Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Technique d’isolement et de culture de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de rat

2.2K vues

⸱

DOI :

10.3791/66765

⸱

31 mai 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical School of Chinese PLA, 2Department of Stomatology, the First Medical Centre, Chinese PLA General Hospital, 3Department of Stomatology, Fujian People's Armed Police Corps Hospital

Dans cet article

Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse de la mâchoire ont des fonctions importantes dans la différenciation, l’auto-renouvellement et la modulation immunitaire. Ils sont devenus un réservoir crucial de cellules précurseurs en thérapie génique, en ingénierie tissulaire et en médecine régénérative. Ici, nous présentons une méthode unique pour isoler les cellules souches mésenchymateuses de la mâchoire et de la moelle osseuse chez le rat.

Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMMSC) sont un type de cellule souche à potentiel de différenciation multidirectionnelle. Par rapport aux BMMS dérivées des os appendiculaires, les BMMS dérivées de la mâchoire ont une plus grande capacité de différenciation proliférative et ostéogénique, devenant progressivement des cellules germes importantes pour la réparation des défauts de la mâchoire. Cependant, la mandibule a une structure osseuse complexe et un contenu moins spongieux que les os appendiculaires. Il est difficile d’acquérir un grand nombre de cellules souches mésenchymateuses de moelle dérivée de la mâchoire de haute qualité en utilisant les méthodes traditionnelles. Cette étude présente une « approche basée sur la souche » pour l’isolement et la culture de cellules souches mésenchymateuses de la mâchoire de rat (JBMMSC). Des JBMMSC primaires de rat ont été isolés et cultivés à l’aide de la méthode d’adhérence de la moelle osseuse entière combinée à la méthode de digestion par tranche d’os. Les cellules isolées ont été identifiées comme des JBMMSC par l’observation de la morphologie cellulaire, la détection de marqueurs de surface cellulaire et l’induction de différenciation multidirectionnelle. Les cellules extraites par cette méthode présentent une forme de fuseau « semblable à celle d’un fibroblaste ». Les cellules sont longues, en forme de fuseau et ressemblent à des fibroblastes. L’analyse par cytométrie en flux montre que ces cellules sont positives pour CD29, CD44 et CD90, mais négatives pour CD11b/c, CD34 et CD45, ce qui correspond aux caractéristiques des BMMC. Les cellules présentent une forte capacité de prolifération et peuvent subir une différenciation ostéogénique, adipogène et chondrogénique. Cette étude fournit une méthode efficace et stable pour obtenir suffisamment de JBMMSC de haute qualité avec une forte capacité de différenciation dans un court laps de temps, ce qui pourrait faciliter d’autres études sur l’exploration de la fonction biologique, de la médecine régénérative et des applications cliniques connexes.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont d’abord été découvertes dans la moelle osseuse, qui ont montré leur capacité à former des colonies adhésives en culture et un fort potentiel ostéogénique1. Pittinger et al.2 ont en outre constaté leur potentiel de différenciation multidirectionnelle vers les os, la graisse et le cartilage. Bien que toutes les cellules souches mésenchymateuses de différentes sources aient un potentiel de différenciation multidirectionnelle, les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse ont le plus fort potentiel de différenciation chondrogénique par rapport aux cellules souches mésenchymateuses dérivées d’autres tissus, ce qui les considère comme les meilleures cellules candidates pour l’ingénierie du tissu osseux3. Cependant, de nombreuses études ont prouvé que les BMMSCs d’origines différentes présentent des caractéristiques et des propriétés spécifiques au site, telles que la capacité de différenciation ostéogénique et l’activité proliférative cellulaire 4,5. Cela peut être dû à des couches germinales différentes entre la mâchoire et les os appendiculaires ou la crête iliaque6.

Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse de la mâchoire (JBMMSC) proviennent des cellules de la crête neurale du neuroectoderme, tandis que les BMMS dérivées du fémur proviennent du mésoderme7. Par rapport aux BMMSCs dérivées des os longs et de la crête iliaque, les JBMMSC ont un taux de prolifération, une activité ALP et un potentiel ostéogénique plus élevés8. En outre, l’effet d’application des BMMSCs dans les tissus et les organes peut varier en fonction des différents types de cellules et des environnements9. La réparation des défauts de la mâchoire dépend principalement du recrutement de cellules souches mésenchymateuses dérivées de la mâchoire. Par conséquent, l’étude des JBMMSC peut fournir une base expérimentale pour son application clinique dans l’ingénierie des tissus osseux de la mâchoire10. Cependant, la recherche fondamentale et les applications cliniques se concentrent principalement sur les BMMSCs dérivées des os appendiculaires et axiaux11. Les recherches sur les JBMMSC sont limitées, ce qui peut être dû à la faible teneur en os spongieux de la mandibule et au fait que les mâchoires des rats ont encore moins de contenu osseuxspongieux 12. Par conséquent, il est difficile de séparer les cellules souches mésenchymateuses de la moelle dérivée de l’os de la mâchoire à l’aide de la méthode ordinaire de rinçage de la moelle osseuse, qui est couramment utilisée pour isoler les BMMSCs des os appendiculaires ou de la crête iliaque13. Sur la base des méthodes de Hong et al.14 et Cheng et al.15, nous avons émis l’hypothèse que la combinaison d’une digestion osseuse dense et de la méthode de rinçage de la moelle osseuse pourrait isoler efficacement les JBMMSC de rat.

Cette étude vise à établir une méthode efficace pour isoler les JBMMSC de rat et à fournir des sources suffisantes de cellules de semence pour l’ingénierie des tissus osseux de la mâchoire.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique animale institutionnel de l’hôpital général chinois PLA. Des rats Wistar mâles âgés de treize semaines ont été utilisés pour l’expérience. Les détails sur les animaux, les réactifs et l’équipement sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation expérimentale

  1. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux, y compris les ciseaux ophtalmiques, les pinces à épiler et les rongeurs osseux, à haute température et pression.
  2. Préparez les milieux de culture à l’avance.
    1. Préparez un milieu complet α-MEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine.
    2. Préparez de la collagénase de type II à 0,1 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    3. Préparez 50 mL de PBS avec 1 % de pénicilline-streptomycine dans un tube à centrifuger stérile jetable de 50 mL.

