Article de méthode

Optimisation de la méthode d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne Longa pour une reperfusion complète

DOI :

10.3791/66720

⸱

22 novembre 2024

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1Department of Histology and Embryology, University of Zagreb School of Medicine, 2Croatian institute for brain research, University of Zagreb School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole présente un guide étape par étape pour les chercheurs afin d’effectuer la procédure d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne sur des souris en utilisant la méthode modifiée de l’artère carotide externe Longa. Les modifications présentées dans cet article visent à augmenter la précision de l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne et à assurer une reperfusion complète.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne sert de modèle animal principal pour l’étude de l’AVC ischémique. Bien qu’il soit utilisé dans la recherche depuis plus de trois décennies, sa standardisation reste insuffisante. Principalement menée sur des rats et des souris, la procédure pose des défis en raison de la nature plus petite et plus fragile des souris. Contrairement à la méthode de l’artère carotide commune de Koizumi, l’artère carotide externe Longa est le seul modèle de course par filament intraluminal assurant une reperfusion complète post-ischémie. Cet aspect revêt une importance cruciale pour les études portant sur les phénomènes de reperfusion. Les modifications chirurgicales démontrées dans cet article assurent un flux sanguin continu de l’artère carotide commune tout au long de la phase ischémique et après le début de la reperfusion. Le but de ces modifications est d’occlure sélectivement l’artère cérébrale moyenne en maintenant la perfusion ininterrompue dans les branches proximales de l’artère cérébrale moyenne pendant la période d’ischémie. De plus, l’apparition de la reperfusion est soudaine et peut être contrôlée avec précision, ce qui permet de modéliser plus précisément la thrombectomie endovasculaire en médecine humaine. En présentant cet article vidéo complet, nous avons pour objectif de faciliter la formation des nouveaux chirurgiens et de promouvoir la standardisation des procédures chirurgicales au sein de la communauté scientifique.

Introduction

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L’AVC se classe au deuxième rang des causes de décès et au troisième rang des causes de décès et d’invalidité combinées1. Selon sa cause, l’AVC peut être ischémique ou hémorragique, l’AVC ischémique étant nettement plus répandu dans la pratique clinique. L’accident vasculaire cérébral ischémique résulte d’un blocage dans une artère fournissant du sang au tissu cérébral, entraînant une ischémie, la mort cellulaire et une inflammation. Depuis l’avènement des thérapies de reperfusion telles que la thrombolyse et la thrombectomie mécanique, de grands progrès ont été réalisés dans le traitement de l’AVC. Cependant, toutes les thérapies de reperfusion comportent le risque d’exacerber l’état du patient en provoquant ce que l’on appelle communément une lésion de reperfusion2. Le mécanisme exact des lésions de reperfusion reste incertain, et il appartient aux études précliniques d’identifier les causes potentielles et les mesures préventives. À cette fin, il devient crucial de développer un modèle animal pertinent pour les lésions de reperfusion qui suivent un AVC ischémique.

L’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) est le modèle animal le plus couramment utilisé pour étudier l’AVC ischémique. Il est principalement pratiqué chez les rongeurs et présente de nombreuses variantes différentes décrites dans la littérature scientifique jusqu’à présent 3,4. Les deux principaux types, Koizumi et Longa, connus sous le nom de variantes de l’artère carotide commune (ACC) et de l’artère carotide externe (ECA), diffèrent techniquement par le site d’artériotomie pour l’insertion du filament 5,6. Dans notre récent article, par le suivi in vivo de la perfusion vasculaire, nous avons montré que seule la méthode Longa peut être véritablement considérée comme un modèle d’ischémie/reperfusion cérébrale7. La procédure consiste à insérer le filament dans l’ECA, à le faire avancer à travers l’ICA et à le fixer au point de ramification de l’artère cérébrale moyenne (MCA) pour induire une ischémie du tissu cérébral. Après une période prédéterminée d’ischémie, le retrait du filament permet une reperfusion, simulant une ischémie cérébrale transitoire. Après le début de l’AVC, la principale variable de résultat utilisée dans la recherche est le plus souvent le volume de la lésion infarctus, qui peut être mesuré à l’aide de l’histologie ex vivo ou de scanners cérébraux in vivo. Les défis des modèles MCAO tournent autour de la faible reproductibilité attribuée aux variances inter-variantes, inter-opérateurs et inter-sujets, ces dernières posant une limitation significative dans la recherche préclinique sur l’AVC4.

