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Technique d’isolement et de culture de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de rat

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DOI :

10.3791/66765

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31 mai 2024

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1Medical School of Chinese PLA, 2Department of Stomatology, the First Medical Centre, Chinese PLA General Hospital, 3Department of Stomatology, Fujian People's Armed Police Corps Hospital

Dans cet article

Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse de la mâchoire ont des fonctions importantes dans la différenciation, l’auto-renouvellement et la modulation immunitaire. Ils sont devenus un réservoir crucial de cellules précurseurs en thérapie génique, en ingénierie tissulaire et en médecine régénérative. Ici, nous présentons une méthode unique pour isoler les cellules souches mésenchymateuses de la mâchoire et de la moelle osseuse chez le rat.

Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMMSC) sont un type de cellule souche à potentiel de différenciation multidirectionnelle. Par rapport aux BMMS dérivées des os appendiculaires, les BMMS dérivées de la mâchoire ont une plus grande capacité de différenciation proliférative et ostéogénique, devenant progressivement des cellules germes importantes pour la réparation des défauts de la mâchoire. Cependant, la mandibule a une structure osseuse complexe et un contenu moins spongieux que les os appendiculaires. Il est difficile d’acquérir un grand nombre de cellules souches mésenchymateuses de moelle dérivée de la mâchoire de haute qualité en utilisant les méthodes traditionnelles. Cette étude présente une « approche basée sur la souche » pour l’isolement et la culture de cellules souches mésenchymateuses de la mâchoire de rat (JBMMSC). Des JBMMSC primaires de rat ont été isolés et cultivés à l’aide de la méthode d’adhérence de la moelle osseuse entière combinée à la méthode de digestion par tranche d’os. Les cellules isolées ont été identifiées comme des JBMMSC par l’observation de la morphologie cellulaire, la détection de marqueurs de surface cellulaire et l’induction de différenciation multidirectionnelle. Les cellules extraites par cette méthode présentent une forme de fuseau « semblable à celle d’un fibroblaste ». Les cellules sont longues, en forme de fuseau et ressemblent à des fibroblastes. L’analyse par cytométrie en flux montre que ces cellules sont positives pour CD29, CD44 et CD90, mais négatives pour CD11b/c, CD34 et CD45, ce qui correspond aux caractéristiques des BMMC. Les cellules présentent une forte capacité de prolifération et peuvent subir une différenciation ostéogénique, adipogène et chondrogénique. Cette étude fournit une méthode efficace et stable pour obtenir suffisamment de JBMMSC de haute qualité avec une forte capacité de différenciation dans un court laps de temps, ce qui pourrait faciliter d’autres études sur l’exploration de la fonction biologique, de la médecine régénérative et des applications cliniques connexes.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont d’abord été découvertes dans la moelle osseuse, qui ont montré leur capacité à former des colonies adhésives en culture et un fort potentiel ostéogénique1. Pittinger et al.2 ont en outre constaté leur potentiel de différenciation multidirectionnelle vers les os, la graisse et le cartilage. Bien que toutes les cellules souches mésenchymateuses de différentes sources aient un potentiel de différenciation multidirectionnelle, les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse ont le plus fort potentiel de différenciation chondrogénique par rapport aux cellules souches mésenchymateuses dérivées d’autres tissus, ce qui les considère comme les meilleures cellules candidates pour l’ingénierie du tissu osseux3. Cependant, de nombreuses études ont prouvé que les BMMSCs d’origines différentes présentent des caractéristiques et des propriétés spécifiques au site, telles que la capacité de différenciation ostéogénique et l’activité proliférative cellulaire 4,5. Cela peut être dû à des couches germinales différentes entre la mâchoire et les os appendiculaires ou la crête iliaque6.

Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse de la mâchoire (JBMMSC) proviennent des cellules de la crête neurale du neuroectoderme, tandis que les BMMS dérivées du fémur proviennent du mésoderme7. Par rapport aux BMMSCs dérivées des os longs et de la crête iliaque, les JBMMSC ont un taux de prolifération, une activité ALP et un potentiel ostéogénique plus élevés8. En outre, l’effet d’application des BMMSCs dans les tissus et les organes peut varier en fonction des différents types de cellules et des environnements9. La réparation des défauts de la mâchoire dépend principalement du recrutement de cellules souches mésenchymateuses dérivées de la mâchoire. Par conséquent, l’étude des JBMMSC peut fournir une base expérimentale pour son application clinique dans l’ingénierie des tissus osseux de la mâchoire10. Cependant, la recherche fondamentale et les applications cliniques se concentrent principalement sur les BMMSCs dérivées des os appendiculaires et axiaux11. Les recherches sur les JBMMSC sont limitées, ce qui peut être dû à la faible teneur en os spongieux de la mandibule et au fait que les mâchoires des rats ont encore moins de contenu osseuxspongieux 12. Par conséquent, il est difficile de séparer les cellules souches mésenchymateuses de la moelle dérivée de l’os de la mâchoire à l’aide de la méthode ordinaire de rinçage de la moelle osseuse, qui est couramment utilisée pour isoler les BMMSCs des os appendiculaires ou de la crête iliaque13. Sur la base des méthodes de Hong et al.14 et Cheng et al.15, nous avons émis l’hypothèse que la combinaison d’une digestion osseuse dense et de la méthode de rinçage de la moelle osseuse pourrait isoler efficacement les JBMMSC de rat.

Cette étude vise à établir une méthode efficace pour isoler les JBMMSC de rat et à fournir des sources suffisantes de cellules de semence pour l’ingénierie des tissus osseux de la mâchoire.

Protocole

Le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique animale institutionnel de l’hôpital général chinois PLA. Des rats Wistar mâles âgés de treize semaines ont été utilisés pour l’expérience. Les détails sur les animaux, les réactifs et l’équipement sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation expérimentale

  1. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux, y compris les ciseaux ophtalmiques, les pinces à épiler et les rongeurs osseux, à haute température et pression.
  2. Préparez les milieux de culture à l’avance.
    1. Préparez un milieu complet α-MEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine.
    2. Préparez de la collagénase de type II à 0,1 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    3. Préparez 50 mL de PBS avec 1 % de pénicilline-streptomycine dans un tube à centrifuger stérile jetable de 50 mL.

2. Isolement et culture des JBMMSC de rats

  1. Isolez la mandibule du rat en suivant les étapes ci-dessous :
    REMARQUE : Pour maintenir la stérilité de l’échantillon, tous les instruments chirurgicaux métalliques doivent être désinfectés à haute température sur une flamme de lampe à alcool pendant au moins trois secondes avant utilisation.
    1. Anesthésier le rat avec du pentobarbital sodique à 2 % (2 mL/kg) par injection intrapéritonéale.
    2. Sacrifiez le rat anesthésié par luxation des vertèbres cervicales (selon les protocoles approuvés par l’établissement) après que sa fréquence respiratoire ait diminué et que les muscles se soient complètement détendus.
    3. Plongez le rat dans de l’éthanol à 75% pendant 30 min pour le désinfecter puis transférez-le sur la table ultra-propre.
    4. Placez le rat sur un chiffon stérile jetable ou dans un récipient stérile et maintenez-le en position couchée.
    5. Coupez et séparez la peau et le muscle de l’angulus oris à l’articulation le long de la branche, puis séparez le condyle de la fosse glénoïde en coupant horizontalement le disque de l’articulation temporo-mandibulaire et les ligaments périphériques bilatéraux avec des ciseaux ophtalmiques.
      REMARQUE : Déterminez la position de l’articulation temporo-mandibulaire en déplaçant la mandibule et en observant la position du condyle vers l’extérieur.
    6. Coupez et séparez les muscles et les tissus conjonctifs de la mandibule latérale à l’aide de ciseaux à partir du sillon vestibulaire du côté buccal des incisives inférieures vers les côtés gauche et droit.
    7. Incisez les muscles linguaux de la mandibule du frein lingual à la région postérieure de la mandibule.
    8. Retirez la mandibule du crâne.
    9. Divisez la mandibule en deux en coupant la symphyse entre les incisives inférieures avec des ciseaux ophtalmiques.
    10. Retirez soigneusement les muscles attachés restants, le fascia et les autres tissus mous de la mandibule à l’aide de ciseaux ophtalmiques et de pinces.
  2. Isolez les JBMMSC.
    1. Placez le bec du rongeur à la jonction des incisives et de la partie mésiale de la première molaire, coupez la connexion entre les incisives inférieures et la mandibule avec le rongeur, et extrayez complètement les incisives inférieures.
    2. Retirez toutes les molaires à l’aide d’un rongeur d’os.
    3. Retirez la branche mandibulaire à l’aide d’un rongeur osseux et exposez la cavité médullaire en séparant la partie centrale de la mandibule le long du bord distal de la dernière molaire16.
    4. Aspirer un milieu complet α-MEM avec une seringue stérile jetable de 1 ml. Insérez l’aiguille dans la cavité de la moelle osseuse et rincez la moelle osseuse à plusieurs reprises dans la boîte de culture avec un milieu complet α-MEM jusqu’à ce que l’os devienne blanc.
    5. Prélever la solution de rinçage de la moelle osseuse dans un tube à centrifuger de 15 mL et la centrifuger à 800 x g pendant 3 min à température ambiante.
    6. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette, remettre les cellules en suspension avec 10 ml de milieu complet α-MEM et les déposer dans une nouvelle boîte de culture de 10 cm.
    7. Divisez la mandibule rincée en tranches d’os de 1 à 3 mm³ à l’aide d’un rongeur et digérez-les avec 3 ml de collagénase de type II à 0,1 % pendant 90 min dans un agitateur à 200 tr/min à 37 °C.
    8. Centrifuger la mandibule digérée à 800 x g pendant 3 min à température ambiante et jeter le surnageant.
    9. Cultivez les cellules récoltées et les tranches d’os digérées avec un milieu complet α-MEM à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 .
    10. Changez la moitié du milieu de culture avec du milieu frais après 72 h, puis changez-le complètement tous les 2 jours.
      REMARQUE : Ne déplacez pas la boîte de culture pendant les trois premiers jours.
    11. Passez les cellules adhérentes dans un rapport de 1:2 lorsqu’elles atteignent une confluence de 80 à 90 %. Retirez les tranches d’os lors de la deuxième sous-culture. Utilisez les cellules des générations P2 ou P3 pour des expériences.

