai de différentes cartouches SPE sont décrites dans la section supplémentaire 1 (fichier supplémentaire 1).

1. Préparation du synthétiseur de spectrométrie de masse

  1. Activer l'alimentation en air comprimé de la cellule chaude, l'arrivée de gaz azote, la ventilation, l'éclairage et l'alimentation électrique de l'ordinateur portable et du contrôleur logique programmable (PLC). Vérifier le niveau de la bouteille de déchets du module. La remplacer par une bouteille vide lorsqu'elle est remplie aux ¾.
  2. Allumer l'ordinateur et se connecter au logiciel du synthétiseur. Saisir le nom d'utilisateur et le mot de passe.
  3. Dans le logiciel du synthétiseur, appuyer sur Télécharger la recette, sélectionner le fichier séquence Excel pour la production de [68Ga]Ga-FAPI-46, puis appuyer sur Ouvrir. Appuyer sur OK une fois le téléchargement de la séquence terminé avec succès.
  4. Appuyer sur Démarrer ; saisir le numéro de lot, le numéro de lot du kit de réactifs et tous commentaires dans la fenêtre contextuelle, puis appuyer sur OK.
    REMARQUE : À partir de ce moment, l'interface utilisateur affichera un message d'étape décrivant l'action en cours et/ou invitant l'opérateur à intervenir.
  5. Retirer l'ancien kit matériel conformément au message d'étape affiché sur l'interface utilisateur. Appuyer sur SUIVANT sur l'interface utilisateur.
  6. Retirer la seringue d'élution du générateur (seringue HCl 1) du synthétiseur, comme indiqué par le message d'étape sur l'interface utilisateur, en tirant la butée de pouce de la seringue hors de la fente du moteur de seringue et en dévissant la seringue de la ligne d'entrée du générateur. Appuyer sur SUIVANT sur l'interface utilisateur.

2. Préparation des réactifs

REMARQUE : Les réactifs nécessaires à la production automatisée de [68Ga]Ga-FAPI-46 (voir Tableau 1) ont été préparés dans un environnement de salle propre juste avant la production.

  1. Obtenez le kit de réactifs et le jeu d'accessoires, un tube à centrifuger de 50 mL contenant au minimum 5 mL d'eau avec une concentration en métaux au niveau des traces ; le sac d'HCl 0,1 M, le flacon de 7 mg d'acide ascorbique (flacon A) ; le flacon de sodium ascorbate (5 mg) (flacon B) ; 2 seringues en polypropylène (PP)/polyéthylène (PE) de 5 mL, sans latex, sans PVC et sans huile de silicone (trois si une élution à double générateur est utilisée) et le flacon en verre contenant 50 µg de FAPI-46 (flacon C ; voir Supplemental Figure S1A,B-Supplemental File 1).
  2. Verser environ 2 mL d'eau dans le bouchon du tube de 50 mL. Aspirer 1 mL d'eau dans une seringue de 5 mL (étiqueter Seringue A). Boucher avec une aiguille. Pipeter 400 µL d'eau et ajouter au flacon d'acide ascorbique de 7 mg (flacon A) — agiter doucement pour dissoudre.
  3. Ouvrir le flacon de tampon acétate de sodium 0,25 M fourni (issu du kit de réactifs) et le flacon en verre contenant 50 µg de FAPI-46. Pipeter 0,9 mL de tampon et ajouter au flacon en verre contenant 50 µg de FAPI-46 (flacon B) ; mélanger délicatement.
  4. Aspirer le contenu du flacon A et du flacon B dans la Seringue A. Mélanger délicatement.
  5. Étiqueter la seringue de 5 mL fournie dans le jeu d'accessoires comme Seringue B. Aspirer 5 mL de HCl 0,1 M à partir du sac de HCl 0,1 M avec la Seringue B ; boucher avec l'embout de distribution fourni.
    NOTE : Pour la production utilisant une élution à double générateur, deux seringues de 5 mL de HCl 0,1 M sont nécessaires.
  6. Étiqueter la seringue de 3 mL fournie dans le jeu d'accessoires comme Seringue C. Ouvrir le flacon de solution acifiée de chlorure de sodium 5 M (issu du kit de réactifs), pipeter 1 mL, transférer dans la Seringue C, puis boucher avec l'embout de distribution fourni.
  7. Aspirer 1 mL de solution saline à 0,9 % dans une seringue de 5 mL (Seringue D) et ajouter au flacon C ; garder la Seringue D vide.

