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Article de méthode

Dissociation d’échantillons de tissus tumoraux humains et murins pour le séquençage d’ARN unicellulaire

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DOI :

10.3791/66766

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16 août 2024

 ,  ,  ,  , 
1Krantz Family Center for Cancer Research, Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Broad Institute of MIT and Harvard, 3Department of Medicine, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la procédure de dissociation rapide des échantillons de tumeurs humaines et de souris pour le séquençage de l’ARN sur cellule unique.

Résumé

Les échantillons de tumeurs humaines contiennent une pléthore d’informations sur leur microenvironnement et leur répertoire immunitaire. La dissociation efficace d’échantillons de tissus humains en suspensions cellulaires viables est une donnée d’entrée nécessaire pour le pipeline de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq). Contrairement aux approches de séquençage de l’ARN en vrac, le scRNAseq nous permet de déduire l’hétérogénéité transcriptionnelle dans les échantillons tumoraux au niveau de la cellule unique. L’intégration de cette approche au cours des dernières années a conduit à de nombreuses découvertes, telles que l’identification d’états cellulaires immunitaires et tumoraux et de programmes associés aux réponses cliniques aux immunothérapies et à d’autres types de traitements. De plus, les technologies unicellulaires appliquées aux tissus dissociés peuvent être utilisées pour identifier les régions de chromatine accessibles, le répertoire des récepteurs des lymphocytes T et B, et l’expression des protéines, à l’aide d’anticorps à code-barres d’ADN (CITEseq).

La viabilité et la qualité de l’échantillon dissocié sont des variables critiques lors de l’utilisation de ces technologies, car elles peuvent affecter considérablement la contamination croisée de cellules uniques avec de l’ARN ambiant, la qualité des données et l’interprétation. De plus, les protocoles de dissociation longs peuvent conduire à l’élimination de populations cellulaires sensibles et à la régulation positive d’une signature génique de réponse au stress. Pour surmonter ces limitations, nous avons conçu un protocole de dissociation universelle rapide, qui a été validé sur plusieurs types de tumeurs humaines et murines. Le processus commence par une dissociation mécanique et enzymatique, suivie d’une filtration, d’une lyse des globules rouges et d’un enrichissement des cellules mortes vivantes, ce qui convient aux échantillons à faible apport de cellules (par exemple, les biopsies à l’aiguille). Ce protocole garantit une suspension unicellulaire propre et viable, essentielle à la génération réussie d’émulsions de billes de gel (GEM), de codes-barres et de séquençage.

Introduction

Bien que de nombreuses avancées dans la recherche sur le cancer aient conduit au développement et à l’approbation par la FDA d’agents ciblant les récepteurs inhibiteurs exprimés sur les cellules immunitaires et tumorales, connus sous le nom d’inhibiteurs de blocage de points de contrôle, la résistance au traitement et l’identification des mécanismes qui déterminent la réponse des patients restent difficiles1. Le défi complexe de caractériser l’hétérogénéité tumorale sur sa diversité moléculaire et l’interaction complexe entre les cellules tumorales et le microenvironnement immunitaire nécessite de nouvelles approches pour disséquer cet écosystème complexe à la résolution d’une seule cellule. La compréhension des subtilités moléculaires au sein des tumeurs et de leurs microenvironnements est essentielle pour faire progresser les stratégies thérapeutiques et déchiffrer la biologie complexe sous-jacente à la progression du cancer2. Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) est devenu de plus en plus populaire car il fournit une analyse à haute résolution de cellules individuelles dans des échantillons tumoraux complexes 3,4.

L’hétérogénéité tumorale, englobant les diversités génétiques, épigénétiques et phénotypiques, pose un défi pour découvrir les subtilités de la biologie du cancer5. Les méthodes conventionnelles de séquençage de l’ARN en vrac ont tendance à masquer les profils d’expression et les phénotypes uniques des populations cellulaires hétérogènes présentes dans les tumeurs, car ces méthodes font la moyenne des signaux sur des populations cellulaires entières4. En revanche, le scRNA-seq permet la dissection de types de cellules individuelles, révélant diverses expressions génétiques, des modèles de répression et des états cellulaires autrement négligés 4,6. Le principe du scRNA-seq réside dans sa capacité à décoder les signatures génétiques et moléculaires des cellules individuelles, ce qui est extrêmement prometteur pour la découverte de nouvelles thérapies contre le cancer7.

