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Utilisation d’organoïdes intestinaux humains pour comprendre l’épithélium de l’intestin grêle au niveau transcriptionnel d’une seule cellule

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DOI :

10.3791/66749

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28 juin 2024

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1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Le protocole combine la technologie des organoïdes intestinaux humains avec l’analyse transcriptomique d’une seule cellule pour fournir des informations significatives sur la biologie intestinale jusqu’alors inexplorée.

Résumé

La transcriptomique sur cellule unique a révolutionné notre compréhension de la biologie cellulaire du corps humain. Des cultures d’organoïdes de l’intestin grêle humain à la pointe de la technologie fournissent des systèmes modèles ex vivo qui comblent le fossé entre les modèles animaux et les études cliniques. L’application de la transcriptomique sur cellule unique à des modèles d’organoïdes intestinaux humains (HIO) révèle la biologie cellulaire, la biochimie et la physiologie du tractus gastro-intestinal jusqu’alors inconnues. Les plateformes avancées de transcriptomique de cellules uniques utilisent le partitionnement microfluidique et le codage à barres pour générer des banques d’ADNc. Ces ADNc à code-barres peuvent être facilement séquencés par des plateformes de séquençage de nouvelle génération et utilisés par divers outils de visualisation pour générer des cartes. Ici, nous décrivons des méthodes de culture et de différenciation des HIO de l’intestin grêle humain dans différents formats et des procédures pour isoler des cellules viables à partir de ces formats qui conviennent à une utilisation dans des plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire. Ces protocoles et procédures facilitent l’utilisation des HIO de l’intestin grêle afin d’obtenir une meilleure compréhension de la réponse cellulaire de l’épithélium intestinal humain au niveau transcriptionnel dans le contexte d’une variété d’environnements différents.

Introduction

L’épithélium de l’intestin grêle comporte deux zones distinctes : la crypte qui abrite les cellules souches intestinales (CSI) et les villosités, qui sont composées de cellules différenciées des lignées sécrétoires et absorbantes. À cette complexité s’ajoute la spécificité régionale de l’épithélium qui offre des propriétés fonctionnelles uniques entre les régions de l’intestin grêle. Des travaux pionniers ont permis d’établir des conditions de culture dans lesquelles la crypte de l’intestin grêle humain et les zones villosités peuvent être générées ex vivo à partir de tissus chirurgicaux ou de biopsies tissulaires1. Ces cultures comblent le fossé entre les études animales et les essais cliniques et révèlent la biologie cellulaire, la biochimie et la physiologie du tractus gastro-intestinal jusqu’alors inconnues. Les HIO se propagent sous forme de structures sphériques 3D à l’aide d’un milieu avec des facteurs de croissance qui favorisent la viabilité des cellules souches et des matrices de soutien extracellulaires. Ces conditions se traduisent par un modèle HIO semblable à une crypte qui se compose principalement de progéniteurs et de cellules souches. L’élimination des facteurs de croissance favorise la différenciation de l’ISC (modèle de type villosité) et la production de cellules épithéliales intestinales matures (caliciforme, entéroendocrine, touffe, entérocytes) dans des proportions appropriées, ainsi que la prolifération et la différenciation cellulaires, la polarisation, l’intégrité de la barrière, les caractéristiques spécifiques régionales et les réponses physiologiquesappropriées2. Les cultures HIO sont génétiquement stables et peuvent être propagées indéfiniment dans leur état de crypte. L’accès facile à la surface apicale de ces cultures est fourni par des conditions de culture qui permettent la croissance dans un format monocouche3. Les DOI permettent également d’inclure dans les analyses biologiques des considérations relatives à la variabilité individuelle de l’hôte, comme la génétique, l’âge, le sexe, l’origine ethnique et le statut pathologique. Les outils d’évaluation analytique et fonctionnelle sont identiques à ceux utilisés dans les approches centrées sur les lignées cellulaires transformées et comprennent une variété de techniques moléculaires telles que la cytométrie en flux, la microscopie, la transcriptomique, la protéomique et la métabolomique.