De plus, les régions infarctus suite à l’AOCM chez les rongeurs sont massives par rapport à la taille du cerveau des rongeurs. De plus, les régions postérieures de l’hippocampe du cerveau sont souvent recrutées dans le volume de l’infarctus, bien que ces régions dépendent principalement du flux sanguin de l’artère cérébrale postérieure (ACP), et non de l’ACM8. Comme dans les méthodes de Koizumi et de Longa décrites dans la littérature, le CCA est maintenu ligaturé pendant la période d’ischémie en raison de la perméabilité incomplète du cercle de Willis chez la souris, conduisant à l’induction de l’ischémie dans une région beaucoup plus large que prévu 5,6,9. Même dans les méthodes où l’ACC est rouvert ou réparé après la période d’ischémie, les 30 à 60 minutes habituelles d’ischémie entraînent des lésions tissulaires irréversibles dans les régions non MCA10. De plus, contrairement aux attentes, des recherches antérieures ont montré que la longueur du revêtement de silicium d’un filament n’a pas d’impact sur la taille11 de la lésion. Cependant, le choix de la longueur du revêtement en silicium du filament n’a été abordé que dans les modèles avec CCA ligaturé pendant la période d’occlusion.

L’objectif de cette méthode était de modifier la méthode Longa MCAO chez la souris pour permettre un flux sanguin ininterrompu de l’ACC pendant la période d’ischémie, augmentant ainsi la sélectivité de la MCAO, tout en assurant une reperfusion complète de la région infarctus après la procédure. Ces modifications profiteraient grandement aux études longitudinales portant sur les lésions d’ischémie-reperfusion chez la souris en abaissant le taux de mortalité et en réduisant la variance entre les sujets.

Protocole

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Toutes les manipulations et procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique des licences de la Faculté de médecine de l’Université de Zagreb et le Comité d’éthique pour la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques du Ministère de l’agriculture de la République de Croatie. Les procédures expérimentales ont été menées conformément à la loi croate sur la protection des animaux (NN 102/17, 32/19), aux amendements à la loi sur la protection des animaux (NN 37/13) et aux lignes directrices sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (NN 55/13) qui sont conformes au Guide européen pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (directive 2010/63/UE).

1. Préparation de l’animal et du site chirurgical

  1. Placez l’animal dans une boîte knock-out et induisez l’anesthésie en utilisant 5% du volume d’isoflurane dans un mélange oxygène/azote (rapport 1:2).
  2. Après avoir inspecté visuellement l’état de conscience et la fréquence respiratoire de l’animal, amenez-le à une balance de laboratoire et pesez-le.
  3. Vérifiez le réflexe en pinçant la peau interdigitale d’un membre inférieur pour assurer une profondeur d’anesthésie appropriée.
  4. Positionnez l’animal sur la table d’opération chauffée et amenez son nez dans le masque d’anesthésie. Réglez la température initiale de la table d’opération à 36 °C et ajustez-la pour maintenir la température corporelle de l’animal à 37 °C (mesurée à l’aide d’une sonde rectale introduite dans les étapes ultérieures). Tout au long de toutes les étapes suivantes, ajustez la fraction volumique d’isoflurane pour maintenir la fréquence respiratoire de l’animal à 100 respirations/min.
    REMARQUE : Toutes les surfaces et matériaux en contact direct avec l’animal doivent être soigneusement désinfectés avant la procédure.
  5. Appliquez une pommade oculaire sur les yeux de l’animal pour les protéger de la déshydratation et du gaz isoflurane.
  6. Retournez l’animal sur le dos et étendez son cou en plaçant un petit oreiller fait de ruban chirurgical en dessous.
  7. Fixez les membres de l’animal en place à l’aide de ruban chirurgical. Veillez à ne pas trop étendre les membres antérieurs afin de ne pas provoquer de luxation de l’articulation de l’épaule par inadvertance.
  8. Lubrifiez la sonde rectale à l’aide de vaseline blanche et insérez-la dans le rectum pour une mesure continue de la température corporelle. Fixez la sonde en place avec la queue à l’aide de ruban chirurgical.
  9. Appliquez une injection préopératoire de solution saline et de buprénorphine (0,5 mg/kg) par voie intrapéritonéale pour maintenir l’animal bien hydraté et sous analgésie pendant l’intervention.
  10. Rasez la fourrure de l’animal dans la région du cou à l’aide d’une tondeuse à chat sans fil. Prélevez toute la fourrure rasée à l’aide de morceaux de ruban adhésif chirurgical. De plus, rasez la région avec un rasoir pour la rendre complètement exempte de fourrure.
  11. Choisissez un filament MCAO en fonction du poids et/ou de l’âge de l’animal mesuré. Sortez-le de son récipient et mettez-le dans une boîte de Pétri à un endroit visible. Mettez une goutte de solution saline sur la partie en silicone du filament pour le garder propre et sans poussière.
    REMARQUE : L’épaisseur du revêtement en silicone du filament doit être choisie selon les recommandations officielles du fabricant dans le cas d’une souris de 12 à 16 semaines. De plus, la longueur du revêtement en silicone doit être soigneusement planifiée à l’avance, en fonction de la taille de la zone d’irrigation à occlure (voir Discussion).
  12. Placez un champ chirurgical propre sur la table d’opération.
  13. Appliquez une goutte de bétadine sur la peau rasée de l’animal. À l’aide d’un coton-tige, frottez le désinfectant sur la peau de manière circulaire de l’intérieur vers l’extérieur. Ensuite, faites de même avec un coton-tige imbibé d’éthanol. Répétez cette étape 3 fois avec une paire de cotons-tiges stériles frais pour chaque répétition.
  14. Appliquez une noisette de gel de lidocaïne sur la région désinfectée du futur site d’incision pour une analgésie locale de la plaie.

