Chanfreinage humide des aiguilles de micro-injection en utilisant une pression d’air constante pour un retour d’information sur l’ouverture de l’aiguille

Résumé

Ce protocole décrit l’assemblage d’un système pneumatique pour l’administration d’air sous pression à une aiguille pendant le processus de biseautage de l’aiguille. Le protocole décrit en outre le processus de biseautage pour créer des aiguilles de micro-injection pointues et comment évaluer la taille relative de l’ouverture de l’aiguille.

Résumé

Les aiguilles de micro-injection sont un outil essentiel dans l’administration de réactifs de modification du génome, de composants CRISPR (ARN guides, protéine Cas9 et matrice donneuse) et de composants du système de transposon (plasmides et ARNm transposase) dans les embryons d’insectes en développement. Les aiguilles de micro-injection tranchantes sont particulièrement importantes lors de l’administration de ces agents modificateurs, car elles aident à minimiser les dommages à l’embryon injecté, augmentant ainsi la survie de ces embryons par rapport à l’injection avec des aiguilles non biseautées. De plus, le biseautage des aiguilles produit des aiguilles qui sont plus uniformes d’une aiguille à l’autre que les aiguilles ouvertes en brisant au hasard la pointe de l’aiguille en frottant la pointe contre un objet (côté d’une lamelle, surface de l’embryon à injecter, etc.). Le processus de biseautage humide des aiguilles de micro-injection avec de l’air à pression constante délivré à l’aiguille permet à la personne qui biseaute l’aiguille de savoir quand l’aiguille est ouverte (présence de bulles) et donne également une indication relative de la taille de l’ouverture de l’aiguille qui a été créée. La taille relative de l’ouverture de l’aiguille peut être déterminée en ajustant la pression d’air délivrée à l’aiguille jusqu’à ce qu’un équilibre soit atteint et que les bulles cessent de s’écouler de la pointe de l’aiguille. Plus la pression à laquelle l’équilibre est atteint est basse, plus la taille de l’aiguille est grande ; Et inversement, plus la pression est élevée, plus la taille de l’aiguille est petite.

Introduction

La modification génétique des insectes est un processus développé à l’origine chez la drosophile par Rubin et Spradling, et au fil des ans, ce processus a été modifié pour créer des modifications génétiques chez d’autres espèces¹. Le processus repose sur l’administration précise de composants de modification micro-injectés dans les embryons à une fenêtre de temps et à un endroit spécifiques au sein de l’embryon^{en développement 2,3,4}. Les aiguilles de micro-injection pointues sont un outil essentiel dans le processus de modification génétique de certains insectes, tels que les moustiques 4,5,6,7,8,9 et les phlébotomes¹⁰, alors qu’ils ne sont pas aussi critiques pour d’autres insectes, tels que les vers à soie ¹¹. Les aiguilles pointues sont souvent un facteur clé entre le succès et l’échec lorsqu’on essaie de créer un insecte génétiquement modifié ^2,4. En règle générale, les aiguilles de verre microcapillaires sont tirées en chauffant le verre jusqu’au point où le verre devient élastique, ce qui permet au capillaire d’être tiré dans une aiguille à pointe fermée effilée. Avant de pouvoir utiliser l’aiguille, elle doit être ouverte de manière à créer une pointe pointue pour l’injection. Traditionnellement, les aiguilles sont ouvertes en brossant doucement la pointe de l’aiguille contre quelque chose (le bord d’une lame/lamelle, ou l’embryon, etc.) qui provoque la rupture d’une petite quantité de verre de la pointe, créant au hasard une pointe pointue ^2,3. Un processus un peu moins aléatoire est le biseautage à sec, où l’aiguille est rapidement abaissée sur une plaque abrasive optiquement plate et tournante pendant une courte période de temps, provoquant l’abrasion d’une petite quantité de verre de la pointe de l’aiguille, créant ainsi une pointe pointue. Le biseautage à sec est un peu moins aléatoire que le brossage de la pointe de l’aiguille contre quelque chose. Le protocole décrit ci-dessous va encore plus loin dans le processus de biseautage en fournissant de l’air comprimé à l’aiguille biseautée et en la biseautant sous une couche liquide afin que les bulles soient visibles dès que l’aiguille a été ouverte. Ce protocole détaille une méthode permettant de produire des aiguilles de micro-injection tranchantes de manière fiable. Le biseautage sous une couche liquide est une amélioration par rapport à la casse aléatoire de l’aiguille comme décrit ci-dessus, et au biseautage à sec car l’utilisateur reçoit un retour sur le processus de biseautage, ce qui permet à la personne qui biseaute de savoir quand l’aiguille est ouverte et relativement quelle est la taille de l’ouverture de l’aiguille. Connaître la taille relative de l’ouverture de la pointe de l’aiguille peut permettre à la personne qui biseaute de créer des aiguilles avec différentes tailles d’ouverture. Différentes tailles d’ouverture d’aiguille présentent des avantages différents ; Par exemple, des ouvertures d’aiguille plus grandes peuvent accueillir des mélanges d’injection de viscosité élevée, tandis que des aiguilles plus petites causent moins de dommages à l’embryon injecté.

