Stratégies d’imagerie et de montage par microscopie à feuillet de lumière pour les embryons précoces de poisson-zèbre

Résumé

Une stratégie de préparation d’échantillons pour l’imagerie d’embryons précoces de poisson-zèbre dans un chorion intact à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière est décrite. Il analyse les différentes orientations que les embryons acquièrent à l’intérieur du chorion aux stades épibolique et bourgeonnaire à 70 % et détaille les stratégies d’imagerie pour obtenir une résolution à l’échelle cellulaire dans tout l’embryon à l’aide du système de feuillet lumineux.

Résumé

La microscopie à feuillet de lumière est devenue la méthodologie de choix pour l’imagerie en direct d’embryons de poisson-zèbre sur de longues échelles de temps avec une phototoxicité minimale. En particulier, un système multiview, qui permet la rotation des échantillons, permet d’imager des embryons entiers sous différents angles. Cependant, dans la plupart des séances d’imagerie avec un système multivue, le montage des échantillons est un processus fastidieux car les échantillons sont généralement préparés dans un tube en polymère. Pour faciliter ce processus, ce protocole décrit les stratégies de montage de base pour l’imagerie du développement précoce du poisson-zèbre entre les stades épibolique de 70 % et les premiers stades somite. Plus précisément, l’étude fournit des statistiques sur les différentes positions par défaut des embryons aux stades de 70 % de l’épibolie et du bourgeon dans le chorion. De plus, il traite du nombre optimal d’angles et de l’intervalle entre les angles requis pour imager des embryons entiers de poisson-zèbre aux premiers stades du développement afin que des informations à l’échelle cellulaire puissent être extraites en fusionnant les différentes vues. Enfin, étant donné que l’embryon couvre tout le champ de vision de la caméra, ce qui est nécessaire pour obtenir une résolution à l’échelle cellulaire, ce protocole détaille le processus d’utilisation des informations de billes situées au-dessus ou en dessous de l’embryon pour l’enregistrement des différentes vues.

Introduction

Garantir une phototoxicité minimale est une exigence majeure pour l’imagerie d’embryons vivants avec une résolution spatio-temporelle élevée pendant de longues périodes. Au cours de la dernière décennie, la microscopie à feuillet de lumière est devenue la méthodologie de choix pour répondre à cette exigence 1,2,3,4,5,6,7. Brièvement, dans cette technique qui a été utilisée pour la première fois en 2004 pour capturer les processus de développement⁸, deux fines feuilles de laser alignées traversent l’embryon à partir d’extrémités opposées, éclairant uniquement le plan d’intérêt. Un objectif de détection est placé orthogonalement, puis la lumière fluorescente émise par tous les points éclairés de l’échantillon est collectée simultanément. Une image 3D est ensuite obtenue en déplaçant séquentiellement l’embryon à travers la feuille de lumière statique.

De plus, dans une forme spécifique de cette méthodologie, appelée microscopie à feuillet de lumière multivue, les échantillons peuvent être suspendus dans un tube en polymère qui peut être tourné à l’aide d’un rotor, permettant d’imager le même embryon sous plusieurs angles ^9,10,11. Après l’imagerie, les images sous plusieurs angles sont fusionnées en fonction de marqueurs de recalage, qui sont généralement des marqueurs fluorescents globulaires à l’intérieur de l’embryon (par exemple, des noyaux) ou dans le tube (par exemple, des billes fluorescentes). L’imagerie multivue et la fusion améliorent considérablement la résolution axiale, offrant une résolution isotrope sur les trois dimensions¹². Bien qu’il s’agisse d’un grand avantage, l’un des principaux défis de la méthodologie multiview est le montage d’échantillons, où les embryons doivent être montés et maintenus en place dans les tubes pendant toute la durée de l’imagerie.

Pour effectuer une imagerie multivue, pour maintenir les embryons en place et empêcher les mouvements pendant l’imagerie, les embryons peuvent être intégrés dans l’agarose. Cependant, cela conduit souvent à une croissance et à un développement préjudiciables, en particulier pour les embryons de poisson-zèbre à un stade précoce¹³, le système modèle dont il est question ici. Une deuxième stratégie de montage consiste à utiliser un tube mince qui est à peine plus grand que le diamètre de l’embryon, où l’embryon peut être tiré dans le tube avec le milieu embryonnaire, suivi de la fermeture du fond du tube avec un bouchon d’agarose¹⁴. Dans cette méthode, parce que le tube est rempli de milieu embryonnaire, les marqueurs d’enregistrement tels que les billes fluorescentes ne peuvent pas être utilisés pour la fusion des différentes vues, et l’enregistrement dépend donc des marqueurs à l’intérieur de l’embryon. En général, les billes agissent comme de meilleurs marqueurs de repérage, car le signal des marqueurs à l’intérieur de l’embryon se dégrade à mesure que l’on s’enfonce plus profondément dans l’échantillon en raison des limites d’éclairage et de détection de tout microscope.

Ainsi, une troisième approche, qui sera détaillée ici et utilisée précédemment 5,13,14,15,16, consiste à imager des embryons précoces de poisson-zèbre avec un chorion intact et à remplir le tube avec un pourcentage minimal d’agarose, qui contient des billes comme marqueurs d’enregistrement. Dans ce scénario, étant donné qu’il n’est pas possible d’intervenir manuellement pour positionner les embryons dans un chorion, cette étude fournit des statistiques sur l’orientation par défaut des embryons précoces de poisson-zèbre, en se concentrant particulièrement sur 70% des stades d’épibole et de bourgeon. Il discute ensuite du nombre optimal de vues requis pour l’imagerie des embryons à un stade précoce à une résolution à l’échelle cellulaire et détaille le processus de fusion à l’aide de BigStitcher, un plugin^basé sur les FIDJI 10,17,18. L’ensemble de ce protocole, qui utilise un objectif 20x/1 NA, vise à faciliter l’utilisation par les embryologistes de poisson-zèbre de systèmes de feuilles de lumière multivues pour l’imagerie d’embryons avec des noyaux et des marqueurs membranaires de la gastrulation aux premiers stades sommites.