2. Chirurgie d’induction de l’ischémie

  1. Faites une première incision sur la peau désinfectée à l’aide d’un scalpel. Maintenez le nombre de coups d’incision cutanée au minimum pour faciliter la cicatrisation de la plaie chirurgicale.
    REMARQUE : Tous les instruments doivent avoir été préalablement stérilisés. Le lecteur devrait se référer aux lignes directrices de leur établissement sur l’utilisation de gants stériles ou chirurgicaux.
  2. À l’aide d’une pince de type 7 et 5, arrachez le fascia superficiel et détachez les glandes salivaires du tissu sous-jacent.
    REMARQUE : Avancez toujours avec des pinces fermées et étendez-la tout en vous éloignant pour repousser le tissu. De cette façon, les espaces anatomiques peuvent être traversés avec un minimum de traumatisme tissulaire.
  3. Placez l’écarteur de fil dans sa position initiale tout en vous assurant que les glandes salivaires n’interfèrent pas avec les étapes suivantes.
  4. Retirez le fascia profond du cou à l’aide d’une pince de type 7 et détachez les muscles sterno-cléido-mastoïdiens de la région carotide pour repositionner l’écarteur.
  5. Repositionnez l’écarteur pour atteindre sous les muscles sterno-cléido-mastoïdiens afin de permettre l’accès à la région carotidienne.
  6. Réséquez le muscle omohyoïdien pour permettre une vision claire et une approche plus facile de la région carotidienne.
  7. Libérez l’artère carotide et ses branches de la veine carotide et du nerf vague, qui sont maintenus ensemble dans le fascia carotide.
    REMARQUE : Ce fascia doit être retiré avec précaution pour éviter de blesser le nerf vague ou de provoquer un saignement important.
    1. Pincez le fascia carotidien sur le côté latéral de la triade carotidienne et tirez-le doucement latéralement pour identifier visuellement l’artère, le nerf, la veine et toutes les branches des vaisseaux sanguins environnants.
    2. Tout en tirant latéralement sur le fascia, à l’aide d’une pince de type 5, séparez le CCA du nerf et de la veine adjacents jusqu’au point de ramification et à la veine thyroïdienne supérieure, qui traverse le CCA.
    3. Détachez complètement la partie inférieure de l’ACC des tissus sous-jacents et du fascia à l’aide d’une pince incurvée de type 7, en vous assurant qu’elle est prête à être serrée dans les étapes suivantes.
    4. En procédant crânienne dans la région au-dessus du point de ramification de l’ACC, déchirez le fascia carotidien à l’aide de deux pinces.
    5. De même, tirez l’extrémité libre du fascia carotidien médialement et latéralement pour détacher avec précision l’ECA et l’artère carotide interne (ICA) du fascia et des tissus environnants, respectivement.
    6. Libérez l’ECA et l’ICA du tissu sous-jacent à l’aide d’une pince incurvée de type 7.
  8. Avec le CCA soigneusement préparé avec ses deux branches respectives, soulevez l’ECA à l’aide d’une pince incurvée de type 7 et fixez-la avec une pince à fermeture automatique de type N0.
  9. Abaissez soigneusement la pince à fermeture automatique de type N0 sur la table d’opération.
    REMARQUE : Pour repositionner le point de serrage de l’ECA, il est parfois nécessaire de relâcher légèrement la poignée et de pousser le point de dérivation de l’ECA vers la queue. À ce stade, il est important de s’assurer qu’il reste plus de 1 mm d’ECA entre le serrage ECA et le point de ramification.
  10. Avec l’ECA serré et maintenu solidement avec une pince à épiler de type N0, introduisez deux fils de soie tressés derrière l’ECA.
    REMARQUE : Le fil crânien fera le nœud de ligature et doit être placé crânienne à partir du site de serrage.
  11. Attachez complètement le fil crânien, car il est permanent, et coupez l’excédent de fil à l’aide de ciseaux.
  12. Attachez le fil caudal en un nœud de sécurité lâche.
    REMARQUE : Il doit être placé près du point de ramification ECA et maintenu lâche pour que le filament MCAO puisse passer à travers.
  13. À l’aide de microclips vasculaires, clampez l’ACC et l’ICA pour éviter les saignements après l’artériotomie.
    REMARQUE : Il est crucial de s’assurer que le microclip appliqué sur le CCA a une prise suffisamment forte, car le CCA est une artère à haut débit pulsé, et le non-respect de cette méthode peut entraîner une hémorragie abondante et la mort de l’animal dans les étapes ultérieures.
  14. À l’aide de ciseaux à micro-ressorts, faites une petite artériotomie juste en dessous du site de serrage ECA.
    REMARQUE : L’artériotomie doit être suffisamment grande pour que la partie en silicium du filament puisse y entrer, mais pas plus grande que la moitié de la circonférence ECA afin de ne pas compromettre la tension maintenue par la pince de type N0.
  15. Avec un angle correspondant à celui de l’ECA, insérez le filament dans le site de l’artériotomie dans une direction proximale à l’ECA, en passant à travers le nœud de fixation lâche au site de ramification de l’ECA et en le collant dans la lumière de l’ECA avec le filament.
  16. Serrez le nœud de fixation autour de la partie en silicone du filament.
    REMARQUE : Une grande prudence est nécessaire à ce stade car le filament a tendance à glisser hors de l’ECA à mi-chemin de la dernière manœuvre, et le remettre en place à ce moment-là est très difficile.
  17. Ouvrez avec précaution le micro-clip ICA et retirez-le.
  18. Avec le filament partiellement inséré dans l’ECA et fixé vers le bas, faites une artériotomie complète, libérant ainsi le moignon ECA avec le filament MCAO à l’intérieur. À ce stade, relâchez la pince à fermeture automatique de type N0 et retirez-la.
  19. Avec un jeu de pinces à épiler de type 5, pincez fermement la souche ECA et soulevez-la légèrement. Tout en tenant le filament partiellement inséré à l’aide d’une autre pince, abaissez et tirez doucement le moignon ECA pour orienter l’extrémité intérieure du filament vers l’ICA. Ne pincez jamais la partie silicone du filament.
  20. Avec une pince tenant le filament, avancez lentement le filament à travers l’ICA vers le cercle de Wills.
    REMARQUE : Le premier point de ramification de l’ICA est également le seul où l’opérateur peut manquer le point de ramification MCA souhaité. Par conséquent, un léger angle d’avancement latéral est nécessaire pour guider le filament vers le point de ramification du MCA. Avec le léger angle d’avancement latéral, le filament s’éloigne de l’artère ptérygo-palatine (PPA) et rend l’extrémité en progression plus susceptible d’entrer dans le cercle de Willis (Figure 1).