En déchiffrant les profils d’expression génique des cellules tumorales et des cellules stromales et immunitaires environnantes, les chercheurs peuvent identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et développer des stratégies de médecine génétique de précision adaptées à chaque patient6. De plus, la dissection du répertoire immunitaire au sein du microenvironnement tumoral fournit des informations cruciales sur l’interaction entre les cellules tumorales et les effecteurs immunitaires, ouvrant ainsi la voie à des interventions immunothérapeutiques3. Malgré les progrès réalisés dans l’utilisation du scRNAseq sur des échantillons cliniques, plusieurs défis au cours des étapes de traitement peuvent nuire à l’intégrité de l’ARN de la cellule, à la viabilité et à la qualité des données générées. De plus, le traitement de tissus à faible viabilité cellulaire peut augmenter les niveaux d’ARN ambiant dans les gouttelettes générées lors de l’encapsulation des cellules individuelles, entraînant une contamination croisée et une annotation incorrecte des types de cellules, tandis que les protocoles de dissociation longs effectués à 37 °C peuvent conduire à la régulation positive d’une signature génique de réponse au stress dans plusieurs types de cellules 8,9, 10. Aéroport international

La procédure par étapes (Figure 1A) décrite dans ce protocole commence par une dissociation mécanique et enzymatique rapide des tumeurs, suivie d’une filtration et de l’élimination des cellules mortes, en fonction de la viabilité de chaque échantillon tumoral. À l’heure actuelle, cette procédure a été vérifiée dans des échantillons de mélanome11, de colorectal12, de carcinome épidermoïde de la tête et du cou13, de tumeurs du pancréas et du poumon (données non publiées). Ces techniques garantissent la génération de suspensions cellulaires viables de haute qualité, cruciales pour les analyses en aval14. Notamment, l’élimination des globules rouges, dépourvus d’ARN synthétisé, devient impérative pour purifier l’échantillon15. L’évaluation ultérieure du nombre de cellules et l’élimination des cellules mortes constituent une condition préalable à la réussite de la génération d’émulsion de billes de gel (GEM) 10x Genomics, du codage à barres, et augmentent la récupération des transcrits et des cellules séquencées sans compromettre l’exclusion des populations sensibles (par exemple, les neutrophiles et les cellules épithéliales)16. Ces étapes sont fondamentales pour libérer le potentiel de l’analyse de la résolution unicellulaire dans les échantillons tumoraux 9,10, découvrir de nouveaux profils d’expression génique et des signatures immunitaires nécessaires pour conduire des interventions thérapeutiques innovantes, et identifier de nouvelles vulnérabilités tumorales.

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Protocole

Cette étude a respecté toutes les directives institutionnelles concernant l’échantillonnage de tissus humains. Le consentement éclairé des patients a été reçu et les données identifiables de l’échantillon ont été anonymisées. Les échantillons sont prélevés dans la salle d’opération, placés dans une solution de RPMI, de sérum physiologique ou de PBS, et confirmés cancéreux par le service de pathologie avant d’être utilisés dans la recherche. Toutes les étapes, sauf indication contraire, doivent être effectuées à 4 °C ou sur glace. Travaillez à l’intérieur d’une cagoule de biosécurité lors du traitement de tissus humains. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole.

1. Obtention de l’échantillon

  1. Obtenez un échantillon de tumeur solide dans un tube de support et placez-le sur de la glace.
    1. Demandez au personnel de la salle d’opération de transporter l’échantillon dans un tube contenant suffisamment de RPMI, de solution saline ou de PBS pour immerger complètement le tissu afin d’éviter la déshydratation de l’échantillon.
      REMARQUE : Il est important de s’assurer que l’échantillon n’est pas desséché, car cela diminuera la viabilité.
  2. Refroidissez toutes les centrifugeuses à 4 °C et amenez le mélangeur thermique à 37 °C.
  3. Retirez les enzymes de dissociation tumorale humaines ou de souris préparées (tableau des matériaux), décongelez-les sur le mélangeur thermique à 37 °C et passez-les à la glace une fois décongelées.
  4. Prélever une aliquote de 20 mL de RPMI.
  5. Consignez les renseignements pertinents sur l’échantillon (p. ex., numéro d’identification du patient, désidentificateur, type d’échantillon).
  6. Transférez l’échantillon dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm (placée sur de la glace) en retournant le tube plusieurs fois et en versant le contenu dans la boîte pour s’assurer que tout le matériel de l’échantillon est transféré. Si l’échantillon n’a pas été livré dans le milieu à l’arrivée, ajoutez du milieu frais dans le plat.
    1. Si l’échantillon est fragmenté, faire tourner le tube contenant l’échantillon à 450 × g, 4 °C pendant 5 min, jeter le surnageant, remettre l’échantillon en suspension dans 420 μL de RPMI et passer à la section 2.

