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Accès à la différenciation précoce des lymphocytes T CD4+ auxiliaires folliculaires spécifiques du virus chez les souris infectées par le LCMV aigu

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DOI :

10.3791/66752

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26 avril 2024

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1Department of Urology, South China Hospital, Medical School, Shenzhen University, 2Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging, National-Regional Key Technology Engineering Laboratory for Medical Ultrasound, School of Biomedical Engineering, Shenzhen University Medical School, 3Cancer Center, Daping Hospital & Army Medical Center of PLA, Third Military Medical University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 5Institute of Immunology, Third Military Medical University, 6Dermatology Hospital, Southern Medical University, 7Institute of Immunological Innovation and Translation, Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

L’étude actuelle présente des protocoles permettant d’évaluer l’engagement précoce du devenir des cellules TFH spécifiques du virus et de manipuler l’expression génique dans ces cellules.

Résumé

Les lymphocytes T auxiliaires folliculaires (TFH) sont perçus comme une lignée de lymphocytes T CD4+ indépendante qui aide les lymphocytes B apparentés à produire des anticorps de haute affinité, établissant ainsi une immunité humorale à long terme. Au cours d’une infection virale aiguë, l’engagement du destin des lymphocytes TFH spécifiques du virus est déterminé au début de la phase d’infection, et l’étude des lymphocytes TFH différenciés précocement est cruciale pour comprendre l’immunité humorale dépendante des lymphocytes T et optimiser la conception du vaccin. Dans l’étude, à l’aide d’un modèle murin d’infection par le virus de la chorioméningite lymphoïde aiguë (LCMV) et de la souris SMARTA (SM) transgénique TCR avec des lymphocytes T CD4+ reconnaissant spécifiquement l’épitope de la glycoprotéine LCMV I-AbGP66-77, nous avons décrit des procédures permettant d’accéder à l’engagement précoce du devenir des cellules TFH spécifiques du virus sur la base de colorations par cytométrie en flux. De plus, en exploitant la transduction rétrovirale des lymphocytes T SM CD4+ , des méthodes permettant de manipuler l’expression génique dans les lymphocytes TFH spécifiques du virus différenciés précocement sont également fournies. Par conséquent, ces méthodes aideront aux études explorant le(s) mécanisme(s) sous-jacent(s) à l’engagement précoce des cellules TFH spécifiques du virus.

Introduction

Lorsqu’ils rencontrent différents agents pathogènes ou menaces, les lymphocytes T CD4+ naïfs adaptent leurs réponses immunitaires en se différenciant en divers sous-ensembles de lymphocytes T auxiliaires (TH) dotés de fonctions spécialisées1. Dans le scénario d’une infection virale aiguë, une grande partie des lymphocytes T CD4+ naïfs se différencient en lymphocytes T auxiliaires folliculaires (TFH) qui aident les lymphocytes B 2,3. Distinctes des autres sous-ensembles de cellules TH CD4+ (p. ex., cellules TH1, TH2, TH9 et TH17), les cellules TFH expriment un niveau substantiel de CXCR5, qui est le récepteur de la chimiokine à tête chercheuse des cellules B CXCL13, permettant aux cellules TFH de migrer dans les follicules des cellules B. Dans les follicules des cellules B, les cellules TFH aident les cellules B apparentées à initier et à maintenir les réactions du centre germinal, permettant ainsi une production rapide d’anticorps de haute affinité et une mémoire humorale à long terme 2,3.

Lors d’une infection virale aiguë, l’engagement précoce du devenir des lymphocytes TFH spécifiques du virus se produit dans les 72 h 4,5 et est contrôlé par le répresseur transcriptionnel lymphome-6 à cellules B (Bcl-6)5,6,7,8, qui agit comme le « régulateur principal » régissant les décisions de destin des cellules TFH. La carence en Bcl-6 ralentit sévèrement la différenciation des cellules TFH, tandis que l’expression ectopique de Bcl-6 favorise considérablement l’engagement du destin des cellules TFH. En plus de Bcl-6, plusieurs molécules sont impliquées dans l’instruction de l’engagement précoce du destin des cellules TFH. Les facteurs de transcription TCF-1 et LEF-1 initient la différenciation des cellules TFH via l’induction de Bcl-6 9,10,11. L’inhibition de Blimp1, à la fois par Bcl-6 et TCF-1, est nécessaire pour l’engagement précoce du destin des cellules TFH 11,12. STAT1 et STAT3 sont également nécessaires à la différenciation précoce des cellules TFH 13. De plus, les modifications épigénétiques par l’histone méthyltransférase EZH214,15 et la méthyltransférase m6A METTL316 aident à stabiliser les programmes transcriptionnels des cellules TFH (en particulier Bcl6 et Tcf7) et donc à amorcer l’engagement précoce du destin des cellules TFH. Bien que des progrès, y compris les molécules susmentionnées et d’autres, résumées ailleurs3, aient été réalisés dans la compréhension des régulations transcriptionnelles et épigénétiques de l’engagement précoce des cellules TFH, des molécules jusqu’alors inconnues restent à apprendre.

Dans le modèle murin d’infection par le virus de la chorioméningite lymphoïde aiguë (LCMV), les lymphocytes T CD4+ congéniques SMARTA (SM) transgéniques transférés par adoption, qui reconnaissent spécifiquement l’épitope de la glycoprotéine LCMV I-ABGP66-77, SUBISSENT UNE DIFFÉRENCIATION CELLULAIRE TFH ou TH1 au cours de l’infection virale. Ce modèle de différenciation de la bifurcation TFH/TH1 soutient l’avancement du modèle d’infection SM/LCMV aiguë dans l’étude de la biologie des cellules TFH spécifiques du virus. En effet, le modèle d’infection SM/LCMV aiguë a été largement utilisé dans le domaine de la recherche sur les cellules TFH et a joué un rôle crucial dans des découvertes marquantes en biologie des cellules TFH. Cela comprend l’identification de Bcl-6 susmentionné comme facteur de transcription définissant la lignée des cellules TFH 5,6, ainsi que d’autres facteurs transcriptionnels importants (par exemple, Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 et Itch19) guidant la différenciation des cellules TFH, les régulations post-transcriptionnelles ( par exemple, METTL316 et miR-17~9220) de la différenciation des cellules TFH, de la mémoire et de la plasticité des cellules TFH 21,22 et des stratégies de vaccination rationnelles ciblant les cellules TFH (par exemple, le sélénium23).