L’air est fourni à l’aiguille à l’aide d’un régulateur et d’un système de tube en uréthane basé sur un système d’injection régulé à pression d’air modifiée². Alors que l’air est fourni à l’aiguille à une pression constante, l’aiguille est biseautée sous une couche de liquide. Le processus de biseautage est composé d’un processus répété en cinq étapes : 1) abaisser l’aiguille sur la surface abrasive, 2) laisser l’aiguille biseauter pendant une courte période de temps, 3) soulever l’aiguille pour l’éloigner de la plaque abrasive tout en la maintenant sous la surface de la couche liquide, 4) arrêter la rotation de la plaque abrasive pour vérifier l’apparition de bulles. S’il n’y a pas de bulles, les étapes 1 à 4 sont répétées jusqu’à ce que des bulles apparaissent. 5) Une fois que les bulles sont présentes, la pression de l’air peut être ajustée pour déterminer la taille relative de l’ouverture de l’aiguille. Plus la pression nécessaire pour arrêter la formation de bulles est faible, plus l’ouverture à la pointe de l’aiguille est grande.

Protocole

REMARQUE : Le protocole décrit ci-dessous utilise le microcapillaire Sutter BV-10 biseauté. Cependant, ce protocole peut être modifié pour être utilisé avec n’importe quel modèle de microcapillaire biseauté.

