Ce protocole décrit l’assemblage d’un système pneumatique pour l’administration d’air sous pression à une aiguille pendant le processus de biseautage de l’aiguille. Le protocole décrit en outre le processus de biseautage pour créer des aiguilles de micro-injection pointues et comment évaluer la taille relative de l’ouverture de l’aiguille.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Chanfreinage humide des aiguilles de micro-injection en utilisant une pression d’air constante pour un retour d’information sur l’ouverture de l’aiguille
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les aiguilles de micro-injection sont un outil essentiel dans l’administration de réactifs de modification du génome, de composants CRISPR (ARN guides, protéine Cas9 et matrice donneuse) et de composants du système de transposon (plasmides et ARNm transposase) dans les embryons d’insectes en développement. Les aiguilles de micro-injection tranchantes sont particulièrement importantes lors de l’administration de ces agents modificateurs, car elles aident à minimiser les dommages à l’embryon injecté, augmentant ainsi la survie de ces embryons par rapport à l’injection avec des aiguilles non biseautées. De plus, le biseautage des aiguilles produit des aiguilles qui sont plus uniformes d’une aiguille à l’autre que les aiguilles ouvertes en brisant au hasard la pointe de l’aiguille en frottant la pointe contre un objet (côté d’une lamelle, surface de l’embryon à injecter, etc.). Le processus de biseautage humide des aiguilles de micro-injection avec de l’air à pression constante délivré à l’aiguille permet à la personne qui biseaute l’aiguille de savoir quand l’aiguille est ouverte (présence de bulles) et donne également une indication relative de la taille de l’ouverture de l’aiguille qui a été créée. La taille relative de l’ouverture de l’aiguille peut être déterminée en ajustant la pression d’air délivrée à l’aiguille jusqu’à ce qu’un équilibre soit atteint et que les bulles cessent de s’écouler de la pointe de l’aiguille. Plus la pression à laquelle l’équilibre est atteint est basse, plus la taille de l’aiguille est grande ; Et inversement, plus la pression est élevée, plus la taille de l’aiguille est petite.
Introduction
La modification génétique des insectes est un processus développé à l’origine chez la drosophile par Rubin et Spradling, et au fil des ans, ce processus a été modifié pour créer des modifications génétiques chez d’autres espèces1. Le processus repose sur l’administration précise de composants de modification micro-injectés dans les embryons à une fenêtre de temps et à un endroit spécifiques au sein de l’embryonen développement 2,3,4. Les aiguilles de micro-injection pointues sont un outil essentiel dans le processus de modification génétique de certains insectes, tels que les moustiques 4,5,6,7,8,9 et les phlébotomes10, alors qu’ils ne sont pas aussi critiques pour d’autres insectes, tels que les vers à soie 11. Les aiguilles pointues sont souvent un facteur clé entre le succès et l’échec lorsqu’on essaie de créer un insecte génétiquement modifié 2,4. En règle générale, les aiguilles de verre microcapillaires sont tirées en chauffant le verre jusqu’au point où le verre devient élastique, ce qui permet au capillaire d’être tiré dans une aiguille à pointe fermée effilée. Avant de pouvoir utiliser l’aiguille, elle doit être ouverte de manière à créer une pointe pointue pour l’injection. Traditionnellement, les aiguilles sont ouvertes en brossant doucement la pointe de l’aiguille contre quelque chose (le bord d’une lame/lamelle, ou l’embryon, etc.) qui provoque la rupture d’une petite quantité de verre de la pointe, créant au hasard une pointe pointue 2,3. Un processus un peu moins aléatoire est le biseautage à sec, où l’aiguille est rapidement abaissée sur une plaque abrasive optiquement plate et tournante pendant une courte période de temps, provoquant l’abrasion d’une petite quantité de verre de la pointe de l’aiguille, créant ainsi une pointe pointue. Le biseautage à sec est un peu moins aléatoire que le brossage de la pointe de l’aiguille contre quelque chose. Le protocole décrit ci-dessous va encore plus loin dans le processus de biseautage en fournissant de l’air comprimé à l’aiguille biseautée et en la biseautant sous une couche liquide afin que les bulles soient visibles dès que l’aiguille a été ouverte. Ce protocole détaille une méthode permettant de produire des aiguilles de micro-injection tranchantes de manière fiable. Le biseautage sous une couche liquide est une amélioration par rapport à la casse aléatoire de l’aiguille comme décrit ci-dessus, et au biseautage à sec car l’utilisateur reçoit un retour sur le processus de biseautage, ce qui permet à la personne qui biseaute de savoir quand l’aiguille est ouverte et relativement quelle est la taille de l’ouverture de l’aiguille. Connaître la taille relative de l’ouverture de la pointe de l’aiguille peut permettre à la personne qui biseaute de créer des aiguilles avec différentes tailles d’ouverture. Différentes tailles d’ouverture d’aiguille présentent des avantages différents ; Par exemple, des ouvertures d’aiguille plus grandes peuvent accueillir des mélanges d’injection de viscosité élevée, tandis que des aiguilles plus petites causent moins de dommages à l’embryon injecté.