La transcriptomique unicellulaire révolutionne notre compréhension de la biologie et de la physiologie de l’intestin grêle en fournissant un aperçu des contributions individuelles de chaque type de cellule à un processus biologique. Des travaux pionniers utilisant cette technologie ont fourni un paysage des types de cellules présentes dans l’intestin humain natif 4,5,6. Les plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire permettent d’explorer le paysage transcriptionnel des cellules individuelles, permettant à l’hétérogénéité cellulaire d’être à l’avant-garde de l’exploration scientifique. Dans certaines plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire, le partitionnement microfluidique et le codage à barres sont utilisés pour générer des banques d’ADNc à partir d’ARNm cellulaires polyadénylés obtenus à partir d’un maximum de 10 000 cellules par échantillon. Sur cette plate-forme, des gouttelettes contenant des cellules uniques, des oligonucléotides à code-barres, des réactifs de transcription inverse et de l’huile forment une vésicule réactionnelle qui fait que tous les ADNc d’une seule cellule ont le même code-barres. Les ADNc à code-barres peuvent ensuite être séquencés efficacement à l’aide du séquençage de nouvelle génération. Les données générées peuvent être traitées à l’aide de logiciels et d’outils de visualisation, qui convertissent les séquences de code-barres en cartes de visualisation et en profils transcriptionnels unicellulaires. Les populations cellulaires peuvent être identifiées à l’aide de bases de données publiques sur l’épithélium 4,5,6 de l’intestin grêle humain. Bien que de nombreuses études aient utilisé cette plateforme pour interroger les organoïdes intestinaux murins au niveau de la cellule unique, l’analyse des réponses transcriptionnelles des HIO sur cellule unique a pris du retard par rapport à 7,8,9,10,11,12.

Nous présentons ici un guide étape par étape pour isoler des cellules viables à partir d’OHI de l’intestin grêle afin de les traiter sur des plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire (Figure 1). Nous fournissons des directives de culture et de différenciation ainsi que des composants de milieux qui ont été optimisés pour la différenciation épithéliale. Nous décrivons des méthodes de récupération cellulaire pour trois formats de culture différents : les cultures tridimensionnelles (3D) et monocouches, sur plastique ou sur des inserts de culture cellulaire à membrane. Nous fournissons des échantillons de données de regroupement obtenus à l’aide d’un logiciel open source pour dériver des gènes exprimés de manière différentielle dans chaque grappe.

Protocole

Les lignées organoïdes utilisées ici ont été obtenues à partir du GEMS Core du Texas Medical Center Digestive Disease Center. En bref, pour établir initialement des lignées d’organoïdes, des échantillons de tissus du donneur ont été lavés et digérés par voie enzymatique pour libérer les cryptes intestinales. Les cryptes ont été encastrées dans une membrane basale et cultivées dans un milieu. Le conseil d’examen institutionnel du Baylor College of Medicine a approuvé le protocole d’étude pour obtenir des échantillons de tissus à partir desquels des lignées organoïdes ont été établies, et le consentement éclairé a été obtenu de tous les donneurs pour établir des lignées organoïdes à partir des tissus donnés.

1. Transfert des HIO 3D pour se différencier

  1. Retirer et jeter le milieu des puits d’organoïdes cultivés en plaques de 24 puits (autour de la membrane basale solide) à l’aide d’une pipette P1000. Ajouter 300 μL de trypsine-EDTA à 0,05 % dans le puits et briser mécaniquement les organoïdes en pipetant avec une pipette P1000 de haut en bas 5x.
  2. Incuber la plaque à 37 °C pendant 4 min. Ajouter 500 μL de milieu complet sans facteurs de croissance (CMGF-milieu) avec 10 % FBS dans chaque puits (tableau 1). Utilisez une pipette P1000 et une pipette CMGF medium et un mélange HIO, 10x d’avant en arrière dans le puits. Transférez tout le volume dans un tube de 15 ml. Combinez le passage de plusieurs puits dans le même tube de 15 ml. Ne combinez pas plus de 10 puits par tube.
  3. Faites tourner les cellules à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse à rotor pivotant à 100 x g pendant 5 min. Retirez tout le fluide, en gardant la pastille au fond du tube. Gardez le tube sur de la glace.
  4. Calculer la quantité de membrane basale nécessaire pour le nombre de granules HIO plaquées et remettre en suspension la pastille HIO dans 30 μL/puits de membrane basale à l’aide des pointes de pipette P200 froides. Pipetez le mélange de membrane basale HIO sous forme de gouttelette au centre d’une plaque de 24 puits à l’aide d’embouts de pipette P200 froids.
  5. Transférez la plaque dans un incubateur à 37 °C. Laissez la membrane basale se solidifier pendant 5 à 10 minutes, puis ajoutez 500 μL de milieu complet à température ambiante contenant du WNT, de la R-spondine, de la caboche, de l’EGF et de l’inhibiteur de ROCK (WRNE+Y ; Tableau 1) à chaque puits et culture dans un incubateur à 37 °C. Rafraîchissez votre culture avec WRNE+Y tous les deux jours pendant 7 jours.
    REMARQUE : Un HIO sain aura une forme kystique avec un épithélium bourgeonnant brillant (figure 2). Les cellules au milieu du kyste ne peuvent pas être visualisées. Un HIO malsain aura l’air terne et aura un épithélium épais avec un milieu solide. La caractéristique la plus importante est l’aspect brillant.

