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Condensats synthétiques et architectures cellulaires à partir de nanostructures d’ADN amphiphiles

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DOI :

10.3791/66738

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31 mai 2024

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 2Department of Chemistry, Imperial College London, 3fabriCELL, Imperial College London

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole pour la préparation de condensats biomoléculaires synthétiques constitués de nanoétoiles d’ADN amphiphiles à partir de leurs oligonucléotides d’ADN constitutifs. Les condensats sont produits à partir d’un seul composant nano-étoile ou de deux composants et sont modifiés pour soutenir la transcription in vitro de l’ARN à partir d’une matrice d’ADN intégrée.

Résumé

Les gouttelettes et les condensats synthétiques deviennent des constituants de plus en plus courants des systèmes biomimétiques avancés et des cellules synthétiques, où ils peuvent être utilisés pour établir une compartimentation et maintenir des réponses réalistes. Les nanostructures d’ADN synthétique ont démontré un potentiel important en tant que blocs de construction formant des condensats en raison de leur forme programmable, de leur fonctionnalisation chimique et de leur comportement d’auto-assemblage. Nous avons récemment démontré que les « nanoétoiles » d’ADN amphiphile, obtenues par marquage de jonctions d’ADN avec des fractions hydrophobes, constituent une solution particulièrement robuste et polyvalente. Les condensats d’ADN amphiphiles qui en résultent peuvent être programmés pour afficher des architectures internes complexes à plusieurs compartiments, répondre structurellement à divers stimuli externes, synthétiser des macromolécules, capturer et libérer des charges utiles, subir des transformations morphologiques et interagir avec des cellules vivantes. Ici, nous démontrons des protocoles de préparation de condensats d’ADN amphiphiles à partir d’oligonucléotides d’ADN constitutifs. Nous aborderons (i) les systèmes à un composant formant des condensats uniformes, (ii) les systèmes à deux composants formant des condensats cœur-coquille, et (iii) les systèmes dans lesquels les condensats sont modifiés pour soutenir la transcription in vitro des nanostructures d’ARN.

Introduction

Les cellules synthétiques sont des dispositifs à l’échelle micrométrique (10-50 μm) construits de bas en haut pour reproduire les fonctions et les structures des cellules biologiques existantes 1,2. Les cellules synthétiques sont souvent liées par des membranes construites à partir de vésicules bicouches lipidiques 3,4,5,6,7, de polymères 8,9 ou de protéinosomes10,11, qui peuvent également être utilisés pour établir une compartimentation interne12,13. Inspirées par les organites sans membrane connus pour soutenir diverses fonctionnalités dans les cellules vivantes14, des structures telles que les coacerces de polymères, les condensats biomoléculaires et les hydrogels gagnent du terrain en tant qu’alternatives polyvalentes et robustes pour établir la compartimentation externe et interne dans les cellules synthétiques 15,16,17,18.

Tirant parti de la boîte à outils polyvalente de la nanotechnologie de l’ADN19, de multiples solutions ont été développées pour concevoir des gouttelettes et des condensats synthétiques à partir de l’auto-assemblage de nanostructures d’ADN artificiel, dont la taille, la forme, la fonctionnalité, la valence et les interactions mutuelles peuvent être programmées avec précision20. Les gouttelettes d’ADN ou les condensats sont biocompatibles et peuvent servir d’échafaudages pour les cellules synthétiques et les organites, hébergeant des réactions chimiques et biomoléculaires21, calculant des informations22,23, capturant et libérant des cargaisons24,25 et soutenant les réponses structurelles26.

Parmi les diverses conceptions de nanostructures d’ADN formant des condensats, les nanoétoiles d’ADN amphiphiles - surnommées étoiles C - se sont révélées robustes et polyvalentes27. Les étoiles C sont de simples motifs ramifiés constitués d’une jonction d’ADN fixe (généralement à quatre voies), d’où émergent des bras d’ADN double brin (ds)28. Les bras sont ensuite terminés par des fractions hydrophobes, généralement du cholestérol, ce qui rend les nanostructures amphiphiles et entraîne leur condensation à la suite d’un simple recuit en un seul pot. Les condensats C-star offrent une programmabilité structurelle et fonctionnelle précise, y compris la possibilité d’établir des architectures multi-compartiments29,30, de répondre structurellement aux déclencheurs d’ADN et de cations31, de synthétiser des macromolécules29, de capturer et de libérer des charges utiles32 et d’interagir avec des cellules vivantes33. Ci-dessous, nous décrirons et discuterons des protocoles permettant de produire des condensats C-star à partir de leurs oligonucléotides constitutifs.

Le protocole résume la préparation des condensats unaires (à un composant) et binaires (à deux composants), en utilisant trois conceptions différentes en étoile C (Figure 1) : « Non réactif », « TMSD-réactif » et « ARN-templating ». L’étoile C « non réactive » (panneau A) se compose de quatre « brins centraux » avec des séquences distinctes formant la jonction à quatre voies. Quatre oligonucléotides identiques modifiés par le cholestérol sont connectés à la jonction, ce qui garantit la présence d’une molécule de cholestérol à l’extrémité de chaque bras. Les étoiles C non réactives constituent des échafaudages simples et inertes pour les condensats unaires et binaires. Dans l’étoile C « sensible au TMSD » (panneau B), la connexion entre les brins cholestérolisés et la jonction est assurée par un brin « pont de maintien des orteils », qui comporte un domaine « toehold » d’ADN simple brin (ss) pendant. En présence d’un brin d’ADN envahisseur avec un domaine d’ancrage complémentaire, une réaction de déplacement de brin médiée par l’ancrage peut être déclenchée34, par laquelle l’envahisseur déplace le pont d’ancêtre, brisant la connexion entre la jonction et les fractions hydrophobes et déclenchant le désassemblage du réseau d’ADN32. Enfin, l’étoile C « modèle d’ARN » (panneau C) comprend une modification « Base » complémentaire à un brin « Bridge », ce dernier reliant le modèle ssDNA retranscriptionnable de l’aptamère du brocoli29. Les détails de la séquence des oligonucléotides constitutifs des trois types de conceptions d’étoiles C mentionnés ici peuvent être trouvés dans le tableau supplémentaire 1 et dans les travaux précédents 29,30,32.