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Figure 1 : Une illustration de l’avancement du filament d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne au-delà du point de ramification de l’artère ptérygo-palatine. L’avancement correct du filament (à gauche) est obtenu en orientant le filament MCAO de telle sorte qu’il s’appuie contre la paroi latérale de l’ICA et s’éloigne du point de ramification du PPA. Si vous ne le faites pas (à droite), le filament peut pénétrer dans le PPA et ne pas provoquer d’accident vasculaire cérébral. Dans ce dernier cas, le filament ne pourra pas avancer aussi loin qu’il le devrait et le chirurgien doit retirer le filament jusqu’à ce que son extrémité devienne visible au point de ramification de l’ICA et recommencer à faire avancer le filament. Les artères de couleur verte représentent les artères communicantes postérieures (PcomA), la plupart du temps non patentes chez la souris. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Faites avancer lentement le filament MCAO à travers le cercle de Willis jusqu’à ce qu’une augmentation soudaine de la résistance se fasse sentir.
    REMARQUE : À ce stade, il est important d’observer la longueur restante du filament. Le filament doit se déplacer sans effort à au moins 7 mm du point de ramification de l’ICA chez une souris adulte.
  2. Serrez le nœud de fixation pour vous assurer que le filament n’est pas déplacé pendant l’ischémie.
  3. Retirez le clip CCA et notez l’heure.
    REMARQUE : Cela marque le début de l’apparition de l’ischémie.
  4. Emballez l’extrémité libre du filament MCAO dans la rainure entre le triangle carotidien et le muscle sternocléido-mastoïdien ipsilatéral afin qu’il ne dépasse pas de la plaie chirurgicale.
  5. Retirez l’écarteur de fil et rapprochez les bords de la plaie chirurgicale les uns des autres. Laissez le site chirurgical se stabiliser pendant quelques secondes pour que le tissu revienne à sa position anatomique.
  6. Fermez la plaie chirurgicale à l’aide de fermetures de plaie à ruban adhésif pour faciliter une réouverture plus rapide de la plaie après la période d’ischémie.
    REMARQUE : Si un chercheur souhaite laisser l’animal se réveiller pendant la période d’ischémie, il est recommandé de suturer la plaie pour éviter une réouverture prématurée de la plaie.