L’air est fourni à l’aiguille à l’aide d’un régulateur et d’un système de tube en uréthane basé sur un système d’injection régulé à pression d’air modifiée2. Alors que l’air est fourni à l’aiguille à une pression constante, l’aiguille est biseautée sous une couche de liquide. Le processus de biseautage est composé d’un processus répété en cinq étapes : 1) abaisser l’aiguille sur la surface abrasive, 2) laisser l’aiguille biseauter pendant une courte période de temps, 3) soulever l’aiguille pour l’éloigner de la plaque abrasive tout en la maintenant sous la surface de la couche liquide, 4) arrêter la rotation de la plaque abrasive pour vérifier l’apparition de bulles. S’il n’y a pas de bulles, les étapes 1 à 4 sont répétées jusqu’à ce que des bulles apparaissent. 5) Une fois que les bulles sont présentes, la pression de l’air peut être ajustée pour déterminer la taille relative de l’ouverture de l’aiguille. Plus la pression nécessaire pour arrêter la formation de bulles est faible, plus l’ouverture à la pointe de l’aiguille est grande.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
REMARQUE : Le protocole décrit ci-dessous utilise le microcapillaire Sutter BV-10 biseauté. Cependant, ce protocole peut être modifié pour être utilisé avec n’importe quel modèle de microcapillaire biseauté.
1. Assemblage du régulateur, du manomètre et du tube d’alimentation en air
- Coupez une section de tube en uréthane pour le raccordement de l’alimentation en air à la base du régulateur (R ; Section 1, Figure 1). La longueur de cette section dépendra de la distance entre l’alimentation en air et le régulateur, qui sera situé à côté du biseauteur.
- Faites glisser un collier de serrage sur le tube en uréthane, puis enfoncez un connecteur de tuyau dans l’extrémité du tube. Assurez-vous que le connecteur du tuyau est complètement inséré en plaçant le connecteur du tuyau contre une surface dure. Tout en tenant le tube près du connecteur du tuyau, appuyez fermement sur le tube dans le tuyau jusqu’à ce que le connecteur du tuyau soit complètement inséré. Ensemble, le collier de serrage et le connecteur de tuyau forment la connexion HC (Figure 1).
- Faites glisser le collier de serrage jusqu’à l’extrémité du tube où le connecteur du tuyau est inséré. Faites pivoter le collier de serrage sur l’extrémité cannelée insérée afin qu’il forme une connexion étanche à l’air.
- Vissez le connecteur du tuyau dans la base du régulateur (R) à la main, puis terminez de serrer le raccord avec une petite clé. Assurez-vous que la connexion est étanche à l’air mais pas trop.
- Dans l’orifice latéral du régulateur, vissez un connecteur en T (T) à la main, puis utilisez une petite clé pour terminer le serrage.
- Coupez un petit morceau de tube d’uréthane (figure 1, section 2) d’environ 3 à 5 cm de longueur. Placez deux colliers de serrage sur le morceau de tube, puis insérez un connecteur de tuyau à chaque extrémité du tube et terminez les connexions (HC) comme décrit aux étapes 1.2-1.4 pour chaque extrémité du tube.
- Vissez une extrémité du tube court dans la base du manomètre, puis terminez le serrage à l’aide d’une clé comme à l’étape 1.5.
- Vissez l’autre extrémité du tube court dans l’un des ports du connecteur en T (T) connecté au régulateur à l’étape 1.5.
- Coupez une section de tube en uréthane (Figure 1, Section 3) pour la connexion entre le régulateur et le porte-aiguille (NH). La taille de cette section dépendra de la distance entre le chanfreinet et l’emplacement du régulateur.
- Placez un collier de serrage sur la section du tube, puis insérez un connecteur de tuyau comme décrit aux étapes 1.2-1.4.
- De l’autre côté de cette section de tube, placez le connecteur Luer femelle (LC) fourni avec le porte-aiguille (NH).
- Retirez la pince de retenue et la rondelle en nylon (Figure 2, f) du manipulateur. La pince de retenue et la rondelle sont conçues pour contenir uniquement un microcapillaire en verre, elles ne sont pas conçues pour supporter le poids supplémentaire d’un support de microcapillaire, d’une tige filetée et d’un tube d’alimentation en air.