3. Préparation de la cassette de synthèse et installation de la cassette

  1. Obtenir une cassette stérile dédiée [68Ga]Ga.
  2. Assembler la cassette en suivant les étapes ci-dessous :
    1. Déballer l’enveloppe de la cassette, vérifier qu’il n’y a aucun dommage et resserrer chaque raccord Luer. Tourner et aligner chaque robinet sur la cassette pour s’assurer qu’ils ne sont pas bloqués et qu’ils s’adapteront sur le module. Retirer tous les bouchons d’aiguille.
    2. Conditionner la cartouche SPE de prépurification par échange cationique fort comme suit :
      1. Retirer la cartouche située sur le robinet 7 du manifolder 3 (M3) de la cassette.
      2. Placer une bouteille de rebut en verre ouverte et dédiée sur le plan de travail.
      3. Fixer la seringue contenant 2 mL de HCl 3 M (fournie dans le kit de réactifs) sur la cartouche SPE et éluer lentement la cartouche SPE goutte à goutte dans la bouteille de rebut en verre. Retirer la seringue, aspirer 5 mL d’air, puis rincer la SPE avec 5 mL d’air.
        ATTENTION : L’étape 3.2.2.3 implique la manipulation d’un acide fort (acide chlorhydrique 3 M). Porter des équipements de protection appropriés (gants, lunettes de sécurité, blouse de laboratoire).
      4. Fixer la seringue contenant 5 mL d’eau (provenant du kit de réactifs) sur la SPE et éluer lentement la SPE goutte à goutte dans la bouteille de rebut en verre. Retirer la seringue, aspirer 5 mL d’air, puis rincer la SPE avec 5 mL d’air.
      5. Replacer la SPE sur le manifolder à la position M3, robinet 7.
    3. Appuyer sur SUIVANT sur l’interface utilisateur.
    4. Assembler et installer la nouvelle cassette comme indiqué sur l’interface utilisateur (voir Figure 1A,B en cas d’élution double), sans aucun réactif, en suivant les connexions décrites dans Figure 1C
      1. Connecter la seringue de 10 mL (provenant du kit d’accessoires) au robinet 6 du M2.
      2. Installer les quatre manifolders et verrouiller la cassette à l’aide des verrous magnétiques du synthétiseur.
      3. Placer le réacteur dans le four.
      4. Connecter les tubulures aux ports G1, W2, W1, R et G2.
      5. Connecter la tubulure du côté droit du robinet 3 du M1 à la cartouche d’échange cationique située sur le robinet 7 du M3.
      6. Installer une cartouche SPE de postpurification sur le robinet 4 du M2.
        REMARQUE : Une photo du montage final pour la synthèse est présentée dans la figure supplémentaire S1C (Fichier supplémentaire 1).
  3. Appuyer sur SUIVANT sur l’interface utilisateur pour lancer les tests suivants dans l’ordre indiqué ci-dessous :
    1. Test de pression de la connexion du gaz inerte vers M4.
    2. Test de pression de la connexion entre M3 et M4.
    3. Test de pression du réacteur.
    4. Test de pression de la connexion de rebut vers M3.
    5. Test de pression de la cartouche SPE de postpurification entre M3 et M2.
    6. Test de pression de la connexion de la seringue sur le robinet 6 du M2.
    7. Test de pression de la connexion de rebut vers M2.
    8. Test de pression de la connexion du gaz inerte vers M1.
    9. Test de pression de la cartouche SPE de prépurification entre M1 et M3.
    10. Rinçage des aiguilles des robinets 10, 11 et 12 avec du gaz inerte.
    11. Rinçage de M3 et M4 avec du gaz inerte.
    12. Rinçage des cartouches SPE de prépurification et de postpurification avec du gaz inerte.

4. Installation des réactifs, de la ou des lignes du générateur et du flacon du produit final (voir Figure 1A, C et Figure 1B, C si utilisation d'une élution avec deux générateurs)

  1. Prélevez les flacons d'éthanol (100 %), de solution saline et d'eau pour préparations injectables dans le coffret de réactifs ; retirez les bouchons ; et passez une lingette imprégnée d'alcool sur chaque septum.
  2. Installez les flacons sur le coffret aux positions M4 valve 10, M4 valve 11 et M4 valve 12 lorsque le synthétiseur y invite ; cliquez sur SUIVANT dans l'interface utilisateur.
  3. Retirez l'aiguille de la seringue A et tirez le piston jusqu'à 5 mL.
  4. Déconnectez la tubulure du port central du réacteur et transférez le contenu de la seringue A dans le flacon du réacteur via le port central du réacteur.
  5. Reconnectez la tubulure au port central du réacteur ; cliquez sur SUIVANT dans l'interface utilisateur.
  6. Installez la ou les tubulures de sortie du générateur sur la cassette à la position M1 valve 2 (et M1 valve 1 en cas d'élution à double générateur) ; cliquez sur SUIVANT dans l'interface utilisateur.
  7. Retirez l'aiguille de distribution de la seringue C et installez-la à la position M1 valve 3 ; cliquez sur SUIVANT dans l'interface utilisateur.
  8. Retirez l'aiguille de distribution de la seringue B, connectez le raccord à vis de la seringue B sur l'adaptateur de la tubulure d'entrée du générateur, puis poussez la seringue B de manière à ce que la butée du piston s'insère dans la fente du moteur de seringue ; cliquez sur SUIVANT dans l'interface utilisateur.
  9. Préparez le flacon du produit final dans une hotte de sécurité biologique de classe II ou équivalente, en suivant les étapes ci-dessous :
    1. Placez un flacon stérile de 25 mL étiqueté dans un pot en tungstène (ou un pot convenablement blindé).
    2. Nettoyez le septum du flacon avec une lingette imprégnée d'alcool, placez un couvercle sur le pot, puis insérez une aiguille de ventilation filtrée.
    3. Connectez la sortie d'un filtre ventilé stérilisant de 0,22 µm en polyvinylidène difluorure (PVDF) à faible liaison aux protéines à une aiguille hypodermique stérile de 20 G. Étiquetez le filtre avec le numéro de lot du produit.
    4. Insérez l'aiguille dans le flacon ventilé de 25 mL contenant le produit final.
    5. Aspirez le contenu du flacon C (Tableau 1) dans la seringue D vide (voir étape 2.7) et ajoutez 4 mL d'air.
    6. Connectez la seringue D à l'entrée du filtre ventilé de 0,22 µm. Poussez le contenu de la seringue à travers le filtre de 0,22 µm et l'aiguille dans le flacon du produit final.
    7. Rincez le filtre 2 fois avec 5 mL d'air. Retirez la seringue du filtre ventilé de 0,22 µm.
      NOTE : Les rinçages doivent être effectués lentement afin d'éviter de percer la membrane du filtre.
  10. Transférez le pot contenant le flacon du produit final dans la cellule chaude, connectez la tubulure d'extrémité provenant de la position M2 valve 5 au filtre du flacon de produit, puis cliquez sur SUIVANT dans l'interface utilisateur.