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Graphique 1. Schémas de trois modèles différents de nanoétoiles d’ADN amphiphiles (étoiles C). Les séquences d’oligonucléotides pour divers exemples des étoiles C décrites ici peuvent être trouvées dans le tableau supplémentaire 1. (A) Schéma d’une étoile C conçue pour former des condensats non réactifs, avec les brins d’oligonucléotides constitutifs « Core 1 », « Core 2 », « Core 3 », « Core 4 » (colorés en rose) et « Terminal cholesterol » (colorés en bleu). Chaque couleur unique représente un brin d’oligonucléotide de séquence unique. Le « tronc commun 1 » et le « tronc commun 3 » sont chacun partiellement complémentaires du « tronc commun 2 » et du « tronc commun 4 », mais ne sont pas complémentaires l’un de l’autre. (B) Schéma d’une étoile C conçue pour se démonter lors de l’ajout d’un brin envahisseur par déplacement de brin médié par la prise de pied, comme décrit dans les travaux précédents32. Cette étoile C est composée des brins « Cœur » et « Cholestérol terminal » (colorés en gris) ainsi que d’un « Complément terminal » (illustré en orange) et d’un brin « Pont de maintien des orteils » (illustré en sarcelle foncée). Ce dernier contient un surplomb de six nucléotides auquel un brin envahisseur conçu de manière appropriée peut se lier et par la suite déplacer entièrement le brin « pont de maintien des orteils », ce qui provoque la dissociation de la jonction centrale des nanoétoiles (composée des « noyaux 1, 2, 3 et 4 ») des duplex composés des brins du « complément terminal » et du « cholestérol terminal ». (C) Schéma d’une étoile C fonctionnalisée avec une matrice d’ADN pour un aptamère d’ARN. Celui-ci est également composé du brin « Cholestérol terminal » et des « Cœurs 2, 3 et 4 » (tous indiqués en gris), ainsi que d’une version étendue du brin « Cœur 1 » (en rose), d’un brin « Base » (marron), d’un brin « Pont » (jaune) et du « Modèle d’aptamère » (vert). Le duplex d’ADN composé des deux derniers brins forme la région promotrice de la polymérase T7, qui marque le site de début de la transcription. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les condensats en étoile C se forment lors du recuit thermique des oligonucléotides constitutifs, qui, dans le protocole présenté ici, est effectué dans des capillaires en verre scellés avec une section transversale rectangulaire à rapport d’aspect élevé. Ces conteneurs offrent de multiples avantages clés : i) L’étanchéité garantit que l’évaporation est complètement évitée au cours des étapes de recuit (parfois lentes) ; ii) Le fond plat des capillaires, de qualité optique, permet d’imager le transitoire d’auto-assemblage (ou de désassemblage) ; iii) le rapport d’aspect élevé des capillaires garantit que les condensats lourds se déposent sur une zone large et plate, réduisant ainsi les risques de coalescence et d’agrégation aux stades ultérieurs du transitoire d’auto-assemblage qui se produirait dans des récipients en forme de coin (par exemple, les tubes de microcentrifugation), et produisant des populations de condensats relativement monodispersés ; iv) La réalisation du recuit dans un capillaire en verre allongé minimise l’exposition de l’échantillon aux interfaces hydrophobes (air, plastique ou huile), dont on a observé qu’elles perturbent l’auto-assemblage en recrutant les oligonucléotides glycolésophiles et cholestérolisés. Une fois le protocole d’assemblage terminé, les condensats peuvent être extraits des capillaires en verre pour d’autres expériences impliquant des réactifs supplémentaires.

Protocole

REMARQUE : Le protocole est divisé en trois sections. La section 1 décrit les étapes préalables, y compris la préparation des oligonucléotides d’ADN et des capillaires en verre. La section 2 décrit la préparation des condensats en étoile C de divers modèles, y compris les modèles à un et deux composants, et leur extraction des capillaires en verre. La section 3 décrit l’utilisation de condensats d’étoiles C à un composant pour la synthèse d’un aptamère d’ARN. L’utilisateur doit suivre les bonnes pratiques de laboratoire tout au long du processus, s’assurer que toutes les évaluations et mesures d’atténuation des risques nécessaires sont en place, et porter un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris des gants, des lunettes de sécurité et une blouse de laboratoire. Le nettoyage des tubes capillaires en verre nécessite leur sonication, d’abord dans une solution de tensioactif et ensuite dans de l’isopropanol ou de l’éthanol. L’extraction des condensats C-star des tubes capillaires nécessite l’utilisation d’un stylo à tracer en diamant pour marquer et casser le verre, avec un risque associé de blessures dues à des fragments de verre. Les principaux matériaux, équipements et réactifs utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux. La plupart des oligonucléotides non fonctionnalisés sont purifiés par le fournisseur à l’aide d’un dessalage standard, à l’exception des brins « Extended Core 1 » et « Aptamer Template », qui sont commandés avec une purification par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE). Les oligonucléotides modifiés par le cholestérol sont purifiés par le fournisseur à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en phase inverse.