Protocole

Les procédures d’entretien et expérimentales du poisson-zèbre utilisées dans cette étude ont été approuvées par le comité d’éthique animale de l’établissement, voir les références TIFR/IAEC/2023-1 et TIFR/IAEC/2023-5. Des embryons obtenus par croisement de poissons hétérozygotes exprimant Tg(actb2 :GFP-Hsa.UTRN)¹⁹ ont été injectés avec l’ARNm H2A-mCherry (30 pg) au stade unicellulaire. L’ARNm H2A-mCherry a été synthétisé à l’aide du plasmide pCS2+ H2A-mCherry (un don du laboratoire Oates, EPFL) par transcription in vitro . Les embryons exprimant les deux marqueurs, appelés respectivement Utr-GFP et H2A-mCherry, dans le reste du protocole, ont été imagés aux stades de l’épibole et du bourgeon à 70 %. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation d’échantillons pour l’imagerie multi-vues

1. Préparation des tubes FEP/PTFE
   1. Nettoyez les tubes FEP/PTFE en suivant les procédures décrites précédemment¹⁴.
   2. Après le nettoyage, coupez les tubes en longueurs de 2 à 2,5 cm selon les besoins et rangez-les dans des tubes de microcentrifugation de 2 ml contenant de l’eau distillée doublement. Les tubes peuvent être conservés de cette manière pendant environ un mois.
   3. Avant la préparation de l’échantillon, chauffez les tubes à 70-75 °C pendant environ 25 minutes pour redresser les tubes. Évitez l’encombrement dans chaque tube de microcentrifugation pour éviter l’agglutination, en assurant un espace suffisant pour un redressement efficace du tube.
      REMARQUE : Portez des gants pendant toute la procédure de manipulation des tubes, car toute empreinte digitale/particule de poussière laissée sur les tubes peut interférer avec l’imagerie.
2. Préparation de l’agarose
   1. Préparez les solutions mères tampon E3 50x comme suit :
      1. Stock 1 - 3,252 g de Na₂HPO₄, 0,285 g de KH₂PO₄, 11,933 g de NaCl, 0,477 g de KCl dans 1 L d’eau déminéralisée
      2. Stock 2 - 2,426 g de CaCl₂, 4,067 g de MgSO₄ dans 1 L d’eau déminéralisée.
   2. Pour fabriquer 1 tampon E3, ajoutez 20 ml de chacune des solutions mères 1 et 2 dans 960 ml d’eau désionisée.
      REMARQUE : N’ajoutez pas de bleu de méthylène dans le tampon E3 utilisé pour l’imagerie, car cela provoque une diffusion de la lumière.
   3. Dissoudre l’agarose à bas point de fusion dans 1x E3 en chauffant à 70-75 °C sur un bloc chauffant en agitant jusqu’à ce que la solution devienne claire sans grumeaux ni cristaux.
   4. Pour l’imagerie multivue, ajoutez des billes fluorescentes disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux) à la solution d’agarose, ce qui permet le recalage de l’image pendant l’analyse. Soniquez les billes à température ambiante avec une fréquence de 40 kHz pendant 20 à 30 min dans un ultrasoniseur à bain d’eau pour désagréger les billes.
   5. Après la sonication, ajouter 1 μL de billes à 10 mL de solution d’agarose dans un tube de 15 mL et bien agiter le tube pour assurer une dispersion uniforme des billes.
      REMARQUE : Le volume de solution de billes à ajouter à l’agarose dépend de la solution mère et du fabricant. Essayez une gamme de volumes et choisissez une concentration où les billes apparaissent bien dispersées lorsqu’elles sont imagées dans le système de feuillet de lumière. Trop de billes peuvent s’agréger malgré la sonication et le vortex, tandis que trop peu de billes peuvent affecter le recalage de l’image.
   6. Conservez le tube d’agarose avec les billes ajoutées dans un bain-marie fermé maintenu à 37 °C pendant au moins 30 minutes avant la préparation de l’échantillon. Cela permet de faire baisser la température de l’agarose de 70 °C à 37 °C.
3. Préparation des échantillons
   1. Installez les poissons par paires avec des séparateurs la veille du jour de l’imagerie. Retirez les séparateurs pendant environ 15 minutes et prélevez les embryons en utilisant la procédure standard²⁰.
   2. Une fois que les embryons ont atteint le stade d’intérêt pour la préparation de l’échantillon, versez la totalité des 10 ml d’agarose (avec des billes) maintenue à 37 °C dans une boîte de Pétri de 6 cm.
   3. Attendez environ 2-3 minutes pour ramener la température en dessous de 33 °C avant de transférer 10 à 15 embryons dans la solution d’agarose.
      REMARQUE : Il s’agit d’une étape importante pour prévenir tout choc thermique possible pour les embryons transférés dans l’agarose.
   4. Assurez-vous que le moins de tampon E3 possible est ajouté à la solution d’agarose lors du transfert des embryons. Faites tourner la boîte de Pétri pour que le peu de tampon qui aurait été transféré soit bien dispersé.
   5. Porter des gants pour le reste de la procédure de préparation de l’échantillon.
   6. Prenez une micropipette de 200 μL avec une pointe de pipette appropriée et insérez un tube droit nettoyé sorti du tube de la microcentrifugeuse dans la pointe de la pipette, comme illustré à la figure 1A,B.
   7. Aspirez un peu d’agarose dans le tube, suivi de 2-3 embryons à l’aide de la micropipette (Figure 1C,D). Assurez-vous que les embryons sont près du fond du tube (Figure 1E), ce qui deviendra important lors de la mise en place de l’imagerie. Assurez-vous également qu’il y a un peu d’agarose entre les différents embryons (figure 1E) afin que les billes de cette région puissent être utilisées comme marqueurs d’enregistrement.
   8. Sans relâcher la pression de la pipette, détachez le tube de la pointe de la pipette et placez-le sur le couvercle de la boîte de Pétri remplie d’E3 pour que l’agarose se solidifie (Figure 1F).
   9. Répétez les étapes 1.3.6 à 1.3.8 jusqu’à ce que tous les embryons de la boîte de Pétri soient transférés dans les tubes.
   10. Une fois que l’agarose s’est solidifiée (ce qui peut prendre de 5 à 10 minutes et peut être confirmé en vérifiant l’agarose dans la boîte de Pétri), transférez les tubes dans un tube de microcentrifugation de 2 mL rempli d’E3 (figure 1G).
   11. Conservez les tubes contenant les embryons dans un incubateur à 28 °C ou 33 °C, selon les besoins, avant de passer à l’imagerie multivue.

2. Imagerie multivue

REMARQUE : Cette étape présente une procédure générale pour l’imagerie multivue des embryons de poisson-zèbre à leurs premiers stades de développement. La méthode détaillée ci-dessous peut être facilement adaptée à tout système de microscopie à feuillet de lumière multivue.