2. Digestion mécanique et enzymatique

  1. Pipeter 420 μL de milieu de la boîte d’échantillonnage de 60 mm vers un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Essayez d’inclure des fragments d’échantillons en suspension dans le support.
  2. Transférez le tissu de l’échantillon de la boîte de 60 mm dans le tube de 1,5 mL contenant le milieu à l’aide d’une pince à épiler. Découpez l’échantillon avec des ciseaux propres à l’intérieur du tube de sorte que les morceaux aient un diamètre maximal de 2 à 3 mm.
  3. Ajouter à l’échantillon des enzymes de digestion, préparées conformément aux spécifications du fabricant (tableau des matériaux), dans les volumes suivants : 42 μL d’enzyme H (protéases non spécifiques) pour les échantillons humains, l’enzyme D (protéases non spécifiques) pour les échantillons murins, 21 μL d’enzyme R (protéases non spécifiques) et 5 μL d’enzyme A (nucléase).
  4. Ajoutez 420 μL de support supplémentaire de la parabole ou jusqu’à 1 ml sur le tube. Ne pas dépasser 420 μL de support.
  5. Vortex le tube pendant 5 s et placez-le dans un mélangeur thermique positionné verticalement sur son côté (Figure 1B). Incuber à 37 °C, 450 tr/min, pendant 15 min.
    REMARQUE : Pendant l’incubation, retirez tous les 10x matériaux génomiques nécessaires à la génération de GEM, car ils nécessitent 30 minutes pour s’équilibrer à température ambiante

3. Filtrage des échantillons

  1. Placez un filtre à cellules de 50 μm sur un nouveau tube conique de 15 mL et amorcez le filtre en faisant passer 1 mL de média RPMI frais à travers celui-ci dans le tube.
  2. Après la digestion, transférez l’échantillon dans le tube de 15 ml à l’aide d’une pointe de pipette large à faible rétention de 1 000 μL. Lavez le tube de 1,5 mL avec 1 mL de média frais et transférez le média sur le filtre pour vous assurer que tout le matériel de l’échantillon passe à travers le filtre.
  3. Prenez une seringue en plastique de 1 ml et retirez-en seulement le piston (jetez le reste de la seringue). À l’aide de l’arrière du piston de la seringue, broyez et poussez l’échantillon sur le filtre dans un mouvement de torsion.
  4. Lavez le filtre avec 5 ml de média et tout média restant de la boîte qui contenait l’échantillon (section 1) pour recueillir les cellules qui auraient pu se détacher du tissu.
  5. Placez un filtre à cellules de 30 μm sur un nouveau tube conique de 15 ml, amorcez le filtre avec 1 ml de média et transférez le contenu du tube contenant l’échantillon dissocié à travers le filtre.
    REMARQUE : Cette étape éliminera les gros débris qui pourraient se boucher ou provoquer un échec de mouillage lors de l’analyse de l’échantillon à l’aide des puces microfluidiques 10x Genomics.

4. Lyse des globules rouges

  1. Centrifuger l’échantillon à 450 × g, 4 °C pendant 5 min. Aspirez le média en faisant attention de ne pas déranger la pastille.
  2. Résuspendez-le dans le tampon de lyse ACK pour éliminer les globules rouges (GR) et enregistrer le volume utilisé. Le volume dépendra de la taille des granulés et de l’étendue des globules rouges dans les granulés.
    REMARQUE : La solution d’échantillon ACK remise en suspension doit être incolore lorsqu’une quantité suffisante de tampon de lyse ACK a été ajoutée, car cela éliminera les globules rouges de l’échantillon.
  3. Centrifuger le tube d’échantillon à 450 × g, 4 °C pendant 5 min, et aspirer le surnageant.
  4. Répétez les étapes 4.2 et 4.3 au besoin jusqu’à ce que la pastille d’échantillon n’ait plus de couleur rouge visible après centrifugation (Figure 2). Enregistrez tous les volumes supplémentaires de mémoire tampon de lyse ACK utilisés dans cette étape.
  5. Remettre en suspension la pastille d’échantillon dans un milieu frais en préparation du comptage.