2. Différenciation HIO : format 3D

  1. Utiliser un puits de HIO 3D pour 3 puits de HIO différenciés 3D 1 semaine après la culture.
  2. Retirez le milieu des puits. Dispersez la membrane basale et les HIO à l’aide d’une pipette P1000 et ajoutez 500 μL froids de CMGF- par puits et pipetez de haut en bas au moins 5 fois. Faites tourner les HIO à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse à rotor pivotant à 100 x g pendant 5 min. Retirez tout le fluide en gardant la pastille au fond du tube.
  3. Ajouter 30 μL de membrane basale par puits de DOI plaqués. Pipeter la gouttelette de 30 μL de membrane basale avec des HIO dans un puits d’une plaque de 24 puits. Incuber à 37 °C pendant 10 min. Ajouter 500 μL de support WRNE+Y/Diff (50/50).
  4. Passez le milieu au milieu de différenciation après 24 h pendant 3 jours supplémentaires, en rafraîchissant le milieu tous les deux jours. Préparez 3 puits par échantillon pour la piscine afin de réduire la variabilité technique.

3. Différenciation HIO : Format monocouche

  1. Enduire les inserts ou les puits de culture cellulaire membranaire d’une plaque de 96 puits avec 100 μL/puits de collagène placentaire humain IV (1 mg/ml dans 100 mM d’acide acétique) dilué dans duH2O froid (1:30). Incuber à 37 °C pendant au moins 1,5 h ou au maximum toute la nuit. Pour l’insert de culture cellulaire membranaire, ajouter du H2O stérile dans l’espace de la plaque pour humidifier la plaque ; pour une plaque à 96 puits, ajouter du H2O stérile dans les puits non utilisés.
  2. Prélever les HIO 3D cultivés dans WRNE pendant 7 jours en retirant le milieu et en récupérant la membrane basale et les cellules en ajoutant 500 μL/puits d’EDTA froid 0,5 mM (0,5 M EDTA dilué 1:1000 dans du PBS stérile). Utilisez une pipette P1000 pour pipeter les organoïdes et la solution de haut en bas 5 fois et transférez-les dans un tube de microcentrifugation de 15 ml. Ne mettez pas en commun plus de 10 puits d’organoïdes par tube. Centrifugeuse pendant 5 min à 300 x g dans un rotor à godets oscillants à 4 °C.
    REMARQUE : Pour préparer 3 puits sur une plaque de 96 puits, utilisez 1 puits de HIO 3D. Pour préparer 1 insert de culture cellulaire sur membrane, utilisez 1 puits de HIO 3D (la densité d’ensemencement des cellules individuelles est d’environ 1-2 x 105 cellules/puits pour une plaque de 96 puits, 2,5-3-3 x 105 cellules/puits pour l’insert de culture cellulaire sur membrane).
  3. Retirez 500 μL de média en laissant la pastille au fond du tube. Dissocier les OIH en ajoutant 500 μL de trypsine à 0,05 % et 0,5 mM d’EDTA et en laissant incuber pendant 4 à 5 minutes à 37 °C. Pipetez vigoureusement de haut en bas pour ~50x à l’aide d’un P1000. Évitez de faire des bulles en pipetant contre le côté du tube.
  4. Inactivez la trypsine en ajoutant 1 mL de CMGF- contenant 10 % de FBS. Filtrez les gros amas de cellules non digérées en mouillant une crépine cellulaire de 40 μm avec 1 mL de CMGF- contenant 10 % de FBS et en ajoutant les cellules au sommet de la crépine cellulaire. Utilisez la gravité pour permettre aux cellules de passer à travers la passoire et jetez la crépine contenant des amas de cellules.
  5. Recueillir les cellules par centrifugation pendant 5 min à 400 x g dans un rotor à godets oscillants à température ambiante.
  6. Retirez le liquide de l’insert de culture cellulaire à membrane recouvert de collagène ou de la plaque à 96 puits. Remettre la pastille HIO en suspension dans 100 μL/puits de WRNE contenant 10 μM d’Y-27632, puis pipeter dans le compartiment supérieur de l’insert de culture cellulaire à membrane ou dans la plaque à 96 puits. Pour l’insert de culture cellulaire à membrane, ajoutez 600 μL de WRNE contenant 10 μM d’Y-27632 dans le compartiment inférieur du puits.
  7. Après 24 h, retirer le milieu des parties supérieure et inférieure de l’insert de culture cellulaire membranaire ou de la plaque à 96 puits et le remplacer par un milieu de différenciation pendant 5 jours. Préparez 3 puits par échantillon pour la piscine afin de réduire la variabilité technique.