3. Cytométrie en flux pour l’identification des marqueurs de surface cellulaire

  1. Remettre en suspension les JBMMSC de la génération P2 dans le tampon de cytométrie en flux. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et ajustez la concentration à 3 × 106 cellules/ml.
  2. Ajouter 100 μL de suspension cellulaire et 2 μL d’anticorps monoclonaux (CD11b/c, CD29, CD34, CD44, CD45 et CD90) dans chaque tube de microcentrifugation. Incuber pendant 30 min à 4 °C17,18.
  3. Lavez l’échantillon deux fois avec 200 μL de tampon de cytométrie en flux et centrifugez-le pendant 5 min à 250 x g à température ambiante. Retirez le surnageant.
  4. Ajouter 100 μL de tampon de cytométrie en flux et 2 μL d’anticorps secondaires fluorescents marqués au PE dans chaque tube. Incuber à 4 °C pendant 30 min.
  5. Répétez l’étape 3.3.
  6. Remettre en suspension les JBMMSC dans 300 à 500 μL de tampon de cytométrie en flux par tube.
  7. Effectuez l’analyse cytométrique en flux à l’aide d’un cytomètre en flux.
    REMARQUE : Utilisez des anticorps homologues comme témoins négatifs pour éliminer la coloration de fond causée par la combinaison non spécifique d’anticorps.

4. Détermination de la prolifération cellulaire

  1. Amorcez les JBMMSC de la génération P3 dans une plaque de 96 puits à une densité de 5 × 103 cellules par puits.
  2. Ajouter 10 μL de solution de CCK-8 dans chaque puits.
  3. Placez la plaque à 96 puits dans l’incubateur pendant 2 h et mesurez l’absorbance (valeur de DO à 450 nm) à l’aide d’un lecteur de microplaques.
    REMARQUE : Effectuez le test à la même heure tous les jours pendant sept jours consécutifs.

5. Capacité de formation de colonies

  1. Semez 1000 JBMMSC du passage 3 dans des boîtes de culture de 10 cm et cultivez à 37 °C avec 5% de CO2.
  2. Changez le milieu de culture tous les 3 jours.
  3. Effectuez une coloration violette cristalline après une culture continue pendant 15 jours.
  4. Ensuite, fixez les cellules avec du méthanol pendant 5 minutes et colorez-les avec du violet cristallin à 2 % pendant 5 minutes.