5. Comptage des cellules

  1. Placer 10 μL de bleu trypan dans un tube de 1,5 mL. Mélangez délicatement les cellules dissociées, prélevez 10 μL d’échantillon et mélangez (1:1) avec le bleu de trypan. Chargez 10 μL de chaque côté d’un hémocytomètre et comptez les cellules.
  2. Enregistrez la concentration des cellules, le nombre total de cellules vivantes, le pourcentage de viabilité et le volume final du milieu après le comptage.
  3. Assurez-vous que le nombre de cellules se situe entre 700 et 1 200 cellules/μL (7 × 105 - 1,2 × 106/mL) pour une analyse génomique optimale de 10x.
    1. Si l’échantillon est trop concentré, diluez-le avec un milieu et recomptez-le.
    2. Si l’échantillon est trop dilué, centrifugez-le à 450 × g, 4 °C pendant 5 min, et mettez-le en suspension dans un volume de milieu moindre.
    3. Si la viabilité cellulaire est inférieure à 80 %, effectuez une procédure de mort vivante pour éliminer les cellules mortes.
    4. S’il y a moins d’un million de cellules, voir section 6.
    5. S’il y a plus d’un million de cellules et que la viabilité > 10 %, voir rubrique 6.
    6. S’il y a plus d’un million de cellules et que la viabilité < 10 %, voir rubrique 7.
    7. Si la viabilité des cellules est supérieure à 80 %, conservez les cellules traitées sur de la glace et procédez immédiatement à la génération de GEM conformément aux instructions du fabricant.

6. Élimination des cellules mortes - Kit 1

REMARQUE : Travaillez à l’intérieur d’une cagoule de biosécurité lorsque vous utilisez les réactifs d’élimination des cellules mortes, car ceux-ci peuvent facilement être contaminés.

  1. Centrifuger l’échantillon à 450 × g, 4 °C pendant 5 min.
  2. Préparez le milieu d’isolement dans un tube conique de 15 ml et conservez-le à température ambiante : 9,8 ml de PBS, 10 μL de CaCl2 et 200 μL de FCS inactivé par la chaleur (ajouté dans une hotte de biosécurité).
  3. Après la centrifugation, aspirer le média de la pastille et le remettre en suspension dans 1 mL du média d’isolement.
  4. Centrifugez à nouveau le tube à 450 × g, 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de milieu d’isolement.
  5. Transvaser 100 μL d’échantillon dans un milieu d’isolement dans un puits d’un tube à bandelettes PCR de 0,2 mL.
  6. Dans une hotte de biosécurité, ajoutez 10 μL d’Annexin V Cocktail et 10 μL de Biotin Selection Cocktail dans le puits contenant 100 μL de l’échantillon dans un milieu isolant. Mélangez la solution à la pipette et laissez-la reposer à température ambiante pendant 4 min.
  7. Après 4 min, vortex les particules magnétiques enrobées de dextran pendant 30 s. Ajouter 20 μL de billes et 60 μL de milieu d’isolement à l’échantillon (un volume total de 200 μL). Si la viabilité est inférieure à 40 %, augmentez la quantité de billes jusqu’à 40 μL tout en ajustant le volume du milieu d’isolement (jusqu’à 40 μL), en maintenant un volume total de 200 μL. Mélangez à la pipette et laissez la solution reposer à température ambiante pendant 3 min.
  8. Placez le tube de la bandelette sur un séparateur magnétique Genomics 10x (sur le réglage élevé) pendant 5 min à température ambiante.
  9. Transférez le liquide du tube à bandelettes sans déranger les billes dans un nouveau tube à microcentrifugation à faible liaison de 1,5 ml. Ne retirez pas le tube ruban de l’aimant.
  10. Centrifuger le tube de 1,5 mL contenant l’échantillon à 450 × g, 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un volume approprié de milieu RPMI en fonction de la taille de la pastille et des cellules de numération, comme décrit à la section 5. Répétez la procédure d’élimination des cellules mortes si la viabilité reste inférieure à 80 % (Figure 3 et Figure 4).
    REMARQUE : Ne mettez pas les cellules en suspension dans un milieu d’isolement pour la génération de GEM en aval, car le chlorure de calcium interférera avec le processus d’encapsulation et l’étape de transcription inverse (RT).
  11. Conservez les cellules traitées sur de la glace si la viabilité des cellules est supérieure à 80 % et procédez immédiatement à la génération de GEM conformément aux instructions du fabricant.