La présente étude décrit des méthodes reproductibles pour accéder à l’engagement précoce du devenir des cellules TFH spécifiques du virus, y compris (1) l’établissement d’un modèle de souris chimère SM infectée par un LCMV aigu adapté à l’accès aux cellules TFH différenciées précocement, (2) la réalisation de colorations par cytométrie en flux de molécules associées aux cellules TFH différenciées précocement, et (3) la manipulation de gènes basée sur des vecteurs rétroviraux dans SM CD4+ lymphocytes T. Ces méthodes seront utiles pour les études portant sur l’engagement précoce du devenir des cellules TFH spécifiques du virus.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées selon des procédures approuvées par les comités institutionnels de soin et d’utilisation des animaux de la troisième université de médecine militaire. Les souches de souris suivantes ont été utilisées dans la présente étude : souris C57BL/6J (B6) (des deux sexes), âgée de 6 à 8 semaines, pesant de 25 à 30 g ; souris transgéniques CD45.1+SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgéniques), des deux sexes, âgées de 6 à 8 semaines, pesant de 25 à 30 g ; et souris transgénique CXCR5-GFP CD45.1+SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgénique × CXCR5-GFP knock-in), des deux sexes, âgées de 6 à 8 semaines, pesant de 25 à 30 g. Les espèces transgéniques ont été générées à la suite d’un rapport précédemment publié24. Les détails des réactifs, des tampons et de l’équipement utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Prélèvement de lymphocytes T CD45.1+ SM CD4+ pour le transfert adoptif

  1. Euthanasier (selon les protocoles approuvés par l’établissement) le nombre requis de souris SM transgéniques CD45.1+ TCR âgées de 6 à 8 semaines24. Faites une incision de 1 pouce à gauche de la paroi péritonéale des souris euthanasiées avec des ciseaux chirurgicaux, disséquez la rate du péritoine et déchirez le tissu conjonctif derrière la rate 25,26.
  2. Placez chaque rate dans une passoire cellulaire de 70 μm à l’intérieur d’une boîte de Pétri (60 mm × 15 mm) et broyez la rate avec 3 ml de tampon de lyse des globules rouges (GR) à l’aide d’un piston de seringue de 1 ml.
    REMARQUE : Utilisez le côté rond du piston de la seringue pour broyer la rate jusqu’à ce qu’il ne reste que du tissu conjonctif.
  3. Ajouter 6 mL de RPMI + 2 % FBS (RPMI 2 %) dans chaque plat pour diluer 3 mL de tampon de lyse des globules rouges. Pipeter les suspensions cellulaires dans un tube conique de 15 mL à partir de la boîte. Rincez le plat avec 3 ml supplémentaires de RPMI à 2 % et transférez-le dans le même tube conique.
  4. Centrifuger les suspensions cellulaires à 800 × g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant par décantation. Remettez les cellules en suspension avec un tampon d’isolement et ajustez la densité des cellules à ~1 × 108 cellules par ml. Placez le tube sur de la glace.
  5. Préparer un cocktail d’anticorps biotinylés 1x contre CD8a, CD19, NK1.1, F4/80, CD11c et Ter119 dans un tampon d’isolement pour l’enrichissement des lymphocytes T CD4+ .
    REMARQUE : Ajouter des anticorps biotinylés dans le tampon d’isolement à la dilution indiquée comme mentionné dans le tableau des matériaux. Maintenez le volume du cocktail d’anticorps identique à celui du tampon d’isolement à l’étape 1.4.
  6. Centrifuger les suspensions cellulaires à 800 × g pendant 5 min à 4 °C et éliminer le surnageant par décantation.
  7. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec le cocktail d’anticorps biotinylés 1x indiqué dans le tube conique.
  8. Posez le tube conique sur de la glace dans un agitateur pendant 30 min à 45 tr/min.
  9. Pendant l’incubation avec des anticorps biotinylés, préparez le volume requis de billes enrobées de streptavidine selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE : Les splénocytes totaux d’une souris naïve ont besoin de 200 μL de billes enrobées de streptavidine.
  10. Laver les cellules par centrifugation à 800 x g avec 8-10 mL de tampon d’isolement pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant. Répétez cette étape deux fois de plus.
  11. Mettre en suspension la pastille cellulaire avec des billes préparées enrobées de streptavidine.
  12. Posez le tube sur de la glace dans un shaker pendant 40 min à 45 tr/min.
  13. Ensuite, placez le tube sur un support magnétique pendant 3-4 min jusqu’à ce que toutes les billes soient assemblées du côté magnétique.
  14. Prélevez soigneusement le surnageant et transférez-le dans un nouveau tube conique de 15 ml.
  15. Centrifuger les suspensions cellulaires à 800 × g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant par décantation.
    REMARQUE : Il existe d’autres trousses commerciales pour l’enrichissement des lymphocytes T CD4+ , qui peuvent être utilisées comme substituts à la procédure d’enrichissement des lymphocytes T CD4+ décrite aux étapes 1.5 à 1.15.
  16. Remettre en suspension la pastille de cellule avec 2-3 mL de RPMI à 2 %. Aspirer 50 μL de suspension cellulaire pour l’analyse par cytométrie en flux de l’efficacité de l’enrichissement en lymphocytes T CD4+ (CD4 et Vα2) et de la viabilité cellulaire.
  17. Centrifuger les suspensions cellulaires à 800 × g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant par décantation. Remettez la pastille cellulaire en suspension avec de l’IPRP et ajustez la densité cellulaire à 1 × 107 cellules CD4+Vα2+ SM par ml. Mettez le tube sur de la glace et passez au transfert de cellules adoptives à l’étape suivante.