6. Différenciation multilignée des JBMMSC

REMARQUE : Utilisez des JBMMSC de génération P3 pour la différenciation multilignage. Le groupe témoin a été cultivé avec un milieu complet α-MEM.

  1. Effectuer une différenciation ostéogénique.
    1. Inoculer 1 × 105 JBMMSC par puits dans une plaque à six puits.
    2. Lorsque la confluence cellulaire atteint 70 %, changez le milieu en milieu d’induction ostéogénique.
      REMARQUE : Changez le milieu d’induction ostéogénique tous les 3 jours.
    3. Effectuer une coloration à la phosphatase alcaline (ALP) après 7 jours d’induction ostéogénique.
    4. Retirez le milieu de la plaque à six puits, fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde à température ambiante pendant 30 min, puis lavez-les trois fois avec du PBS.
    5. Teindre les cellules avec une solution de coloration ALP à température ambiante pendant 30 min et les protéger de la lumière.
    6. Rincez les cellules jusqu’à ce qu’il ne reste plus de solution de coloration et observez les échantillons au microscope.
    7. Effectuer la coloration rouge d’alizarine après 21 jours d’induction ostéogénique.
    8. Colorer les cellules avec une solution de coloration rouge d’alizarine pendant 5 minutes après avoir fixé les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes.
    9. Lavez les cellules avec du PBS jusqu’à ce qu’il ne reste plus de solution de coloration rouge d’alizarine.
    10. Observez le nombre de nodules calciques au microscope.
  2. Effectuer la différenciation adipogénique.
    1. Inoculer 1 × 105 JBMMSC par puits dans une plaque à six puits.
    2. Lorsque la confluence cellulaire atteint 70 %, changez le milieu en milieu d’induction adipogénique.
      REMARQUE : Changez le milieu d’induction adipogénique tous les trois jours.
    3. Effectuer la coloration au rouge d’huile O après 14 jours d’induction adipogénique.
    4. Retirez le milieu de la plaque à six puits, fixez les cellules avec la solution de fixation Oil red O pendant 20 à 30 min, puis lavez-les trois fois avec du PBS.
    5. Retirez la solution de fixation et lavez deux fois les cellules à l’eau distillée.
    6. Immergez les cellules dans de l’isopropanol à 60 % pendant 20 à 30 s.
    7. Retirez l’isopropanol à 60 % et colorez les cellules avec le rouge d’huile O pendant 20 à 30 min.
    8. Retirez la solution colorante, rincez les cellules avec de l’isopropanol à 60 % pendant 20 à 30 secondes, puis lavez-les à l’eau distillée.
    9. Teintez le noyau avec une solution d’hématoxyline pendant 1 à 2 min.
    10. Retirez la solution d’hématoxyline et lavez les cellules 2-3 fois avec de l’eau distillée. Ajouter le tampon O rouge huile pendant 1 min et le retirer.
    11. Observez le nombre de gouttelettes lipidiques au microscope.
  3. Effectuer la différenciation chondrogénique.
    1. Inoculer 1 × 105 JBMMSC par puits dans une plaque à six puits.
    2. Lorsque la confluence cellulaire atteint 70 %, changez le milieu en milieu d’induction chondrogénique.
      REMARQUE : Changez le milieu d’induction chondrogénique tous les 3 jours.
    3. Effectuer une coloration au bleu d’Alcian après 21 jours d’induction chondrogénique.
    4. Retirez le milieu de la plaque à six puits, fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde à température ambiante pendant 30 min, puis lavez-les trois fois avec du PBS.
    5. Teindre les cellules avec une coloration au bleu d’Alcian à 37 °C pendant 1 h.
    6. Rincez les cellules jusqu’à ce qu’il ne reste plus de solution de coloration et observez-les au microscope.