1. Conditions préalables

REMARQUE : Les solutions suivantes doivent être préparées dans de l’eau ultra-pure (type I) et filtrées à l’aide de filtres à seringue de 0,22 μm : tampon Tris-EDTA (TE), comprenant 10 mM de Tris, 1 mM d’EDTA, à pH ~8,0 ; Tampon TE complété par du NaCl 2 M ; et tampon TE complété par 0,3 M de NaCl. Les solutions tampons doivent être utilisées dans les 2 semaines suivant la préparation et stockées à 4 °C lorsqu’elles ne sont pas utilisées. De plus, une solution de 1 % voltois de détergent optique alcalin dans de l’eau ultrapure sera utilisée pour nettoyer les capillaires en verre.

  1. Préparation d’oligonucléotides d’ADN à partir de l’état lyophilisé
    1. Centrifuger brièvement (2000 x g pendant 10 à 30 s) les tubes d’oligonucléotides d’ADN lyophilisé pour s’assurer que les pastilles d’ADN lyophilisé s’accumulent au fond.
      REMARQUE : La centrifugation se fait à température ambiante (RT) pendant 10 à 30 s. La mini-centrifugeuse utilisée ici est par défaut de 2000 x g (6000 tr/min).
    2. Ajouter la quantité appropriée de tampon TE pour reconstituer chaque oligonucléotide à 100 μM. Tourbillonner soigneusement pour assurer une dissolution complète, puis faire tourner les tubes pour recueillir tout le liquide conformément à l’étape 1.1.1.
    3. Pour chaque solution mère, mesurer l’absorbance à 260 nm et calculer la concentration finale à l’aide du coefficient d’extinction de la séquence d’oligonucléotides testée.
      REMARQUE : Le coefficient d’extinction pour une séquence d’oligonucléotides donnée se trouve généralement sur la fiche technique du fournisseur, mais peut également être calculé à l’aide d’outils en ligne à l’aide du modèle du voisin le plus proche35 ou des valeurs tabularisées du coefficient d’extinction des nucléotides individuels36.
    4. Conservez les oligonucléotides réhydratés à 4 °C pendant de courtes périodes (jusqu’à 1 semaine) ou à -20 °C pour un stockage à plus long terme (jusqu’à 6 mois).
  2. Nettoyage des tubes capillaires en verre
    1. Sonicate dans un détergent optique alcalin à 1 % pour composants optiques dans de l’eau désionisée.
      1. Prenez le nombre requis de tubes capillaires en verre à nettoyer et placez-les dans un récipient haut et étroit (par exemple, un bécher ou un tube à centrifuger de 15/50 ml) de sorte que les capillaires ne reposent pas à plat sur la base du récipient.
      2. Ajoutez le détergent dans le récipient en le remplissant juste au-dessus du niveau des tubes capillaires. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air emprisonnées à l’intérieur des tubes capillaires - tapotez pour les retirer, si nécessaire. Couvrez le récipient sans serrer (p. ex., dans du papier d’aluminium ou à l’aide du couvercle du tube à centrifuger, en vous assurant qu’il n’est pas hermétiquement fermé).
      3. Réglez un bain-marie à 40 °C, placez le récipient couvert à la verticale dans le bain et laissez soniser pendant 30 min. Assurez-vous que la feuille, si elle est utilisée, n’entre pas en contact avec l’eau du bain de sonique.
        REMARQUE : Le bain soniquant utilisé dans cette étude a par défaut une fréquence de sonication de 60 Hz et une puissance de sonication de 150 W.
        ATTENTION : N’ajoutez ou ne retirez jamais d’articles d’un bain soniquant pendant la course ; Mettez toujours le protocole en pause en premier.
      4. Une fois la sonication terminée, éteignez l’élément chauffant du bain-marie sonique, puis rincez abondamment les capillaires du récipient avec de l’eau déminéralisée ou ultra-pure - au moins cinq fois, en jetant l’eau de rinçage à chaque fois.
  3. Sonicate dans de l’isopropanol ou de l’éthanol.
    1. Aux tubes capillaires en verre dans le récipient de nettoyage, ajoutez de l’isopropanol ou de l’éthanol (minimum 70%), en remplissant juste au-dessus du niveau des tubes capillaires. Comme à l’étape 1.2.1.2, assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air piégées dans les tubes capillaires et couvrez le récipient sans serrer.
    2. Placez le récipient à la verticale dans le bain de sonication et sionicate pendant 15 à 30 min.
      ATTENTION : L’isopropanol et l’éthanol sont inflammables, avec des points d’éclair inférieurs à RT. Minimisez les volumes de solvants utilisés pendant le nettoyage en choisissant un récipient de taille appropriée, assurez-vous que les récipients sont légèrement couverts et ne laissez pas le bain de sonique sans surveillance pendant cette étape.
    3. Une fois la sonication terminée, éliminez de manière appropriée l’isopropanol ou l’éthanol et séchez les capillaires sous l’azote, en les manipulant avec un chiffon non pelucheux.