5. Étapes préliminaires du synthétiseur avant le marquage radioactif

  1. Attendre que le synthétiseur effectue les étapes préliminaires suivantes : pressurisation du flacon d'éthanol (M4, valve 10) ; pressurisation du flacon de solution saline (M4, valve 11) ; pressurisation du flacon d'eau (M4, valve 12) ; pressurisation de la seringue de chlorure de sodium acidifié (M1, valve 3) ; conditionnement de la cartouche SPE postpurification avec de l'éthanol ; conditionnement de la SPE postpurification avec de l'eau ; repressurisation du flacon d'eau (M4, valve 12).
  2. Appuyer sur SUIVANT sur l'interface utilisateur pour démarrer la production lorsque le synthétiseur indique Prêt à éluer le générateur de 68Ga.

6. Radiomarquage automatisé pour produire du [68Ga]Ga-FAPI-46

REMARQUE : La synthèse automatisée est initiée en effectuant l'étape 5.2. Figure 1D décrit la réaction de radiomarquage pour produire le [68Ga]Ga-FAPI-46. Une image représentative de l'interface du synthétiseur et un profil typique d'activité radioactive sont présentés respectivement dans Figure 1A,B et Figure 2. Pour une production utilisant l'élution de deux générateurs, le synthétiseur invite l'utilisateur à retirer la seringue B vide après l'élution du premier générateur, puis à installer une autre seringue contenant 5 mL de HCl 0,1 M sur le moteur de seringue pour l'élution du second générateur.

  1. À la fin de la synthèse (EOS), recherchez le message synthesis complete affiché par le synthétiseur. Retirez le filtre stérilisant ventilé de 0,22 µm et l'aiguille de ventilation filtrée du flacon contenant le produit final, puis récupérez le creuset en tungstène de la cellule chaude.

Tableau 1 : Préparation des réactifs pour la production de [68Ga]Ga-FAPI-46. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Schéma du radiomarquage avec dispositif à collecteur et processus de réaction ; inclut les étapes de chromatographie.
Figure 1 : Schéma de l'interface utilisateur du synthétiseur ; configuration de la cassette et des réactifs pour la radiosynthèse automatisée de [68Ga]Ga-FAPI-46. (A) Configuration de production à générateur unique. (B) Configuration de production à double générateur. (C) Positions des réactifs pour la production automatisée de [68Ga]Ga-FAPI-46 à l'aide du synthétiseur radioactif MS. (D) Schéma de radiomarquage de [68Ga]Ga-FAPI-46. Abréviations : FAPI = inhibiteur de la protéine d'activation des fibroblastes ; Mn = collecteur n ; Wn = sortie des déchets n ; Vn = vanne n ; R = réacteur sous vide ; Gn = entrée de gaz n. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Schéma du processus de radiomarquage : élution de [68Ga]Ga3+, piégeage sur SPE, analyse de l'activité radioactive en fonction du temps.
Figure 2 : Profil typique d'activité radioactive sur le synthétiseur pour la synthèse automatisée de [68Ga]Ga-FAPI-46. Abréviations : FAPI = inhibiteur de la protéine d'activation des fibroblastes ; SPE = extraction en phase solide. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

7. Distribution de [68Ga]Ga-FAPI-46 pour le contrôle qualité et l'expédition

  1. Transférez le flacon du produit vers un système de distribution convenablement blindé et retournez le flacon afin d'homogénéiser le produit.
  2. En utilisant des techniques aseptiques et des techniques de protection contre les rayonnements, prélevez un échantillon de 1 mL à partir du flacon de produit et :
    1. Prélevez 150 µL dans un tube de 1,5 mL à faible liaison aux protéines (tube 1) pour les tests de contrôle qualité préalables à la libération et l'analyse des solvants résiduels.
    2. Prélevez 50 µL dans un tube de 1,5 mL à faible liaison aux protéines (tube 2) pour le test de pyrogènes.
    3. Prélevez 300 µL dans un flacon stérile en verre vide de 10 mL pour le test de stérilité (envoyez à un prestataire externe après que l'échantillon ait décru à un niveau acceptable [10 demi-vies]).
    4. Prélevez 500 µL dans un flacon stérile en verre vide de 10 mL pour la conservation.
    5. Prélevez le produit restant dans un flacon (~10 mL) destiné aux doses pour patients.