7. PCR en temps réel

  1. Extrayez l’ARN total à l’aide du kit d’extraction d’ARN et mesurez la concentration d’ARN avec un marqueur enzymatique (en suivant les instructions du fabricant).
  2. Synthétisez l’ADNc à l’aide de 500 ng d’ARN19.
  3. Effectuez une qRT-PCR sur un système en temps réel avec 10 μL de mélange qRT-PCR contenant 1 μL d’ADNc, 3,5 μL d’eau bidistillée, 5 μL de SYBR et 0,5 μL de mélange d’amorces (0,1 μM).
    REMARQUE : Les séquences d’amorces sont énumérées dans le Tableau 1. Les conditions de cycle thermique sont les suivantes : 50 °C pendant 2 min, 95 °C pendant 2 min, suivis de 40 cycles de 95 °C pendant 15 s, de 60 °C pendant 2 min, puis d’incréments de 0,5 °C pendant 5 s de 60 °C à 95 °C pour la courbe de fusion.
  4. Utiliser le GAPDH comme contrôle interne16.

Résultats

Après 72 h d’inoculation cellulaire, la plupart des cellules étaient suspendues et de forme ronde, et très peu adhéraient à la paroi (figure 1B). Au cinquième jour, des colonies cellulaires adhérentes sont apparues, présentant des fuseaux ou des formes semblables à celles des fibroblastes (Figure 1C). Au septième jour, les cellules adhérentes ont atteint une confluence de 90 %, formant une forme de « banc de poissons » avec un petit nombre de cellules suspendues intermittentes (figure 1D). Les cellules passées se sont développées rapidement et ont été passées tous les 3 jours. La morphologie cellulaire était relativement homogène, principalement en forme de fuseau, et disposée selon un motif vortex après confluence (Figure 1E-G).

L’analyse par cytométrie en flux a révélé des niveaux d’expression élevés des marqueurs de surface des cellules souches mésenchymateuses CD90, CD29 et CD44, avec des taux positifs de 97,2 %, 97,7 % et 95,7 %, respectivement. À l’inverse, les marqueurs de surface des cellules souches hématopoïétiques CD45, CD34 et CD11b/c ont montré une faible expression, avec des taux positifs de 1,37 %, 0,66 % et 1,49 %, respectivement (Figure 2A). Après 2 semaines de culture, les JBMMSC ont montré une colonisation, comme en témoigne la coloration au violet cristallin (Figure 2B). Ils ont montré une capacité d’expansion stable in vitro, la courbe de croissance cellulaire suivant un modèle typique en forme de « S » (Figure 2C). Le processus de prolifération cellulaire comprenait une période latente, une phase de croissance logarithmique et une phase de plateau. La croissance rapide a commencé après deux jours, suivie d’un ralentissement après six jours. Les cellules individuelles présentaient des caractéristiques d’auto-réplication et de prolifération.

Les cellules présentaient des particules de coloration ALP bleu-violet le 7e jour et des nodules minéralisés rouges le 21e jour. De plus, après 14 jours d’induction adipogénique, les cellules présentaient des gouttelettes lipidiques perlées rouges, tandis que l’induction de la différenciation chondrogénique a entraîné la formation d’un tissu cartilagineux bleu (Figure 3A). De plus, après 7 jours d’induction ostéogénique, les niveaux d’expression de l’ARNm de l’ALP, de l’OCN et du Runx2 dans les JBMMSC étaient élevésde 15 (Figure 3B).