1. Assemblage du régulateur, du manomètre et du tube d’alimentation en air

1. Coupez une section de tube en uréthane pour le raccordement de l’alimentation en air à la base du régulateur (R ; Section 1, Figure 1). La longueur de cette section dépendra de la distance entre l’alimentation en air et le régulateur, qui sera situé à côté du biseauteur.
2. Faites glisser un collier de serrage sur le tube en uréthane, puis enfoncez un connecteur de tuyau dans l’extrémité du tube. Assurez-vous que le connecteur du tuyau est complètement inséré en plaçant le connecteur du tuyau contre une surface dure. Tout en tenant le tube près du connecteur du tuyau, appuyez fermement sur le tube dans le tuyau jusqu’à ce que le connecteur du tuyau soit complètement inséré. Ensemble, le collier de serrage et le connecteur de tuyau forment la connexion HC (Figure 1).
3. Faites glisser le collier de serrage jusqu’à l’extrémité du tube où le connecteur du tuyau est inséré. Faites pivoter le collier de serrage sur l’extrémité cannelée insérée afin qu’il forme une connexion étanche à l’air.
4. Vissez le connecteur du tuyau dans la base du régulateur (R) à la main, puis terminez de serrer le raccord avec une petite clé. Assurez-vous que la connexion est étanche à l’air mais pas trop.
5. Dans l’orifice latéral du régulateur, vissez un connecteur en T (T) à la main, puis utilisez une petite clé pour terminer le serrage.
6. Coupez un petit morceau de tube d’uréthane (figure 1, section 2) d’environ 3 à 5 cm de longueur. Placez deux colliers de serrage sur le morceau de tube, puis insérez un connecteur de tuyau à chaque extrémité du tube et terminez les connexions (HC) comme décrit aux étapes 1.2-1.4 pour chaque extrémité du tube.
7. Vissez une extrémité du tube court dans la base du manomètre, puis terminez le serrage à l’aide d’une clé comme à l’étape 1.5.
8. Vissez l’autre extrémité du tube court dans l’un des ports du connecteur en T (T) connecté au régulateur à l’étape 1.5.
9. Coupez une section de tube en uréthane (Figure 1, Section 3) pour la connexion entre le régulateur et le porte-aiguille (NH). La taille de cette section dépendra de la distance entre le chanfreinet et l’emplacement du régulateur.
10. Placez un collier de serrage sur la section du tube, puis insérez un connecteur de tuyau comme décrit aux étapes 1.2-1.4.
11. De l’autre côté de cette section de tube, placez le connecteur Luer femelle (LC) fourni avec le porte-aiguille (NH).
12. Retirez la pince de retenue et la rondelle en nylon (Figure 2, f) du manipulateur. La pince de retenue et la rondelle sont conçues pour contenir uniquement un microcapillaire en verre, elles ne sont pas conçues pour supporter le poids supplémentaire d’un support de microcapillaire, d’une tige filetée et d’un tube d’alimentation en air.
13. Coupez un morceau rectangulaire de feuille d’emballage en caoutchouc de 1,5 cm x 2 cm pour envelopper la tige filetée dans la pince d’aile de vélo. Cela aidera à maintenir la tige filetée et le porte-aiguille plus solidement dans la pince d’aile du vélo. À l’aide de deux pinces à bec effilé, ouvrez le clip d’aile du vélo, pliez le morceau rectangulaire de feuille d’emballage en caoutchouc sur la tige filetée à 3,5 cm d’une extrémité de la tige de sorte qu’il forme un U sur la tige. Insérez la tige filetée recouverte d’une feuille de caoutchouc dans la pince d’aile de vélo ouverte et utilisez la pince pour fermer la pince autour de la tige et de la feuille de caoutchouc. Installez la pince de vélo et la tige filetée sur le boulon du manipulateur, remplacez la pince de retenue sans la rondelle en nylon et serrez la pince de retenue jusqu’à ce qu’elle maintienne solidement l’ensemble de tige filetée.
14. Enfilez le porte-aiguille sur la tige filetée. Assurez-vous que le connecteur Luer se termine dans une position qui ne coincera pas le tube en uréthane lorsqu’il est connecté (Figure 2, g).
15. Connectez le connecteur Luer femelle au connecteur Luer mâle (Figure 2, g) du porte-aiguille (Figure 2, d).
16. Connectez l’extrémité libre du tube de la Figure 1, section 1 à l’alimentation en air (cette connexion variera en fonction de l’alimentation en air utilisée). L’alimentation en air doit être propre, sèche et exempte de résidus d’huile. L’alimentation en air peut provenir d’une source d’air domestique ou d’une bouteille de gaz, soit de l’air comprimé ou de l’azote.