3. Période d’ischémie

  1. Validez le succès de la chirurgie à l’aide de l’IRM ou d’une autre méthode de mesure quantitative de la perfusion.
    REMARQUE : Dans le cas d’une IRM, l’imagerie pondérée en perfusion (PWI) doit montrer une ischémie critique dans la région large de l’ACM et l’imagerie pondérée en diffusion (DWI) doit décrire le site de la réduction du coefficient de diffusion apparent (ADC) due à l’œdème cellulaire.
  2. Placez l’animal dans une cage propre jusqu’à la fin de la période d’ischémie.

4. Chirurgie de retrait de filament

  1. Environ 5 minutes avant la fin du temps d’ischémie imparti, positionnez l’animal et fixez-le à nouveau sur la table d’opération.
  2. Retirez les fermetures de la plaie du ruban adhésif et rouvrez la plaie chirurgicale avec l’enrouleur de fil.
  3. Libérez l’extrémité libre du filament MCAO des tissus environnants et les extrémités du fil du nœud de fixation.
  4. Avec une pince de type N0, pincez et tirez le bord du moignon ECA ventralement pour le mettre en tension. Abaissez soigneusement la pince de pincement, comme lors de la première intervention chirurgicale.
    REMARQUE : L’opérateur doit éviter de pincer le nœud de fixation, car cela empêcherait le nœud de se détacher.
  5. Clampez à nouveau l’ACC à l’aide d’un clip microvasculaire.
  6. À l’aide d’une pince de type 5, desserrez le nœud de fixation pour permettre le retrait du filament.
    REMARQUE : La meilleure façon de commencer à desserrer le nœud est de continuer à le pincer jusqu’à ce qu’il se sépare en parties individuelles, puis de pousser les extrémités du fil vers le nœud.
  7. Retirez lentement le filament MCAO jusqu’à ce que la partie en silicium commence à dépasser de la souche ECA. Serrez légèrement le nœud de fixation pour préparer le retrait complet du filament.
  8. Lorsque vous êtes proche de l’extrémité en silicone du filament, serrez le nœud de fixation de sorte qu’il pousse le filament MCAO et ferme la souche ECA en une seule manœuvre. Serrez complètement le nœud une fois que le filament a glissé.
  9. Ouvrez et retirez la pince de pincement avec le clip CCA.
    REMARQUE : Cela marque la fin de la période d’ischémie et le début du processus de reperfusion.
  10. Retirez l’écarteur de fil et rapprochez à nouveau les bords de la plaie chirurgicale.
  11. Suturez la plaie chirurgicale en commençant par la périphérie, en fermant complètement la plaie sans qu’aucun tissu sous-jacent ne soit visible.
    REMARQUE : Le nombre de sutures nécessaires dépend de la taille de la plaie chirurgicale.
  12. Nettoyez et désinfectez le site chirurgical à l’aide de lingettes imbibées d’alcool à friction.

5. Soins postopératoires

  1. Placez l’animal dans une cage propre et laissez-le se réveiller spontanément de l’anesthésie.
  2. Placez les granulés de nourriture au fond de la cage pour un accès plus facile. Ramollissez les granulés alimentaires avec de l’eau potable. Remplissez une petite boîte de Pétri avec de l’eau potable et apportez-la également sur le sol de la cage.
  3. Au cours des 48 prochaines heures, injecter 0,25 mL de solution saline avec de la buprénorphine (0,5 mg/kg) toutes les 24 heures par voie intrapéritonéale.

Résultats

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L’IRM peropératoire ou postopératoire, en particulier l’imagerie pondérée en perfusion (PWI) et/ou l’imagerie pondérée en diffusion (DWI) (Figure 2) peuvent offrir la preuve définitive de la réussite d’une procédure. L’IPP peropératoire montre une ischémie critique dans la région IPSILATÉRALE du MCA, confirmant ainsi que le placement du filament a entraîné une occlusion complète. L’IPP postopératoire d’une procédure réussie présente une hyperperfusion au cœur de la lésion, ainsi qu’un certain degré de reperfusion aux frontières de la région MCA. Les lésions peropératoires de la DWI correspondent aux régions ischémiques observées sur la PWI peropératoire. Les lésions postopératoires de la DWI présentent un rétrécissement vers le noyau de la lésion ischémique, accompagné d’une diminution significative du coefficient de diffusion apparent de la lésion, ce qui la rend plus foncée que les lésions peropératoires de la DWI et le tissu cérébral réperfusé environnant. Les scans anatomiques T2 standard, à la fois peropératoires et postopératoires, ne montrent généralement rien de remarquable, sauf en cas d’hémorragie induite par le filament

(Figure 3). Dans de tels cas, les scanners PWI et DWI révèlent une ischémie incomplète ou inexistante.

Le processus de reperfusion suit dans les 48 heures suivantes, et il est confirmé qu’il a eu lieu sur les IRM effectuées le deuxième jour après l’intervention (Figure 2, CBF le jour 2). Les scintigraphies PWI montrent une reperfusion complète dans le site de la lésion avec une légère hyperperfusion dans le noyau de la lésion. Les scintigraphies DWI montrent plusieurs régions où les coefficients de diffusion apparents sont abaissés en raison de la formation d’un œdème cérébral. Les scans anatomiques T2 indiquent des régions hyperintenses d’œdème enveloppant les régions MCA, sans implication des régions non MCA telles que l’hippocampe.