2. Établissement du modèle de souris chimère SM infectée par le LCMV aigu pour accéder aux cellules T FH SM différenciées précocement

  1. Réchauffez les souris C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines avec une lampe infrarouge pour dilater la veine de la queue en vue d’une injection intraveineuse.
  2. Aspirer 100 μL de suspension cellulaire contenant 1 × 10cellules 6 SM préparées à l’étape 1.17 à l’aide d’une seringue à insuline.
    REMARQUE : Le volume d’injection doit être modifié par chaque chercheur et ne doit pas dépasser le volume d’injection maximal autorisé par la législation institutionnelle et locale.
  3. Maintenez les souris en place avec un fixateur de souris, redressez la queue et essuyez la queue avec de l’éthanol à 75 % à l’aide d’une boule de coton pour rendre la veine de la queue visible.
  4. Insérez l’aiguille de la seringue à insuline dans la veine de la queue et injectez les suspensions cellulaires en douceur et lentement. Ensuite, laissez les souris receveuses se reposer pendant la nuit.
  5. Le lendemain, diluer le stock du virus Armstrong du LCMV avec un milieu RPMI pour obtenir une concentration finale de 1 × 107 unités formant une plaque/mL.
  6. Injecter 100 μL de solution diluée de LCMV Armstrong (contenant 1 × 106 unités formant la plaque) dans la veine de la queue des souris receveuses.
    REMARQUE : Chaque chercheur doit faire attention à ce que le titre infectieux recommandé soit autorisé par la loi institutionnelle et locale.

3. Coloration par cytométrie en flux de cellules SM TFH différenciées précocement

  1. Sacrifiez les souris (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement) à partir de l’étape 2.6 au jour 3 après l’infection, et traitez les lymphocytes de la rate comme décrit à l’étape 1. Ajustez la densité cellulaire à environ 2 × 107 cellules par ml.
  2. Chargez 50 μL de suspensions cellulaires (~1 × 106 cellules) sur une plaque à fond rond de 96 puits et complétez avec 150 μL de tampon de coloration par puits. Gardez l’assiette sur de la glace.
  3. Préparez le cocktail d’anticorps anti-souris CXCR5 purifié pour le rat (c.-à-d. l’anticorps primaire CXCR5) à une dilution de 1:50 dans 50 μL de tampon de coloration des cellules TFH pour chaque échantillon dans un tube. Agiter soigneusement le tube et le centrifuger à 15 000 × g pendant 3 min à 4 °C pour agréger les particules. Gardez le tube sur de la glace.
  4. Centrifuger la plaque à 96 puits à 800 × g pendant 1 min à 4 °C, jeter le surnageant par décantation, agiter brièvement la plaque et ajouter 200 μL de tampon de coloration par puits.
  5. Répétez l’étape 3.4 et remettez en suspension les cellules avec 50 μL de l’anticorps primaire CXCR5 par puits. Bien mélanger en pipetant de haut en bas et incuber sur glace pendant 1 h.
  6. Préparez le cocktail d’anticorps anti-rat de chèvre biotinylée (c.-à-d. l’anticorps secondaire CXCR5) à une dilution de 1:200 dans 50 μL de tampon de coloration des cellules TFH pour chaque échantillon dans un nouveau tube. Vortex le tube et centrifugez-le à 15 000 × g pendant 3 min à 4 °C pour agréger les particules. Gardez le tube sur de la glace.
  7. Centrifuger la plaque à 800 × g pendant 1 min à 4 °C, jeter le surnageant par décantation, agiter brièvement la plaque et ajouter 200 μL de tampon de coloration par puits.
  8. Répétez l’étape 3.7 deux fois et gardez l’assiette sur de la glace.
  9. Ajouter 50 μL d’anticorps secondaires CXCR5 par puits dans la plaque. Bien mélanger en pipetant de haut en bas et incuber sur glace pendant 30 min.
  10. Préparez de la streptavidine conjuguée à la fluorescence (c.-à-d. l’anticorps tertiaire CXCR5) à une dilution de 1:200 dans 50 μL de tampon de coloration des cellules TFH pour chaque échantillon. Pendant ce temps, ajoutez d’autres anticorps contre les marqueurs de surface (par exemple, CD45.1, CD4,-1, CD25 et d’autres molécules intéressées) et la coloration des cellules mortes avec l’anticorps tertiaire CXCR5.
  11. Vortex le tube et centrifugez-le à 15 000 × g pendant 3 min à 4 °C pour agréger les particules. Gardez le tube sur de la glace.
  12. Centrifuger la plaque à 800 × g pendant 1 min à 4 °C, jeter le surnageant par décantation, agiter brièvement la plaque et ajouter 200 μL de tampon de coloration par puits.
  13. Répétez l’étape 3.12 deux fois et gardez la plaque sur de la glace.
  14. Ajouter 50 μL de cocktail d’anticorps tertiaires CXCR5 par puits dans la plaque. Bien mélanger en pipetant de haut en bas et incuber sur de la glace pendant 30 min dans l’obscurité.
  15. Préparez 200 μL de tampon de fixation/perméabilisation pour chaque puits selon les instructions du fabricant.
  16. Centrifuger la plaque à 800 × g pendant 1 min à 4 °C, jeter le surnageant par décantation, agiter brièvement la plaque et ajouter 200 μL de tampon de coloration par puits.
  17. Répétez l’étape 3.16 deux fois et gardez l’assiette sur de la glace dans l’obscurité.
  18. Ajouter 200 μL de tampon de fixation/perméabilisation dans chaque puits. Bien mélanger en pipetant de haut en bas et en incubant à température ambiante pendant 30 min (dans l’obscurité).
    REMARQUE : Préparez le tampon de perméabilisation (1x) selon les instructions du fabricant.
  19. Préparez le cocktail d’anticorps contre les facteurs de transcription, y compris Bcl-6, TCF-1, T-bet et d’autres molécules intéressées, dans 50 μL de tampon de perméabilisation (1x) pour chaque puits dans un nouveau tube.
  20. Vortex le tube et centrifugeuse à 15 000 x g pendant 3 min à 4 °C pour agréger les particules.
  21. Centrifuger la plaque à 800 × g pendant 1 min à 4 °C, jeter le surnageant par décantation, agiter brièvement la plaque et ajouter 50 μL de cocktail d’anticorps de facteur transcriptionnel par puits. Bien mélanger et incuber sur glace pendant 30 min dans le noir.
  22. Centrifuger la plaque à 800 × g pendant 1 min à 4 °C, jeter le surnageant, agiter brièvement la plaque par décantation et ajouter 200 μL de tampon de perméabilisation (1x) par puits.
  23. Répétez l’étape 3.22.
  24. Ajouter 200 μL de tampon de coloration dans chaque puits, centrifuger la plaque à 800 × g pendant 1 min à 4 °C, jeter le surnageant par décantation et agiter brièvement la plaque.
  25. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans chaque puits avec 200 μL de tampon de coloration et transférez les cellules dans des tubes de cytométrie en flux pour une analyse immédiate par cytométrie en flux.
    REMARQUE : Alternativement, les échantillons peuvent être détectés dans les 3 jours dans des conditions d’ajout de 200 μl de PFA à 2 % dans chaque tube et d’être stockés à 4 °C dans l’obscurité.