2. Chanfreinage des aiguilles en borosilicate

1. Tirez les aiguilles de micro-injection à l’aide de micro-capillaires en verre borosilicate avec les réglages suivants sur l’instrument : Chaleur : 305, Fil : 4, Vel : 70, Del : 235, Pul : 160, avec temps de boucle de 12,24.
2. Assemblez l’ensemble de meulage selon les instructions du fabricant, composé de la plaque abrasive et de la bague de retenue avec aimants¹².
   REMARQUE : Il peut être nécessaire d’envelopper la plaque abrasive d’une fine bande de film transparent pour éviter une fuite prématurée de Photo-Flo (agent mouillant) de la plaque abrasive. Cela n’est nécessaire que si la solution d’agent mouillant s’écoule prématurément dans l’huile du piédestal, provoquant l’arrêt de la rotation de la plaque de broyage. L’agent mouillant réduit le risque de marques de séchage sur les aiguilles de verre après le biseautage. L’utilisation d’un agent mouillant n’est pas critique pour le processus de chanfreinage, et l’eau peut être substituée.
3. Placez 10 gouttes d’huile sur la surface optiquement plane du socle et placez l’ensemble de broyage sur le dessus. Démarrez l’ensemble de meulage.
4. Allumez la source lumineuse pour éclairer la surface. Assurez-vous que la source lumineuse est positionnée derrière le biseauté et qu’elle brille à un angle de 45° par rapport à la plaque abrasive et à l’aiguille. L’angle d’éclairage est nécessaire pour qu’une ombre de l’aiguille soit facilement vue. À un grossissement de 90x, tournez la tête du microscope en place. Arrêtez brièvement la rotation de la plaque abrasive et concentrez le microscope sur la surface de la plaque abrasive.
5. Ajoutez 1 % d’agent mouillant à la mèche jusqu’à ce que la mèche soit complètement mouillée. Ajoutez 1 % d’agent mouillant à la surface de la plaque abrasive. Assurez-vous que l’agent mouillant recouvre la surface abrasive mais ne fuit pas sur la bague de retenue noire.
6. Placez la mèche pré-humide sur la surface de la plaque abrasive pendant qu’elle tourne. Assurez-vous que la mèche se trouve sur le côté gauche de la plaque abrasive (lorsque vous regardez vers le bas depuis le haut) et qu’elle s’étend de 11 heures à 6 heures (avec la plaque comme cadran d’horloge). Assurez-vous que la mèche ne repose pas sur la partie noire de l’anneau de retenue.
7. Insérez une aiguille dans le porte-aiguille (Figure 2, d) et serrez la bague de retenue pour maintenir l’aiguille en place. Ouvrez le régulateur (Figure 1, R) et augmentez la pression à 24 psi.
8. Soulevez le porte-aiguille en tournant le bouton de réglage de la trajectoire (Figure 2, a) Assurez-vous que l’aiguille est suffisamment haute pour être plus haute que la surface de la plaque abrasive rotative, puis faites pivoter l’ensemble du manipulateur de sorte que l’aiguille se mette en place au-dessus de la plaque abrasive rotative. L’aiguille à biseauter doit être placée sur la plaque abrasive rotative orientée de telle sorte que la rotation de la plaque s’éloigne de la pointe de l’aiguille (figure 3A)
9. En regardant de côté, utilisez le bouton de réglage grossier (Figure 2, a) pour abaisser l’aiguille vers la surface de la plaque abrasive. Arrêtez-vous lorsque l’aiguille touche presque la surface du liquide.
10. Utilisez le zoom pour réduire le grossissement du microscope, puis déplacez le microscope de manière à ce que l’aiguille soit au centre du champ de vision. Une fois au centre de la vue, augmentez le grossissement, en ajustant la position du manipulateur de manière à ce que la pointe de l’aiguille reste au centre de la vue. Une fois au grossissement maximal, arrêtez la plaque de meulage et focalisez le microscope sur la surface de la plaque abrasive, puis redémarrez immédiatement la rotation de la plaque une fois la surface nette. L’aiguille n’est peut-être pas en vue à ce stade.
11. À l’aide du bouton de réglage grossier du manipulateur, abaissez l’aiguille vers la plaque abrasive. Dans le champ de vision, une image de l’aiguille et une ou plusieurs ombres de l’aiguille seront visibles. Lorsque l’aiguille et la ou les ombres de l’aiguille sont sur le point de se toucher, passez au bouton de réglage fin du manipulateur et continuez à abaisser l’aiguille jusqu’à ce que l’aiguille et ses ombres semblent se toucher. À ce stade, lisez l’étrier (Figure 2, c) et notez la lecture. La surface de la plaque abrasive se trouve au niveau ou en dessous de cette lecture d’étrier.
    REMARQUE : Il est difficile de voir quand l’aiguille touche la surface de la plaque abrasive rotative, de sorte que l’aiguille peut ne pas toucher la plaque abrasive à ce stade.
12. Laissez l’aiguille rester à ce niveau de lecture de l’étrier pendant 5 à 10 s.
13. À l’aide du bouton de réglage fin du manipulateur, soulevez l’aiguille en vous assurant qu’elle reste sous la surface de l’agent mouillant. Arrêtez la rotation de la plaque abrasive pendant quelques secondes et observez si des bulles s’échappent de la pointe de l’aiguille. Si des bulles sont présentes, passez à l’étape 2.15. S’il n’y a pas de bulles, passez à l’étape 2.14.
14. Remettez l’aiguille sur la lecture de l’étrier à l’aide du bouton de réglage fin du manipulateur, puis déplacez-la un peu plus bas et prenez une nouvelle lecture de l’étrier, puis répétez les étapes 2.12-2.13.
15. Redémarrez la plaque abrasive pour voir si la formation de bulles est observable pendant la rotation de la plaque. Si des signes de formation de bulles sont visibles pendant la rotation de la plaque, l’ouverture de l’extrémité de l’aiguille est probablement trop grande pour les micro-injections d’embryons sensibles, telles que les injections d’embryons de moustiques. Si la formation de bulles n’est pas visible lors de la rotation de la plaque abrasive, l’ouverture de l’aiguille est idéale pour une utilisation dans les procédures nécessitant une aiguille d’ouverture tranchante et petite.
16. Utilisez le bouton de réglage de la trajectoire du manipulateur pour soulever l’aiguille au-dessus de la plaque abrasive jusqu’à une position suffisamment haute au-dessus de la plaque pour que l’aiguille ne heurte rien pendant que l’ensemble du manipulateur est tourné pour éloigner l’aiguille de la plaque abrasive et du microscope.
17. Une fois que l’aiguille est dans une position où elle peut être retirée sans rien heurter, abaissez la pression d’air à zéro, retirez l’aiguille et placez-la dans une boîte de rangement pour aiguilles (une boîte de Pétri avec du ruban adhésif double ou de la pâte à modeler pour maintenir les aiguilles biseautées) jusqu’à utilisation.