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Figure 1 : Isolement et culture des JBMMSC. (A) Un aperçu du protocole. (B-D) Images de cellules cultivées pendant 3 jours, 5 jours et 7 jours en culture primaire, respectivement. (E-G) Images des cellules P1, P2 et P3, respectivement. Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Identification des JBMMSC. (A) Résultats de l’analyse par cytométrie en flux des JBMMSC de rats. L’analyse par cytométrie en flux a révélé que ces cellules étaient positives pour les CD29, CD44 et CD90, ce qui correspond aux caractéristiques des BMMSC. À l’inverse, ils étaient négatifs pour CD11b/c, CD34 et CD45. (B) Images représentatives des colonies de JBMMSC colorées au violet cristallin (barres d’échelle : 100 μm). (C) La courbe de croissance cellulaire a montré le taux de prolifération cellulaire. Les données et les barres d’erreur indiquent la moyenne ± l’écart-type, n = 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Différenciation multilignée (ostéogénique, adipogène et chondrogénique) des JBMMSC. (A) Après 7 jours d’induction ostéogénique, une augmentation de l’activité de l’ALP a été observée. 21 jours après l’induction ostéogénique, de nombreux nodules minéralisés ont été colorés en rouge avec une coloration au rouge d’alizarine. La coloration au rouge d’huile O a révélé un nombre important de gouttelettes lipidiques. La coloration au bleu d’alcian a mis en évidence les cellules induites dans les chondrocytes après l’induction chondrogénique. (B) Expression de l’ARNm du gène ostéogénique apparenté ALP, OCN et Runx2 des JBMMSC après induction ostéogénique pendant 7 jours. (***P < 0,001, par rapport au groupe témoin). Les données et les barres d’erreur indiquent la moyenne ± l’écart-type, n = 3. Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Gèneséquences d’amorces (5'-3')
GADPHF : ACCCAGAAGACTGTGGATGG
R : CACATTGGGGGTAGGAACAC
ALPF : CACGTTGACTGTGGTTACTGCTGA
R : CCTTGTAACCAGGCCCGTTG
OCNF : GGTGGTGAATAGACTCCGGC
R : GCAACACATGCCCTAAACGG
Runx2F : GCACCCAGCCCATAATAGA
R : TTGGAGCAAGGAGAACCC

Tableau 1 : Amorces utilisées dans la PCR en temps réel.

Discussion

Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMMSC) représentent un sous-ensemble de cellules souches non hématopoïétiques résidant dans la moelle osseuse, caractérisées par leurs capacités d’auto-renouvellement, leur potentiel de différenciation multidirectionnelle et leurs fonctions de soutien de l’hématopoïèse. Ces cellules jouent un rôle central dans divers processus physiologiques tels que la régénération tissulaire, l’angiogenèse et la régulation des activités cellulaires20. Par conséquent, les BMMSC sont fréquemment utilisées dans la réparation des tissus et l’ingénierie régénérative en tant que source optimale de cellules de semence21.

Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse de la mâchoire (JBMMSC), initialement isolées à partir d’aspirations de moelle osseuse de la mâchoire humaine en 2005 par Matsubara et al.22, présentent des caractéristiques de différenciation distinctives attribuables aux origines uniques et aux voies de développement de la mâchoire par rapport aux autres sites squelettiques 4,23. Étant donné les mécanismes développementaux et pathologiques distincts régissant l’os cranio-facial, il semble impératif de donner la priorité aux JBMMSC dans la réparation des défauts de l’os cranio-facial, en raison de leurs traits de développement homologues23. De plus, les JBMMSC présentent une histocompatibilité accrue avec le microenvironnement buccal en raison de leurs origines tissulaires embryonnaires communes24,25. Malgré ces avantages, il reste difficile de mettre en place un protocole d’isolement normalisé et sûr pour les JBMMSC, et les recherches sur les JBMMSC restent relativement limitées.

L’isolement et la culture des BMMSCs manquent actuellement de normalisation, les méthodes couramment utilisées étant le tri immunomagnétique des billes, le tri par cytométrie en flux, la centrifugation par gradient de densité et la culture adhérente de la moelle osseuse entière26. Parmi celles-ci, la méthode des billes immunomagnétiques et la méthode de tri par cytométrie en flux isolent les cellules en reconnaissant des antigènes spécifiques à la surface de la cellule. Cependant, ces méthodes impliquent des opérations lourdes, nécessitent des instruments spécialisés et peuvent affecter l’activité cellulaire malgré le produit de cellules de haute pureté27. La méthode de centrifugation par gradient de densité sépare les cellules par centrifugation et stratification, ce qui peut modifier le microenvironnement cellulaire, entraînant un ralentissement de la croissance cellulaire et une augmentation du vieillissement cellulaire28. À l’inverse, la méthode de culture adhérente de la moelle osseuse entière sépare et purifie les BMMC en remplaçant par intermittence le milieu et en les transmettant en fonction des différentes capacités d’adhérence entre les différents types de cellules de la moelle osseuse. Cette méthode inflige des dommages minimes aux cellules et est simple à exécuter16.