Au réveil, l’animal présente des signes évidents d’AVC aigu. Les symptômes comportementaux courants comprennent une augmentation du tonus musculaire du côté de la lésion, ce qui oblige l’animal à fléchir son torse dans cette direction. Les cercles et les rotations dans le sens ipsilatéral sont également des signes évidents d’un accident vasculaire cérébral aigu. L’ataxie de la marche suggère souvent l’implication de l’hippocampe dans le volume de la lésion ischémique. Cependant, ce symptôme peut manquer de spécificité dans la phase hyperaiguë en raison des effets secondaires de l’anesthésie à l’isoflurane. Dans les jours qui suivent, l’animal devrait développer une flexion ipsilatérale des membres antérieurs et une aggravation de son état postural, accompagnée d’une absence de réflexe de moustache. Le taux de mortalité atteint un pic environ 3 jours après l’intervention en raison d’un œdème cérébral. La phase chronique commence après que l’œdème cérébral commence à se résorber. Pendant ce temps, l’animal peut présenter une rétention d’urine. Pour cette raison, il est important d’inspecter l’animal pour détecter toute rigidité de la vessie ainsi qu’un capuchon ferme à la sortie de l’urètre. La plupart du temps, ce problème peut être résolu en massant doucement la vessie pour faciliter la miction. Les signes de récupération de poids apparaissent généralement dans les 7 premiers jours suivant le début de l’AVC.

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Figure 2 : Exemple représentatif d’un MCAO réussi avec reperfusion complète confirmée par IRM. CBF, ADC et T2w sont respectivement l’abréviation de cartes de débit sanguin cérébral, de cartes de coefficient de diffusion apparent et de scans anatomiques pondérés en T2. L’intra-opératoire, le postopératoire et le D02 signifient 3 points temporels différents de l’imagerie après le début de l’ischémie, après le début de la reperfusion et le deuxième jour après le MCAO, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Examens IRM représentatifs d’une hémorragie induite par un filament pendant la procédure MCAO. CBF, ADC et T2w sont respectivement l’abréviation de cartes de débit sanguin cérébral, de cartes de coefficient de diffusion apparent et de scans anatomiques pondérés en T2. L’intra-opératoire, le postopératoire et le D02 signifient 3 points temporels différents de l’imagerie : après le début de l’ischémie, après le début de la reperfusion et le deuxième jour après le MCAO, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Une illustration du bon placement du filament au niveau de la branche moyenne de l’artère cérébrale. Dans la plupart des cas, la partie en silicium du filament (de couleur blanche) se loge dans la partie proximale de l’artère cérébrale antérieure (ACA) environ 2 mm plus loin que le point de ramification de l’ACM. Normalement, la région cérébrale de l’ACA n’est pas affectée chez la souris, car l’ACA se joint à la région controlatérale en un azygos ACA singulier. Les artères touchées sont indiquées en gris. À gauche, le CCA est laissé breveté pendant la période d’ischémie, fournissant ainsi du sang à toutes les branches de l’ICA jusqu’au MCA qui est occlus avec la partie silicium du filament. Sur la droite, le filament est positionné de manière identique, sauf que la ligature CCA est maintenue pendant la période d’ischémie. Étant donné que PcomA (de couleur verte) n’est pas perméable dans la plupart des cas, si la ligature CCA est conservée, l’AVC enveloppe de manière non sélective la majorité de l’hémisphère ipsilatéral via MCA, AchA, VTA, HTA et PCA. Dans ces cas, des signes d’infarctus aigu de l’œil (leucocolie et anisocorie) peuvent également être observés en raison d’un blocage de l’APP. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

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Le MCAO est une procédure très exigeante pour l’opérateur et débilitante pour l’animal. Pour cette raison, il est de la plus haute importance pour les chercheurs d’avoir une procédure opératoire standard qui minimise la gravité de l’AVC, réduit les échecs de la procédure et améliore le bien-être de l’animal après la procédure. Ce protocole MCAO met en évidence certains des aspects clés à prendre en compte lors de l’exécution de cette procédure sur une souris.