4. Production de rétrovirus

  1. Cultivez les cellules 293T (avec moins de dix passages) avec un milieu DMEM 10% dans une boîte de culture de 10 cm pendant une durée de 2-3 passages.
  2. Lorsque les cellules ont atteint une confluence de 90 %, jetez l’ancien milieu et lavez doucement les cellules avec du PBS deux fois, puis essayez brièvement les cellules 293T à l’aide de 1 ml de trypsine-EDTA à 0,25 % à température ambiante pendant 1 min.
  3. Arrêtez le processus de digestion en remettant les cellules en suspension dans 2 ml de milieu DMEM 10 % préchauffé, en les transférant dans un tube conique de 15 ml et en les centrifugeant à 200 × g pendant 5 min à 4 °C.
  4. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire en pipetant le milieu de culture de haut en bas avec 2 ml de milieu DMEM à 10 % préchauffé.
  5. Quantifiez le nombre de cellules et de plaques de 5 × 105 cellules dans un milieu de DMEM à 10 % de 2,5 mL par puits dans une plaque de 6 puits.
    REMARQUE : Faites tourner doucement le plat pour permettre aux cellules 293T de se répartir uniformément dans toute la plaque.
  6. Lorsque la confluence des cellules 293T dépasse 80 %, préparez les réactifs de transfection comme décrit aux étapes 4.7 à 4.9.
  7. Pour chaque puits d’une plaque à 6 puits, ajoutez 250 μL de milieu Opti-MEM préchauffé dans un tube stérile de 1,5 mL. Ensuite, ajoutez 3 μg d’ADN plasmidique (contenant 2 μg de vecteur rétroviral et 1 μg de pCL-Eco) dans le milieu Opti-MEM, suivi d’un pipetage doux de haut en bas pour assurer un mélange complet.
    REMARQUE : Les vecteurs rétroviraux utilisés à titre d’exemples dans cette étude sont le vecteur MigR1 et le vecteur MigR1 modifié avec la région CDS Bcl6 en amont de l’IRES-GFP (MigR1-Bcl6).
  8. Ensuite, ajoutez 7,5 μL de réactif de transfection préchauffé (obtenu dans le commerce) au mélange et pipetez doucement de haut en bas pour assurer un mélange complet.
  9. Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 min.
  10. Distribuez le mélange goutte à goutte dans des régions distinctes du puits de culture cellulaire 293T, puis balancez doucement le récipient de culture dans un mouvement de va-et-vient et d’un côté à l’autre pour assurer une répartition uniforme du mélange.
  11. Incuber les cellules 293T pendant 72 h dans un incubateur à 37 °C contenant 5% de CO2.
  12. Détectez l’étiquette du vecteur rétroviral comme indicateur de l’efficacité de la transfection dans les cellules 293T transfectées à l’aide d’un microscope à fluorescence ou d’une cytométrie en flux.
    REMARQUE : Par exemple, nous avons confirmé le signal de fluorescence GFP dans une proportion significative de cellules 293T transfectées par vecteur MigR1, suggérant une transfection de haute qualité.
  13. Prélever le milieu de culture cellulaire et centrifuger à 2 500 × g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires. Le surnageant résultant doit être soigneusement recueilli et stocké soit pour une conservation à long terme à -80 °C, soit temporairement conservé à 4 °C.