Par rapport au fémur, la mâchoire est de plus petite taille et a une cavité de moelle osseuse plus étroite, avec interférence des cellules de la dent ou du ligament parodontal. La méthode de rinçage et d’adhésion de la moelle osseuse nécessite une quantité relativement plus importante de moelle osseuse et convient aux grands animaux et aux humains29. Les JBMMSC chez les rats extraits en appliquant la méthode traditionnelle de rinçage de la moelle osseuse sont rares en nombre, lentes à proliférer et de mauvaise qualité30,31. La teneur en JBMMSC dans la moelle osseuse est très faible et se trouve principalement dans l’os compact et l’endosteum. Bu-Kyu Lee et al.32 ont utilisé les aspirations mandibulaires pour isoler les JBMMSC, tandis que le temps total d’aspiration pour 10 ml de sang de moelle pour la mandibule était cinq fois plus long que celui de la crête iliaque, et le rendement initial des CSM à partir de la mandibule était trois fois inférieur à celui de la crête iliaque. Le rinçage de la moelle osseuse seul ne peut pas isoler efficacement les cellules de l’os compact et de l’endosteum.

Au cours des dernières années, des études ont montré que l’os compact est une source nouvelle et fiable de BMMSC, et une méthode relativement simple d’isolement des BMMSC a été dérivée, la méthode de culture de digestion de tranches d’os33. Les BMMS isolés par cette méthode ont une grande pureté34. Guo et al.35ont réussi à isoler des cellules souches mésenchymateuses osseuses à partir de fémurs de souris en utilisant la méthode de culture de digestion de tranches d’os. Yamazaet al.12 et Cheng et al.15 ont appliqué la méthode de culture de digestion par tranche d’os à l’isolement de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse mandibulaire de souris et ont vérifié les propriétés des CSM par prolifération cellulaire, immunophénotype et différenciation multilignée. Cette expérience a utilisé une combinaison d’adhésion de moelle osseuse entière rincée et de digestion par tranche d’os pour isoler et cultiver des JBMMSC primaires de rat. La moelle osseuse a été soigneusement lavée de la cavité sans filtration pour maintenir la composition cellulaire d’origine et les facteurs de croissance dans la moelle osseuse. Ensuite, les tranches d’os ont été coupées en petits morceaux et digérées à l’aide de collagénase de type II pour faciliter la sortie des cellules des fragments d’os. Enfin, les tranches d’os ont été inoculées dans une boîte de culture et cultivées pour permettre aux cellules de sortir des tranches d’os. La méthode de combinaison fait que le système de culture de la cellule primaire contient simultanément des composants de cellules souches hématopoïétiques, d’os spongieux et d’os cortical, ce qui peut mieux simuler le microenvironnement des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse dans le corps et est plus propice au maintien des caractéristiques biologiques d’origine des cellules. Cette méthode est donc appelée « une approche basée sur la souche basée sur la niche »36. Luet al.37 a également souligné l’importance des niches de cellules souches dans l’isolement des BMMSC, mais elles n’impliquaient que le microenvironnement dans la moelle osseuse sans os cortical. Cette méthode a été appliquée avec succès dans l’isolement de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse de la mâchoire38 de souris.

Nous avons également réussi à isoler et à élever des JBMMSC de rats grâce à cette approche basée sur des niches. Tout d’abord, les cellules isolées présentaient une forme semblable à celle d’un fibroblaste et adhéraient à des plaques de culture en plastique in vitro. Deuxièmement, les cellules ont exprimé positivement les marqueurs de surface CD90, CD29 et CD44 et ont exprimé négativement CD45, CD34 et CD11b/c. Troisièmement, les cellules pourraient se différencier en ostéocytes, adipocytes et chondrocytes. Les cellules obtenues avaient une bonne morphologie, un taux de prolifération rapide et une capacité de différenciation, qui répondaient aux critères minimaux d’identification des cellules souches mésenchymateuses d’origine humaine proposés par la Société internationale de thérapie cellulaire17.

