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Article de méthode

Évaluation de la clairance de l’insuline chez la souris via la perfusion hépatique in situ

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DOI :

10.3791/66730

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13 décembre 2024

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1Department of Endocrinology and Metabolism, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La clairance hépatique de l’insuline est essentielle pour réguler l’homéostasie du glucose. Cet article décrit une procédure de perfusion hépatique conviviale permettant d’évaluer directement le taux de clairance hépatique de l’insuline in situ chez la souris.

Résumé

La clairance hépatique de l’insuline est essentielle au maintien de l’homéostasie du glucose et est étroitement liée aux troubles métaboliques tels que l’obésité, la résistance à l’insuline et le diabète. Une mesure précise de la clairance de l’insuline est essentielle pour comprendre les mécanismes sous-jacents de ces affections. Ce protocole présente une procédure de perfusion hépatique simple et conviviale chez la souris, spécialement conçue pour évaluer directement le taux de clairance hépatique de l’insuline. La méthode implique une canulation précise de la veine porte et de la veine cave inférieure suprahépatique pour créer un système de perfusion in situ qui imite les conditions physiologiques. Le protocole guide les chercheurs à travers toutes les étapes de la procédure, de la préparation chirurgicale et la mise en place du système de perfusion à la collecte et à l’analyse des échantillons. Des instructions détaillées sont fournies, ainsi que des résultats représentatifs et des conseils importants pour optimiser la procédure. Un tutoriel vidéo accompagne le protocole écrit, offrant des instructions et des illustrations visuellement approfondies, ce qui en fait une référence accessible et complète pour les scientifiques qui explorent les mécanismes moléculaires à l’origine du métabolisme et de la clairance de l’insuline hépatique.

Introduction

La découverte de l’insuline est devenue l’un des jalons du siècle dernier. On sait beaucoup de choses sur la régulation de la synthèse et de la sécrétion d’insuline et de ses fonctions physiologiques dans les tissus métaboliques. Cependant, l’accent a été moins mis sur la dégradation de l’insuline et ses mécanismes de régulation. Le métabolisme de l’insuline peut être compris comme l’interaction entre la fonction des cellules bêta, la résistance à l’insuline (IR) ou la sensibilité et la clairance de l’insuline. Parallèlement à la sécrétion d’insuline, la clairance hépatique de l’insuline joue un rôle crucial dans le maintien du niveau homéostatique d’insuline nécessaire pour atteindre les tissus cibles périphériques et faciliter l’action correcte de l’insuline1. De nombreuses études ont identifié l’altération de la clairance de l’insuline comme un facteur crucial dans la pathogenèse de l’hyperinsulinémie dans le syndrome métabolique, ainsi que dans d’autres affections telles que le diabète de type 2 2,3, la stéatohépatite non alcoolique 4 et le syndrome des ovaires polykystiques5. Ainsi, l’hyperinsulinémie secondaire à une clairance réduite peut jouer un rôle dans la pathogenèse de la maladie métabolique. Les stratégies qui améliorent la clairance de l’insuline ont le potentiel d’inverser les effets défavorables de l’hyperinsulinémie chez ces personnes.

L’insuline a un mode de distribution unique. Le taux d’insuline plasmatique circulante dépend de l’équilibre entre la sécrétion et l’élimination de l’insuline. Le pancréas sécrète de l’insuline dans la veine porte de manière pulsatile, en la dirigeant vers les hépatocytes. En tant que premier organe à rencontrer la sécrétion d’insuline, le foie dégrade la majorité de l’insuline lors de son premier passage, représentant 60 à 70 % de l’insuline totale6. L’insuline restante sort du foie par la veine hépatique, entrant dans la circulation systémique, où elle est partiellement utilisée par les tissus périphériques (principalement les muscles, le tissu adipeux et les reins) avant d’être extraite par le foie lors de son deuxième passage dans l’artère hépatique7.

La mesure précise de la clairance de l’insuline est cruciale. Il est difficile de mesurer directement la clairance hépatique de l’insuline dans les études humaines, car il est difficile d’obtenir des échantillons de sang dans les veines porte et hépatiques. Des méthodes directes et indirectes sont utilisées pour estimer la clairance de l’insuline chez l’homme et les modèles animaux. Environ trois stratégies sont employées pour mesurer indirectement la clairance de l’insuline. Les évaluations les plus fréquemment utilisées dans la pratique clinique impliquent des méthodes basées sur le rapport molaire C-peptide/insuline8. Cette approche est fondée sur la sécrétion équimolaire des deux peptides et l’absence d’extraction du peptide C par le foie9. Le deuxième groupe de méthodes dépend de l’analyse mathématique des courbes de décroissance plasmatique de l’insuline après une entrée connue et spécifique de l’hormone dans la circulation 2,10,11. La troisième méthode est basée sur le fait que la perfusion d’insuline à un taux constant conduit à des niveaux stables de l’hormone dans le sang, où le taux d’élimination correspond au taux d’administration12. Ces méthodes indirectes reflètent principalement la clairance globale de l’insuline dans le corps. Étant donné que le foie est le principal site de clairance de l’insuline et joue un rôle crucial dans ce processus, il est essentiel d’évaluer directement la clairance hépatique de l’insuline.