4. Préparation de suspensions unicellulaires à partir de HIO 3D différenciés pour la transcriptomique sur cellule unique

  1. Placer le réactif de digestion cellulaire enzymatique à 37 °C dans un incubateur de CO2 pour le décongeler et le réchauffer 30 minutes avant le début de la digestion 3D HIO. Vérifiez les HIO à l’aide d’un microscope à champ clair à 10x pour vous assurer de la santé des cellules.
  2. Retirez le milieu des puits et ajoutez 500 μL de solution de récupération de cellules froides dans les puits. Pipetez de haut en bas plusieurs fois pour libérer les cellules de la membrane basale à l’aide d’une pipette P1000 et d’embouts de pipette standard. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
    REMARQUE : L’utilisation de puits répliqués permet d’assurer un nombre adéquat de cellules et de réduire les variations d’un puits à l’autre. Ne combinez pas les puits avant l’étape 4.7 ci-dessous.
  3. Incuber les tubes de cellules sur de la glace pendant 10 min, en pipetant de haut en bas toutes les 5 min. Recueillir les cellules par centrifugation pendant 3 min à 400 x g à 4 °C.
  4. Retirez le liquide du tube en prenant soin de ne pas déranger la pastille de cellule. Remettre les cellules en suspension dans 500 μL de réactif de digestion cellulaire enzymatique préchauffé. Pipette de haut en bas avec un P1000 au moins 10x.
  5. Incuber les HIO pendant 30 min à 37 °C dans un incubateur de CO2 . Toutes les 10 min, pipeter 10 fois l’ensemble du volume à l’aide d’une pipette P1000 pour aider à dissocier les cellules. Évitez d’introduire des bulles d’air dans la suspension cellulaire.
  6. Granulez les cellules pendant 3 min à 400 x g à 4 °C. Retirer le surnageant, remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de différenciation et les stocker sur de la glace.
    REMARQUE : À partir de ce moment, les DOI doivent toujours être gardés sur la glace.
  7. Pipetez les cellules de haut en bas 50 fois rapidement à l’aide d’un P1000 pour vous assurer que les HIO sont dissociés en cellules uniques. Veillez à ne pas introduire de bulles d’air à cette étape, car cela entraînerait une perte de cellules.
  8. Filtrez tout le volume à travers une crépine de 70 μm à l’aide d’une pointe de pipette P1000. À l’aide d’un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, recueillir l’éluat.
    REMARQUE : L’embout du filtre ne se bouchera pas si le temps de digestion est suffisant. Utilisez plusieurs filtres si le filtre est bouché ; Ne forcez pas le volume à travers le filtre.
  9. Répétez l’étape 4.8 avec une passoire à pointe de 40 μm. Conservez les échantillons sur de la glace.
  10. Compter les cellules individuelles viables sur une chambre de comptage cellulaire en utilisant l’exclusion du bleu de trypan en ajoutant 5 μL de bleu de trypan à 0,4 % à 5 μL de suspension cellulaire. Diluer l’échantillon au besoin à 1000 cellules/μL. Si la densité cellulaire est inférieure à 1000 cellules/μL, granulez les cellules pendant 2 min à 400 x g à 4 °C, retirez le milieu d’origine et remettez-les en suspension dans le milieu de culture cellulaire. Ce protocole produit généralement 5 x 105-1 x 106 cellules.
    REMARQUE : La préparation d’une suspension de haute qualité (90 % de cellules viables et 90 % de cellules uniques) est essentielle pour des données de haute qualité sur une seule cellule. Cependant, l’expérience montre qu’une viabilité aussi faible que 75 % peut être acceptée dans les cas où un traitement, comme une infection ou l’application de petites molécules, a un impact sur la viabilité.
  11. Préparer des banques d’ADN pour les plateformes de profilage transcriptionnel de cellules uniques selon les protocoles du fabricant. Traiter les données selon les protocoles de meilleures pratiques pour l’analyse des données scRNAseq13,14.