5. Activation in vivo, transduction du rétrovirus et transfert adoptif de lymphocytes T SM CD4+

  1. Injecter par voie intraveineuse à une souris CD45.1+ SM (âgée de 6 à 8 semaines) 200 μg de peptide11,14 LCMV GP61-77 dans un volume de 100 μL de milieu RPMI.
    REMARQUE : Le volume d’injection doit être modifié par chaque chercheur et ne doit pas dépasser le volume d’injection maximal autorisé par l’établissement et la législation locale.
  2. Euthanasier la souris SM 16-18 h après l’injection de peptide (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Acquérez les splénocytes en suivant les procédures susmentionnées à l’étape 1.
    REMARQUE : Alternativement, la méthode de stimulation anti-CD3/anti-CD28 in vitro 27,28 peut être utilisée pour activer les lymphocytes T CD4+ SM à la place de la stimulation peptidique in vivo décrite aux étapes 5.1 et 5.2.
  3. Suspendez les splénocytes avec 2 % de RPMI et ajustez la densité cellulaire à environ 1 × 108 cellules par mL dans un tube conique de 15 mL. Gardez le tube sur de la glace.
  4. Versez 50 μL de suspension cellulaire dans une plaque à fond rond de 96 puits et complétez avec 150 μL de tampon de coloration par puits.
  5. Centrifugez la plaque à 96 puits à 800 × g pendant 1 min à 4 °C pour granuler les cellules, retirez soigneusement le surnageant par décantation, agitez brièvement la plaque et ajoutez 200 μL de tampon de coloration par puits.
  6. Répétez l’étape 5.5 et remettez en suspension les cellules avec 50 μL de cocktail d’anticorps de surface, y compris CD4, CD25 et CD69, pour détecter l’état d’activation des cellules T SM CD4+ . Bien mélanger en pipetant de haut en bas et incuber sur de la glace pendant 30 min dans l’obscurité.
  7. Remplir chaque puits avec un tampon de coloration à 200 μL, suivi d’une centrifugation de la plaque à 800 × g pendant 1 min à 4 °C. Jetez le surnageant par décantation et faites un bref tourbillon sur la plaque.
  8. Répétez l’étape 5.7 deux fois.
  9. Remettez les cellules en suspension dans 200 μL de tampon de coloration et transférez-les dans un tube de cytométrie en flux.
  10. Analysez les cellules colorées par anticorps conjugués à la fluorescence à l’aide d’une cytométrie en flux pour évaluer l’état d’activation des lymphocytes T CD4+ SM.
    REMARQUE : Les lymphocytes T CD4+ SM activés ont présenté des expressions abondantes de CD25 et CD69 par rapport aux cellules naïves, permettant ainsi des procédures de transduction ultérieures.
  11. Ajouter 1 × 106 lymphocytes T CD4+ SM (à partir de l’étape 5.3) par puits dans une plaque à 24 puits. Faites tourner les cellules à 800 × g pendant 3 min à 4 °C, puis retirez délicatement le milieu par décantation.
  12. Ajouter 1 mL de milieu rétroviral tel que décrit à l’étape 4.13 et 8 μg de polybrène dans chaque puits.
  13. Spin-transduction des cellules à 800 × g pendant 2 h à 37 °C.
  14. Jeter soigneusement le milieu rétroviral par pipetage et ajouter 1 mL de RPMI 10 % préchauffé complété par 10 ng/mL d’IL-2 murin recombinant dans chaque puits.
  15. Incuber les cellules pendant 48 h dans un incubateur à 37 °C contenant 5% de CO2.
  16. Transvaser la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et faire tourner les cellules à 800 × g pendant 6 min à 4 °C.
  17. Retirer le surnageant par décantation et remettre en suspension les cellules avec un volume approprié de 2 % RPMI pour obtenir une densité cellulaire de 1 × 108 cellules par mL dans un tube conique de 15 mL. Gardez le tube sur de la glace.
  18. Versez 50 μL de suspension cellulaire dans une plaque à fond rond de 96 puits et complétez avec 150 μL de tampon de coloration par puits.
  19. Centrifugez la plaque à 96 puits à 800 × g pendant 1 min à 4 °C pour granuler les cellules, retirez soigneusement le surnageant par décantation, agitez brièvement la plaque et ajoutez 200 μL de tampon de coloration par puits.
  20. Répétez l’étape 5.19 et remettez en suspension les cellules avec 50 μL de cocktail d’anticorps de surface, y compris CD4, Vα2 et l’anticorps associé à une étiquette vectorielle. Bien mélanger en pipetant de haut en bas et incuber sur de la glace pendant 30 min dans l’obscurité.
  21. Remplir chaque puits avec un tampon de coloration à 200 μL, suivi d’une centrifugation de la plaque à 800 × g pendant 1 min. Jetez le surnageant par décantation et faites un bref tourbillon sur la plaque.
  22. Répétez l’étape 5.21 deux fois.
  23. Remettez les cellules en suspension dans 200 μL de tampon de coloration et transférez-les dans un tube de cytométrie en flux.
  24. Analysez les cellules colorées par anticorps conjugués à la fluorescence avec cytométrie en flux pour évaluer l’efficacité de la transduction dans les lymphocytes T SM CD4+ .
    REMARQUE : Dans l’étude, les lymphocytes T CD4+ SM transduits efficacement ont montré une expression élevée de l’étiquette du rétrovirus, comme la GFP.
  25. Centrifuger les suspensions cellulaires à partir de l’étape 5.17 à 800 × g pendant 5 min à 4 °C et éliminer le surnageant par décantation. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec RPMI et ajuster la densité cellulaire à 1 × 107 cellules CD4+Vα2+ SM/mL.
  26. Transférez adoptivement un nombre total de 1 × 106 lymphocytes T CD45.1+ SM CD4+ à chaque souris receveuse C57BL/6 (âgée de 6 à 8 semaines) par injection intraveineuse de 100 μL de suspension cellulaire à l’étape 5.25.
  27. Le lendemain, infecter les souris receveuses du C57BL/6 avec 1 × 106 unités formant la plaque LCMV Armstrong par injection intraveineuse.

6. Analyse par cytométrie en flux des cellules SM TFH transduites par le rétrovirus au stade précoce de l’infection aiguë par le LCMV

  1. Acquérez les splénocytes des souris C57BL/6 à partir de l’étape 5.25 le 3e jour suivant l’infection.
  2. Effectuez une coloration par cytométrie en flux des marqueurs de surface, y compris CD4, CD45.1, CXCR5, CD25 et d’autres molécules intéressées, dans les splénocytes, comme décrit à l’étape 3.
  3. Pour la détection de facteurs transcriptionnels dans les lymphocytes T CD4+ SM transduits par un rétrovirus marqué par des protéines fluorescentes, ajouter 200 μL de PFA à 2 % dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 20 min dans l’obscurité.
  4. Effectuez la fixation/perméabilisation, la coloration par cytométrie en flux des facteurs transcriptionnels intéressés et l’analyse par cytométrie en flux comme décrit à l’étape 3.