2. Préparation et extraction des condensats en étoile C (Figure 2)

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Figure 2 : Chargement de mélanges C-star et extraction des condensats de tubes capillaires en verre. Dans tous les panneaux, le mélange C-star a été remplacé par une solution aqueuse de 25 mM de calcéine pour faciliter la visibilité. (A-E) Les étapes clés, dans l’ordre, à prendre avant le recuit, correspondent aux sections 2.1 et 2.2 du protocole. (F-J) Les étapes clés, afin de les suivre après le recuit, correspondent à la section 2.3 du protocole. Lors de l’extraction (panneaux (I-J)), les condensats d’ADN vont sédimenter du capillaire dans le réservoir tampon tant que le tube de la microcentrifugeuse est stocké verticalement. Les condensats ne seront pas visibles à l’œil nu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Préparation de mélanges C-star pour condensats monocomposants
    REMARQUE : Les détails de la séquence pour diverses conceptions de composants uniques peuvent être trouvés dans le tableau supplémentaire 1 et dans les travaux précédents 29,30,32. Les protocoles de recuit lent définis aux étapes 2.1.9 et 2.2.2 ont été développés pour assurer la relaxation des réseaux de nanoétoiles en morphologies compactes, compte tenu des propriétés rhéologiques fortement dépendantes de la température des réseaux de nanoétoiles37.
    1. Les composants d’oligonucléotides et de tampons varient en fonction de la conception C-star souhaitée. Préparez un mélange de 60 μL de condensats monocomposant en étoile C à une concentration de 5 μM pour l’étoile C à quatre bras non réactive, l’étoile C sensible au TMSD ou l’étoile C de modèle d’ARN.
    2. Pour chaque modèle, pipeter les composants appropriés énumérés dans le tableau supplémentaire 2 dans un tube de microcentrifugation séparé et bien mélanger par pipetage.
      REMARQUE : On suppose que toutes les solutions mères d’oligonucléotides ont une concentration de 100 μM dans l’ET.
    3. Prélever la totalité des 60 μL de solution C-star et pipeter avec précaution pour injecter le mélange dans le tube capillaire en verre nettoyé et sec, comme le montre la figure 2A, en prenant soin d’éviter l’introduction de bulles d’air.
    4. À l’aide d’une pipette, injecter environ 9 à 12 μL d’huile minérale à chaque extrémité du tube capillaire, en recouvrant l’échantillon de manière à ce qu’il n’y ait pas d’interface libre entre la solution C-star et l’air (voir la figure 2B). Ensuite, séchez soigneusement le tube capillaire avec du papier de soie pour vous assurer qu’il n’y a pas d’huile à l’extérieur de celui-ci (Figure 2C), en prenant soin de ne pas évacuer l’huile minérale ou la solution C-star du tube capillaire. Le résultat final est illustré à la figure 2D.
    5. Préparez un petit lot de colle époxy en deux parties pour coller chaque extrémité du tube capillaire, côté plat vers le bas, sur une lamelle en verre. Assurez-vous que les ouvertures du tube sont complètement recouvertes de colle, formant un joint continu, comme illustré à la figure 2E.
    6. Laisser durcir pendant au moins 3 h, mais de préférence toute la nuit.
    7. Après ~30 min de durcissement, inspectez la couche de colle pour détecter la présence de lacunes dans le joint causées par des bulles d’air. S’ils sont présents, scellez-les à l’aide d’une petite quantité de colle.
    8. Enroulez le tube capillaire collé à la lamelle dans du papier d’aluminium, en veillant à ce que la feuille soit maintenue à plat sur la face inférieure de la lamelle en verre. La feuille assure un bon contact thermique entre celui-ci et l’élément chauffant du thermocycleur (voir étape suivante).
    9. Placez l’échantillon enveloppé dans un thermocycleur et recuit en suivant le protocole suivant : Maintenir à 95 °C pendant 30 min, puis refroidir de 85 °C à 50 °C à -0,04 °C·min-1, puis refroidir de 50 °C à RT à -0,5 °C·min-1.
      1. Stockez les condensats recuits C-star à 4 °C ou RT pendant de longues périodes (mois) tant que le capillaire reste scellé, car le recuit thermique stérilise efficacement l’échantillon et dénature les nucléases. Gardez le capillaire plat pendant le stockage et la manipulation pour éviter que les condensats ne sédimentent vers une extrémité et ne s’agglomérent.
  2. Préparation de mélanges d’étoiles C pour condensats binaires
    REMARQUE : Pour éclairer la sélection des populations d’étoiles C pour les systèmes binaires, reportez-vous aux travaux de Malouf et al., qui décrivent les règles de conception et le comportement de phase attendu des condensats binaires d’étoiles C30.
    1. Pour préparer des condensats binaires, combiner des volumes de 30 μL des mélanges C-star décrits à l’étape 2.1 ci-dessus à un volume total de 60 μL, mélanger soigneusement, charger dans des capillaires et suivre les étapes 2.1.4 à 2.1.8.
    2. Placez l’échantillon enveloppé dans un thermocycleur et recuit en suivant le protocole suivant : Maintenir à 95 °C pendant 30 min, puis refroidir de 85 °C à 40 °C à -0,01 °C·min-1, puis refroidir de 40 °C à RT à -0,1 °C·min-1.
  3. Extraction des condensats C-star des tubes capillaires.
    1. Préparez un grand tube de microcentrifugation (1,5 mL ou 2,0 mL) contenant 60 μL de NaCl 0,3 M dans un tampon TE.
    2. Déballez l’échantillon capillaire et utilisez un stylo à tracer en diamant pour marquer le dessous de la lamelle à chaque extrémité intérieure de la zone collée (figure 2F). Cassez la lamelle dans cette région et jetez-la de manière appropriée.
    3. Nettoyez soigneusement les tubes capillaires avec de l’éthanol et séchez.
    4. Entaillez chaque extrémité des tubes capillaires à l’aide du stylo à tracer en diamant, d’abord avec le dessous (figure 2G), puis en retournant et en marquant les tubes « à l’endroit vers le haut ».
      1. Assurez-vous que les lignes d’entaille ne chevauchent pas l’interface huile-eau. Ils doivent se trouver dans la région aqueuse pour éviter que l’huile ne reste dans l’échantillon extrait.
    5. Cassez les extrémités des tubes capillaires (Figure 2H), en conservant la partie centrale du tube et en jetant le reste. Placez le tube capillaire coupé dans le tube de microcentrifugation préparé à l’étape 2.3.1, en veillant à ce que le fond du tube capillaire entre en contact avec la solution tampon (figure 2I).
    6. Les condensats sédimenteront du tube dans le réservoir tampon par gravité ; laisser cela se dérouler pendant au moins 10 minutes (Figure 2J). Retirez le tube capillaire coupé et jetez-le de manière appropriée. Cette approche d’extraction douce limite le risque d’agrégation des condensats.