7. Élimination des cellules mortes - Kit 2

REMARQUE : Travaillez à l’intérieur d’une cagoule de biosécurité lors de l’utilisation des réactifs du kit.

  1. Placez les microbilles et la solution mère de tampon de liaison 20x à l’intérieur d’une hotte de biosécurité.
  2. Centrifuger la suspension d’échantillon à 450 × g, 4 °C pendant 5 min.
  3. Préparez 1 solution tampon dans des conditions stériles en utilisant 1 mL de la solution mère du tampon de liaison 20 fois pipetée dans 19 mL d’eau distillée exempte d’ADN et d’ARNse.
  4. Une fois la centrifugation terminée, aspirez le surnageant, ajoutez les microbilles, mélangez doucement l’échantillon et incubez à température ambiante pendant 15 min.
    1. Lorsque le nombre de cellules est de 10à 7 ou moins, ajoutez 100 μL de microbilles.
    2. Pour un dénombrement supérieur à 107 cellules totales, ajuster les microbilles pour obtenir une concentration finale de 100 μL par 107 cellules vivantes.
  5. Pendant l’incubation, obtenir une colonne de sélection positive MACS, un multisupport MACS et le séparateur magnétique correspondant. Assurez-vous que le séparateur est mis à niveau sur le support multiple et qu’aucun autre objet métallique ou magnétique ne se trouve à proximité du support, car la force magnétique est puissante et pourrait affecter l’efficacité d’élimination des cellules mortes. Placez la colonne bien ajustée dans un support de séparateur avec les ailes vers l’extérieur.
  6. Après l’incubation de l’échantillon, si le volume total de remise en suspension est inférieur à 500 μL, ajoutez 1 tampon de liaison jusqu’à ce que le volume total soit de 500 μL.
  7. Placez un tube conique de 15 ml sous la colonne et amorcez la colonne avec 3 ml de 1 tampon de liaison.
  8. Remplacez le tube conique par un nouveau tube conique de 15 mL pour le prélèvement d’échantillons cellulaires et ajoutez l’échantillon à la colonne, ce qui lui permet de s’écouler complètement à travers la colonne.
  9. Lavez la colonne 4 x 3 ml de 1 tampon de reliure, en ajoutant seulement un lavage à la fois après que le lavage précédent ait entièrement coulé à travers la colonne.
  10. Après le quatrième lavage, centrifuger le tube conique contenant les cellules isolées pendant 5 min à 450 × g, 4 °C. Jetez la colonne et le 1x tampon de liaison restant.
  11. Remettre en suspension la solution d’échantillon dans la quantité appropriée de milieu RPMI en fonction de la taille des pastilles et compter les cellules isolées à l’aide de la méthode décrite à la section 5 (figure 3 et figure 5).
    1. Si la viabilité reste inférieure à 80 % et que le nombre total de cellules est de 106 ou moins, répéter la section 6.
    2. Si la viabilité cellulaire est supérieure à 80 %, conservez les cellules traitées sur de la glace et procédez immédiatement à la génération de GEM conformément aux instructions du fabricant.

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Résultats

Une biopsie du mélanome suspendue dans un RPMI a été obtenue et immédiatement placée sur de la glace. L’échantillon a été transféré dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 420 μL de RPMI et d’enzymes de digestion, haché en petits morceaux à l’aide de ciseaux, puis soumis à une digestion enzymatique pendant 15 min dans un mélangeur thermique positionné verticalement à 37 °C (figure 1). Après la digestion, l’échantillon a été filtré à travers un filtre stérile jetable de 50 μm,...

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Discussion

Ce protocole décrit la dissociation d’échantillons tumoraux humains ou murins en une suspension unicellulaire pour le séquençage de l’ARNsc à l’aide du système microfluidique 10x Genomics. Lors du traitement de tissus qui proviennent souvent de cancers rares ou qui font partie d’essais cliniques en cours ou de longues expériences pour des tumeurs murines, l’échantillon doit être conservé de manière optimale et soigneuse entre toutes les étapes. Toutes les étapes doivent être effectuées rapidement sur de la glace ou à 4 °...