Résultats

Caractéristiques des lymphocytes TFH spécifiques du virus différenciés précocement au cours d’une infection aiguë par le LCMV
Afin de sonder l’engagement précoce des lymphocytes TFH spécifiques du virus, des lymphocytes T congéniques SM CD4+ naïfs qui reconnaissent spécifiquement l’épitope I-AbGP66-77 du LCMV ont été transférés adoptivement chez des receveurs CD45.2+ C57BL/6. Le lendemain, ces receveurs ont été infectés par voie intraveineuse avec une forte dose du LCMV Armstrong, à résolution aiguë (figure 1A). Le 3e jour après l’infection, les splénocytes des receveurs du vaccin C57BL/6 ont été analysés par cytométrie en flux, et les résultats ont indiqué une grande quantité de lymphocytes T CD4+ CD4+ SM transférés (~10 % du total des lymphocytes T CD4+) (figure 1B), ce qui a fourni un nombre suffisant de lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus pour un examen plus approfondi. D’autres analyses des lymphocytes T CD4+ SM transférés ont montré une co-expression de CXCR5 et Bcl-6/TCF-1 et une expression réciproque de CXCR5 et CD25/T-bet, définissant ainsi les lignées TFH (CXCR5+Bcl-6+ ou CXCR5+TCF-1+) et TH1 (CXCR5-CD25+ ou CXCR5-T-bet+) (Figure 1C). Pour évaluer la spécificité et la sensibilité de la coloration des anticorps CXCR5 présentée dans l’étude, nous avons ensuite croisé la lignée de souris CD45.1+ SM susmentionnée avec la lignée de souris knock-in CXCR5-GFP, qui a été générée par l’insertion d’une construction IRES-GFP après le cadre de lecture ouvert de Cxcr529. Ensuite, des cellules SM rapporteures CD45.1+ CXCR5-GFP ont été transférées dans des receveurs C57BL/6. Ces receveurs ont été infectés par le LCMV Armstrong, et leurs splénocytes ont été analysés le 3e jour suivant l’infection. En effet, le signal de fluorescence de la méthode de coloration des anticorps CXCR5 dans l’étude chevauchait finement le signal GFP dans les cellules T CD4+ 29 SM rapporteures CXCR5-GFP transférées au jour 3 de l’infection (Figure 1D), indiquant la grande spécificité de la méthode de coloration des anticorps CXCR5 en trois étapes.

Surexpression de Bcl-6 basée sur le rétrovirus dans les lymphocytes T CD4+ SM
Bcl-6 est l’une des molécules les plus importantes dans la promotion de la différenciation des cellules TFH 6,7,8. Afin de déterminer la fiabilité du protocole actuel pour l’accès aux lymphocytes TFH différenciés précocement, les lymphocytes T CD4+ CD4+ SM CD4+ ont été activés et transduits in vivo avec un surnageant rétroviral à partir de cellules 293T transfectées par plasmide de surexpression du plasmide MigR1 ou de cellules 293T de surexpression de MigR1-Bcl6 (Figure 2 et Figure 3A). Les lymphocytes T SM CD4+ transduits par le rétrovirus ont ensuite été transférés adoptivement chez des receveurs C57BL/6, qui ont ensuite été infectés par le LCMV Armstrong (figure 3B). Le 3e jour après l’infection, nous avons constaté une bifurcation équilibrée des lymphocytes TFH et TH1 dans les lymphocytes T CD4+ MigR1-SM, tandis qu’une différenciation prédominante dirigée parles lymphocytes T CD4+ MigR1-Bcl6-SM (Figure 3C). De manière constante, le niveau d’expression de Bcl-6 a été augmenté dans les lymphocytes T CD4+ MigR1-Bcl6-SM par rapport à celui dans les lymphocytes T CD4+ MigR1-SM (Figure 3D). Par conséquent, le phénotype selon lequel ladifférenciation 6 des cellules TFH induite par l’expression ectopique de Bcl-6 a été finement reproduit selon le protocole actuel.