3. Détermination de la taille relative de l’ouverture de l’aiguille biseautée

REMARQUE : La détermination des tailles d’ouverture relatives de l’aiguille biseautée est effectuée à l’étape 2.13. Les étapes ci-dessous décrivent plus en détail ce processus.

1. Une fois que des bulles sont observées à l’étape 2.13, alors que la plaque abrasive ne tourne pas, diminuez lentement la pression de l’air en tournant le bouton de réglage du régulateur (figure 1, R) jusqu’à ce que les bulles cessent de s’écouler de la pointe de l’aiguille. Notez la pression à laquelle les bulles cessent de s’écouler de la pointe.
2. Augmentez la pression de l’air jusqu’à ce que des bulles s’écoulent à nouveau de la pointe de l’aiguille. Plus la pression est élevée, plus l’ouverture de l’aiguille est petite.
3. Déplacez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle puisse être retirée en toute sécurité, étapes 2.16 et 2.17.

Résultats

La procédure décrite ci-dessus produit des aiguilles de micro-injection toujours tranchantes. Les aiguilles pointues se caractérisent par leur capacité à s’insérer dans un chorion mou des embryons d’insectes, tels que des embryons de moustiques, avec peu ou pas de résistance de la membrane embryonnaire. Lorsque les embryons de moustiques sont micro-injectés pour la modification génétique, la membrane embryonnaire est relativement élastique. Si vous poussez une aiguille émoussée contre la membrane embryonnaire, vous la ferez s’indenter (figure 4B). Lorsque l’aiguille est tirée vers l’arrière, la membrane retrouve sa forme. Avec une pression suffisante, l’aiguille émoussée finira par déchirer la membrane et l’embryoplasme s’échappera probablement. Plus l’aiguille est pointue, moins il y a d’indentation car l’aiguille est pressée contre la membrane embryonnaire (Figure 4E). Au lieu de déchirer la membrane, une aiguille pointue glissera à travers la membrane, causant peu ou pas de dommages à l’embryon. Avec une aiguille idéale, il n’y aura presque pas d’indentation de la membrane embryonnaire lorsque l’aiguille se glissera dans l’embryon.