1. Localisation de l’embryon
   REMARQUE : Remplissez la chambre d’échantillon du microscope avec le milieu embryonnaire²⁰ et réglez la température de la chambre d’échantillon à la température d’intérêt au moins 10 min avant l’imagerie.
   1. Assemblez le porte-échantillon comme décrit précédemment²¹, mais avec une modification. Comme l’imagerie sera effectuée à travers le tube, insérez le tube contenant les embryons directement dans un capillaire de bon diamètre, de sorte qu’il soit maintenu en place sans pousser l’agarose vers l’extérieur et déranger les embryons au fond (Figure 1H).
      REMARQUE : Étant donné que la chambre d’échantillonnage a une hauteur définie, s’assurer que les embryons sont situés vers le fond du tube pendant la préparation de l’échantillon (comme mentionné à l’étape 1.3.7) permettrait de positionner l’embryon dans le champ de vision sans heurter le sol de la chambre.
   2. Insérez le porte-échantillon dans le système multiview et utilisez les commandes x et y pour placer l’embryon au centre du champ de vision.
   3. Utilisez la commande z du navigateur d’échantillon pour ensuite mettre l’embryon au point.
   4. À ce stade, l’orientation de l’embryon à l’intérieur du chorion sera clairement visible, et si elle n’est pas satisfaisante, insérez un nouveau tube et choisissez l’embryon avec une orientation d’intérêt.
2. Alignement des feuilles de lumière
   1. Une fois que l’embryon est en position, configurez tous les paramètres expérimentaux - lasers, trajet lumineux, filtre, séparateur de faisceau et caméra.
   2. Lors de la configuration des paramètres d’acquisition, si le logiciel propose une option de balayage pivot, sélectionnez-la. Un balayage pivot réduira l’effet d’ombrage émergeant de la feuille de lumière lorsqu’elle rencontre des structures ou des régions opaques dans l’échantillon.
   3. Lancez le balayage en direct de l’échantillon. Configurez la taille du bit, la puissance du laser et le zoom souhaité, ce qui déterminera l’épaisseur de la feuille de lumière et, par conséquent, la résolution axiale.
   4. Pour aligner les feuilles lumineuses, passez d’abord à l’éclairage unilatéral et modifiez les paramètres des deux feuilles lumineuses (gauche et droite) séquentiellement. Zoomez numériquement sur une région de l’échantillon où des structures d’intérêt claires sont visibles.
      REMARQUE : Dans cette étude, un marqueur nucléaire (H2A-mCherry) ou un marqueur membranaire (Utr-GFP) a été utilisé pour aligner les feuilles. Il est recommandé de modifier les paramètres de la feuille de lumière dans le logiciel afin d’obtenir le contraste de signal le plus net dans la région d’intérêt.
   5. Une fois que les deux feuilles lumineuses sont optimisées individuellement pour obtenir le meilleur signal, allumez les deux feuilles lumineuses. Effectuez un deuxième tour d’alignement et assurez-vous que le scintillement est minimal, ce qui indique un assez bon alignement des deux feuilles.
   6. Une fois l’alignement terminé, activez l’option de fusion automatique des images générées par les deux feuilles, si le logiciel le permet. Alternativement, on peut d’abord aligner grossièrement les feuilles de lumière en se concentrant sur les billes autour de l’échantillon, puis affiner l’alignement à l’aide des informations de l’échantillon.
      REMARQUE : Lors de l’imagerie avec deux fluorophores (tels que des marqueurs nucléaires et membranaires), l’alignement optimal est généralement légèrement différent pour les deux structures. Dans ce scénario, choisissez un paramètre basé sur les contraintes de traitement en aval. Par exemple, si les limites cellulaires doivent être segmentées, ce qui nécessite un traitement relativement plus intensif, alignez les feuillets légers en fonction du marqueur de membrane.
3. Configuration de l’imagerie multivue
   1. Après avoir aligné les feuilles de lumière, activez les options permettant d’effectuer une pile z ainsi qu’une imagerie multivue.
   2. Lancez la numérisation en direct et naviguez à l’aide du navigateur d’échantillons pour sélectionner la première vue. Dans cette vue, configurez l’intervalle de tranches, suivi de la première et de la dernière tranche de la pile z. Ajoutez cette position dans la boîte de dialogue multivue, qui prend note de la position et des informations de la pile z pour cette vue.
   3. Passez à la vue suivante en modifiant l’angle dans le navigateur d’échantillons. Configurez la pile z pour la deuxième vue et ajoutez les informations dans la boîte de dialogue multivue.
   4. Répétez la même opération pour des vues supplémentaires.
      REMARQUE : Assurez-vous qu’un certain nombre minimum de tranches sont imagés dans chaque vue afin qu’il y ait suffisamment de chevauchement entre les différentes vues, ce qui facilitera éventuellement l’enregistrement des vues pendant le traitement. Le nombre minimum de tranches dépendra du facteur de zoom ainsi que du nombre d’angles choisis pour l’imagerie.
   5. Après avoir configuré toutes les vues, enregistrez ces informations dans un fichier texte (nommé 'embryo-positions', par exemple), qui contiendra les informations de la pile z, les coordonnées (x, y, z) du tube ainsi que les spécifications de l’angle pour chaque vue. Après l’enregistrement, effacez toutes les positions de la boîte de dialogue multivue.
   6. Étant donné que l’imagerie est faite avec un chorion intact, qui est relativement grand, il n’est pas possible de voir les billes dans le tube avec les mêmes réglages. Par conséquent, les informations sur les billes doivent être acquises à partir d’une position différente dans le tube. Pour ce faire, traduisez par une coordonnée « y » différente loin de l’embryon où les billes sont visibles. Ajoutez cette position à la boîte de dialogue multivue et enregistrez-la dans un fichier texte (nommé 'beads-y', par exemple).
      REMARQUE : Imagez les billes aussi près que possible de l’échantillon d’embryon afin de minimiser les effets d’éventuelles différences de courbure du tube aux deux positions. Par conséquent, si plusieurs embryons sont montés dans le tube, il est important de laisser un peu d’agarose entre les tubes pour imager les billes (comme mentionné à l’étape 1.3.7).
   7. Allez dans le dossier où les fichiers texte sont enregistrés et dupliquez le fichier 'embryo-positions' dans un nouveau fichier nommé 'beads-positions'. Remplacez la coordonnée y de toutes les vues du fichier 'beads-positions' par la coordonnée y du fichier 'beads-y'. Cela garantira que les perles sont imagées avec le même nombre de vues, d’empilements z et de coordonnées x, mais à une position y différente dans le tube.
   8. Revenez au logiciel d’imagerie et chargez le fichier « bead-positions » dans le logiciel. Si l’option de série chronologique est activée, sélectionnez un cycle et démarrez l’expérience. Enregistrez les images de perles en tant que 'billes', qui seront utilisées pour enregistrer les différentes vues pendant le traitement de l’image.
   9. Après avoir pris les images des billes, effacez les positions et chargez le fichier initial « embryo-positions » dans le logiciel. Réglez le nombre de cycles souhaité avec un intervalle de temps approprié et démarrez l’expérience.