8. Contrôle de qualité de [68Ga]Ga-FAPI-46

REMARQUE : Les tests de contrôle qualité décrits ci-dessous ont été réalisés conformément aux procédures décrites dans la Pharmacopée européenne40.

  1. Évaluer l'aspect par inspection visuelle.
  2. Évaluer le pH à l'aide d'un papier indicateur.
  3. Déterminer la demi-vie du radionucléide en effectuant trois mesures d'activité sur un échantillon de 50 µL, à l'aide d'une chambre d'ionisation.
  4. Évaluer l'identité radionucléidique et la pureté radionucléidique à l'aide d'un spectromètre gamma NaI(Tl) basé sur un analyseur multicanaux (AMC).
  5. Évaluer l'identité radiochimique par radio-HPLC analytique en vérifiant que les temps de rétention de l'échantillon de [68Ga]Ga-FAPI-46 et d'un étalon de référence non radioactif [natGa]Ga-FAPI-46 sont similaires (en tenant compte d'un petit volume de retard entre les détecteurs de radioactivité et UV).
  6. Quantifier la pureté radiochimique en % par radio-HPLC analytique en utilisant l'équation (1).
    Calcul de la pureté radiochimique ; équation ; AUC des pics radioactifs sur le chromatogramme du détecteur de radioactivité. 
  7. Quantifier la pureté radiochimique en % par radio-CMT analytique en utilisant l'équation (2).
    Formule de pureté radiochimique ; méthode chromatographique ; AUC du pic de [68Ga]Ga-FAPI-46 ; front du solvant. 
    REMARQUE : Les étapes 8.8, 8.9 et 8.10 peuvent être réalisées avant ou après la libération, selon les exigences réglementaires locales. Les étapes 8.11 et 8.12 peuvent être effectuées après la libération. Toute analyse postérieure à la libération doit être réalisée dès que possible après la décroissance radioactive de l'échantillon.
  8. Quantifier la teneur en solvant résiduel (éthanol) de la formulation par chromatographie en phase gazeuse.
  9. Évaluer les niveaux d'endotoxines bactériennes à l'aide d'un système de test d'endotoxines basé sur des cartouches (méthode cinétique chromogène du lysat d'amébocyte de Limulus [LAL]).
  10. Évaluer l'intégrité du filtre de 0,22 µm en effectuant un test de bulles.
  11. Évaluer la pureté radionucléidique (présence de germanium-68) à l'aide d'un spectromètre gamma ou d'un compteur gamma. Conserver la solution à examiner pendant au moins 48 h afin de permettre la décroissance du gallium-68 à un niveau permettant la détection des impuretés.
  12. Évaluer la stérilité du produit.

9. Essais de stabilité

  1. Pour l'analyse de stabilité, prélever 50 µL de [68Ga]Ga-FAPI-46 du flacon du produit final immédiatement après la fin de synthèse (EOS), puis à nouveau toutes les heures jusqu'à 3 h après la EOS.
  2. Quantifier le pourcentage de pureté radiochimique par HPLC radiométrique à chaque point temporel.
  3. Quantifier le pourcentage de pureté radiochimique par TLC radiométrique à chaque point temporel.

Résultats

Le rendement de radiomarquage évalué entre 5 et 20 min de réaction à 95 °C est indiqué dans le Tableau 2. Les cartouches SPE après purification HLB 30 mg, Strata X 60 mg et Sep-Pak C18 Plus Short 360 mg ont montré des rendements très similaires (94,3 ± 0,5 % corrigé pour la décroissance [DC]) (Tableau 3). Selon nos résultats, le rendement obtenu avec la cartouche HLB 225 mg était nettement plus faible (63,8 ± 3,5 % DC).