5. Préparation de suspensions unicellulaires à partir de HIO différenciés sur insert de culture cellulaire membranaire

  1. Placer le réactif de digestion cellulaire enzymatique à 37 °C dans un incubateur de CO2 pour le décongeler et le réchauffer 30 min avant le début de la digestion par insert de culture cellulaire membranaire HIO. Divisez le réactif de digestion cellulaire enzymatique préchauffé en aliquotes de 200 μL dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL, 1 tube par insert de culture cellulaire à membrane. Conservez les tubes dans l’incubateur à 37 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi.
  2. Préparez le PBS-EDTA en ajoutant 5 μL de 0,5 M EDTA à 5 mL de PBS. Aliquote 500 μL de PBS-EDTA dans une plaque de 24 puits, 1 puits par insert de culture cellulaire membranaire.
  3. Laver les cellules avec du PBS-EDTA : transférer les inserts de culture cellulaire membranaire des puits contenant des milieux de croissance vers les puits contenant du PBS-EDTA. Retirez le milieu de culture cellulaire du côté apical et remplacez-le par 100 μL de PBS-EDTA. Veillez à ne pas perturber la couche cellulaire.
  4. Jetez immédiatement le PBS-EDTA ajouté sur la face apicale des inserts de culture cellulaire membranaire. Retirez l’insert de culture cellulaire à membrane du puits, épongez-le en touchant doucement le bord d’une serviette en papier, puis retournez-le sur la paillasse. À l’aide d’une lame de scalpel tranchante, vous pouvez retirer la membrane de l’insert en coupant autour de la circonférence intérieure de la membrane. Travaillez rapidement pour éviter le dessèchement.
  5. À l’aide d’une pince, transférez la membrane dans le tube de microcentrifugation préchauffé de 1,5 mL rempli d’un réactif de digestion cellulaire enzymatique et assurez-vous que la membrane est complètement immergée. Répétez l’opération pour tous les inserts de culture cellulaire à membrane supplémentaires.
    REMARQUE : L’augmentation du volume du réactif de digestion cellulaire enzymatique à 500 μL peut aider à dissocier les monocouches denses.
  6. Dissocier les cellules en incubant des tubes avec des membranes à 37 °C dans un incubateur de CO2 . Mélanger en pipetant doucement tout le volume 5x avec une pipette de 200 μL toutes les 10 min pour un total de 30 min. Eviter les bulles et l’aspiration de la membrane pour préserver la viabilité.
  7. Transférez une petite aliquote de cellules (1-2 μL) dans une lame de verre toutes les 10 minutes pour évaluer la dissociation en évaluant qualitativement le pourcentage de cellules individuelles. Cela peut prendre jusqu’à 50 minutes avec un pipetage supplémentaire pour obtenir 80 % à 90 % de cellules uniques, selon le type de HIO. Grattez doucement la membrane avec la pointe d’une pipette pendant les étapes de mélange pour favoriser la dissociation, en particulier pour les cellules difficiles à dissocier, mais le grattage peut avoir un impact sur la viabilité.
  8. Combinez 3 puits répétés par condition dans un seul tube de microcentrifugation de 1,5 mL (600 μL au total). Ajouter 400 μL de milieu de culture cellulaire (diff) + 10 μM ROCKi (volume total de 1 mL). Mélanger délicatement par pipetage.
    REMARQUE : L’utilisation de puits répliqués permet d’assurer un nombre adéquat de cellules et de réduire les variations d’un puits à l’autre. Les puits doivent être regroupés à cette étape.
  9. Filtrez tout le volume à travers une passoire de 70 μm à l’aide d’une pointe de pipette de 1 ml. Recueillir le débit dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 ml.
    REMARQUE : L’embout du filtre ne se bouchera pas si le temps de digestion est suffisant. Utilisez plusieurs filtres si le filtre est bouché ; Ne forcez pas le volume.
  10. Répétez l’étape 5.9 avec une passoire à pointe de 40 μm. Conservez les échantillons sur de la glace.
  11. Compter les cellules individuelles viables sur une chambre de comptage cellulaire en utilisant l’exclusion du bleu de trypan en ajoutant 5 μL de bleu de trypan à 0,4 % à 5 μL de suspension cellulaire. Diluer l’échantillon au besoin à 1000 cellules/μL. Si la densité cellulaire est inférieure à 1000 cellules/μL, essorez 2 min à 400 x g à 4 °C pour granuler les cellules, retirer le milieu d’origine et remettre en suspension dans WRNE+Y à la densité cellulaire souhaitée. Ce protocole produit généralement 4 x 105 - 6 x 105 cellules.
    REMARQUE : La préparation d’une suspension de haute qualité (90 % de cellules viables et 90 % de cellules uniques) est essentielle pour obtenir des données de haute qualité sur une seule cellule. Cependant, l’expérience montre qu’une viabilité aussi faible que 75 % peut être acceptée dans les cas où un traitement, comme une infection ou l’application de petites molécules, a un impact sur la viabilité.
  12. Préparer des banques d’ADN pour les plateformes de profilage transcriptionnel de cellules uniques selon les protocoles du fabricant. Traiter les données selon les protocoles de meilleures pratiques pour l’analyse des données scRNAseq13,14.