figure-results-1
Figure 1 : Analyses par cytométrie en flux de l’engagement précoce du devenir des cellules SM TFH au cours de l’infection par le LCMV Armstrong. (A) Conception expérimentale. Des lymphocytes T CD4+ spléniques ont été prélevés sur des souris CD45.1+ SM, puis transférés adoptivement chez des receveurs C57BL/6 (CD45.2+). Le lendemain, ces receveurs ont été infectés par le LCMV Armstrong. Le 3e jour après l’infection, les cellules CD45.1+ SM transférées de la rate des receveurs ont été analysées par cytométrie en flux. (B) Données représentatives de cytométrie en flux montrant la stratégie de déclenchement des lymphocytes T CD45.1 SM CD4+ transférés à partir de la rate des receveurs au 3e jour de l’infection par le LCMV Armstrong. (C) Des données représentatives de cytométrie en flux montrant des co-coloration de CXCR5 et d’autres molécules associées aux cellules TFH (Bcl-6, TCF-1, CD25 et T-bet) dans les cellules SM CD45.1+ transférées de la rate des receveurs au 3e jour de l’infection par LCMV Armstrong. (D) Données représentatives de cytométrie en flux montrant des co-coloration de l’anticorps conjugué à la fluorescence contre CXCR5 et le signal GFP dans les cellules SM rapporteures CD45.1+ CXCR5-GFP transférées de la rate des receveurs au 3e jour après l’infection par LCMV Armstrong. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Transduction rétrovirale dans les lymphocytes T CD4+ SM. (A) Schéma de principe de la production et de la transduction rétrovirales dans les lymphocytes T CD4+ SM. Pour la production de rétrovirus, les cellules 293T ensemencées dans une plaque à 6 puits ont été transfectées avec des plasmides d’ADN cibles lorsque la densité cellulaire atteint ≥80 % de confluence. Ensuite, un surnageant de culture cellulaire contenant des rétrovirus a été prélevé 72 h après la transfection et immédiatement utilisé ou stocké à -80 °C. Pour la transduction rétrovirale dans les lymphocytes T CD4+ SM, une souris CD45.1+ SM a reçu une injection intraveineuse de 200 μg de peptide LCMV GP61-77. Ensuite, la rate a été disséquée chez la souris SM 16 à 18 h après l’injection peptidique, et l’état d’activation des lymphocytes T CD4+ spléniques a été détecté. Les lymphocytes T CD4+ SM activés ont été transduits avec un surnageant de culture contenant des rétrovirus et cultivés in vitro pendant 48 h avant d’accéder à l’efficacité de transduction. (B) Imagerie par microscopie à fluorescence de la GFP dans les cellules 293T transfectées par l’ADN plasmidique. Barre d’échelle : 400 μm. (C) Analyse par cytométrie en flux des niveaux d’expression de CD25 et CD69 dans des lymphocytes T CD4+ naïfs de souris naïves (naïves, à gauche) ou de lymphocytes T CD4+ spléniques de souris SM injectées de peptide LCMV GP61-77 (activé, à droite). (D) Analyse par cytométrie en flux de l’expression de la GFP dans les lymphocytes T SM CD4+ transduits par rétrovirus (transduits, à gauche) ou les lymphocytes T SM CD4+ non transduits par rétrovirus (non transduits, à gauche). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Effets de la surexpression de Bcl-6 dans l’engagement du destin cellulaire SM TFH. (A) Cartes linéaires des squelettes rétroviraux MigR1 (panneau en haut) et du vecteur MigR1 modifié avec la région CDS Bcl6 en amont de IRES-GFP (MigR1-Bcl6) (panneau inférieur). (B) Conception expérimentale. Les lymphocytes T SM CD4+ transduits par MigR1 ou MigR1-Bcl6 ont été transférés adoptivement chez des receveurs C57BL/6 (CD45.2+) un jour avant le LCMV Armstrong. Le 3e jour après l’infection, les lymphocytes T CD45.1+ SM CD4+ transférés de la rate des receveurs ont été analysés par cytométrie en flux. (C) Analyse par cytométrie en flux de CXCR5 et CD25 dans les lymphocytes T GFP+ SM CD4+ transduits par MigR1 ou MigR1-Bcl6. Les chiffres adjacents à la porte indiquent les fréquences des cellules TFH dans les cellules T SM CD4+. (D) Analyse par cytométrie en flux du niveau d’expression de Bcl-6 dans les lymphocytes T SM CD4+ transduits par MigR1 ou MigR1-Bcl6. MFI, intensité moyenne de fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La recherche dans le domaine des lymphocytes TFH a été mise en évidence depuis la découverte de la fonction spécialisée des lymphocytes TFH dans l’aide aux lymphocytes B. De plus en plus d’études ont indiqué que la différenciation des cellules TFH est un processus en plusieurs étapes et multifactoriel30, dans lequel l’engagement du destin des cellules TFH est déterminé à un stade précoce5. Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents aux lymphocytes TFH différenciés précocement est cruciale pour la biologie des lymphocytes TFH et la conception rationnelle de vaccins. Dans ce document, nous avons fourni des méthodes pour accéder à l’engagement précoce du devenir des cellules TFH spécifiques du virus et pour manipuler l’expression génique dans les cellules TFH différenciées précocement en exploitant le modèle d’infection virale LCMV Armstrong, la souris SM transgénique TCR et la transduction médiée par le rétrovirus.

Le récepteur des chimiokines CXCR5 est un marqueur de surface important qui distingue les cellules TFH des autres sous-ensembles de cellules TH CD4+ 6,7,8,31, nécessitant ainsi la méthode de coloration CXCR5 de haute spécificité et sensibilité dans la recherche sur les cellules T FH. Dans l’étude, une méthode de coloration en trois étapes de la streptavidine-biotine CXCR5 a été présentée pour identifier le sous-ensemble de cellules TFH (Figure 1C). Bien que la perte de spécificité soit un problème épineux pour les approches de coloration d’anticorps à deux ou trois streptocoques de haute sensibilité, il a été constaté que le signal de fluorescence par coloration des anticorps CXCR5 en trois étapes chevauchait presque complètement le signal GFP dans les lymphocytes T SM CD4+ rapporteurs CXCR5-GFP29 le 3e jour après l’infection (Figure 1D), suggérant l’obtention de la spécificité et de la sensibilité par la méthode de coloration des anticorps CXCR5 en trois étapes. En effet, cette stratégie de coloration CXCR5 à trois streptocoques a fait ses preuves et a aidé les chercheurs à mieux étudier la biologie des cellules TFH 11,14,15,21 ainsi que d’autres types de cellules T exprimant CXCR5 29,32.

Lors de l’infection et de l’immunisation, l’engagement du destin des lymphocytes TFH est généralement modélisé par une différenciation bifurquée des lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes TFH ou en lymphocytes TH effecteurs non TFH 2,3,30. Cette étude a mis en évidence la bifurcation équilibrée des cellules TFH et TH1 dans les cellules T SM CD4+ transférées. De plus, ces lymphocytes T SM CD4+ transférés ont une quantité cellulaire adéquate au stade précoce de l’infection, agissant ainsi comme un modèle approprié pour étudier la différenciation des lymphocytes TFH. Certes, l’expression ectopique de Bcl-6 médiée par le rétrovirus dans les lymphocytes T CD4+ CD4+ transférés était fortement biaisée en faveur de la différenciation des lymphocytes TFH par rapport à celle des lymphocytes T CD4+ SM témoins (86,6 % contre 53,8 %) (Figure 3C), ce qui est aligné avec le rapportprécédent 6 et prouve une fois de plus l’exactitude des protocoles décrits dans l’étude. Alternativement, les protocoles susmentionnés peuvent également être appliqués à l’inactivation médiée par le rétrovirus de gènes intéressés (par exemple, bcl6, Tcf7) dans les cellules T SM CD4+ 11 activées précocement (données non présentées).