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Déclarations de divulgation

M.S-F. a reçu un financement de Bristol Myers-Squibb, d’Istari Oncology, et a été consultant pour Galvazine Therapeutics.

Remerciements

Cette étude a été financée par la Fondation Adelson pour la recherche médicale (AMRF), l’Alliance de recherche sur le mélanome (MRA) et U54CA224068. Les figures 1, 4 et 5 ont été créées à l’aide de BioRender.com.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x PipetteCorning21-040-CV
10 mLCorning357551
1000 &mu ; L pointes de pipette à faible rétentionRainin30389213
1000 &mu ; L pointes de pipette larges à faible rétentionRainin30389218
1000 &mu ; Pointes de pipette LRainin30389212
10x Séparateur magnétique10x Genomics120250
15 mL Tubes coniquesCorning430052
2 mL Pipette aspiranteCorning357558
20 &mu ; L pointes de pipette à faible rétentionRainin30389226
20 &mu ; L pointes de pipetteRainin30389225
200 &mu ; L pointes de pipette à faible rétentionRainin30389240
200 &mu ; Pointes de pipette LRainin30389239
50 mL Tube conique en polypropylèneFalcon352098
60 x 15 mm Boîte de culture tissulaireFalcon353004
Tampon de lyse ACKGibcoA10492-1
BD Seringue de 1 mLBecton, Dickinson and Company3090659
Hémocytomètre Bright-LineHausser Scientific551660
Chlorure de calcium SolutionSigma Aldrich2115-100ML
Cell Ranger  ;10x GenomicsN/Ahttps://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Lames de comptage de cellules pour compteur de cellules TC20Bio-Rad1450015
CellTrics 30&mu ; m filtres stériles jetablesSysmex04-004-2326
CellTrics 50&mu ; m filtres jetables stérilesSysmex04-004-2327
Kit d’élimination des cellules mortes  ;Miltenyi Biotec130-090-101Boutique à -20 ° ; C; kit 2
Pinces à dissectionner, pointe fineVWR82027-386
DNA LoBind Microtubes à centrifuger, 1,5 mLEppendorf22431021
EasySepTM Dead Cell Removal
(Annexin V) Kit		STEMCELL Technologies17899Stocker à 4 ° ; C; Kit 1
Centrifugeuse Eppendorf 5425REppendorf5406000640
Centrifugeuse Eppendorf 5910REppendorf2231000657
Eppendorf Easypet 3 Contrôleur de pipette électroniqueEppendorfEP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Modèle 5384EppendorfEP5384000012
FBS Gibco26140-079Conserver à 4 ° ; C, utilisation dans un capot biologique
Ciseaux en acier inoxydable allemandOutils de science fine14568-12
Microscope Leica Dmi1Leica Microsystems454793
LS ColonneMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultistandMiltenyi Biotec130-042-303
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+Rainin17014382
Pipette Pipet-Lite LTS L-200XLS+Rainin17014391
Pipette Pipet-Lite LTS L-20XLS+Rainin17014392
Quadro MACS MagnetMiltenyi Biotec130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)Gibco21870-076Stocker à 4 ° ; C
TempAssure 0,2 mL PCR 8 bandelettes de tubesUSA Scientific1402-4700
Coloration bleue trypan 0,4 %Thermo Fisher ScientificT10282
Kit de dissociation tumorale, HumainMiltenyi Biotec130-095-929Stocker à -20 ° ; C, préparer les enzymes selon les instructions du kit :
Reconstituer le flacon d’enzyme H lyophilisée dans 3 mL de RPMI 1640
Reconstituer le flacon d’enzyme R lyophilisée dans 2,7 mL de RPMI 1640
Reconstituer le flacon d’enzyme A lyophilisé dans 1 mL de tampon A fourni avec le kit.
Kit de Dissociation Tumorale, SourisMiltenyi Biotec130-096-730Stocker à -20 ° ; C, préparer les enzymes selon les instructions du kit :
Reconstituer le flacon d’enzyme D lyophilisée dans 3 mL de RPMI 1640
Reconstituer le flacon d’enzyme R lyophilisée dans 2,7 mL de RPMI 1640
Reconstituer le flacon d’enzyme A lyophilisée dans 1 mL de tampon A fourni avec le kit.
Eau distillée UltraPureInvitrogen10977-015Stocker à 4 ° ; L
sérologique PBS

Références

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