6. Préparation de suspensions unicellulaires à partir de HIO différenciés en monocouches à 96 puits

  1. Placer le réactif de digestion cellulaire enzymatique à 37 °C dans un incubateur de CO2 pour le décongeler et le réchauffer 30 minutes avant le début de la digestion HIO monocouche.
  2. Préparez le PBS-EDTA en ajoutant 5 μL de 0,5 M EDTA à 5 mL de PBS. Jetez le milieu de culture cellulaire de la plaque à 96 puits et remplacez-le par 100 μL de PBS-EDTA. Veillez à ne pas perturber la couche cellulaire.
  3. Dissociez les cellules : Jetez le PBS-EDTA et ajoutez 100 μL de réactif de digestion cellulaire enzymatique chaud dans chaque puits. Placez la plaque à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 et mélangez en pipetant doucement tout le volume 5 fois avec une pointe de pipette de 200 μL toutes les 10 minutes pendant 20 à 30 minutes. Évitez les bulles pour préserver la viabilité.
    REMARQUE : L’augmentation du volume de réactif de digestion cellulaire enzymatique à 500 μL peut aider à dissocier les monocouches denses.
  4. Transférez une petite aliquote de cellules (1-2 μL) dans une lame de verre toutes les 10 minutes pour évaluer la dissociation. Il peut s’écouler jusqu’à 50 minutes avant d’obtenir 80 % à 90 % de cellules individuelles, selon le type de DOI. Racler doucement la plaque à l’aide d’une pointe de pipette pendant les étapes de mélange pour favoriser la dissociation, en particulier pour les cellules difficiles à dissocier ; Cependant, le grattage peut avoir un impact sur la viabilité.
  5. Combinez 3 puits répétés par condition dans un seul tube de microcentrifugation de 1,5 mL (300 μL au total). Ajouter 700 μL de milieu de culture cellulaire (diff) + 10 uM ROCKi (volume total de 1 mL). Mélanger délicatement par pipetage.
    REMARQUE : L’utilisation de puits cultivés répétés garantit un nombre adéquat de cellules et réduit les variations d’un puits à l’autre.
  6. Filtrez tout le volume à travers une passoire de 70 μm à l’aide d’une pointe de pipette de 1 ml. Recueillir le débit dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 ml.
    REMARQUE : L’embout du filtre ne se bouchera pas si le temps de digestion du réactif de digestion cellulaire enzymatique est suffisant. Utilisez plusieurs filtres si le filtre est bouché ; Ne forcez pas le volume.
  7. Répétez l’étape 6.6 avec une crépine à pointe de 40 μm. Conservez les échantillons sur de la glace.
  8. Compter les cellules individuelles viables sur une chambre de comptage cellulaire en utilisant l’exclusion du bleu de trypan en ajoutant 5 μL de bleu de trypan à 0,4 % à 5 μL de suspension cellulaire. Diluer au besoin à 1000 cellules/μL. Si la densité cellulaire est inférieure à 1000 cellules/μL, essorer 2 min à 400 x g 4 °C pour granuler les cellules, retirer le milieu d’origine et remettre en suspension dans le milieu de culture cellulaire + ROCKi à la densité cellulaire souhaitée. Ce protocole produit généralement 2 x 105 - 6 x 105 cellules.
    REMARQUE : La préparation d’une suspension de haute qualité (90 % de cellules viables et 90 % de cellules uniques) est essentielle pour obtenir des données de haute qualité sur une seule cellule. Cependant, l’expérience montre qu’une viabilité aussi faible que 75 % peut être acceptée dans les cas où un traitement, comme une infection ou l’application de petites molécules, a un impact sur la viabilité.
  9. Préparez des banques d’ADN selon les protocoles du fabricant de la plate-forme de profilage transcriptionnel de cellule unique. Traiter les données selon les protocoles de meilleures pratiques pour l’analyse des données scRNAseq13,14.

Résultats

Des suspensions unicellulaires ont été regroupées à partir de 2 à 3 puits d’insert de culture cellulaire membranaire, de monocouche et de HIO 3D pour assurer un rendement cellulaire suffisant et réduire les variations d’un puits à l’autre. Des banques de cellules uniques ont été préparées à l’aide de réactifs spécifiques à la plateforme de profilage transcriptionnel de cellule unique. et séquencé avec des lectures d’extrémité appariées sur une plate-forme de séquençage de nouvelle génération, 30 000 lectures/cellule. Les lectures ont été cartographiées, comptées et analysées à l’aide d’outils analytiques pour la génomique unicellulaire. Les cellules de faible qualité avec plus de 20 % de lecture mitochondriale, ou moins de 200 gènes comptés, ont été exclues de l’analyse. Pour évaluer la qualité des cellules, nous avons tracé le nombre de gènes, les UMI et le pourcentage de lectures mitochondriales par cellule (Figure 3) ; les cellules de haute qualité contiennent environ 3500 gènes, 15 000 UMI et 10% de lectures mitochondriales. Suite au filtrage, nous avons obtenu 4000 à 9500 cellules uniques selon le format de croissance HIO. Le clustering non supervisé et la réduction de la dimension UMAP ont permis d’identifier des clusters distincts représentant les types de cellules attendus, y compris les entérocytes absorbants et les cellules sécrétoires (Figure 4).