Tableau 2 : Résumé de la conversion radiochimique de la réaction brute mesurée par chromatographie sur couche mince (CCM) après 5, 10, 15 et 20 minutes de durée de réaction (n = 3). Abréviations : CCM = chromatographie sur couche mince ; Exp. = expérience. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Résumé des analyses du pourcentage de récupération et de la pureté radiochimique par CCM et HPLC de [68Ga]Ga-FAPI-46 à la fin de la synthèse, à l’aide de quatre cartouches différentes d’extraction en phase solide (n = 3). Abréviations : SPE = extraction en phase solide ; FAPI = inhibiteur de la protéine d’activation des fibroblastes ; EOS = fin de la synthèse ; RSD = écart type relatif ; CCM = chromatographie sur couche mince ; HPLC = chromatographie liquide à haute performance. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Le protocole automatisé pour la production de [68Ga]Ga-FAPI-46 a été élaboré en utilisant un temps de réaction de 10 minutes et une cartouche SPE Strata X de 60 mg. Deux séries de trois lots de validation ont été réalisées à partir d'une élution simple et d'une élution double du générateur, fournissant respectivement des activités moyennes du produit final de 0,60 GBq et de 1,6 GBq (Tableau 4). Dans les deux séries, la concentration finale [68Le produit Ga]Ga-FAPI-46 a satisfait à tous les tests de contrôle qualité (Tableau 4). La stabilité du [68Le produit [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-46 a été évalué en déterminant la pureté radiochimique du produit par analyse TLC et HPLC (Figure 3 et Figure 4) pour l'ensemble des six productions pendant jusqu'à 3 h après la synthèse, et était supérieure à 98,0 ± 1,8 % (n = 3) et 99,1 ± 0,9 % (n = 3), respectivement. Dans l'ensemble, la synthèse de [68Ga]Ga-FAPI-46 a été validé avec un rendement corrigé à la décroissance de 89,8 ± 4,8 % (n = 6). La production automatisée est actuellement utilisée pour la synthèse de [68Ga]Ga-FAPI-46 pour soutenir les essais cliniques.

Tableau 4 : Résumé des résultats du contrôle qualité pour les essais de validation de [68Ga]Ga-FAPI-46 (n = 6) : à faible activité à partir d'une seule élution de générateur (n = 3) et à forte activité à partir d'une double élution de générateur (n = 3). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Graphique de la radioactivité en fonction de la distance pour les composés de \[^{68}\text{Ga}\] ; résultats de la séparation chromatographique.
Figure 3 : Chromatogramme de CCM de [68Ga]Ga-FAPI-46 : (Application de 5 µL) à la fin de la synthèse (EOS) sur papier iTLC-SG, avec un éluant constitué d'acétate d'ammonium 1 M/méthanol (1:1, v/v). La radioactivité a été mesurée à l'aide d'un scanner radio-CCM équipé d'un détecteur radio PS Plastic, en intégrant tous les 1 mm à une vitesse de 1 mm/s. Abréviations : CCM = chromatographie sur couche mince ; FAPI = inhibiteur de la protéine d'activation des fibroblastes ; EOS = fin de synthèse ; iTLC-SG = CCM instantanée sur gel de silice. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Graphique de chromatographie ; détection UV et radiodétection de Ga-FAPI-46 ; intensité du pic en fonction du temps.
Figure 4 : Analyse par HPLC du produit final [68Ga]Ga-FAPI-46. Colonne en phase inverse RP-18, phase mobile A : acide trifluoroacétique à 0,1 %, phase mobile B : acétonitrile pur. Gradient : 0-0,5 min 2 % B, 0,5-10,0 min 2 %-35 % B, 10,0-12,0 min 35 % B, et 12,0-15,0 min 35 % B. La longueur d'onde UV était de 280 nm et le débit de 2 mL/min. (A) Chromatogramme UV du produit [68Ga]Ga-FAPI-46, incluant le signal UV de l'ascorbate de sodium à 1,0 min et les deux petits pics à 4,5 et 4,8 min correspondant respectivement à [natGa]Ga-FAPI-46 et au précurseur FAPI-46. Les chromatogrammes UV des étalons à 10 mg/L de [natGa]Ga-FAPI-46 et de précurseur FAPI-46 à 10 mg/L sont présentés dans la figure supplémentaire S2 (Fichier supplémentaire 1). (B) Radiochromatogramme de [68Ga]Ga-FAPI-46 (Rt [68Ga]Ga-FAPI-46 = 4,6 min - Rt du [68Ga]Ga3+ libre = 1,1 min). Abréviations : HPLC = chromatographie liquide à haute performance ; FAPI = inhibiteur de la protéine d'activation des fibroblastes ; Na+Asc- = ascorbate de sodium. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Ce document comprend : Tableau supplémentaire S1 - Synthèses automatisées rapportées et détails du contrôle qualité pour le [68Ga]Ga-FAPI-46, Section supplémentaire 1 - Expériences préliminaires : Optimisation du temps de réaction et sélection de la cartouche SPE post-purification pour la production automatisée du [68Ga]Ga-FAPI-46 sur le synthétiseur radioactif MS, Figure supplémentaire S1 - Images des réactifs et configuration finale pour la synthèse automatisée du [68Ga]Ga-FAPI-46 sur le synthétiseur MS, Figure supplémentaire S2 - Chromatogrammes UV du [natGa]Ga-FAPI-46 et du précurseur FAPI-46, et Figure supplémentaire S3 - Chromatogramme radioactif du [68Ga]Ga-FAPI-46 pour un marquage radiométallique à haute activité (2,8 GBq) sans acide ascorbique dans le réacteur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce travail décrit la production fiable et à haut rendement de [68Ga]Ga-FAPI-46 sur le synthétiseur MS pour des applications cliniques. L’élaboration préliminaire de ce protocole a testé, dans la même série d’expériences, différents temps de réaction pour la synthèse de [68Ga]Ga-FAPI-46 ainsi que quatre cartouches SPE différentes pour la purification du produit final. Afin (i) de réduire la dose de rayonnement reçue par l’opérateur et (ii) de recréer les conditions dans lesquelles la production habituelle de [68Ga]Ga-FAPI-46 allait être développée, ces expériences préliminaires ont également été menées à l’aide du synthétiseur MS lorsque cela était possible. Une séquence [68Ga]Ga-FAPI-46 a été créée à l’aide de paramètres similaires utilisés pour la production de [68Ga]Ga-PSMA-11 et [68Ga]Ga-DOTA-TATE. La séquence est basée sur une simple programmation par étapes dans une feuille de calcul Excel et peut être facilement modifiée. Les kits et les réactifs ont été assemblés pour la première partie de la synthèse du [68Ga]Ga-FAPI-46 uniquement (élution et purification du 68Ga ; réaction de marquage), en omettant les étapes finales (purification SPE et filtration stérile finale) car ces expériences préliminaires ont été effectuées manuellement sur la matière brute. Par conséquent, il n’a pas été nécessaire d’installer la cartouche SPE post-purification (Strata X 60 mg) ainsi que les flacons d’éthanol, d’eau et de sérum physiologique du collecteur 4 et du flacon du produit final.