2. Isolement et culture des JBMMSC de rats

  1. Isolez la mandibule du rat en suivant les étapes ci-dessous :
    REMARQUE : Pour maintenir la stérilité de l’échantillon, tous les instruments chirurgicaux métalliques doivent être désinfectés à haute température sur une flamme de lampe à alcool pendant au moins trois secondes avant utilisation.
    1. Anesthésier le rat avec du pentobarbital sodique à 2 % (2 mL/kg) par injection intrapéritonéale.
    2. Sacrifiez le rat anesthésié par luxation des vertèbres cervicales (selon les protocoles approuvés par l’établissement) après que sa fréquence respiratoire ait diminué et que les muscles se soient complètement détendus.
    3. Plongez le rat dans de l’éthanol à 75% pendant 30 min pour le désinfecter puis transférez-le sur la table ultra-propre.
    4. Placez le rat sur un chiffon stérile jetable ou dans un récipient stérile et maintenez-le en position couchée.
    5. Coupez et séparez la peau et le muscle de l’angulus oris à l’articulation le long de la branche, puis séparez le condyle de la fosse glénoïde en coupant horizontalement le disque de l’articulation temporo-mandibulaire et les ligaments périphériques bilatéraux avec des ciseaux ophtalmiques.
      REMARQUE : Déterminez la position de l’articulation temporo-mandibulaire en déplaçant la mandibule et en observant la position du condyle vers l’extérieur.
    6. Coupez et séparez les muscles et les tissus conjonctifs de la mandibule latérale à l’aide de ciseaux à partir du sillon vestibulaire du côté buccal des incisives inférieures vers les côtés gauche et droit.
    7. Incisez les muscles linguaux de la mandibule du frein lingual à la région postérieure de la mandibule.
    8. Retirez la mandibule du crâne.
    9. Divisez la mandibule en deux en coupant la symphyse entre les incisives inférieures avec des ciseaux ophtalmiques.
    10. Retirez soigneusement les muscles attachés restants, le fascia et les autres tissus mous de la mandibule à l’aide de ciseaux ophtalmiques et de pinces.
  2. Isolez les JBMMSC.
    1. Placez le bec du rongeur à la jonction des incisives et de la partie mésiale de la première molaire, coupez la connexion entre les incisives inférieures et la mandibule avec le rongeur, et extrayez complètement les incisives inférieures.
    2. Retirez toutes les molaires à l’aide d’un rongeur d’os.
    3. Retirez la branche mandibulaire à l’aide d’un rongeur osseux et exposez la cavité médullaire en séparant la partie centrale de la mandibule le long du bord distal de la dernière molaire16.
    4. Aspirer un milieu complet α-MEM avec une seringue stérile jetable de 1 ml. Insérez l’aiguille dans la cavité de la moelle osseuse et rincez la moelle osseuse à plusieurs reprises dans la boîte de culture avec un milieu complet α-MEM jusqu’à ce que l’os devienne blanc.
    5. Prélever la solution de rinçage de la moelle osseuse dans un tube à centrifuger de 15 mL et la centrifuger à 800 x g pendant 3 min à température ambiante.
    6. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette, remettre les cellules en suspension avec 10 ml de milieu complet α-MEM et les déposer dans une nouvelle boîte de culture de 10 cm.
    7. Divisez la mandibule rincée en tranches d’os de 1 à 3 mm³ à l’aide d’un rongeur et digérez-les avec 3 ml de collagénase de type II à 0,1 % pendant 90 min dans un agitateur à 200 tr/min à 37 °C.
    8. Centrifuger la mandibule digérée à 800 x g pendant 3 min à température ambiante et jeter le surnageant.
    9. Cultivez les cellules récoltées et les tranches d’os digérées avec un milieu complet α-MEM à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 .
    10. Changez la moitié du milieu de culture avec du milieu frais après 72 h, puis changez-le complètement tous les 2 jours.
      REMARQUE : Ne déplacez pas la boîte de culture pendant les trois premiers jours.
    11. Passez les cellules adhérentes dans un rapport de 1:2 lorsqu’elles atteignent une confluence de 80 à 90 %. Retirez les tranches d’os lors de la deuxième sous-culture. Utilisez les cellules des générations P2 ou P3 pour des expériences.

3. Cytométrie en flux pour l’identification des marqueurs de surface cellulaire

  1. Remettre en suspension les JBMMSC de la génération P2 dans le tampon de cytométrie en flux. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et ajustez la concentration à 3 × 106 cellules/ml.
  2. Ajouter 100 μL de suspension cellulaire et 2 μL d’anticorps monoclonaux (CD11b/c, CD29, CD34, CD44, CD45 et CD90) dans chaque tube de microcentrifugation. Incuber pendant 30 min à 4 °C17,18.
  3. Lavez l’échantillon deux fois avec 200 μL de tampon de cytométrie en flux et centrifugez-le pendant 5 min à 250 x g à température ambiante. Retirez le surnageant.
  4. Ajouter 100 μL de tampon de cytométrie en flux et 2 μL d’anticorps secondaires fluorescents marqués au PE dans chaque tube. Incuber à 4 °C pendant 30 min.
  5. Répétez l’étape 3.3.
  6. Remettre en suspension les JBMMSC dans 300 à 500 μL de tampon de cytométrie en flux par tube.
  7. Effectuez l’analyse cytométrique en flux à l’aide d’un cytomètre en flux.
    REMARQUE : Utilisez des anticorps homologues comme témoins négatifs pour éliminer la coloration de fond causée par la combinaison non spécifique d’anticorps.