L’installation de transformation des insectes de l’Université du Maryland (UM-ITF) est une installation de service qui crée des insectes génétiquement modifiés pour des clients du milieu universitaire et de l’industrie. L’installation utilise des aiguilles biseautées pour la micro-injection d’embryons de moustiques. Au cours de la période allant de janvier 2023 à décembre 2023, l’UM-ITF a injecté 12 795 embryons d’Aedes dans 56 projets clients (tableau 1). L’utilisation d’aiguilles biseautées a permis à l’UM-ITF de maintenir une trappe post-injection moyenne de 31 % pour l’ensemble des projets (tableau 2). De plus, l’UM-ITF a été en mesure de maintenir un taux de réussite des injections de 96 %, tel que déterminé par le suivi post-projet auprès des clients (tableau 2). Le succès de l’injection est une mesure permettant de déterminer si les matériaux d’injection (guides CRISPR, protéine Cas9, plasmides de vecteurs transposons, etc.) injectés ont été administrés dans les embryons du projet de manière à ce que ces matériaux aient pu créer une modification génétique, en gros, y avait-il des preuves de la création de CRISPR Indel, de l’insertion du vecteur basé sur le transposon du client ou de l’insertion d’un vecteur de contrôle de la qualité de l’injection (le transposon se termine par un promoteur plus un marqueur). En d’autres termes, les injections étaient-elles assez bonnes pour produire une modification génétique, si les composants injectés fonctionnaient correctement. De nombreux facteurs contribuent au succès d’un projet de modification génétique, et des micro-injections de qualité avec des aiguilles pointues sont un facteur clé de succès. Le chanfreinage des aiguilles à l’aide de la procédure décrite dans le protocole ci-dessus permet à l’UM-ITF de produire des aiguilles de micro-injection pointues de qualité de manière constante, ce qui permet à l’UM-ITF de donner des injections toujours réussies.

Figure 1 : Schéma de principe des composants du système d’air et de la connexion au microcapillaire. L’air est acheminé vers l’aiguille capillaire à travers un système de tubes en uréthane à partir d’une alimentation en air (air domestique ou cylindre d’air). Les tubes en uréthane sont reliés au régulateur (R) et au manomètre par des raccords de tuyau (HC), qui se composent d’un raccord de tuyau et d’un collier de serrage. Le raccord du tuyau se visse dans un raccord femelle fileté 10-32 à la base du régulateur (R) et du manomètre. Un connecteur en T (T) est connecté au régulateur (R) pour déverser de l’air entre le manomètre et le porte-aiguille (NH). Le tube en uréthane est relié au porte-aiguille par un connecteur Luer (LC) qui est fourni avec le porte-aiguille (NH). Le raccordement à l’alimentation en air variera en fonction de l’alimentation en air utilisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Pièces du manipulateur et configuration de l’air. Pièces du manipulateur : a. bouton de réglage grossier, b. bouton de réglage fin, c. pied à coulisse, d. porte-aiguille WPI, e. jauge d’angle, f. pince de retenue et clip d’aile de vélo, g. adaptateur Luer et connecteur de tuyau Luer, et h. tube en uréthane. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Placement de l’aiguille par rapport à la rotation de la plaque abrasive. (A) Placement correct de l’aiguille pendant le biseautage. L’aiguille à biseauter doit être placée sur la plaque abrasive rotative orientée quelque part entre perpendiculaire à la rotation et alignée avec la rotation, où la rotation s’éloigne de la pointe de l’aiguille. (B) Mauvais placement de l’aiguille. La rotation de la plaque abrasive dans cette orientation fait en sorte que la surface de la plaque abrasive pousse sur la pointe de l’aiguille plutôt que sous et au-delà de la pointe. Dans cette orientation, le biseautage peut ne pas se produire en douceur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Comparaison de l’insertion de l’aiguille par des aiguilles non tranchantes et des aiguilles pointues. (A-C) Aiguille non tranchante et (D-F) Aiguille pointue. (A) et (D) ont été capturés avant que l’aiguille n’entre en contact avec l’embryon ; (B) et (E) se trouvent juste avant que l’aiguille ne perce la membrane embryonnaire, et (C) et (F) sont juste après le perçage de l’aiguille. La flèche blanche en (B) indique l’indentation de la membrane embryonnaire car une pression plus grande doit être appliquée pour qu’une aiguille non tranchante puisse percer. La flèche noire en (E) indique l’absence d’indentation due au piercing à l’aiguille effectué facilement grâce à une aiguille pointue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Projets Aedes de l’UM-ITF de janvier 2023 à décembre 2023. Liste des projets de micro-injection UM-ITF Aedes avec le nombre d’embryons injectés pour chaque projet, le nombre de larves qui ont éclos de ces embryons injectés et le pourcentage total de larves qui ont éclos par embryon injecté. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Résultats du projet Aedes de l’UM-ITF. L’UM-ITF est un établissement de services qui fournit des services de micro-injection pour la modification génétique des insectes. Le tableau répertorie le nombre de projets Aedes injectés par l’ITF de janvier 2023 à décembre 2023. Le nombre de clients qui ont répondu à des demandes de suivi de projet dans lesquelles la réponse indiquait le succès ou l’échec du projet d’injection. Le nombre de projets réussis, c’est-à-dire qu’il s’agit d’un projet dans lequel les matériaux d’injection ont été micro-injectés à un moment et à un endroit dans l’embryon en développement de sorte que les injections étaient capables de produire une modification génétique, et le nombre de projets qui ont été considérés comme non retenus en raison de l’absence de modification génétique. Le taux d’éclosion moyen des projets de micro-injection Aedes au cours de la période de janvier 2023 à décembre 2023. Le taux de réussite du projet et le taux de réponse du client. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