3. Transcription d’un aptamère d’ARN à partir de condensats d’étoiles C modélisant l’ARN

REMARQUE : Pour la production de l’aptamère d’ARN du brocoli, une solution de difluoro-4-hydroxybenzylidène imidazolidinone (DFHBI) est nécessaire - la poudre de DFHBI est d’abord préparée sous forme de solution mère à 10 mM dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO), qui est ensuite diluée à 600 μM dans de l’eau sans RNase ni DNase.

  1. Lavage des condensats d’étoiles C modélisant l’ARN
    REMARQUE : Les condensats C-star à modèle d’ARN sont lavés trois fois pour s’assurer que les oligonucléotides matrices non liés sont éliminés.
    1. Laisser reposer la solution des condensats extraits pendant au moins 5 min, puis retirer environ la moitié du volume du surnageant.
      1. Pour un volume de 60 μL de condensats extraits, retirer entre 25 et 30 μL de surnageant.
      2. Pipeter par le haut du niveau de liquide pour minimiser le nombre de condensats retirés lors de cette étape.
    2. Ajouter le même volume de NaCl 0,3 M dans l’TE pour remplacer le surnageant retiré et mélanger par pipetage.
    3. Répétez les deux étapes précédentes pour un total de trois cycles.
  2. Préparation du mélange de transcription T7
    REMARQUE : Le mélange de transcription T7 est préparé à l’aide du kit de transcription CellScript T7-FlashScribe. L’étape 3.2.2 est une modification du protocole du fabricant, que l’on peut trouver ici38. Nous décrivons ici la transcription de l’aptamère d’ARN du brocoli, qui induit la fluorescence dans le DFHBI lors de la liaison. Pour les autres aptamères lumineux, remplacer le volume de DFHBI décrit à l’étape 3.2.2 par l’azogène approprié. Pour les autres transcriptions, supprimez complètement ce composant.
    1. Préparez une solution mère de 10 mM de DFHBI dans du DMSO, puis diluez une aliquote jusqu’à une concentration finale de 600 μM en utilisant de l’eau exempte de RNase et de DNase.
    2. Décongeler les composants du kit de transcription sur de la glace, puis pipeter les éléments suivants dans un tube de microcentrifugation autoclavé à température ambiante à l’aide d’embouts de pipette stériles : 2 μL de 10 tampons de transcription T7 (fournis dans le kit de transcription), 1,8 μL de 100 mM d’ATP, 1,8 μL de 100 mM CTP, 1,8 μL de 100 mM GTP, 2 μL de DTT 100 mM, 2 μL de DFHBI 600 μM, 0,5 μL d’inhibiteur de RNase, 2 μL de solution d’enzyme T7 (fournis dans le kit de transcription).
    3. Mélangez doucement la solution par pipetage.
    4. Utilisez le mélange de transcription pour l’étape 3.3 (synthèse de la transcription de l’ARN) immédiatement après la préparation.
  3. Synthèse de transcrit d’ARN
    1. Dans une chambre adaptée à l’imagerie microscopique, pipetez 3,3 μL des condensats lavés préparés à partir d’étoiles C modélisant l’ARN et ajoutez le volume total du mélange de transcription préparé au préalable.
    2. Acquérir des images de microscopie pour une durée de 18 h, en commençant immédiatement après l’ajout du mélange de transcription aux condensats.
      REMARQUE : Les paramètres de microscopie dépendent du système préparé. Assurez-vous que les paramètres d’excitation et d’émission appropriés sont utilisés pour tous les fluorophores de l’échantillon, ainsi que les temps d’exposition qui n’entraîneront pas de saturation au fur et à mesure que la transcription progresse. Comme pour tout time-lapse, il faut trouver un compromis entre une puissance laser ou LED suffisamment élevée pour un bon signal tout en minimisant le risque de photoblanchiment. Le photoblanchiment sur de longues périodes sera minimisé sur les systèmes à LED par rapport aux systèmes à laser. Intervalles d’imagerie suggérés : 20 min pour les 2 premières h, et 30 min par la suite.