3. Analyse d’images multivues

REMARQUE : Pour fusionner les images multivues, un plugin FIJI, BigStitcher, qui est la dernière version du plugin Multiview Reconstruction, est utilisé 10,17,18. Le plug-in peut être installé en ajoutant le plug-in BigStitcher dans la fonction « Gérer les sites de mise à jour », accessible dans l’option « Mettre à jour » du menu « Aide ». Une fois installé, le plugin apparaîtra dans le menu 'Plugins'. Les grandes étapes de la fusion sont les suivantes : (1) Définir des paires de fichiers .xml/.h5 pour les billes et les embryons ; (2) Enregistrez toutes les vues avec le fichier de perles ; (3) Extraire la fonction d’étalement de point (PSF) pour les billes, qui peut être utilisée pour la déconvolution (Figure 2A) ; (4) Transférez les informations d’enregistrement et de PSF du fichier de billes vers le fichier d’embryon et commencez la déconvolution multivue. La plupart de ces étapes ont déjà été décrites en détail²¹, et ici, les étapes qui sont traitées différemment sont décrites.

1. Définition d’un jeu de données .xml
   1. Définissez un nouvel ensemble de données pour les billes et l’embryon comme « beads.xml » et « embryo.xml », respectivement, comme décrit précédemment²¹.
2. Détection et enregistrement à l’aide de points d’intérêt
   1. Une fois l’exportation du fichier beads.xml réussie, sélectionnez les vues requises pour l’enregistrement dans la boîte de dialogue « Multiview Explorer » (Figure 2B). Cliquez avec le bouton droit de la souris et choisissez Détecter les points d’intérêt. Procédez comme décrit^{à la section 21}.
   2. Après avoir détecté les points d’intérêt, sélectionnez toutes les vues, cliquez avec le bouton droit de la souris et choisissez Enregistrer à l’aide des points d’intérêt. Suivez le protocole décrit²¹.
   3. Vérifiez soigneusement si l’enregistrement du cordon a fonctionné avec succès. Une fois l’enregistrement réussi, les perles superposées de différentes vues se superposent (Figure 2C). Pour vérifier la précision du repérage, sélectionnez deux vues consécutives, accédez à la zone de chevauchement et basculez entre les deux vues pour observer si les perles imagées sous différents angles sont superposées. Répétez cette opération pour chaque vue consécutive.
   4. Si le chevauchement n’est pas précis, réessayez l’enregistrement en assouplissant la signification requise pour l’enregistrement et/ou l’erreur acceptable de chevauchement (appelée « erreur RANSAC » dans la boîte de dialogue « Enregistrement »).
   5. Une fois l’inscription réussie, cliquez sur Enregistrer dans la fenêtre « Multiview Explorer » pour enregistrer le fichier .xml mis à jour.
      REMARQUE : Enregistrez également le fichier journal, car il contient des informations détaillées supplémentaires sur l’efficacité de l’enregistrement. Pour traduire les informations d’enregistrement des billes à l’embryon, suivez les étapes décrites ci-dessous.
   6. Ouvrez le fichier bead.xml dans l’éditeur de texte de votre choix et copiez l’intégralité du bloc sous « ViewRegistrations ».
   7. Ouvrez le embryo.xml et remplacez le bloc « ViewRegistrations » par le bloc copié à partir du fichier de billes. S’il y a plusieurs canaux, remplacez les informations d’enregistrement de chaque canal comme ci-dessus. Les informations d’enregistrement peuvent être transférées manuellement ou à l’aide du code MATLAB personnalisé qui peut être téléchargé ici : https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
   8. Ouvrez le fichier embryo.xml dans « BigStitcher » et vérifiez soigneusement si l’enregistrement a fonctionné avec succès pour l’embryon. Répétez la même chose que pour les perles, en vérifiant le chevauchement des structures d’intérêt toutes les deux vues consécutives.
      REMARQUE : Parfois, l’enregistrement de l’embryon peut ne pas être aussi souhaitable malgré le fait que les billes soient parfaitement enregistrées. Cela est possible s’il y a de légers changements dans la courbure du tube entre la position où les billes sont imagées et la position de l’embryon. De plus, il pourrait y avoir des mouvements subtils de l’embryon entre les vues car il flotte librement dans le chorion. Dans ce cas, effectuez un deuxième tour d’enregistrement à l’aide d’un marqueur nucléaire dans l’embryon.
   9. Pour ce faire, ouvrez le fichier embryo.xml dans « BigStitcher », faites un clic droit sur toutes les vues qui ont le marqueur nucléaire, et choisissez Détecter les points d’intérêt.
   10. Renommez les points d’intérêt en « noyaux » et procédez aux étapes comme pour les billes.
   11. Lors de la définition des paramètres de « différence de gaussienne », assurez-vous que la plupart, sinon la totalité, des noyaux sont détectés et qu’il n’y a pas de détection nucléaire ectopique. Ensuite, cliquez sur Terminé.
   12. Ensuite, enregistrez ces vues en choisissant Enregistrer à l’aide de points d’intérêt et optez pour l’option Basé sur un descripteur précis (invariant de traduction ). Assurez-vous que l’option « Comparer toutes les vues et tous les points d’intérêt » est sélectionnée et utilisez les « noyaux » comme points d’intérêt. Utilisez l’option pour corriger la première vue et ne pas cartographier en arrière.
   13. Pour l’enregistrement, utilisez un modèle affine avec une régularisation rigide et les paramètres par défaut dans le plugin.
   14. Vérifiez à nouveau le succès de l’inscription en comparant toutes les deux vues consécutives.
   15. Une fois l’inscription réussie, cliquez sur Enregistrer dans la fenêtre « Multiview Explorer » pour enregistrer le fichier .xml mis à jour.
   16. Ouvrez le fichier embryo.xml dans l’éditeur de texte de votre choix et copiez les informations d’enregistrement des marqueurs nucléaires vers les autres canaux.
3. Extraction et affectation de fonctions d’étalement de points
   1. Pour effectuer une déconvolution multivue, extrayez la PSF du système d’imagerie à partir de l’ensemble de données de billes enregistrées et appliquez-la au fichier de l’embryon.
   2. Pour obtenir ces informations, sélectionnez toutes les vues dans le fichier de perle, puis cliquez avec le bouton droit de la souris et choisissez les options Fonctions d’étalement de points et Extraction .
   3. Dans la boîte de dialogue qui apparaît, assurez-vous que les options Utiliser les points d’intérêt correspondants et Supprimer les projections d’intensité minimale de la PSF sont cochées, passez aux tailles PSF par défaut et cliquez sur OK.
      REMARQUE : Si l’extraction PSF réussit pour toutes les vues, le fichier journal affichera « Extrait n/n PSF »
   4. Ensuite, réenregistrez le fichier .xml. Une case cochée dans la colonne PSF de la boîte de dialogue « Multiview Explorer » apparaîtra, et un dossier « psf » sera généré dans le dossier respectif avec tous les PSF extraits.
   5. Ouvrez le fichier embryo.xml et attribuez le PSF à chaque vue séparément. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur « une vue » → cliquez sur Fonctions d’étalement de points → choisissez Attribuer → sélectionnez Avancé, puis Attribuer un nouveau PSF à toutes les vues sélectionnées. Cliquez sur Parcourir, allez dans le chemin du fichier .xml et ouvrez le dossier psf .
   6. Choisissez le PSF correspondant avec l’ID correspondant dans la vue sélectionnée et cliquez sur OK, après quoi la case PSF apparaîtra cochée dans la fenêtre 'Multiview Explorer'.
   7. Répétez le processus pour toutes les autres vues.
4. Fusion et déconvolution multivues
   1. Une fois que la fonction d’étalement de points a été affectée à toutes les vues, cliquez avec le bouton droit de la souris et choisissez Multiview Deconvolution.
   2. Sélectionnez le cadre de sélection en tant que vues actuellement sélectionnées. Pour ce travail, l’accélération OSEM par défaut et le nombre d’itérations fonctionnent bien.
   3. Sous-échantillonnez les images si nécessaire si vous souhaitez un calcul plus rapide ou si la mémoire du processeur est limitante.
      REMARQUE : Si la RAM requise dépasse la mémoire existante, un message d’erreur d’avertissement de couleur rouge apparaîtra en bas de la fenêtre. Ne démarrez pas la déconvolution si cet avertissement apparaît, car le plugin se bloquera et cessera de répondre à un moment donné pendant le traitement.
   4. Pour évaluer la progression de la déconvolution, consultez le fichier journal, qui affichera les résultats toutes les 5 itérations.
   5. Pour augmenter la vitesse de calcul, effectuez une déconvolution multivue dans le GPU si déjà installé.
      REMARQUE : À la fin de ce processus, une fenêtre d’image fusionnée apparaîtra, qui peut être enregistrée en tant que fichier tiff.