Le choix du filament MCAO influence la taille et l’emplacement de la lésion provoquée par l’AVC et constitue donc une étape critique de cette procédure11. Les filaments recouverts de silicium, tels que ceux mis au point par Doccol, ont fait un grand bond en avant dans la réduction de l’incidence des hémorragies induites par les filaments12. Cependant, les filaments recouverts de silicium sont disponibles dans une grande variété de tailles et de longueurs, ce qui pose un défi aux nouveaux chercheurs qui doivent choisir ceux qui conviennent au MCAO chez les animaux de laboratoire. Alors que les fabricants de filaments fournissent généralement des directives pour choisir le bon diamètre de filament pour un poids d’animal donné, la longueur du revêtement en silicone est considérée comme une préférence personnelle de l’opérateur et ne doit être choisie que sur la base de ses compétences. Dans ce travail, nous préconisons de minimiser la longueur du silicium pour s’assurer que la lésion provoquée par l’AVC n’englobe que la zone d’irrigation MCA, améliorant ainsi la reproductibilité. La figure 4 illustre que l’artère cérébrale postérieure (ACP), la première branche intracrânienne de l’ICA, alimente les régions postérieures du cerveau, y compris des parties de l’hippocampe. Des études micro-CT récentes sur des souris ont identifié trois autres branches plus petites issues de l’ICA avant le point de ramification de la MCA13. L’artère hypothalamique (ETH), l’artère tegmentale ventrale (ATV) et l’artère choroïde antérieure (AChA), dans leur ordre de ramification, contribuent de manière significative à la variabilité intra-variant et intra-sujet8. De plus, des études micro-CT ont montré que, chez la souris, la distance moyenne entre les points de ramification du MCA et du PCA est d’environ 1,7 mm, ce qui est considérablement plus court que la longueur du revêtement en silicium de la plupart des filaments manufacturés14. Étant donné que le seul retour d’information qu’un opérateur reçoit lors de l’avancement du filament est une augmentation brutale de la résistance lorsque le filament atteint le point de ramification du MCA, la longueur de traînée du revêtement de silicium du filament est ce qui induit une ischémie au MCA et, en fonction de la longueur du revêtement de silicium, à l’AChA, VTA, HTA et même au PCA, l’introduction d’une variabilité contraire au modèle MCAO prévu. Ainsi, pour maintenir la reproductibilité et le bien-être animal postopératoire, l’objectif devrait être uniquement l’occlusion de l’ACM. Doccol propose des filaments MCAO avec des revêtements en silicone allant de 1 à 2 mm, mais notre expérience indique que l’utilisation de revêtements de 1 à 2 mm entraîne souvent une opération fictive sans provoquer d’accident vasculaire cérébral. L’IRM peropératoire a révélé que le filament avance jusqu’à 2 mm au-delà du point de ramification de l’ACM dans l’artère cérébrale antérieure (ACA) avant de fournir une rétroaction résistive critique à l’opérateur. Pour cette raison, nous suggérons fortement l’utilisation de revêtements en silicone d’une longueur de 2 à 3 mm, ce qui réduit l’implication de l’hippocampe dans les lésions d’AVC par rapport aux revêtements en silicone plus longs sur les filaments MCAO.

La deuxième étape critique de cette procédure est le placement correct du filament MCAO afin d’obtenir une occlusion complète du MCA. L’entrée par erreur dans la première branche de l’ICA, l’artère ptérygo-palatine (PPA), est un problème courant pour l’opérateur, car il n’y a pratiquement aucun retour indiquant que le filament MCAO a pris un mauvais virage au cours de sa progression. Pour cette raison, nous recommandons un léger angle d’avancement latéral afin que l’extrémité recouverte de silicium du filament s’éloigne du point de ramification du PPA, ce qui le rend plus susceptible de pénétrer dans la partie intracrânienne de l’ICA. (Graphique 1) Comme indiqué dans la section protocole, il est important d’observer la longueur du filament arrière pour déterminer si le placement du filament est adéquat. Dans le cas où le filament ne peut pas être inséré à au moins 7 mm du point de ramification ICA, l’opérateur doit rétracter le filament et répéter. Toute force inutile appliquée lors de l’insertion du filament peut entraîner une hémorragie et un échec de la procédure. D’ailleurs, une mesure de perfusion laser-Doppler continue peut être utilisée pour confirmer le placement correct du filament.

Assurer un flux sanguin sans entrave à partir de l’ACC pendant la période ischémique est une autre étape critique de ce protocole. Contrairement à la plupart des illustrations représentant un cercle de Willis complet chez une souris, des études ont montré que l’artère communicante postérieure (PcomA) n’est le plus souvent pas bilatéralement perméable chez la souris et ne peut pas alimenter de manière fiable le côté ipsilatéral du cercle de Willis si le CCA reste fermé pendant la période d’ischémie15,16. Dans ces cas, même si un chercheur sélectionne soigneusement la bonne longueur de revêtement en silicium du filament, la course enveloppera tout l’hémisphère ou seulement la région MCA, en fonction de la perméabilité PcomA, donnant lieu à la variance non prise en compte des tailles de course. Pour cette raison, nous avons modifié la procédure pour inclure l’étape d’instruction où l’opérateur retire le clip CCA juste après avoir réglé le filament MCAO occlusif. Ces modifications pourraient augmenter la précision et la reproductibilité de la chirurgie et réduire l’hétérogénéité des résultats en même temps. La normalisation des méthodes améliorerait encore le taux de réussite et la comparabilité, ainsi que le potentiel de traduction des résultats17.