Des études antérieures ont mesuré directement l’extraction hépatique de l’insuline chez des chiens en bonne santé13,14. Des études ont également utilisé un modèle isolé de foie de rat perfusé pour évaluer l’extraction de l’insuline du foie15,16. En raison de la grande disponibilité des souches génétiquement modifiées, les souris servent de modèles précieux pour l’étude des voies moléculaires. Quelques étudesont utilisé la perfusion hépatique pour évaluer directement la clairance hépatique de l’insuline dans un modèle murin. Dans ces études, un perfusat contenant de l’insuline humaine est perfusé dans la veine porte et prélevé dans la veine cave inférieure. La proportion d’insuline absorbée par le foie indique sa clairance. La technique de perfusion hépatique maintient le foie dans des conditions quasi physiologiques en faisant circuler un perfusat chaud, oxygéné et enrichi en nutriments à travers le système vasculaire hépatique. Cependant, il n’y a pas suffisamment d’orientations pratiques et de conseils essentiels pour faire progresser et diffuser cette technique.

Ainsi, alors que la clairance hépatique de l’insuline a fait l’objet d’une attention croissante, son rôle dans les troubles, ainsi que ses mécanismes moléculaires, restent incertains18. Par conséquent, les techniques de pointe sont grandement nécessaires dans le domaine de la recherche scientifique. Ce protocole établit une procédure détaillée de perfusion hépatique modifiée chez la souris pour évaluer la clairance hépatique de l’insuline. De plus, cette méthode peut également être utilisée pour étudier les effets des médicaments sur le foie, y compris l’effet de premier passage, les processus de transport des médicaments et divers autres aspects.

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Protocole

Ce protocole a été approuvé par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine de Nanjing (IACUC-2105018) et a suivi les directives du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux. Toutes les souris C57BL/6N ont été maintenues sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Des souris âgées de six semaines ont été divisées au hasard en un groupe de régime Chow (CD) et un groupe de régime riche en graisses (HFD). Le groupe HFD a été nourri avec un régime riche en graisses à 60 % et a continué à suivre ce régime jusqu’à l’âge de 10 semaines. Le poids corporel moyen était de 28,55 g ± 1,2 g pour le groupe HFD et de 24,3 g ± 0,48 g pour le groupe témoin. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation

  1. Effectuer la stérilisation requise des instruments chirurgicaux et des consommables par autoclavage.
  2. Placez les instruments chirurgicaux, la suture en soie 6-0, le petit applicateur de coton stérile, l’injection de chlorure de sodium (500 ml), les cotons-tiges et les éponges de manière appropriée sur la table d’opération.
  3. Préparer 30 mL de solution saline héparinée à la concentration finale de 200 UI/mL.
  4. Préparez deux tubes en silicone d’un diamètre intérieur de 0,31 mm et d’un diamètre extérieur de 0,64 mm ; L’un de 4 cm de long pour être utilisé comme cathéter de veine porte, et l’autre de 10 cm de long pour être utilisé comme cathéter de la veine cave inférieure.
  5. Préparez le tampon de perfusion Krebs-Henseleit (KRBH) contenant 5,0 mmol/L de glucose et 0,25 % de BSA.
  6. Préparez le tampon de perfusion Krebs-Henseleit (KRBH) contenant 5,0 mmol/L de glucose, 0,25 % de BSA et 4,0 ng/mL d’insuline humaine.
  7. Mettre en place le système de perfusion hépatique. La figure 1 montre les principaux composants du système de perfusion hépatique.