Résultats

L’orientation précise de l’échantillon est un élément essentiel de l’utilisation efficace d’un dispositif de microscopie. Cependant, l’orientation manuelle des échantillons n’est souvent pas possible lors de l’utilisation d’un système de feuille lumineuse à vues multiples, étant donné la nécessité de préparer les échantillons dans un tube. Par conséquent, pour vérifier s’il existe des positions stéréotypées que les embryons occupent dans le chorion, les embryons de poisson-zèbre ont été imagés à 70% d’épibolie (environ 7 h après la fécondation (hpf)), car l’imagerie en accéléré de la gastrulation aux premiers stades somites était au centre de cette étude. Lorsque les échantillons ont été préparés immédiatement avant l’imagerie à 70 % d’épibolie, les embryons n’ont montré aucune orientation spécifique fréquemment observée sur les échantillons. Comme cela n’est souvent pas souhaitable, les échantillons ont été préparés bien avant la gastrulation et stockés dans des tubes de microcentrifugation à la température appropriée jusqu’au début de l’imagerie. Dans ces conditions, à 70 % d’épibolie (N = 3 ; n = 87 embryons), les orientations de l’embryon pouvaient être classées en (1) horizontale, lorsque l’axe animal-végétal (AV) de l’embryon était orthogonal à l’axe long du tube en polymère, (2) verticale, lorsque l’axe AV était parallèle à l’axe long du tube en polymère, et, (3) oblique, lorsque l’axe AV était à un angle aigu (Figure 3A). La position horizontale était la moins représentée, tandis que les positions verticale et oblique étaient également observées (Figure 4).

Lorsque les embryons ont été laissés dans les tubes, les embryons étaient stables dans ces positions respectives jusqu’à 90% d’épibole, après quoi la plupart des embryons ont changé d’orientation. Par conséquent, une deuxième série de documentation des orientations au stade du bourgeon de l’embryogenèse (environ 10 hpf) a été nécessaire pour tenir compte des orientations modifiées. Cela a été fait pour des échantillons préparés indépendamment. Pour l’imagerie des premiers stades somites, il a déjà été rapporté qu’un embryon avec sa notocorde orthogonale à l’axe long du tube en polymère était l’orientation idéale car il permet de visualiser plusieurs somites bilatéraux se formant le long de l’axe¹⁵. Lorsque des échantillons ont été préparés avant la gastrulation (N = 3, n = 93 embryons), environ 25 % des embryons présentaient cette orientation (Figure 4) et ces embryons sont restés stables dans cette orientation au moins jusqu’au stade 8-somite, conformément aux rapports précédents¹⁵. Le reste des embryons présentait diverses autres orientations au stade du bourgeon (classés dans les figures 3B et 4) ; Cependant, beaucoup d’entre eux se sont réorientés vers la position horizontale au début de la formation de Somite. Il est intéressant de noter qu’un pourcentage similaire d’embryons présentaient une orientation horizontale au stade du bourgeon, que l’échantillon ait été préparé avant la gastrulation, à 70 % de l’épibole ou immédiatement avant le stade du bourgeon. Ainsi, le timing de préparation des échantillons semble moins critique pour l’orientation horizontale d’intérêt pour l’imagerie des étages sommites, contrairement à ce qui a été observé pour l’imagerie à 70% d’épibolie.

L’avantage d’un système multiview est la possibilité de visualiser le même échantillon sous plusieurs angles. Cependant, pour les embryons de poisson-zèbre aux stades mentionnés, le nombre de vues nécessaires pour obtenir une résolution cellulaire sur l’ensemble de l’embryon n’est pas clair. Pour caractériser cela, les embryons de poisson-zèbre ont été imagés à l’aide d’un objectif 20x/1 NA dans le bras de détection avec un facteur de zoom de 1, ce qui correspondait à une épaisseur de feuille légère de 4,57 μm. Dans ces paramètres, l’embryon couvrait tout le champ de vision d’une caméra sCMOS d’une taille de pixel de 6,5 μm et d’une zone de 1920 par 1920 pixels. La micro-injection d’ARNm pour un fluorophore marqué à l’histone (H2A-mCherry) dans des embryons au stade 1 cellule obtenus à partir d’une lignée transgénique dont les filaments d’actine étaient marqués (Utr-GFP) a permis de visualiser à la fois les noyaux et les membranes cellulaires de l’embryon. Pour effectuer la fusion multivue d’embryons avec différents intervalles angulaires, l’acquisition à 360° des embryons transgéniques doubles ainsi que des billes dans le tube a été réalisée à tous les intervalles de 30° (n = 3 embryons à 70% d’épibole ; n = 3 embryons au stade de bourgeon) ou 45° (n = 3 embryons à 70% d’épibole ; n = 3 embryons au stade de bourgeonnement) avec environ 100 tranches dans chaque angle et un intervalle de coupe de 2 μm. En sautant d’angles alternatifs pendant le traitement de l’image, les acquisitions de 30° et 45° ont également fourni les ensembles de données de 60° et 90°.