La plus grande limitation de la technique proposée est le fait que l’ECA reste ligaturée après l’intervention, ce qui peut potentiellement aggraver l’état de l’animal pendant la récupération18. Jusqu’à présent, nous n’avons pas réussi à réparer l’ECA tout en maintenant le taux de réussite de la procédure suffisamment élevé. Cela reste un point potentiel pour des améliorations futures de la méthode. De plus, il est difficile de minimiser le temps pendant lequel l’ACC reste serré, mais il est essentiel d’empêcher le recrutement de régions non MCA dans l’AVC. Étant donné que cela pourrait fournir une source de variance inter- et intra-opérateur, il est conseillé de mesurer la durée du serrage CCA, ce qui pourrait permettre aux chercheurs de tenir compte statistiquement d’au moins une fraction de la variance totale observée dans les tailles de course. D’autre part, les compétences et l’expérience de l’opérateur jouent un rôle crucial dans la réduction du temps de ligature CCA et de la durée globale de la procédure11.

La méthode présentée est importante car elle permet aux chercheurs d’occlure sélectivement l’ACM, rendant ainsi le début de la reperfusion soudain et hautement contrôlable. La méthode imite la thrombectomie endovasculaire et les lésions de reperfusion qui en résultent avec plus de précision que les méthodes actuellement disponibles, fournissant des détails pour un modèle reproductible et cliniquement pertinent d’ischémie/lésion de reperfusion chez l’animal.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer. Les auteurs n’ont aucune affiliation avec les noms commerciaux et les marques de commerce mentionnés dans cet ouvrage.

Remerciements

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Ce travail a été financé par le projet BRADISCHEMIA de la Fondation croate pour la science (UIP-2017-05-8082) ; GA KK01.1.1.01.0007 financé par l’Union européenne par l’intermédiaire du Fonds européen de développement régional et par l’Union européenne par l’intermédiaire du Fonds européen de développement régional au titre de la convention de subvention n° KK.01.1.1.07.0071, projet "SineMozak. Le travail des doctorants Rok Ister et Marta Pongrac a été entièrement soutenu par le « Projet de développement de carrière des jeunes chercheurs - formation des doctorants » de la Fondation croate pour la science, financé par l’Union européenne par le Fonds social européen. La procédure a été filmée à l’aide d’un smartphone Android monté sur un microscope chirurgical à l’aide d’un support de caméra générique. Les documents vidéo ont été édités et la voix off a été enregistrée à l’aide de l’éditeur vidéo Wondershare Filmora.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution cutanée de bétadine 10g/100mlAlcaloïde SkopjeN/A
Suture en soie tresséeFine Science Tools18020-60
Suture Dafilon 5/0 DS16B. BraunC0936154
Dolokain 20 mg/g gelJadran-Galenski LaboratorijN/A
Dumont #5 pince FineScience Tools11251-202 pièces
Pince Dumont #7Fine Science Tools11271-30
Pince à fermeture automatique Dumont N0Fine Science Tools11480-11
Durapore Ruban chirurgical 1,25cm x 9,1m3M7100057169
Durapore Ruban chirurgical 2,5cm x 9,1m3M7100057168
Thermostat externePetnap1012536
Porte-aiguilles HalseyFine Science Tools12500-12
Stérilisateur à billes chaudesOutils de science fine18000-50
Ciseaux à irisOutils de science fine14060-10
Isoflurane USPPiramal soins intensifsN/A
Laser DopplerMonitor MoorMOORVMS-LDF2
Metal Pet Heat PadPetnap
Ciseaux à ressort Micro VannasFine Science Tools15000-00
Écarteur Mini-colibriFine Science Tools17000-01
Recugel pommade pour les yeuxBausch& LombN/A
S& T B-1 micro pince pour cuveOutils scientifiques fins00396-012 pièces
S& Pince à appliquer T micro clampFine Science Tools00071-14
Schwartz micro serrefinesFine Science Tools18052-01
Stemi DV4 Spot stéréomicroscopeZeiss000000-1018-453
Steri-Strip Reinforced Adhesive Skin Closures 3 mm x 75 mm3M7100236545
Pince à tissus droiteFine Science Tools11023-10
SZX Bras de supportOlympusSZ2-STS
Tec III série 300 vaporisateur calibréVaporizer Sales and Service inc.N/A
Support Universel Type 2OlympusSZ2-STU2
VetFlo Support d’Anesthésie Six CanauxKent ScientificVetFlo-1225Modifié pour le mélange O2/N2
1012525

Références

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Mots-clés

Ischemic Stroke ModelExternal Carotid ArteryIntraluminal Filament ModelRodent Stroke ModelSurgical StandardizationPerfusion Weighted ImagingApparent Diffusion Coefficient

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