4. Détermination de la prolifération cellulaire

  1. Amorcez les JBMMSC de la génération P3 dans une plaque de 96 puits à une densité de 5 × 103 cellules par puits.
  2. Ajouter 10 μL de solution de CCK-8 dans chaque puits.
  3. Placez la plaque à 96 puits dans l’incubateur pendant 2 h et mesurez l’absorbance (valeur de DO à 450 nm) à l’aide d’un lecteur de microplaques.
    REMARQUE : Effectuez le test à la même heure tous les jours pendant sept jours consécutifs.

5. Capacité de formation de colonies

  1. Semez 1000 JBMMSC du passage 3 dans des boîtes de culture de 10 cm et cultivez à 37 °C avec 5% de CO2.
  2. Changez le milieu de culture tous les 3 jours.
  3. Effectuez une coloration violette cristalline après une culture continue pendant 15 jours.
  4. Ensuite, fixez les cellules avec du méthanol pendant 5 minutes et colorez-les avec du violet cristallin à 2 % pendant 5 minutes.

6. Différenciation multilignée des JBMMSC

REMARQUE : Utilisez des JBMMSC de génération P3 pour la différenciation multilignage. Le groupe témoin a été cultivé avec un milieu complet α-MEM.

  1. Effectuer une différenciation ostéogénique.
    1. Inoculer 1 × 105 JBMMSC par puits dans une plaque à six puits.
    2. Lorsque la confluence cellulaire atteint 70 %, changez le milieu en milieu d’induction ostéogénique.
      REMARQUE : Changez le milieu d’induction ostéogénique tous les 3 jours.
    3. Effectuer une coloration à la phosphatase alcaline (ALP) après 7 jours d’induction ostéogénique.
    4. Retirez le milieu de la plaque à six puits, fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde à température ambiante pendant 30 min, puis lavez-les trois fois avec du PBS.
    5. Teindre les cellules avec une solution de coloration ALP à température ambiante pendant 30 min et les protéger de la lumière.
    6. Rincez les cellules jusqu’à ce qu’il ne reste plus de solution de coloration et observez les échantillons au microscope.
    7. Effectuer la coloration rouge d’alizarine après 21 jours d’induction ostéogénique.
    8. Colorer les cellules avec une solution de coloration rouge d’alizarine pendant 5 minutes après avoir fixé les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes.
    9. Lavez les cellules avec du PBS jusqu’à ce qu’il ne reste plus de solution de coloration rouge d’alizarine.
    10. Observez le nombre de nodules calciques au microscope.
  2. Effectuer la différenciation adipogénique.
    1. Inoculer 1 × 105 JBMMSC par puits dans une plaque à six puits.
    2. Lorsque la confluence cellulaire atteint 70 %, changez le milieu en milieu d’induction adipogénique.
      REMARQUE : Changez le milieu d’induction adipogénique tous les trois jours.
    3. Effectuer la coloration au rouge d’huile O après 14 jours d’induction adipogénique.
    4. Retirez le milieu de la plaque à six puits, fixez les cellules avec la solution de fixation Oil red O pendant 20 à 30 min, puis lavez-les trois fois avec du PBS.
    5. Retirez la solution de fixation et lavez deux fois les cellules à l’eau distillée.
    6. Immergez les cellules dans de l’isopropanol à 60 % pendant 20 à 30 s.
    7. Retirez l’isopropanol à 60 % et colorez les cellules avec le rouge d’huile O pendant 20 à 30 min.
    8. Retirez la solution colorante, rincez les cellules avec de l’isopropanol à 60 % pendant 20 à 30 secondes, puis lavez-les à l’eau distillée.
    9. Teintez le noyau avec une solution d’hématoxyline pendant 1 à 2 min.
    10. Retirez la solution d’hématoxyline et lavez les cellules 2-3 fois avec de l’eau distillée. Ajouter le tampon O rouge huile pendant 1 min et le retirer.
    11. Observez le nombre de gouttelettes lipidiques au microscope.
  3. Effectuer la différenciation chondrogénique.
    1. Inoculer 1 × 105 JBMMSC par puits dans une plaque à six puits.
    2. Lorsque la confluence cellulaire atteint 70 %, changez le milieu en milieu d’induction chondrogénique.
      REMARQUE : Changez le milieu d’induction chondrogénique tous les 3 jours.
    3. Effectuer une coloration au bleu d’Alcian après 21 jours d’induction chondrogénique.
    4. Retirez le milieu de la plaque à six puits, fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde à température ambiante pendant 30 min, puis lavez-les trois fois avec du PBS.
    5. Teindre les cellules avec une coloration au bleu d’Alcian à 37 °C pendant 1 h.
    6. Rincez les cellules jusqu’à ce qu’il ne reste plus de solution de coloration et observez-les au microscope.