La littérature publiée sur la production de [68Ga]Ga-FAPI-46 décrit la purification du produit final à l’aide de différentes cartouches SPE : OASIS HLB 30 mg sorbant23,29, OASIS HLB Plus 225 mg28, CM26,34, C18 Plus Sep-Pak30,32 et Sep-Pak Light C1831. Ce travail compare trois des différentes cartouches SPE utilisées dans la littérature (HLB 30 mg ; C18 SepPak Plus Short, et HLB 225 mg) avec le Strata X 60 mg qui est fourni avec nos cassettes existantes pour la purification de [68Ga]Ga-PSMA-11 et [68Ga]Ga-DOTA-TATE. À notre connaissance, la cartouche SPE de 60 mg de Strata X n’avait pas encore été évaluée pour la purification du [68Ga]Ga-FAPI-46. Les strates X 60 mg ont montré des résultats similaires (HLB 30 mg ; C18 SepPak Plus Short) ou supérieure (HLB 225 mg) à celle des autres SPE utilisés dans la littérature pour la purification du [68Ga]Ga-FAPI-46, en ce qui concerne l’efficacité de piégeage et d’élution (tableau 3). L’élution du HLB 225 mg avec un millilitre supplémentaire d’éthanol n’a pas entraîné d’amélioration significative (résultats non présentés). La cartouche Strata X 60 mg a été sélectionnée pour la validation de la synthèse entièrement automatisée décrite dans ce protocole.

La synthèse automatisée de [68Ga]Ga-FAPI-46 décrite dans le protocole ci-dessus peut être décrite en quatre étapes principales. La première étape est l’élution d’un ou deux générateurs 68Ge/68Ga avec 0,1 M HCl et le piégeage ultérieur de [68Ga]GaCl3 sur la cartouche échangeuse d’ions. S’ensuit l’élution de [68Ga]Ga3+ de la cartouche échangeuse d’ions dans le récipient de réaction (préchargé avec la solution de précurseur contenant 50 μg de précurseur de FAPI-46, 1,4 mL d’eau contenant des traces de métal et 7 mg d’acide ascorbique) à l’aide d’une solution de chlorure de sodium 5 M acidifiée. Le pH de la réaction de marquage est de 3,5-4. L’étape suivante est la réaction de radiomarquage au cours de laquelle le réacteur est chauffé à 95 °C pendant 10 min pour permettre la complexation du [68Ga]Ga3+ par la fraction DOTA du précurseur FAPI-46. Après refroidissement du mélange réactionnel à 40 °C, la quatrième et dernière étape est la purification du [68Ga]Ga-FAPI-46 consistant en (i) le piégeage et la purification du mélange réactionnel sur la cartouche SPE Strata X 60 mg post-purification, (ii) le rinçage de la cartouche SPE Strata X 60 mg avec de l’eau pour injection, (iii) élution du produit final avec de l’éthanol, (iv) dilution avec une solution saline pour injection, et (v) transfert dans le flacon de produit final à travers un filtre à air pulsé stérilisant de 0,22 μm. La réaction peut être surveillée en temps réel par une inspection visuelle et des lectures de capteurs (par exemple, la température, la pression, le vide, la lecture des radiations et les comptes à rebours). Une capture d’écran représentative de l’interface utilisateur est illustrée à la figure 1A,B. Le profil de radioactivité illustré à la figure 2 est particulièrement utile pour suivre la progression de la synthèse en affichant le transfert de la radioactivité à travers les étapes critiques décrites ci-dessus.