Résultats

Après recuit, les condensats C-star peuvent être imagés directement dans le tube capillaire, ou après extraction, pour confirmer leur formation. Pour toutes les variantes de conception en étoile C, il faut observer des condensats sphériques ou polyédriques distincts d’environ 10 à 50 μm de diamètre, ces derniers se formant lors de la cristallisation28,32. Pour les condensats monocomposants, les condensats doivent être discrets et uniformes et peuvent apparaître polyédriques (figure 3A) ou sphériques (figure 3B, C) selon la conception en étoile C utilisée. La morphologie des condensats binaires dépend des propriétés des populations d’étoiles C utilisées, comme décrit précédemment30. La figure 3D montre des condensats binaires présentant une séparation de phase, observable en imagerie en champ clair. La présence de bulles d’air dans le tube capillaire peut également interférer avec l’auto-assemblage des condensats, entraînant souvent une agrégation près de l’interface air (Figure 4A,B). Des mélanges mal préparés, tels que ceux qui ne contiennent pas de composants oligonucléotidiques ou ceux préparés avec des stœchiométries déséquilibrées, peuvent entraîner l’absence de formation de condensats ou la formation de réseaux ou d’agrégats non sphériques reliés comme le montre la figure 4C. De même, des condensats binaires mal préparés peuvent présenter une agrégation et des réseaux, et peuvent également ne présenter aucune séparation de phase observable, comme le montre la figure 4D.

Pour la transcription d’aptamères lumineux d’ARN, un résultat positif sera observé en surveillant l’augmentation de la fluorescence du fluorogène au fil du temps, par exemple par microscopie (Figure 5) ou spectrophotométrie.

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Figure 3 : Micrographies représentatives montrant des condensats recuits en étoile C. (A) Micrographie à fond clair et encart montrant des condensats formés à partir d’une étoile C non réactive avec une longueur de bras de 28 paires de bases. On note ici la morphologie polyédrique qui reflète l’ordre cristallin des petites étoiles C32. (B) Micrographie à champ clair et encart montrant des condensats formés à partir d’une étoile C sensible au TMSD, avec une longueur de bras de 50 paires de bases. Ces condensats sont largement sphériques, bien que beaucoup présentent une morphologie plus irrégulière indiquant la fusion de plusieurs condensats, comme on peut s’y attendre pour les étoiles C plus grandes qui ont tendance à être plus fluides32. (C) Micrographie à fond clair et encart montrant des condensats formés à partir d’une étoile C non réactive avec une longueur de bras de 35 paires de bases. Ces condensats semblent sphériques, bien que les données de diffusion des rayons X aux petits angles provenant de travaux antérieurs montrent que leur microstructure est cristalline32. (D) Micrographie à champ clair et encart montrant des condensats binaires formés à partir d’une combinaison des populations d’étoiles C également utilisées dans les panneaux (B) et (C). La combinaison de ces deux populations conduit à la formation de condensats avec séparation de phase distincte, visible sans marquage fluorescent. D’autres combinaisons peuvent ne pas présenter de séparation de phase, comme décrit dans les travaux précédents30. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Micrographies montrant les problèmes courants rencontrés avec des condensats mal préparés. (A) Micrographies à fond clair montrant des condensats formés à partir d’une étoile C non réactive avec une longueur de bras de 28 paires de bases (qui se sont formées avec succès sur la figure 3A) en présence d’une bulle d’air dans le tube capillaire. Le panneau est composé de deux micrographies cousues au niveau de la ligne pointillée rouge et montre l’agrégation des condensats près de l’interface aérienne. (B) Micrographie à champ clair montrant des condensats formés à partir d’une étoile C sensible au TMSD de 50 paires de bases de bras (qui s’est formée avec succès sur la figure 3B) en présence d’une bulle d’air dans le tube capillaire. Ici, les condensats ont fusionné pour former un réseau interconnecté continu en raison de la nature plus fluide des condensats composés de motifs d’étoiles C plus grands32. (C) Micrographie à fond clair montrant des condensats formés à partir d’une étoile C non réactive avec une longueur de bras de 35 paires de bases (qui s’est formée avec succès sur la figure 3C). La morphologie est irrégulière et anguleuse, indiquant une erreur de préparation, peut-être des stœchiométries déséquilibrées. (D) Micrographie à champ clair de condensats binaires formés à partir d’une combinaison des populations d’étoiles C comme dans Fig. 3D. Ces condensats sont fortement connectés, comme dans le panneau (C), et ne présentent pas non plus la séparation de phase attendue (voir Figure 3D), indiquant une erreur dans leur préparation. Bien que les sources exactes des erreurs soient difficiles à identifier, des stœchiométries incorrectes ou l’utilisation de séquences d’oligonucléotides incorrectes sont des causes potentielles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Résultats représentatifs de la transcription d’une matrice d’ADN intégrée pour un aptamère d’ARN. Timelapse montrant la synthèse de l’aptamère lumineux du brocoli via la transcription d’une matrice d’ADN intégrée dans des condensats fabriqués à partir du motif de l’étoile C décrit à la figure 1C. L’aptamère se lie au DFHBI présent dans le mélange de transcription, induisant une augmentation de la fluorescence au fil du temps. Il convient de noter ici un changement dans la morphologie du condensat au fil du temps, qui semble former une structure cœur-coquille. Ce phénomène est probablement dû à un gonflement de la couche externe du condensat dû à un déséquilibre transitoire de la pression osmotique associé à la production locale de l’aptamère de l’ARN. La production d’aptamères peut se produire préférentiellement dans les couches externes des condensats en raison de la tendance signalée du brin modèle d’aptamère à s’accumuler dans cette région30. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire 1 : Détails de séquence pour diverses conceptions de composants uniques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Volume des composants pour chaque modèle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le protocole décrit ici fournit une approche pour la préparation de condensats à un ou deux composants à partir de nanoétoiles d’ADN amphiphiles, avec des variations de conception pour introduire différentes réponses dans les condensats. Le protocole donné produit des condensats dans une solution tampon de 0,3 M de NaCl dans l’TE, mais les conditions tampons peuvent être modifiées en modifiant de manière appropriée les volumes énumérés ci-dessus. Des travaux antérieurs ont étudié la formation de condensats en étoile C dans le NaCl 0,2 M dans TE et le NaCl 0,1 M dans le TE et dans la solution saline tamponnée au phosphate (PBS)32. Les condensats en étoile C sont produits à une concentration finale de 5 μM, mais celle-ci peut également être modifiée en modifiant de manière appropriée les concentrations d’oligonucléotides et/ou les volumes ajoutés dans le protocole ci-dessus. En fonction des variations souhaitées, il peut être nécessaire de préparer des solutions mères d’oligonucléotides à des concentrations et dans des tampons différents par rapport au protocole décrit à la section 1, bien que les aspects pratiques du protocole restent les mêmes. La conception de l’étoile C peut être facilement modifiée pour introduire une fonctionnalité ou une réponse différente, comme détaillé dans les travaux précédents32. Les variations de conception comprennent l’introduction de motifs qui répondent aux changements de pH32, aux ions potassium31 ou aux séquences d’oligonucléotides30,32. Si de nouvelles conceptions sont souhaitées, il est conseillé de tester d’abord l’assemblage par calcul (à l’aide d’outils tels que NUPACK39), puis de tester la formation des nanoétoiles équivalentes, non cholestérolisées, à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose 32,40. L’étendue de la séparation de phase dans les condensats binaires dépendra de la combinaison de populations d’étoiles C utilisée, comme décrit dans les travaux précédents30. Nous notons que les protocoles de recuit spécifiés pour la formation des condensats nécessitent des échelles de temps beaucoup plus longues que celles typiques du repliement de petites nanostructures d’ADN similaires à des étoiles C individuelles. Un recuit lent est en effet nécessaire pour permettre l’équilibrage sur les grandes échelles de longueur des condensats. Pour les condensats monocomposants, le protocole suggéré a une durée de 17 h, et pour les condensats binaires, un protocole de recuit encore plus long (~3 jours) est utilisé pour s’approcher de l’équilibre thermodynamique. Nous avons constaté que ces protocoles donnent des résultats reproductibles sur toutes les différentes populations d’étoiles C utilisées à ce jour, mais si les chercheurs souhaitent améliorer le débit d’échantillons, nous recommandons une étude systématique où les taux de recuit sont modulés pour trouver le protocole le plus court possible où les morphologies souhaitées peuvent être obtenues pour le système testé. Il est recommandé de ne pas modifier la durée de conservation de 30 minutes à 95 °C, car cette étape stérilise efficacement l’échantillon et permet un stockage à long terme dans des tubes capillaires.