7. PCR en temps réel

  1. Extrayez l’ARN total à l’aide du kit d’extraction d’ARN et mesurez la concentration d’ARN avec un marqueur enzymatique (en suivant les instructions du fabricant).
  2. Synthétisez l’ADNc à l’aide de 500 ng d’ARN19.
  3. Effectuez une qRT-PCR sur un système en temps réel avec 10 μL de mélange qRT-PCR contenant 1 μL d’ADNc, 3,5 μL d’eau bidistillée, 5 μL de SYBR et 0,5 μL de mélange d’amorces (0,1 μM).
    REMARQUE : Les séquences d’amorces sont énumérées dans le Tableau 1. Les conditions de cycle thermique sont les suivantes : 50 °C pendant 2 min, 95 °C pendant 2 min, suivis de 40 cycles de 95 °C pendant 15 s, de 60 °C pendant 2 min, puis d’incréments de 0,5 °C pendant 5 s de 60 °C à 95 °C pour la courbe de fusion.
  4. Utiliser le GAPDH comme contrôle interne16.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Après 72 h d’inoculation cellulaire, la plupart des cellules étaient suspendues et de forme ronde, et très peu adhéraient à la paroi (figure 1B). Au cinquième jour, des colonies cellulaires adhérentes sont apparues, présentant des fuseaux ou des formes semblables à celles des fibroblastes (Figure 1C). Au septième jour, les cellules adhérentes ont atteint une confluence de 90 %, formant une forme de « banc de poissons » avec un petit nombre de cellules suspendues...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMMSC) représentent un sous-ensemble de cellules souches non hématopoïétiques résidant dans la moelle osseuse, caractérisées par leurs capacités d’auto-renouvellement, leur potentiel de différenciation multidirectionnelle et leurs fonctions de soutien de l’hématopoïèse. Ces cellules jouent un rôle central dans divers processus physiologiques tels que la régénération tissulaire, l’angiogenèse et la régulation des activités cellulaires20. P...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par les projets de soins de santé du Département de la logistique de la Commission militaire (19BJZ22), de la Fondation des sciences naturelles de Pékin (7232154) et des projets de recherche clinique de la Quatrième Université Mil Med (2021XB025).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alizarin Red S Solution 0.2 %SolarbioG1450
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Kit de Développement de CouleurBeyotimeC3206
Bio-Rad CFX96 Système Temps RéelBio-Rad
CCK8 KitDujindoCK04
Plat de culture cellulaire 10 cmCorning
CentrifugeuseEppendorf5810R
Tube à centrifuger 15 mL  ;Corning430790
Tube à centrifuger 50 mL  ;430828Incubateur
< COsub>2Thermo Fisher3111
Oscillateur à température constanteShanghai Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co., Ltd.ZWY-100H
Sérum fœtal bovinBI04-001-1ACS
Cytomètre en fluxBDFACS C6  ;
Microscope à contraste de phase inverséOlympusCKX41  ;
Kit de détection de marqueurs de surface de cellules souches mésenchymateuses (rats)  ;OricellRAXMX-09011
Lecteur de microplaques multifonctionnel  ;BioTekSynergy LX Multi-Mode
Oil Red O Stain KitSolarbioG1262
Paraformaldéhyde 4 %SolarbioP1110
PBSMACGENECC008
pénicilline-streptomycine 0.25 %MACGENECC004
PowerUp SYBR Green MasterMix Thermo Fisher  ;A25742
PrimeScript RT Master Mix  ;TakaraRR036A
Moelle osseuse de rat Cellules souches mésenchymateuses Kit de différenciation adipogéniqueOricellRAXMX-90031
Cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de rat Kit de différenciation chondrogéniqueOricellRAXMX-90041
Cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de rat Kit de différenciation ostéogéniqueOricellRAXMD-90021
TIANGENDP419
Banc super proprePékin Yataikelong Instrument Technology Co., Ltd.KLCZ-1220A
Trypsine-EDTA  ; 0,25 %MACGENECC012
Collagénase de type IISolarbioC8150
Wistar ratBeijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.
&alpha ;-Milieu de culture MEM  ;GibcoC12571500BT
353003