Les images acquises ont ensuite été enregistrées à l’aide des informations sur les billes, et les détails d’enregistrement ont été transférés dans l’ensemble de données sur l’embryon, comme décrit dans la section protocole. L’enregistrement à l’aide du plugin BigStitcher a été réussi pour les différentes acquisitions, à l’exception de l’ensemble de données à 90°, ce qui est probablement dû à une moindre couverture de l’échantillon sous chaque angle. Pour surmonter ce problème, les embryons ont été imagés tous les 90° avec environ 400 coupes dans chaque angle et un intervalle de coupe de 2 μm, à la fois aux stades épibolique et bourgeonnaire de 70 %, qui ont été enregistrés avec succès (n = 3 embryons pour chaque stade).

L’étape suivante consistait à effectuer la fusion multivues et la déconvolution des ensembles de données enregistrés. Cela a été fait avec un sous-échantillonnage 4x pour accélérer le calcul. Comme on le voit dans la représentation des noyaux à partir de vues individuelles et d’un embryon reconstruit à plusieurs vues (figure 5), les vues individuelles couvrent un champ de vision plus petit, qui, lors de la fusion, a donné une image de l’embryon entier. Pour la représentation, les noyaux ont été détectés à l’aide de Mastodon (https://github.com/mastodon-sc/mastodon), un plugin basé sur FIJI, qui peut être ajouté dans la section « Gérer les sites de mise à jour » du menu « Aide » de FIJI et accessible sous le menu des plugins une fois ajouté. Pour la détection, les images respectives ont d’abord été converties au format XML/hdf5, puis la détection nucléaire a été effectuée à l’aide du plugin « Detection » de Mastodon avec un détecteur DoG (diamètre 6 μm et seuil de qualité 80).

Parmi les différentes images fusionnées, l’ensemble de données à 90° a montré un arrière-plan très élevé plus profondément dans l’échantillon, le rendant impropre à la réalisation d’une quelconque quantification. Ainsi, contrairement à des échantillons plus petits tels que les embryons de drosophile, qui ont souvent été imagés avec un intervalle de 90° dans d’autres études ^9,22, la même chose n’est pas recommandée pour l’imagerie des embryons précoces de poisson-zèbre à l’aide d’un objectif 20x/1 NA. Entre les ensembles de données fusionnées à 30°, 45° et 60°, qualitativement, il n’y avait pas de différence substantielle dans l’information des noyaux (Figure 6B, rangée du haut) ; cependant, les structures plus fines telles que les limites cellulaires semblaient beaucoup mieux résolues avec l’ensemble de données fusionnées à 30° par rapport au reste (Figure 6C, rangée du haut).

Pour confirmer cette observation, Mastodon a été utilisé pour détecter des noyaux dans les images fusionnées obtenues à partir de l’imagerie tous les 30°, 45° et 60°. Trois régions des images fusionnées, une à une profondeur de 20 μm (Figure 6A), une à 50 μm et une à 100 μm de la surface de l’embryon, ont été choisies pour l’analyse. Pour comparer l’efficacité de la détection des noyaux entre les images, la détection a été effectuée comme décrit ci-dessus, avec des paramètres identiques sur les images fusionnées de différents intervalles angulaires. Dans toutes les régions analysées, chaque noyau a été détecté, indépendamment des images fusionnées obtenues à partir de l’imagerie tous les 30°, 45° ou 60° (figure 6B, rangée du bas). Ainsi, les structures globulaires telles que les noyaux peuvent être imagées à n’importe lequel des intervalles angulaires ci-dessus sans perte d’information.

Pour analyser les limites cellulaires, Tissue Analyzer²³, un plug-in FIJI couramment utilisé pour segmenter les cellules^{24, 25 et 26}, a été utilisé. Semblable à Mastodon, le plugin Tissue Analyzer peut être ajouté dans la section « Gérer les sites de mise à jour » du menu « Aide » dans FIJI et accessible sous le menu des plugins une fois ajouté. Les limites cellulaires ont été segmentées à l’aide de l’algorithme du bassin versant avec des paramètres par défaut et un fort flou allant de 1,5 à 2 selon la profondeur du tissu et un faible flou de 1. Ces paramètres ont été maintenus constants dans toutes les analyses, ce qui a facilité une comparaison simple. Lorsque les images segmentées ont été comparées manuellement aux images d’entrée d’origine, des erreurs ont été observées, où le logiciel n’a pas réussi à détecter une limite de cellule ou a tracé des limites de cellule inexistantes (Figure 6C, rangée du bas). Le nombre d’erreurs commises par le plug-in de l’analyseur de tissus a été normalisé en fonction du nombre total de liaisons détectées dans la région et calculé comme « erreur de segmentation des limites ». Bien que ces erreurs soient présentes dans toutes les régions analysées, le nombre d’erreurs a considérablement augmenté dans les images fusionnées obtenues à partir d’images à des intervalles angulaires de 45° et 60°, par rapport à 30° (Figure 6D). Cela indiquait que la résolution des images fusionnées était de plus en plus mauvaise lorsque l’intervalle angulaire était augmenté. Ainsi, pour segmenter des structures plus fines telles que les limites de cellules, un intervalle angulaire plus serré permet un traitement en aval plus facile.