Six cycles de validation répondant à toutes les spécifications de contrôle qualité ont été effectués, à l’aide d’un ou de deux générateurs 68Ge/68Ga (2,41 GBq). Trois essais ont été effectués en utilisant 68Ga à partir d’une élution d’un seul générateur, ce qui a donné 0,59-0,63 GBq de [68Ga]Ga-FAPI-46. Trois essais ont été effectués en utilisant 68Ga élués par deux générateurs, ce qui a donné 1,54-1,71 GBq de [68Ga]Ga-FAPI-46. Chaque passage a été réalisé en ~25 min. La méthode du générateur unique a été conçue en anticipant la nécessité de produire des activités plus élevées à l’avenir. Par conséquent, 7 mg de stabilisant d’acide ascorbique ont été ajoutés au mélange réactionnel pour éviter la radiolyse pendant l’étape de radiomarquage, comme décrit précédemment par Mu et al. pour la production de [68Ga]Ga-DOTA-TATE41. Da Pieve et al.29 et Alfteimi et al.30 ont également signalé l’ajout de 0,3 mg de stabilisant d’acide ascorbique au mélange réactionnel pour la production automatisée de [68Ga]Ga-FAPI-46 (tableau supplémentaire S1-fichier supplémentaire 1). En effet, nous avons observé une radiolyse significative pour une synthèse à haute activité (~2,8 GBq dans le réacteur) lorsque le stabilisant d’acide ascorbique était omis du mélange réactionnel (Figure supplémentaire S3-Fichier supplémentaire 1). De plus, pour éviter la radiolyse du produit final, 5 mg d’ascorbate de sodium dans 1 mL de solution saline injectable à 0,9 % ont été ajoutés manuellement à la fiole de produit final à travers le filtre stérilisant, ce qui a donné un volume de produit final de 11 mL. Chaque lot a été testé jusqu’à 3 h après la production et les productions de faible activité (élution à générateur unique) et de haute activité (élution à double générateur) ont démontré une excellente stabilité radiochimique (>95 % par HPLC et TLC). Il est important de souligner que la mise en œuvre de ce protocole implique la manipulation de matières radioactives non scellées et ne devrait être entreprise que par du personnel dûment formé. Le protocole doit être exécuté derrière un blindage contre les rayonnements, de préférence à l’intérieur d’une cellule chaude ventilée. L’objectif attendu de la synthèse de [68Ga]Ga-FAPI-46 à l’aide de ce protocole est l’administration aux patients pour l’imagerie diagnostique. En tant que tel, des techniques d’asepsie strictes doivent être suivies tout au long du processus. Les essais de contrôle de la qualité du [68Ga]Ga-FAPI-46, tels que décrits dans le protocole ci-dessus, sont essentiels pour garantir la qualité du produit final.