Références

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  3. Shao, J., Zhang, W., Yang, T. Using mesenchymal stem cells as a therapy for bone regeneration and repairing. Biol Res. 48, 62(2015).
  4. Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. Long-bone marrow stromal cells. J Dent Res. 89 (11), 1293-1298 (2010).
  5. Mendi, A., Ulutürk, H., Ataç, M. S., Yılmaz, D. Stem cells for the oromaxillofacial area: Could they be a promising source for regeneration in dentistry. Adv Exp Med Biol. 1144, 101-121 (2019).
  6. Couly, G. F., Coltey, P. M., Le Douarin, N. M. The triple origin of skull in higher vertebrates: A study in quail-chick chimeras. Development. 117 (2), 409-429 (1993).
  7. Leucht, P., et al. Embryonic origin and hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration. Development. 135 (17), 2845-2854 (2008).
  8. Jeyaraman, M., et al. Is mandible derived mesenchymal stromal cells superior in proliferation and regeneration to long bone-derived mesenchymal stromal cells. World J Methodol. 13 (2), 10-17 (2023).
  9. Mouraret, S., et al. The potential for vertical bone regeneration via maxillary periosteal elevation. J Clin Peri.odontol. 41 (12), 1170-1177 (2014).
  10. Li, T. Q., Meng, X. B., Shi, Q., Zhang, T. Research progress in biological characteristics and influencing factors of jaw bone marrow mesenchymal stem cell. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 57 (1), 107-112 (2022).
  11. Arthur, A., Gronthos, S. Clinical application of bone marrow mesenchymal stem/stromal cells to repair skeletal tissue. Int J Mol Sci. 21 (24), 9759(2020).
  12. Yamaza, T., et al. Mouse mandible contains distinctive mesenchymal stem cells. J Dent Res. 90 (3), 317-324 (2011).
  13. Chen, L., et al. Directional homing of glycosylation-modified bone marrow mesenchymal stem cells for bone defect repair. J Nanobiotechnology. 19 (1), 228(2021).
  14. Hong, Y., et al. Isolation and cultivation of mandibular bone marrow mesenchymal stem cells in rats. J Vis Exp. (162), e61532(2020).
  15. Cheng, B., et al. Isolation, culture and biological characteristics of high-purity orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells of the rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 25 (1), 67-72 (2021).
  16. Lee, D. J., et al. Osteogenic potential of mesenchymal stem cells from rat mandible to regenerate critical sized calvarial defect. J Tissue Eng. 10, 2041731419830427(2019).
  17. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  18. Fathi, E., Mesbah-Namin, S. A., Vietor, I., Farahzadi, R. Mesenchymal stem cells cause induction of granulocyte differentiation of rat bone marrow c-kit(+) hematopoietic stem cells through jak3/stat3, erk, and pi3k signaling pathways. Iran J Basic Med Sci. 25 (10), 1222-1227 (2022).
  19. Xu, W., et al. Exosomes from microglia attenuate photoreceptor injury and neovascularization in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Ther Nucleic Acids. 16, 778-790 (2019).
  20. Chu, D. T., et al. An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells. Int J Mol Sci. 21 (3), 708(2020).
  21. Liu, Y., et al. Systemic infusion of mesenchymal stem cells improves cell-based bone regeneration via upregulation of regulatory T cells. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 498-509 (2015).
  22. Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: Differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 20 (3), 399-409 (2005).