figure-results-1
Figure 1 : Aperçu des étapes du protocole. Schémas décrivant les principales étapes de l’installation de différents formats d’OIH dans le flux de travail de données sur une seule cellule. Cette image a été créée à l’aide de Biorender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Images en fond clair. Les HIO prêts à être traités ont été imagés à l’aide d’un microscope à fond clair à un grossissement de 5X. À gauche, organoïdes 3D ; au milieu, plaque à 96 puits ; C’est vrai, Transwell. Barres d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3 : Contrôle de la qualité des données. Exemples de mesures de cellules uniques analysées isolées à partir de HIO jéjunaux cultivés en monocouches sur des plaques à 96 puits. Les graphiques en violon montrent le nombre de gènes (nFeature_RNA), les UMI (nCount_RNA) et le pourcentage de lectures mitochondriales (percent.mt) par cellule. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : PUAM de cellules uniques analysées. (A) Un total de 9952 cellules uniques ont été isolées à partir de HIO jéjunaux différenciés cultivés dans des plaques à 96 puits. (B) Au total, 5623 cellules uniques ont été isolées à partir d’OHI jéjunaux différenciés cultivés sur des inserts de culture cellulaire membranaire. (C) Un total de 4402 cellules uniques ont été isolées à partir de HIO 3D iléaux différenciés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Milieu de croissance WRNEMilieu de différenciation
ComposantVolumeConcentration finaleMilieu WRNE sans milieu conditionné L-WRN, nicotinamide et SB202190
*Y-27632 (5 mM) en option200 μL10 μM
A 83-01 (500 μM)100 μL500 nM
DMEM/F12 avancé45 ml
B272 mL
EGF (50 μg/mL)100 μL50 ng/mL
Gastrine (10 μM)100 μL10 nM
GlutaMax (100X)1 mL
HEPES 1 M1 mL
L-WRN Con- Média50 ml~50 %
N21 mL
N-acétylcystéine (500 mM)100 μL500 μM
Nicotinamide 1 M1 mL10 millions d’euros
SB202190 (10 mM)100 μL10 μM
Total Volume100 ml
CMGF- Moyen
DMEM/F12 avancé500 ml
Glutamax5 mL100 fois
1 M Hepes5 mL

Tableau 1 : Composition des différents supports utilisés.

Discussion

À l’aide de plateformes de génomique unicellulaire, des systèmes biologiques complexes, tels que les cultures HIO dérivées de tissus qui modélisent l’épithélium intestinal, peuvent être décomposés pour produire des contributions cellulaires individuelles à la réponse biologique globale 4,5,6. L’hétérogénéité cellulaire et les populations cellulaires rares peuvent également être identifiées et interrogées. L’entrée cellulaire doit être optimisée pour maximiser la sortie à l’aide de plates-formes basées sur la transcriptomique d’une seule cellule. Nous décrivons ici des protocoles qui produiront des suspensions de cellules uniques hautement viables et de bonne qualité, ce qui augmentera la probabilité d’obtenir des données transcriptomiques de haute qualité en aval. La connaissance du protocole est de la plus haute importance, et il est recommandé d’effectuer plusieurs exercices avant de procéder à la préparation de la bibliothèque. La réalisation reproductible de suspensions unicellulaires viables est suggérée avant d’utiliser les cellules pour la préparation de la banque. La rapidité avec laquelle le protocole est mis en œuvre est de la plus haute importance, car la vitesse est directement proportionnelle aux résultats de viabilité. Sur cette base, il est conseillé de limiter le nombre d’échantillons manipulés en même temps. Il est recommandé d’interagir avec l’entité qui préparera les bibliothèques avant de lancer ces protocoles pour obtenir de l’aide au dépannage.

La viabilité de HIO influence directement la banque d’ADN envoyée pour le séquençage. La viabilité cellulaire du HIO dépend de plusieurs étapes de la préparation de la suspension de cellule unique, notamment la dissociation, la centrifugation, les tampons, le pipetage et la précision du comptage. L’objectif de la préparation des DOI pour la plateforme est d’établir un équilibre entre le maintien de la viabilité cellulaire et la qualité des échantillons. Pour obtenir des données de haute qualité, il est essentiel de minimiser les agrégats cellulaires, les cellules mortes, les acides nucléiques non cellulaires et les inhibiteurs biochimiques de la transcription inverse. Les cellules mourantes augmentent le bruit des acides nucléiques et contribuent à l’agglutination des cellules, entraînant des défaillances des données et des plateformes 7,8,9,10,11,12. Le filtrage avec une taille de filtre appropriée peut aider à supprimer les agrégats volumineux et à améliorer la qualité des données.