La chambre dans laquelle les condensats en étoile C sont produits est cruciale pour leur formation réussie. La chambre doit être en verre ou en quartz ; L’utilisation de récipients en plastique tels que le polypropylène, un matériau typique des tubes de microcentrifugation, perturbera l’auto-assemblage en raison des interactions hydrophobes entre le plastique et les fractions de cholestérol. Le rapport d’aspect du récipient de recuit et la concentration du mélange C-star affecteront également les caractéristiques des condensats, en particulier leur taille et leur agrégation. Plus précisément, si un récipient « plus haut » est utilisé, avec une petite surface au fond par rapport à sa hauteur, les condensats en étoile C sédimenteront au fond avec des densités de surface élevées, ce qui favorisera la formation de points de contact entre les condensats. Si ceux-ci se produisent tard dans le processus de recuit thermique, lorsque la température est relativement basse et que les condensats se comportent comme des liquides ou des solides très visqueux, les condensats en contact ne se détendront pas en formes sphériques et formeront plutôt des agrégats irréguliers de configurations partiellement fusionnées. Lors du pipetage du mélange C-star dans des tubes capillaires, il faut veiller à éviter l’introduction de bulles d’air - de gros agrégats ont tendance à se former à l’interface air/eau, de sorte que les condensats extraits auront une taille et une morphologie non idéales. Le séchage des extrémités des tubes capillaires après l’injection du mélange C-star ou de l’huile minérale entraînera une meilleure adhérence. L’adhésif choisi doit être suffisamment visqueux pour recouvrir complètement les ouvertures du tube capillaire sans être évacué dans le tube, inerte à l’huile minérale, compatible avec le verre et stable aux températures de recuit utilisées. Nous avons constaté que l’adhésif époxy en deux parties Araldite Rapid convient à nos besoins, bien qu’il ne soit évalué qu’à des températures de 80 °C. Des bulles d’air ou des trous dans la colle entraîneront des capillaires imparfaitement scellés, qui ont tendance à fuir pendant le recuit. Une fois la colle durcie, l’emballage des échantillons dans une feuille d’aluminium présente le double avantage de contenir les fuites et d’améliorer le contact thermique entre l’échantillon et le thermocycleur. La feuille doit être maintenue aussi lisse et plate que possible pour s’assurer que les capillaires sont maintenus à niveau pendant le recuit. Les condensats recuits dans les capillaires peuvent être stockés à long terme à température ambiante et recuits si nécessaire. Les échantillons doivent être manipulés avec précaution - les condensats sont susceptibles de fusionner au contact, de sorte que les capillaires doivent être stockés à plat. Pour une imagerie microscopique optimale, la lamelle peut être rainurée et retirée tout en laissant les tubes capillaires intacts. Les condensats ont tendance à avoir un diamètre supérieur à 5 μm, et nous n’avons pas observé de mouvement brownien significatif lors de leur imagerie29,30.