  23. Zhang, G., Li, Q., Yuan, Q., Zhang, S. Spatial distributions, characteristics, and applications of craniofacial stem cells. Stem Cells Int. 2020, 8868593(2020).
  24. Akintoye, S. O. The distinctive jaw and alveolar bone regeneration. Oral Dis. 24 (1-2), 49-51 (2018).
  25. Park, J. B., Kim, I., Lee, W., Kim, H. Evaluation of the regenerative capacity of stem cells combined with bone graft material and collagen matrix using a rabbit calvarial defect model. J Periodontal Implant Sci. 53 (6), 467-477 (2023).
  26. Ni, X., et al. Isolation, culture and identification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering. Materials Exp. 12, 817-822 (2022).
  27. Abdallah, B. M., Khattab, H. M. Recent approaches to isolating and culturing mouse bone marrowderived mesenchymal stromal stem cells. Curr Stem Cell Res Ther. 16 (5), 599-607 (2021).
  28. Tan, S. L., Ahmad, T. S., Selvaratnam, L., Kamarul, T. Isolation, characterization and the multilineage differentiation potential of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Anat. 222 (4), 437-450 (2013).
  29. Mason, S., Tarle, S. A., Osibin, W., Kinfu, Y., Kaigler, D. Standardization and safety of alveolar bone-derived stem cell isolation. J Dent Res. 93 (1), 55-61 (2014).
  30. Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: Basic science to clinical translation. Int J Biochem Cell Biol. 43 (3), 286-289 (2011).
  31. Liu, J., Watanabe, K., Dabdoub, S. M., Lee, B. S., Kim, D. G. Site-specific characteristics of bone and progenitor cells in control and ovariectomized rats. Bone. 163, 116501(2022).
  32. Lee, B. K., Choi, S. J., Mack, D., Oh, S. H. Isolation of mesenchymal stem cells from the mandibular marrow aspirates. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 112 (6), e86-e93 (2011).
  33. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
  34. Short, B. J., Brouard, N., Simmons, P. J. Prospective isolation of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Methods Mol Biol. 482, 259-268 (2009).
  35. Guo, Z., et al. In vitro characteristics and in vivo immunosuppressive activity of compact bone-derived murine mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 24 (4), 992-1000 (2006).
  36. Pal, B., Das, B. In vitro culture of naïve human bone marrow mesenchymal stem cells: A stemness based approach. Front Cell Dev Biol. 5, 69(2017).
  37. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  38. Cao, W., et al. Mir-344d-3p regulates osteogenic and adipogenic differentiation of mouse mandibular bone marrow mesenchymal stem cells. PeerJ. 11, e14838(2023).
  39. Zong, C., Zhao, L., Huang, C., Chen, Y., Tian, L. Isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells from the human mandible. J Vis Exp. (182), e63811(2022).
  40. Park, J. C., et al. Acquisition of human alveolar bone-derived stromal cells using minimally irrigated implant osteotomy: In vitro and in vivo evaluations. J Clin Periodontol. 39 (5), 495-505 (2012).
  41. Mason, S., Tarle, S. A., Osibin, W., Kinfu, Y., Kaigler, D. Standardization and safety of alveolar bone-derived stem cell isolation. J Dent Res. 93 (1), 55-61 (2014).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Explorer plus d’articles

Isolement de la mandibule de ratdigestion de coupes osseusesmoelle osseuse totalemarqueurs de surface cellulairecytométrie en fluxdifférenciation ostéogéniquedifférenciation adipogéniquedifférenciation chondrogénique
Technique d’isolement et de culture de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de rat
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.