Plusieurs facteurs doivent être pris en compte pour réduire au minimum la mort cellulaire des HIO lors de la préparation de suspensions de cellules individuelles. Il est nécessaire d’obtenir au moins 80 % de cellules viables, et >90 % de viabilité est encore plus souhaitable. Les échantillons contenant un grand nombre de cellules non viables peuvent être améliorés à l’aide de stratégies visant à éliminer les cellules mortes, telles que les microbilles sur colonne, bien que celles-ci nécessitent davantage de cellules initiales et de plus grands volumes d’échantillons en raison de la perte lors de la manipulation. Les HIO sont particulièrement sensibles aux tampons et subiront la mort cellulaire s’ils sont laissés trop longtemps à RT dans certains tampons. Les milieux organoïdes entraînent le moins de perte cellulaire et de formation d’agrégats. Le pipetage peut également affecter la viabilité des HIO pendant la dissociation. Les pointes à alésage régulier peuvent cisailler les organoïdes, aidant à se dissocier en suspensions unicellulaires ; cependant, un pipetage trop rapide avec une pointe d’alésage régulière peut endommager les cellules HIO en raison des forces de cisaillement. Le pipetage lent avec des pointes à large diamètre minimise le stress sur les cellules HIO et améliore considérablement le nombre de cellules viables en aval. La centrifugation, le lavage et la remise en suspension sont d’autres facteurs qui peuvent influencer la qualité des suspensions de cellules uniques HIO. La centrifugation à godet oscillant permet d’obtenir une granulation plus douce des cellules HIO, ce qui permet de réduire le nombre de cellules mortes tout en minimisant la perte de cellules. Enfin, la précision du comptage pour déterminer la concentration est essentielle pour garantir que le maximum de cellules atteignent la plate-forme de synthèse de la banque. L’attention portée à ces détails permettra de réduire au minimum le stress exercé sur les cellules HIO pendant le processus d’isolement et d’assurer la plus grande probabilité de retour des données après le traitement.

Bien que la transcriptomique sur cellule unique soit un outil puissant pour disséquer les profils biologiques et les réponses au niveau4, 5 et 6 de la cellule unique, plusieurs limites doivent être prises en compte lors de l’application de la technologie à l’analyse des cultures d’organoïdes intestinaux humains. Tout d’abord, il peut y avoir des variations transcriptionnelles importantes en raison de la variabilité technique introduite lors de la préparation de la banque et du séquençage ou en raison d’effets de lot résultant de la préparation des échantillons. De plus, le séquençage peut entraîner un biais de couverture lorsque la profondeur de séquençage est inégale entre les gènes ou les cellules. Cela pose des défis lors de la détection de gènes faiblement exprimés ou de l’identification de populations de cellules rares. Deuxièmement, l’identification des types cellulaires peut être difficile en raison de l’hétérogénéité cellulaire et transcriptionnelle des cultures d’organoïdes et d’un profil cellulaire moins différencié par rapport à l’épithélium intestinal natif. Le couplage des réponses transcriptionnelles aux phénotypes fonctionnels est également un défi et nécessite une validation supplémentaire à l’aide d’autres approches ou essais. Troisièmement, cette approche n’inclut pas la prise en compte du contexte spatial ou de la dynamique temporelle des cellules. La procédure de dissociation supprime la possibilité de déduire des interactions cellule-cellule à partir des données transcriptionnelles. Il ne fournit qu’un seul instantané dans le temps de l’état cellulaire plutôt qu’un continuum biologique. Enfin, les approches transcriptionnelles sur cellule unique peuvent être coûteuses et nécessiter des outils informatiques spécialisés et une expertise en bioinformatique. Cependant, cette approche reste un outil de pointe dominant pour comprendre l’hétérogénéité cellulaire et identifier de nouveaux types de cellules.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent les subventions U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 et l’avis d’accord de coopération de la NASA / TRISH NNX16AO69A.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
[Leu15]-Gastrin ISigma-AldrichG914510 nM
0,05 % Trypsine-EDTAInvitrogen25300054
0,4 % Bleu trypanMillipore-SigmaT8154
0,5 M EDTACorning46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-Corning21-040-CM
24 mm TranswellCostar3412
Boîte de culture tissulaire de surface Nunclon delta 24 puitsThermo Scientific142475
40 & micro ; crépine à cellules mFalcon352340
40 µ ; m Flowmi passoire à pointesSP Bel-Art LabwareH13680-0040
70 µ ; m Flowmi tip strainerSP Bel-Art LabwareH13680-0070
96 well plateCorning3595
A-83-01Tocris2939500 nM
AccutaseStemCell Technologies7920
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-028
B27 supplementInvitrogen17504-0441X
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Bibliothèque & Kit de perles de gel v3.110x GenomicsPN-1000128
Collagène IVSigma-AldrichC5533-5MG33 µ ; g/mL
solution de récupération des cellules Corning  ;VWR354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)Invitrogen14190-1361X
GlutaMAX-IInvitrogen35050-0612 mM
HEPES 1MInvitrogen15630-08010 mM
L-WRN média conditionnéATCCCRL-3276
Matrigel, GFR, sans phénolCorning356231
souris EGF recombinantInvitrogenPMG804350 ng/mL
supplément de N2Invitrogen17502-0481X
N-AcétylcystéineSigma-AldrichA9165-5G500 µ ;
M NicotinamideSigma-AldrichN063610 mM
SB202190Sigma-AldrichS706710 & micro ; M
TranswellCorning3413
Y27632Technologies des cellules souches7230810 & micro ; L
de

Références

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Mots-clés

Transcriptomique sur cellule uniqueCulture d organo desDissociation cellulaireProfilage transcriptionnelPartitionnement microfluidiqueS quen age de nouvelle g n rationIdentification du type cellulaireMicroscopie en champ clair

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