2. Cathétérisme chirurgical

  1. Préparez le mélange anesthésique en suivant les étapes ci-dessous :
    1. Diluer Zoletil 50 (250 mg/5 mL) 10 fois avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 %.
    2. Diluer 10 fois le chlorhydrate de xylazine (200 mg/2 mL) avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 %.
    3. Mélanger la solution de Zoletil 50 à 0,5 % avec la solution de chlorhydrate de xylazine à 1 % dans un rapport de 1:1.
  2. Anesthésier les souris.
    1. Vérifiez et enregistrez le poids corporel de la souris. Administrer le mélange anesthésique par injection intrapéritonéale à une dose de 5 mL/kg de poids corporel (2,5 mg/mL de Zoletil 50 ; 5 mg/mL de chlorhydrate de xylazine). Le début de l’anesthésie se produit généralement dans les 5 à 10 minutes suivant l’injection, indiqué par la perte du réflexe de redressement et une réponse réduite aux stimuli externes.
    2. Transférez la souris sur la table d’opération. Fixez les membres à l’aide de ruban adhésif. Administrer 2,5 U/g d’héparine par voie intrapéritonéale pour obtenir l’héparinisation.
    3. Utilisez un rasoir électrique pour couper la fourrure de la peau abdominale et désinfectez la zone avec une solution de povidone iodée.
  3. Effectuer un cathétérisme de la veine porte.
    1. Faites une incision longitudinale de 4 cm du bas-ventre vers l’apophyse xiphoïde le long de la ligne médiane. Coupez soigneusement le péritoine avec des ciseaux pour éviter d’endommager les organes viscéraux. Insérez l’écarteur abdominal de la souris pour exposer le champ opératoire.
    2. Déplacez les intestins vers la droite pour révéler la veine porte, le rein droit et la veine cave inférieure (Figure 2A). Utilisez une pince artérielle pour clamper la veine cave sur le bord supérieur du rein.
    3. Isolez la veine porte (Figure 2A) et ligaturez l’extrémité distale avec une suture en soie 6-0. Attachez sans serrer une autre suture à l’extrémité proximale du vaisseau exposé.
    4. Faites une incision près de l’extrémité ligaturée avec des ciseaux à ressort et insérez le cathéter. Faites avancer le cathéter à travers l’incision jusqu’au niveau de la bifurcation porte.
    5. Fixez les deux ligatures autour du cathéter et confirmez le bon prélèvement en connectant l’extrémité libre du cathéter à une seringue de prélèvement. Rincer avec une solution saline héparinisée et clamper le cathéter (Figure 2C).
    6. Retirez le dispositif de traction et réinitialisez les intestins. Couvrez la zone chirurgicale avec de la gaze stérile imbibée de solution saline ou du coton.
  4. Effectuer un cathétérisme de la veine cave inférieure suprahépatique.
    1. Faites une incision le long du sternum à partir de l’apophyse xiphoïde, exposant le sternum.
    2. Ouvrez verticalement le sternum et coupez à travers le diaphragme le long du bord des côtes pour exposer la cavité thoracique.
    3. Exposer et isoler la veine cave inférieure suprahépatique (figure 2B). Ligaturez soigneusement l’extrémité distale avec une suture en soie 6-0. Attachez sans serrer une autre suture à l’extrémité proximale du vaisseau.
    4. Faites une incision juste en dessous de l’extrémité ligaturée avec des ciseaux à ressort et insérez un cathéter de 10 cm. Avancez le cathéter jusqu’à ce que l’extrémité du cathéter soit près du foie et attachez solidement les deux ligatures. Confirmez que le prélèvement est correct et clampez l’extrémité libre du cathéter (figure 2D).
    5. Rincez la zone chirurgicale avec une solution saline. Couvrez la surface avec de la gaze stérile imbibée de solution saline.

3. Perfusion hépatique

  1. Euthanasier la souris en utilisant une surdose d’anesthésique et une thoracotomie conformément aux lignes directrices de l’établissement pour le soin et l’utilisation des animaux, en veillant à ce que toutes les procédures soient effectuées de manière à minimiser la souffrance.
  2. Installez le système de perfusion hépatique, qui comprend un oxygénateur, un dispositif de modulation de température, une pompe à perfusion et des tubes de perfusion, comme illustré à la figure 1.
  3. Fournir un flux gazeux continu de 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone à l’oxygénateur.
  4. Allumez le bain-marie et préchauffez la chambre de l’orgue à 37 °C.
  5. Préparez le tampon de perfusion KRBH avec et sans insuline. Amorcez le système de tuyauterie avec le tampon de perfusion incubé dans un bain-marie à 37 °C.
    REMARQUE : Le KRBH est exempt de BSA et de glucose. Le tampon de perfusion KRBH sans insuline humaine contient 5,0 mmol/L de glucose et 0,25 % de BSA, tandis que le tampon de perfusion KRBH avec insuline humaine contient 5,0 mmol/L de glucose, 0,25 % de BSA et 4,0 ng/mL d’insuline humaine.
  6. Placez la souris dans un récipient avec la température ambiante maintenue à environ 37 °C. Utilisez un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle à 37 °C.
  7. Perfuser le tampon KRBH à travers le cathéter veineux porte. Réglez le débit de perfusion à 0,2 mL/min à l’aide d’une mini-pompe.
  8. Observez que le foie pâlit en quelques secondes, ce qui indique que le tampon de perfusion circule dans le foie. Pour éliminer plus de cellules sanguines restantes dans le foie, interrompez la perfusion pendant 1 minute aux points de 4 minutes et de 8 minutes, en commençant le moment au début de la perfusion.
  9. Perfuser le foie avec le tampon KRBH pendant un total de 10 minutes (à l’exclusion des deux pauses de 1 minute), représentant la période d’équilibre. Prélevez l’échantillon basal à partir du cathéter de la veine cave inférieure.
  10. Perfuser le foie avec la même solution enrichie en insuline (4,0 ng/mL d’insuline humaine) pendant 30 minutes supplémentaires.
  11. Prélever tous les échantillons du tube de la veine cave inférieure toutes les 2 minutes.
  12. Enregistrez le poids du foie après la perfusion. Prélever des échantillons de foie dans différents lobes, les congeler immédiatement dans de l’azote liquide, puis les transférer à -80 °C pour le stockage.
  13. La centrifugeuse a collecté tous les échantillons de perfusion à ~1 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Récupérez les surnageants et transférez-les à -80 °C pour le stockage.
    REMARQUE : La concentration d’insuline dans les échantillons de perfusion est mesurée à l’aide de kits de test immuno-enzymatique (ELISA) humains.
  14. Après l’intervention, assurez-vous que tous les déchets biologiques sont éliminés conformément aux règles de sécurité.