La modification génétique des moustiques repose sur une micro-injection précise des matériaux de modification (plasmides, ARN guides ou protéines) dans les embryons de pré-blastoderme 3,4,5,6,7,8. Les aiguilles pointues qui percent facilement l’embryon lors de l’injection ^2,4 sont cruciales pour ce processus. Une aiguille pointue est capable de glisser à travers la membrane, de délivrer les matériaux de modification et d’être retirée de l’embryon sans qu’aucune partie du plasma embryonnaire ne s’échappe au site d’injection après la micro-injection (observation personnelle).

Les aiguilles de micro-injection sont fermées lorsqu’elles sont tirées pour la première fois et doivent être ouvertes avant l’injection². Traditionnellement, les aiguilles pour la micro-injection ont été ouvertes en brossant doucement l’aiguille contre quelque chose comme le bord de la lamelle ou de la lame de verre qui maintient les embryons, contre l’embryon lui-même, ou un autre matériau². Cependant, ouvrir l’aiguille en la frôlant contre un objet donne un résultat incohérent (observation personnelle). Parfois, l’aiguille se brisera d’une manière qui la rendra tranchante, tandis que d’autres fois, l’aiguille deviendra très émoussée, ce qui, comme mentionné précédemment, peut endommager les embryons injectés, les empêcher d’être modifiés ou, au pire, tuer l’embryon. Alternativement, les aiguilles peuvent également être ouvertes en insérant l’aiguille dans un embryon. Ce processus peut ouvrir l’aiguille, la rendant prête pour l’injection. Cependant, il produit également des résultats aléatoires qui créent parfois une aiguille très pointue, mais obstruent le plus souvent l’aiguille avec du matériel embryonnaire avant qu’elle ne puisse être utilisée pour l’injection. Bien que le biseautage des aiguilles demande plus de temps et d’efforts, le processus produit des aiguilles pointues de manière plus constante.

La modification génétique des moustiques est également un processus dépendant du temps qui nécessite que les embryons soient micro-injectés avant que l’embryon en développement ne se cellularise^{4, 5, 6, 7, 8}. Lors de l’ouverture d’aiguilles en frottant l’aiguille contre quelque chose ou en insérant l’aiguille dans un embryon, le temps nécessaire pour ouvrir et trouver une aiguille pointue est pris lorsque les embryons sont déjà prêts pour l’injection et continuent à se développer. Dans le meilleur des cas, le processus d’ouverture d’une aiguille et de production d’une aiguille pointue ne prend qu’une minute ou deux, mais d’autres fois, cela peut prendre suffisamment de temps pour que les œufs mis en place pour ce cycle d’injection soient trop vieux au moment où une bonne aiguille est fabriquée. L’avantage du biseautage est qu’il est effectué à l’avance et que les aiguilles sont prêtes à l’emploi dès que les embryons sont prêts pour l’injection, ce qui garantit que les embryons sont au stade de développement parfait pour l’injection.