L’une des limites du protocole est le problème de synchronisation (plus de 2 h au total) et le processus en plusieurs étapes de la méthode de coloration CXCR5 en trois étapes. Alternativement, des méthodes de coloration CXCR5 en une étape18,33 ou en deux étapes 4,9,34 ont également été appliquées dans la recherche sur les cellules TFH. Une comparaison de la spécificité/sensibilité de ces méthodes de coloration CXCR5 est justifiée.

En résumé, l’étude actuelle a fourni des protocoles permettant d’accéder à des cellules TFH spécifiques du virus différenciées précocement et d’étudier le(s) gène(s) intéressé(s) qui régulent potentiellement la différenciation des cellules TFH . Ces protocoles alimenteront les investigations sur l’engagement précoce du destin des cellules TFH .

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 32300785 à X.C.), du Programme national postdoctoral de Chine pour les talents innovants (n° 100). BX20230449 à X.C.) et le Grand projet national en sciences et technologie (n° 2021YFC2300602 à L.Y.).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,25 % Trypsine-EDTACorning25-052-CI
4 % Paraformaldéhyde Fix Solution, 4 % PFABeyotimeP0099-500mL
70 &mu ; passoire à cellules mMerckCLS431751
Alexa Fluor 647 anti-souris TCR V&alpha ; 2 (clone B20.1)Biolegend127812dilution 1:200
Alexa Fluor 700 anti-souris CD45.1 (clone A20)Biolegend110724dilution 1:200
APC anti-souris CD25 (clone PC61)Biolegend101910dilution 1:200
B6 CD45.1 (B6. souris SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ)The Jackson Laboratory002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
Biotine anti-souris F4/80 Anticorps (clone BM8)Biolegend123106dilution 1:200
Biotine Rat anti-souris CD11c (clone N418)Biolegend117304dilution 1:200
Biotine Rat anti-souris CD19 (clone 6D5)Biolegend115504dilution 1:200
Biotine Rat anti-souris CD8a (clone 53-6.7)Biolegend100704dilution 1:200
Biotine Rat anti-souris NK-1.1 (clone PK136)Biolegend108704dilution 1:200
Biotine Rat anti-souris TER-119/Cellules érythroïdes (clone TER-119)Biolegend116204dilution 1:200
albumine sérique bovine, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)Biolegend644816dilution 1:100
Brilliant Violet 605 anti-souris CD279 (-1) (clone 29F.1A12)Biolegend135220dilution 1:200
souris C57BL/6J (B6)The Jackson Laboratory000664
souris rapporteureknock-in CXCR5-GFPEn interne ; la ligne de souris knock-in CXCR5-GFP a été générée par l’insertion d’une construction IRES-GFP après le cadre de lecture ouvert de Cxcr5.
DMEM 10 % mediumMedium DMEM contenant 10 % de FBS
DMEM mediumGibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
Sérum fœtal bovin, FBSSigmaF8318
FlowJo (version 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SetInvitrogen00-5523-00Le kit contient trois réactifs : a. Concentré de fixation/perméabilisation (4X) ; b. Diluant de fixation/perméabilisation ; c. Tampon de perméabilisation.
Anticorps IgG anti-rat de chèvre (H+L),laboratoires de vecteursBA-9400-1.5Dilution 1:200
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System ThermoFisherScientific
Tampond’isolation FACS contenant 0,5 % de BSA et 2mM EDTA
LCMV peptide GP61-77 (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes proche infrarouge fixable, pour excitation 633 ou 635 nmLife TechnologiesL10199dilution 1:200
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM mediumGibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE anti-souris CD69 (clone H1.2F3)Biolegend104508Dilution 1:200
PE Souris anti-Bcl-6 (clone K112-91)BD Biosciences561522dilution 1:50
Phosphate tamponné salin, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
Purifié Rat Anti-Souris CXCR5 (clone 2G8)BD Biosciences551961dilution 1:50
Rat monoclonal PerCP anti-souris CD4 (clone RM4-5)Biolegend100538dilution 1:200
souris recombinante IL-2Gibco212-12-1MG
Tampon de lyse des globules rougesBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 mediumSigmaR8758
RPMI 2 %RPMI 1640 medium contenant 2 %
SMARTA (SM) TCR souris transgéniqueLa lignée transgénique SM TCR dans notre laboratoire est un don du Dr Rafi Ahmed (Université Emory). De plus, cette lignée de souris peut également être obtenue auprès du Jackson Laboratory (colorant # : 030450).
TamponPBS contenant 2 % de FBS et 0,01 % de NaN3
Streptavidine PE-Cyanine7eBioscience25-4317-82dilution 1:200
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (conjugué Alexa Fluor 488)  ;Technologie de signalisation cellulaire6444Sdilution 1:400
de coloration cellulaire TFHTampon FACS contenant 1 % de BSA et 2 % de sérum
de souris Réactif TransIT-293Mirus BioMIRUMIR2700
biotinylés FBS de coloration Tampon

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Mots-clés

Lymphocytes T folliculaires helperLymphocytes T sp cifiques du virusInfection aigu au LCMVCytom trie en fluxTransduction r troviraleLymphocytes T CD4Diff renciation pr coce des lymphocytes TExpression de BCL6Engagement du destin des lymphocytes TConception de vaccins
Accès à la différenciation précoce des lymphocytes T CD4+ auxiliaires folliculaires spécifiques du virus chez les souris infectées par le LCMV aigu
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