Figure 1 : Préparation d’échantillons à l’aide de tubes en polymère. (A) Un tube en polymère des tubes de microcentrifugation stockés est prélevé à l’aide d’une pince. (B) Fixation du tube à l’extrémité d’une micropipette de 200 μL. (C) Aspirer des embryons à l’aide d’une pipette dans le tube. (D, E) Un tube en polymère avec des embryons au stade de bourgeon visibles vers le fond du tube. (F) Les tubes en polymère sont placés sur une boîte de Pétri avec E3 pour solidifier l’agarose. (G) Stockage des tubes en polymère dans un tube de microcentrifugation rempli d’E3. (H) Porte-échantillon assemblé avec le tube en polymère monté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Flux de travail d’analyse d’images multivues et recalage à l’aide de billes. (A) Le pipeline d’analyse d’images multivues. (B) L’image montre la fenêtre « Multiview Explorer » de BigStitcher, un plug-in FIJI, où chaque vue apparaît sur une seule ligne et contient des informations sur l’angle, le canal, l’enregistrement, les points d’intérêt et la PSF. Toutes les commandes décrites dans le protocole s’affichent lorsqu’une vue est sélectionnée et suivie d’un clic droit, comme illustré dans le menu contextuel. Les vues sélectionnées peuvent être visualisées dans la fenêtre BigDataViewer, comme indiqué. (C) Une image représentative du cordon avant (à gauche) et après l’enregistrement (à droite) obtenue à partir d’une imagerie à des intervalles angulaires de 30°. Toutes les vues angulaires ont été sélectionnées et affichées. Barres d’échelle : 75 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 : Vue d’ensemble des orientations embryonnaires par défaut. Images représentatives des orientations dans lesquelles les embryons tombent à l’intérieur du chorion à 70 % des stades épibolique (A) et bourgeonnant (B). La rangée supérieure de chaque panneau représente des images en fond clair obtenues à partir du système de feuille de lumière, et la rangée inférieure représente des caricatures représentatives. Les flèches en (B) indiquent la position de la notochorde, qui a été utilisée pour identifier l’orientation. Ap, pôle animal ; Vp, pôle végétal ; A, antérieur ; P, postérieur. Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Statistiques des différentes orientations embryonnaires. (A) La colonne empilée indique les pourcentages d’embryons qui tombent dans les orientations indiquées à 70 % d’épibolie lorsque les échantillons sont préparés avant la gastrulation. (B) Les colonnes empilées indiquent les pourcentages d’embryons qui se trouvent dans les orientations indiquées aux stades du bourgeon lorsque les échantillons sont préparés avant la gastrulation (à gauche), à 70 % d’épibolie (au milieu) et aux stades du bourgeon (à droite). N, le nombre de couvées indépendantes à partir desquelles les embryons ont été obtenus ; n, le nombre total d’embryons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Représentation des noyaux d’un embryon reconstruit à vues multiples. (A)Le nuage de points 3D représente les noyaux détectés dans un embryon reconstruit en plusieurs vues, imagé à un intervalle angulaire de 30°. Chaque cercle représente un noyau et les positions du centroïde des noyaux sont tracées. Les coordonnées nucléaires ont été obtenues à l’aide de Mastodon, un plugin FIJI. (B) Nuages de points 3D de noyaux à partir de trois vues représentatives du même embryon - les représentations étant espacées de 60°. Les couleurs de chaque noyau ont été attribuées au hasard. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Comparaison d’informations à l’échelle cellulaire dans des images fusionnées. (A) L’image de gauche montre un instantané d’un embryon reconstruit à plusieurs vues à une profondeur de 20 μm de la surface. Le cercle jaune représente la région utilisée pour une analyse plus approfondie. Barres d’échelle : 50 μm (dans tous les panneaux). (B) Images brutes représentatives de noyaux à 20 μm de profondeur de la surface de l’embryon à partir de trois ensembles de données imagés tous les 30°, 45° et 60° respectivement (en haut). Noyaux détectés (en vert) dans les mêmes images par Mastodon, un plugin FIJI (en bas). (C) Images brutes représentatives à 20 μm de profondeur de la surface de l’embryon à partir de trois ensembles de données imagés tous les 30°, 45° et 60° respectivement, à l’aide du marqueur d’actine, Utr-GFP (en haut). Les limites segmentées par Tissue Analyzer, un plug-in FIJI, sont affichées pour les mêmes images (en bas). Les flèches indiquent les erreurs commises par l’analyseur de tissus dans la segmentation des limites, la flèche jaune représentant une limite manquante et la flèche blanche représentant les limites détectées à tort alors qu’aucune limite ne semble exister visuellement. (D) La boîte à moustaches illustre le pourcentage d’erreurs commises par l’analyseur de tissus entre des embryons reconstruits à vues multiples imagés tous les 30°, 45° et 60° à différentes profondeurs. Les barres d’erreur indiquent 1,5 fois l’écart interquartile. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le positionnement d’un embryon dans la bonne orientation pour imager la région d’intérêt est l’une des étapes limitant le débit qui entraîne souvent l’échec d’une séance de microscopie pour un utilisateur. C’est d’autant plus le cas dans un microscope à feuillet de lumière multivue, où la manipulation manuelle de l’orientation est difficile car les échantillons sont intégrés dans un tube. Pour faciliter ce processus, cette étude rapporte les statistiques des différentes positions qu’un embryon de poisson-zèbre occupe entre 70% des stades épiboliques et précoces dans un chorion lorsque le tube en polymère avec les embryons est maintenu debout dans un tube de microcentrifugation.

À 70 % de l’épibole, les embryons orientés verticalement ou horizontalement fournissent des informations complémentaires sur les événements dans l’ensemble de l’embryon. Alors que l’orientation horizontale permet de visualiser la dynamique cellulaire dans le pôle animal ainsi que la dynamique des cellules subissant une épibolie vue du pôle végétal, l’orientation verticale permet de visualiser les côtés dorsal et ventral de l’embryon, y compris la dynamique cellulaire dans l’organisateur dorsal, l’internalisation des cellules pendant la gastrulation et les flux de convergence-extension. Cette étude montre qu’il existe une forte probabilité d’obtenir un embryon dans l’orientation verticale purement par hasard si les échantillons sont préparés quelques heures avant l’imagerie ; Cependant, l’orientation horizontale semble être beaucoup moins prévalente à ces stades. Pour les stades antérieurs à 70 % de l’épibolie, il est recommandé de documenter des statistiques similaires sur l’orientation de l’embryon dans le chorion avant de procéder à l’imagerie en accéléré, car le fait de disposer de ces informations à l’avance permet de gagner du temps à long terme.

À partir du stade du bourgeon, la meilleure orientation pour l’imagerie est un embryon positionné horizontalement, car cela permet de suivre la dynamique cellulaire le long de tout l’axe antéropostérieur du corps des embryons¹⁵. Obtenir un embryon dans cette orientation est relativement simple, car environ 25% des embryons tombent dans cette position stable, quel que soit le moment où l’échantillon est préparé. En général, pour l’imagerie de n’importe quel stade d’intérêt, il est recommandé de préparer environ 15 tubes avec deux à trois embryons dans chaque tube, ce qui garantira une forte probabilité d’obtenir des embryons dans l’orientation souhaitée et, par conséquent, une séance de microscopie réussie un jour donné. De plus, il est recommandé de trier les tubes environ une heure avant le stade d’intérêt afin de choisir un embryon avec la bonne orientation pour l’imagerie en accéléré.