Il est prévu que tout site fabriquant du [68Ga]Ga-PSMA-11 ou du [68Ga]Ga-DOTA-TATE sur le synthétiseur MS devrait être entièrement équipé pour préparer le [68Ga]Ga-FAPI-46 en utilisant le protocole décrit ici, avec seulement des modifications mineures requises pour l’utilisation de générateurs ou de réactifs alternatifs. En raison de la demande croissante de [68Ga]Ga-FAPI-46 dans les cliniques, le travail présenté ici a été conçu pour répondre aux divers besoins et capacités du site, de la production de 1 à 2 doses de [68Ga]Ga-FAPI-46 par synthèse sur la méthode à générateur unique et jusqu’à 4 à 5 patients par synthèse pour la méthode à double générateur, en fonction de la disponibilité des caméras TEP.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun partenariat commercial ou source de financement qui entraînerait un conflit d’intérêts réel ou perçu lié à ce travail à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient SOFIE Biosciences Inc. pour la fourniture du précurseur chimique FAPI-46 et de la norme [natGa]Ga-FAPI-46, la Fondation Charlies pour la recherche pour son soutien financier, Stan Poniger d’iPHASE Pty Ltd et l’équipe de production de produits radiopharmaceutiques (RAPID) du Département de technologie médicale et de physique de l’hôpital Sir Charles Gairdner pour leur soutien scientifique et technique. Les auteurs remercient également l’aide du WA National Imaging Facility Node, qui est soutenu par un financement d’infrastructure du gouvernement de l’État d’Australie-Occidentale en partenariat avec le gouvernement fédéral australien, par le biais de la capacité National Collaborative Research Infrastructure Strategy (NCRIS).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,1 M Acide chlorhydrique (HCl)composé biochimique avancé ABX ultra pur (Radberg, Allemagne)HCl-103-GUtilisé pour l’élution du ou des générateurs
Acétate d’ammoniumSigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australie)A1542-250GUtilisé pour fabriquer iTLC phase mobile
C18 SepPak Plus court (360 mg)EauxWAT020515Silice post-purification SPE
Chromolith Performance RP-18 embouti 100-4.6 monolithiqueMerck Pty Ltd (Victoria (Australie 1021290001Colonne HPLC RP-18 emboutie, utilisée pour le contrôle qualité HPLC
Calibrateur de doseCapintecCRC-15PETUtilisé pour calibrer et mesurer l’activité 68Ga
Double balayage-RAM  ;LabLogic Limited (VA, États-Unis)Scanner Radio-TLC SR-1Apour l’analyse du papier iTLC
Précurseur FAPI-46 (GMP)Composé biochimique avancé ABX (Radberg, Allemagne)3601.0000.050Précurseur peptidique
Facilité de remplissage Flacon sous vide stérile (10 mL)Iosotopes HUAYISVV-10CUtilisé pour les échantillons de stérilité et de rétention
Facilité de remplissage Flacon sous vide stérile (25 mL)IosotopesHUAYISVV-25AUtilisé pour le radiomarquage du
peptide Ga68 du produit final avec pré-purification du générateuriPHASE Technologies (Melbourne, Australie)MSR-120G-(RK-3296)Ensemble de réactifs  ;
Radiomarquage Ga68 avec prépurification du générateuriPHASE Technologies (Melbourne, Australie)MSH-120Hardware Cassette + accessoires set  ;
Système de chromatographie en phase gazeuse (GC)Agilent technologies (Vic, Australie)G2630AUtilisé pour mesurer le solvant résiduel
Source étalon GS (Ba133)Global Medical Solutions Pty Ltd (Australie)D-102-19Utilisé pour étalonner le Spectomètre Gamma
Source standard GS (Co60)Global Medical Solutions Pty Ltd (Australie)1559-84Utilisé pour étalonner le Spectomètre Gamma
Système de chromatographie liquide à haute performance (HPLC)Shimadzu Scientific Instruments (NSW, Australie)LC-20Équipement HPLC
Aiguille de purge d’air hydrophobeBaldwin Medical (Victoria, australie)1088Utilisé avec le flacon de produit final
  ; IGG100  ;Eckert & Produits isotopiques Ziegler  ; (Berlin, Allemagne)IGG100-65M-NTgénérateur 68Ge/68Ga
(seringue Injekt luer lock solo)B Braun (Melsungen, Allemagne)4606710VSeringues en polypropylène (PP)/polyéthylène (PE), sans latex, PVC et sans huile de silicone Seringue utilisée pour les réactifs
Papier iTLC-SGTechnologies Agilent (Vic, Australie)SGI0001Utilisée pour l’analyse iTLC
Logiciel LabLogic (LAURA)LabLogic Limited (VA, États-Unis)Logiciel LAURA version 6.1Utilisé pour l’analyse radio-CCM
Acide L-ascorbique Trace selectFluka Sigma05878-100GUtilisé comme piégeur de radicaux dans le mélange réactionnel
Lichrosolv Acetonitrile (ACN)Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australie)1.00030.2500Utilisé pour fabriquer HPLC phase mobile organique
Lichrosolv WaterSigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australie)1.15333.2500Utilisé pour fabriquer du méthanol aqueux en phase mobile HPLC
(MeOH)Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australie)1060182500Utilisé pour fabriquer iTLC phase mobile
Na+I- DétecteurLabLogic Limited (VA, USA)Radiodétecteur 1"NaI / PMTutilisé pour la radio-HPLC
Oasis HLB (30 mg)Waters (Milford, MA, États-Unis)WAT094225Copolymère de post-purification SPE
Oasis HLB Plus court (225 mg)Waters (Milford, MA, États-Unis)186000132Copolymère de postpurification SPE
bandelettes de pHThermo Fisher Scientific Australia Tty Ltd90424Utilisé pour mesurer le pH du produit
Détecteur PSLabLogic Limited (VA, États-Unis)en plastiquePS/PMTutilisé pour la radio-TLC
  ; Tube Safe Lock (1,5 mL)Eppendorf0030 120.086Utilisé pour le contrôle qualité des échantillons
(+)-L-ascorbate de sodiumMerck Pty Ltd (Victoria (Australie)11140-250GStabilisant du produit final
Solution de chlorure de sodium (NaCl) (solution saline)PfizerPS1110,9 %, pour injection, grade USP
Sterican 100 AiguillesB Braun (Melsungen, Allemagne)4667093Utilisé pour produit final
Filtre de seringue stérile (0,22 & micro ; m)Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)SLGSV255FMillex-GV
Strata SCX (dans le kit de cassette de quincaillerie)Kit de quincaillerie d’intérieur Phenomenex de iPHASE Technologies (Melbourne, Australie)MSH-120Silice de prépurification SPE à l’intérieur de la cassette de quincaillerie
Strata X (dans le kit de cassette de quincaillerie)Kit de quincaillerie d’intérieur Phenomenex de iPHASE Technologies (Melbourne, Australie)MSH-120Post-purification silice SPE à l’intérieur Cassette matérielle
Trace Sélectionner l’eau pour l’analyse des tracesHoneywell Riedel-de-Haen95305-2.5LUtilisé pour le mélange réactionnel et pour préconditionner la cartouche SPE de prépurification
Acide trifluoracétique (TFA)Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australie)302031-10X1mLUtilisé pour fabriquer HPLC aqueux en phase mobile
Seringue à insuline ultra fine (0,5 mL)BD326769Utilisé pour la distribution d’échantillons de contrôle qualité
Filtre ventilé Cathivex-GV 0.22 µ ; m, membrane PVDF Durapore à faible liaison protéiqueMerk Millipore (Cork, Irlande)SLGV02505Utilisé pour filtrer le produit final
Seringue de 5 mL Radiodétecteur

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