Bien que le protocole ci-dessus ait été développé pour et utilise le chanfreineur Sutter BV-10, le protocole peut être modifié pour être utilisé avec n’importe quel chanfrein. Le facteur principal est que la surface de biseautage doit être capable de contenir un petit volume de liquide sous lequel l’aiguille est biseautée.

Le biseautage des aiguilles de micro-injection tandis qu’une source d’air fournit de l’air comprimé à l’arrière de l’aiguille présente deux avantages. Tout d’abord, la pression de l’air aide à produire des aiguilles cohérentes. Des aiguilles constamment pointues sont produites lorsque le processus de chanfreinage est démarré à la même pression d’air fourni, et le chanfreinage est arrêté lorsque les bulles apparaissent pour la première fois. Il est essentiel que, pour observer la formation initiale de bulles, la plaque abrasive soit arrêtée momentanément afin que la rotation de la plaque abrasive ne masque pas la formation initiale de bulles. Si la présence de bulles n’est visible que lorsque la plaque abrasive est en mouvement, l’ouverture de l’aiguille est peut-être trop grande. Il est essentiel que la pression de l’air fourni soit la même à chaque fois que le biseautage est lancé, que le biseautage soit arrêté dès que des bulles commencent à s’échapper (visualisé lorsque la plaque n’est pas en mouvement), et que les bulles ne soient pas visibles lorsque la plaque est en mouvement. La taille de l’ouverture peut être mesurée relativement en diminuant la pression de l’air fourni jusqu’à ce que les bulles cessent de s’échapper de la pointe de l’aiguille. En notant la pression à laquelle les bulles cessent de s’écouler de la pointe, une taille d’ouverture relative peut être déduite. Plus la pression à laquelle les bulles cessent de couler est faible, plus l’ouverture de la pointe de l’aiguille est grande, et plus la pression est élevée, plus la taille de l’ouverture de la pointe est petite. Connaître la taille relative de l’ouverture peut être utile lors de l’utilisation d’un mélange d’injection qui est plus visqueux et, par conséquent, plus susceptible d’obstruer l’aiguille d’injection. L’utilisation de cette mesure de la taille relative de l’ouverture permet de créer des aiguilles qui peuvent fournir des mélanges d’injection à viscosité plus élevée. Bien sûr, il y a quelques compromis à faire lors de l’utilisation d’aiguilles avec des ouvertures plus grandes. Plus précisément, les embryons injectés peuvent être plus susceptibles de fuir après l’injection, et les taux de survie des embryons injectés peuvent être plus faibles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microcapillaires de 1,0 mm de diamètre extérieur	World Precision Instruments
socle biseautée	Sutter Instruments	008
Clip d’aile de vélo	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope ou équivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Plaque abrasive diamantée  ;	Sutter Instruments	104F	Plaque abrasive diamantée - extra fine (tailles de pointe 0,2 & ; micro ; à 1,0 & micro)
Joint, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Utilisé pour sceller la connexion sur les connecteurs en T ou en L, s’il n’est pas déjà inclus avec ces pièces
Collier	de serrage Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Connecteur de tuyau	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 raccords de tuyau
Porte-aiguille de micro-injection	World Precision Instruments	MPH3-10 Porte-aiguille	pour microcapillaires de 1mm de diamètre extérieur
P-2000	Sutter Instruments		Tout extracteur d’aiguille
Photo-Flo 200 Solution	B& H Photo, Vidéo et Audio	BH #KOPF200P  ; MFR #1464510	agent mouillant
Manomètre	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	Mèche de référence 0-100 psi
Mèche de référence	Sutter Instruments	X050300
Porte-mèche de référence	Sutter Instruments	M100019
Régulateur	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Besoin de ports #10-32 pour les connexions
Feuille d’emballage en caoutchouc 6 inx 6 in	Danco	Modèle # 59849
T raccord	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pqt
		filetée	Soit une tige filetée, soit une barre avec extrémité filetée. Les fils doivent être de 10 à 32.
Tube en uréthane	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	Référence : URH1-0804-BLT-050