Il est recommandé de préparer plusieurs lots indépendants de condensats C-star pour s’assurer que les éventuelles différences observées entre les échantillons reflètent des différences de composition ou de conditions de recuit, et non des différences causées par des erreurs expérimentales potentielles.

De petites particules de verre seront probablement introduites dans la solution de condensat à la suite du processus d’extraction. Ceux-ci peuvent être minimisés en tamponnant soigneusement les extrémités coupées du tube capillaire avec une bande propre de Parafilm, qui est très efficace pour prélever le verre, avant de placer le tube capillaire coupé dans le tube de microcentrifugation contenant la solution tampon. Pendant l’extraction, le nombre de condensats extraits peut être maximisé en faisant tourner brièvement le tube de microcentrifugation contenant le tube capillaire coupé, bien que cela augmente la probabilité que les condensats fusionnent et forment des morphologies non idéales. Après l’extraction, les condensats doivent être stockés à la température du réfrigérateur (généralement 4 °C) et utilisés dans les trois jours pour éviter les problèmes potentiels de contamination biologique et parce que les condensats dans les tubes de microcentrifugation s’agrègent et fusionnent au fil du temps en raison des formes généralement arrondies ou pointues de ces tubes. Un pipetage très vigoureux des condensats extraits doit être évité, car ils peuvent être endommagés par un écoulement de cisaillement excessif.

Pour la transcription d’un aptamère d’ARN, il peut être nécessaire de modifier le volume du mélange de transcription utilisé car le nombre et la taille des condensats (et, par conséquent, la concentration de la matrice) dans chaque réaction individuelle ne peuvent pas être contrôlés avec précision. Dans les expériences décrites dans la section 3, un excès de mélange de transcription est utilisé par rapport à la concentration théorique de la matrice. Il est recommandé de conserver les surnageants des trois étapes de lavage (section 3.1) et de les utiliser pour effectuer des réactions de transcription. Ces expériences donneront une indication de la quantité de matrice d’aptamère non liée présente dans la solution.

L’un des principaux avantages de la plate-forme C-star est sa flexibilité et sa modularité. Comme décrit ci-dessus et dans des travaux antérieurs, les condensats peuvent être conçus pour répondre à une gamme d’entrées, telles que le déplacement des brins médié par la prise d’orteil et la transcription des aptamères d’ARN séparément ou en séquence. Combinées à la programmabilité inhérente à leurs éléments constitutifs de l’ADN, les nanoétoiles d’ADN amphiphiles offrent une solution robuste et polyvalente pour la conception et la préparation de cellules synthétiques.

Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

LM, LDM et DT saluent le soutien du Conseil européen de la recherche (ERC) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 (ERC-STG n° 851667 - NANOCELL). LDM reconnaît le soutien d’une subvention de recherche de la Royal Society pour les boursiers de recherche (RGF/R1/180043) et le soutien d’une bourse de recherche de l’Université de la Royal Society (UF160152, URF/R/221009).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22 &mu ; Filtres à seringueSigma-AldrichSLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Verres de protection rectangulaires, Menzel Glä ; serVWR631-0853
2-PropanolSigma-Aldrich34683
Nettoyeur à ultrasons 6 L avec minuterie numérique et chaleur, 230 VACCole-ParmerWZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy GlueRSARA-400005
Bio-Rad C1000 thermocycleur Bio-Rad 1851197
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL avec couvercle verrouillableFisher Scientific15338665Tubes de microcentrifugation de 2 mL pour l’extraction des condensats C-star
Diamond ScribingPen RS394-217
Difluoro-4-hydroxybenzylidène imidazolidinone (DFHBI)Sigma-AldrichSML1627
Dimethyl sulfoxyde (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Tubes à centrifuger Safe-LockFisher Scientific0030123301Tubes de microcentrifugation de 0,5 mL pour la préparation de mélanges C-star
Ethanol Absolute 99.8+ %Fisher Scientific1043734170 % d’éthanol est suffisant pour le nettoyage
Fisherbrand ZX4 IR Vortex MixerFisherbrand13284769
Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507
Capillaires rectangulaires creux ID 0,40 x 4,00 mm, longueur 50 mmCM Scientific2540-50
Huile minéraleSigma-Aldrich69794
Mini centrifugeuse, 230 VPRISM(TM)
NaClSigma-AldrichS3014
NanoDrop One SpectrophotomètreThermo Fisher ScientificND-ONE-WUtilisé pour mesurer l’absorbance des oligonucléotides pour les calculs de concentration
OligonucléotidesTechnologies d’ADN intégréesLes séquences d’oligonucléotides personnalisées sont uniques à la conception C-star requise.
Inhibiteur de RNase ScriptGuardCELLSCRIPTC-SRI6310KInhibiteur de RNase
T7-FlashScribe Kit de transcriptionCambioC-ASF3507
Tampon Tris-EDTA, solution mère 100xSigma-Aldrich574793
UltraPure DNase/RNase Eaudistillée Invitrogen10977035
VWR Spec-Wipe 3 Essuie-glacesVWR21914-758
Z763128

Références

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