L’isolement des JBMMSC a été développé et utilisé pour isoler des cellules chez l’homme. Matsubara et coll.22 ont été les premiers à isoler des JBMMSC à partir d’échantillons de moelle osseuse alvéolaire humaine lors d’une chirurgie buccale. Des complications possibles peuvent survenir au cours du processus d’aspiration de la mandibule, notamment des dommages aux tissus adjacents, une infection due à une contamination bactérienne buccale, etc. Zong et coll.39 ont rincé la cavité de la moelle osseuse des morceaux d’échantillon d’os spongieux pour obtenir des JBMMSC humains. Park et coll.40 ont isolé des JBMMSC humaines à partir de fragments d’os alvéolaires obtenus lors du forage d’implants à l’aide d’une méthode de digestion séquentielle. Mason et al.41 ont isolé directement les JBMMSC humains à partir des noyaux de moelle osseuse de la mâchoire et de l’aspiration de patients subissant une pose d’implant dentaire de routine. Il y avait un taux de réussite élevé dans l’isolement des cellules à partir d’aspirations ou de carottes et un taux de réussite plus élevé de la combinaison. Cependant, bien que les méthodes ci-dessus aient réussi à isoler les JBMMSC des humains, les différences d’efficacité entre les méthodes doivent être comparées. À l’heure actuelle, cette méthode n’a été utilisée que chez les souris et les rats, et il n’y a pas de recherche sur l’application de cette méthode à l’isolement des JBMMSC humains. Il y a des limites à cette méthode, surtout lorsqu’elle est appliquée aux humains. Tout d’abord, cette méthode de combinaison du rinçage de la moelle osseuse et de la digestion des tranches d’os est relativement compliquée et nécessite plus d’étapes. Deuxièmement, les processus complexes imposent des exigences plus élevées en matière de stérilité des opérations, ce qui est essentiel au protocole. Troisièmement, il est impossible de rincer toute la cavité de la moelle osseuse de la mâchoire humaine, il est donc nécessaire d’explorer certaines méthodes équivalentes, telles que le rinçage des fragments d’os spongieux.

En résumé, cette étude a réussi à isoler et à cultiver des JBMMSC de rat en utilisant une combinaison de rinçage de la moelle osseuse et de digestion par tranche d’os basée sur le principe de la « niche des cellules souches ». Les résultats de l’identification cellulaire ont confirmé que cette méthode peut isoler suffisamment de JBMMSC de haute pureté, fournissant ainsi de nombreuses sources de cellules pour l’ingénierie tissulaire de la mâchoire, en particulier dans la réparation des défauts osseux, ce qui est d’une grande importance.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par les projets de soins de santé du Département de la logistique de la Commission militaire (19BJZ22), de la Fondation des sciences naturelles de Pékin (7232154) et des projets de recherche clinique de la Quatrième Université Mil Med (2021XB025).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alizarin Red S Solution 0.2 %SolarbioG1450
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Kit de Développement de CouleurBeyotimeC3206
Bio-Rad CFX96 Système Temps RéelBio-Rad
CCK8 KitDujindoCK04
Plat de culture cellulaire 10 cmCorning
CentrifugeuseEppendorf5810R
Tube à centrifuger 15 mL  ;Corning430790
Tube à centrifuger 50 mL  ;430828Incubateur
< COsub>2Thermo Fisher3111
Oscillateur à température constanteShanghai Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co., Ltd.ZWY-100H
Sérum fœtal bovinBI04-001-1ACS
Cytomètre en fluxBDFACS C6  ;
Microscope à contraste de phase inverséOlympusCKX41  ;
Kit de détection de marqueurs de surface de cellules souches mésenchymateuses (rats)  ;OricellRAXMX-09011
Lecteur de microplaques multifonctionnel  ;BioTekSynergy LX Multi-Mode
Oil Red O Stain KitSolarbioG1262
Paraformaldéhyde 4 %SolarbioP1110
PBSMACGENECC008
pénicilline-streptomycine 0.25 %MACGENECC004
PowerUp SYBR Green MasterMix Thermo Fisher  ;A25742
PrimeScript RT Master Mix  ;TakaraRR036A
Moelle osseuse de rat Cellules souches mésenchymateuses Kit de différenciation adipogéniqueOricellRAXMX-90031
Cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de rat Kit de différenciation chondrogéniqueOricellRAXMX-90041
Cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de rat Kit de différenciation ostéogéniqueOricellRAXMD-90021
TIANGENDP419
Banc super proprePékin Yataikelong Instrument Technology Co., Ltd.KLCZ-1220A
Trypsine-EDTA  ; 0,25 %MACGENECC012
Collagénase de type IISolarbioC8150
Wistar ratBeijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.
&alpha ;-Milieu de culture MEM  ;GibcoC12571500BT
353003

Références

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