4. Analyse des données

  1. Présentez les données dans des graphiques XY montrant la concentration d’insuline au fil du temps.
  2. Calculez le taux moyen de clairance hépatique de l’insuline (HICR AVE) à l’aide de la formule suivante :
    HICR AVE = (1−Cf/Ci) × 100 %
    où Ci = concentration initiale d’insuline du tampon de perfusion, Cf = concentration moyenne finale d’insuline au cours des 10 dernières minutes à partir de la veine cave inférieure suprahépatique.

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Résultats

Ce protocole décrit la procédure de perfusion hépatique pour calculer directement la clairance hépatique de l’insuline. Ce modèle est fiable et reproductible. La figure 3 donne un exemple des résultats obtenus à partir d’une expérience. Après une période d’équilibre de 10 minutes, le tampon KRBH complété par 4,0 ng/mL d’insuline humaine a été perfusé par la veine porte pendant 30 min. Le liquide de perfusion a été prélevé à partir du cathéter dans la veine cave inférieure suprahépatique à de...

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Discussion

Étapes critiques du protocole
Les interventions chirurgicales décrites ci-dessus doivent être effectuées avec soin afin d’éviter de créer des lésions hépatiques. De plus, la structure fragile de la paroi vasculaire veineuse du foie la rend vulnérable à la ponction et aux saignements ultérieurs si elle n’est pas manipulée avec soin lors de la canulation. Des tubes en silicone plus souples sont utilisés dans ce protocole pour minimiser les dommages aux vaisseaux sanguin...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82200948, 82270921, 82170882).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Régime riche en graisses à 60 %Research Diets, États-UnisD12492
Kit de dosage de l’alanine aminotransféraseNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC009-2-1
Glucose anhydreSangon Biotech50-99-7500 G
Kit de dosage de l’aspartate aminotransféraseNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC010-2-1
Sérum bovin AlbumineGeminiBio700-107PSans acides gras
Contour TS Lecteur de glycémieBayerPH220800019
Contour TS Bandelettes de test de glycémieBayerDP38M3F05A
Héparine sodique  ;Changzhou Qian hong Bio-pharmaH3202208812500 U/2mL
Insuline humaineNovo NordiskS20191007300 U/3mL
Kit d’immunodosage de l’insuline humaineEzassay BiotechnologyHM200
KRBH tampon (Sucre, sans BSA)coolaberSL65501500 mL
Oxygénateur à membraneXi’an Xijing Appareil médical5
Ciseaux microscopiquesShanghai JinzhongYBC020
Pince micro-serrefineNingbo Aiguille médicale180709
Pince de microchirurgieShanghai JinzhongWA3010, WA3020
Type d’aiguillefiltre N-bulivLG05-133-2
Povidone-iode SolutionShanghai likang Désinfectant Hi-Tech20231016J
pompe 11Elite Harvard ApparatusPC5  ; 70-4500
ÉcarteurGlobalebio (Pékin) TechnologieGEKK-10mm10 mm
Tube en siliconeproduits scientifiques#BB518-120.31 mm × ; 0.64 mm
Tube en siliconeFisher Scientific#11-189-15AID 0.5 mm
Chlorure de sodium injectableBaxterS24020234.5 g/500 mL
Suturechirurgicale en soieYangzhou Huanyu Équipement médical6-0
Modulation de températureXi’an Xijing Appareil médical6
Bain-marie thermostatiqueJiaxing Junsi ElectronicsHIH-1220 V 50 HZ
Joint à trois voiesYISAIAQTCY1.6ID 0,4 mm
Chlorhydrate de xylazine InjectionShengXin20240106200 mg/2mL
Zoletil 50VirbacWK001250 mg/5mL

Références

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