Après avoir obtenu un embryon dans la bonne orientation, il est important de prendre en compte le nombre de vues et l’intervalle d’angle entre les vues pour l’imagerie. Cela dépend de la résolution spatiale et temporelle minimale requise. Plus il y a d’angles sous lesquels une structure ou une région particulière de l’embryon est imagée, meilleure est la résolution spatiale (comme le montre la figure 6), mais cela conduit à un compromis sur la résolution temporelle. Dans ce protocole, avec un système doté de deux bras d’éclairage et d’un bras de détection, l’imagerie de deux canaux sur 360° avec un intervalle angulaire de 30° et environ 100 tranches z dans chaque angle avec un espacement de tranche de 2 μm, a pris environ 3 minutes pour un point unique. Bien que cela soit suffisant pour suivre les cellules aux premiers stades embryonnaires, si l’on veut capturer des événements à dynamique plus rapide, il faut acquérir un plus petit nombre d’angles, ce qui garantit une meilleure résolution temporelle mais avec un compromis sur la résolution spatiale, en particulier si des structures plus fines telles que les limites cellulaires doivent être segmentées. Une deuxième option à envisager pour améliorer la résolution temporelle est d’utiliser un système multi-vues avec deux bras de détection, ce qui augmentera considérablement la vitesse d’acquisition comme récemment utilisée pour suivre les mouvements cellulaires pendant la gastrulation chez les embryons de poisson-zèbre¹⁶. De plus, bien que seul l’objectif 20x/1 NA ait été testé dans ce protocole, en fonction de l’échantillon imagé, de la résolution spatiale requise et du champ de vision, le bon objectif doit être pris en compte. Ensemble, sur la base du traitement en aval et de la quantification nécessaires pour un échantillon et un champ de vision particuliers, le nombre de vues et l’intervalle d’angle doivent être soigneusement choisis. Cependant, pour l’imagerie d’embryons entiers de poissons-zèbres précoces, en particulier avec une résolution à l’échelle cellulaire sous plusieurs angles, un objectif NA 20x/1 semble être optimal, car un objectif avec un grossissement plus faible et NA (par exemple, un objectif 10x/0,5 NA) aura une résolution beaucoup plus faible, ce qui entraînera probablement plus d’erreurs de segmentation, tandis qu’un objectif avec un grossissement et une NA plus élevés ne sera pas réalisable pour couvrir l’embryon entier dans le champ de vision de la caméra.

Dans cette étude, pour discuter des stratégies de montage et d’imagerie, un marqueur d’actine, qui peut être utilisé comme indicateur pour tracer les limites cellulaires, et un marqueur d’histone, pour détecter et suivre les noyaux, ont été utilisés. En fait, la plupart des études précédemment publiées qui ont utilisé un système de feuille de lumière multiview ont utilisé de préférence des marqueurs similaires 5,7,15,16,27. La principale raison du choix de ces marqueurs est que la microscopie à feuillet de lumière multiview est principalement utilisée pour suivre la dynamique à l’échelle cellulaire (par exemple, la forme et le réarrangement cellulaires), soit à l’échelle tissulaire, soit sur l’ensemble de l’embryon pendant de longues périodes allant de quelques heures à plusieurs jours. D’autre part, s’il est nécessaire d’obtenir une résolution subcellulaire, une ligne transgénique différente marquant la région d’intérêt pourrait être utilisée, mais dans ce scénario, un microscope à feuillet de lumière multivues peut ne pas être le meilleur choix d’instrument, mais plutôt un microscope confocal, un système de super-résolution ou même un microscope à feuillet de lumière^{sur réseau 28, 29} peut mieux convenir au problème étudié.

Le protocole discuté fonctionne bien de la gastrulation aux embryons de poisson-zèbre au stade 15-somite³⁰ (environ 17 hpf) sans aucune modification, et bien qu’il n’ait pas été testé ici, il est probable qu’il fonctionne également pour les embryons plus précoces avant le stade de gastrulation. Au-delà du stade de 15 somites, des contractions musculaires spontanées commencent^30,31, qui peuvent être supprimées par l’ajout de tricaïne, un anesthésique, dans le tube ainsi que dans la chambre d’échantillonnage. De plus, à environ 18 hpf, l’éversion de la queue loin du jaune commence^{à 30}, ce qui éloigne l’embryon du champ de vision. Pour s’en occuper, un algorithme de suivi qui suit l’extrémité allongée doit être utilisé pour garder l’embryon au point³². De plus, pour l’imagerie d’embryons à un stade ultérieur lorsqu’ils sont dépourvus de chorion, par exemple pour suivre le développement neuronal, une stratégie de montage alternative doit être employée comme récemment réalisée³³.

Pour l’imagerie d’embryons de poisson-zèbre avec un chorion intact, il n’est pas possible de capturer à la fois les billes, qui servent de marqueurs d’enregistrement, et l’embryon dans le même champ de vision avec un objectif 20x/1 NA. Cette étude fournit une alternative simple en enregistrant les différentes vues avec des informations provenant de billes présentes au-dessus ou en dessous de l’échantillon, puis en déplaçant l’enregistrement des billes vers l’embryon pendant le traitement. Une fois que l’échantillon d’embryon est enregistré de cette façon, un deuxième cycle d’enregistrement en utilisant des noyaux comme marqueurs d’enregistrement peut être effectué, qui sont présents dans l’échantillon, pour affiner davantage l’enregistrement initial. Lors de l’imagerie en accéléré, les informations sur les noyaux, à leur tour, peuvent être utilisées pour l’enregistrement de points temporels consécutifs, comme cela a été signalé précédemment²¹. Une alternative à ce protocole est de renoncer aux billes et d’utiliser à la place les informations des noyaux pour l’enregistrement initial. Mais l’enregistrement a souvent échoué (non montré ici) dans le plugin BigStitcher, peut-être en raison d’une combinaison de nombreux noyaux qui n’ont pas été détectés plus profondément dans l’embryon pendant le traitement et aussi à cause d’un nombre relativement plus petit de noyaux qui sont présents dans l’embryon lorsqu’ils sont vus sous certains angles (par exemple lorsqu’ils sont vus ventralement aux stades épiboliques avancés).

Dans ce protocole, étant donné que les informations sur les billes provenant du dessus ou du dessous de l’échantillon sont utilisées pour l’enregistrement et qu’il n’est pas nécessaire d’imager les billes dans la même vue que l’imagerie de l’échantillon, on peut utiliser ce protocole pour imager uniquement des régions d’intérêt spécifiques, mais à un grossissement élevé sous différents angles au lieu de l’embryon entier. De plus, il est facile d’adapter ce protocole pour l’imagerie de plusieurs échantillons empilés verticalement dans le tube en utilisant les informations de billes entre les échantillons pour l’enregistrement.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose, basse température de gélification	Sigma-Aldrich	A9414
Chlorure de calcium dihydraté	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version : ImageJ 1.54f
Billes de latex, polystyrène modifié au carboxylate, rouge fluorescent, 0,5 &mu ; m taille moyenne des particules, suspension aqueuse	Sigma-Aldrich	L3280
Sulfate de magnésium heptahydraté	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcription	ThermoFischer Scientific	AM1340	Pour la transcription in vitro de H2A-mPlasmide de cerisier
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Phosphate de potassium monobasique	Sigma-Aldrich	P0662
Gaine en PTFE AWG 15L - 1,58 mm ID x 0,15 mm Paroi +/-0,05  ;	Adtech Innovations dans les fluoroplastiques	STW15	Tubes PTFE
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S3014
Phosphate de sodium dibasique	Sigma-Aldrich	71640
Nettoyeur à ultrasons	Labman	LMUC3	Ultrasoniseur
Zeiss LightSheet 7 Système	Zeiss