- Coupez un morceau rectangulaire de feuille d’emballage en caoutchouc de 1,5 cm x 2 cm pour envelopper la tige filetée dans la pince d’aile de vélo. Cela aidera à maintenir la tige filetée et le porte-aiguille plus solidement dans la pince d’aile du vélo. À l’aide de deux pinces à bec effilé, ouvrez le clip d’aile du vélo, pliez le morceau rectangulaire de feuille d’emballage en caoutchouc sur la tige filetée à 3,5 cm d’une extrémité de la tige de sorte qu’il forme un U sur la tige. Insérez la tige filetée recouverte d’une feuille de caoutchouc dans la pince d’aile de vélo ouverte et utilisez la pince pour fermer la pince autour de la tige et de la feuille de caoutchouc. Installez la pince de vélo et la tige filetée sur le boulon du manipulateur, remplacez la pince de retenue sans la rondelle en nylon et serrez la pince de retenue jusqu’à ce qu’elle maintienne solidement l’ensemble de tige filetée.
- Enfilez le porte-aiguille sur la tige filetée. Assurez-vous que le connecteur Luer se termine dans une position qui ne coincera pas le tube en uréthane lorsqu’il est connecté (Figure 2, g).
- Connectez le connecteur Luer femelle au connecteur Luer mâle (Figure 2, g) du porte-aiguille (Figure 2, d).
- Connectez l’extrémité libre du tube de la Figure 1, section 1 à l’alimentation en air (cette connexion variera en fonction de l’alimentation en air utilisée). L’alimentation en air doit être propre, sèche et exempte de résidus d’huile. L’alimentation en air peut provenir d’une source d’air domestique ou d’une bouteille de gaz, soit de l’air comprimé ou de l’azote.
2. Chanfreinage des aiguilles en borosilicate
- Tirez les aiguilles de micro-injection à l’aide de micro-capillaires en verre borosilicate avec les réglages suivants sur l’instrument : Chaleur : 305, Fil : 4, Vel : 70, Del : 235, Pul : 160, avec temps de boucle de 12,24.
- Assemblez l’ensemble de meulage selon les instructions du fabricant, composé de la plaque abrasive et de la bague de retenue avec aimants12.
REMARQUE : Il peut être nécessaire d’envelopper la plaque abrasive d’une fine bande de film transparent pour éviter une fuite prématurée de Photo-Flo (agent mouillant) de la plaque abrasive. Cela n’est nécessaire que si la solution d’agent mouillant s’écoule prématurément dans l’huile du piédestal, provoquant l’arrêt de la rotation de la plaque de broyage. L’agent mouillant réduit le risque de marques de séchage sur les aiguilles de verre après le biseautage. L’utilisation d’un agent mouillant n’est pas critique pour le processus de chanfreinage, et l’eau peut être substituée. - Placez 10 gouttes d’huile sur la surface optiquement plane du socle et placez l’ensemble de broyage sur le dessus. Démarrez l’ensemble de meulage.
- Allumez la source lumineuse pour éclairer la surface. Assurez-vous que la source lumineuse est positionnée derrière le biseauté et qu’elle brille à un angle de 45° par rapport à la plaque abrasive et à l’aiguille. L’angle d’éclairage est nécessaire pour qu’une ombre de l’aiguille soit facilement vue. À un grossissement de 90x, tournez la tête du microscope en place. Arrêtez brièvement la rotation de la plaque abrasive et concentrez le microscope sur la surface de la plaque abrasive.
- Ajoutez 1 % d’agent mouillant à la mèche jusqu’à ce que la mèche soit complètement mouillée. Ajoutez 1 % d’agent mouillant à la surface de la plaque abrasive. Assurez-vous que l’agent mouillant recouvre la surface abrasive mais ne fuit pas sur la bague de retenue noire.
- Placez la mèche pré-humide sur la surface de la plaque abrasive pendant qu’elle tourne. Assurez-vous que la mèche se trouve sur le côté gauche de la plaque abrasive (lorsque vous regardez vers le bas depuis le haut) et qu’elle s’étend de 11 heures à 6 heures (avec la plaque comme cadran d’horloge). Assurez-vous que la mèche ne repose pas sur la partie noire de l’anneau de retenue.
- Insérez une aiguille dans le porte-aiguille (Figure 2, d) et serrez la bague de retenue pour maintenir l’aiguille en place. Ouvrez le régulateur (Figure 1, R) et augmentez la pression à 24 psi.
- Soulevez le porte-aiguille en tournant le bouton de réglage de la trajectoire (Figure 2, a) Assurez-vous que l’aiguille est suffisamment haute pour être plus haute que la surface de la plaque abrasive rotative, puis faites pivoter l’ensemble du manipulateur de sorte que l’aiguille se mette en place au-dessus de la plaque abrasive rotative. L’aiguille à biseauter doit être placée sur la plaque abrasive rotative orientée de telle sorte que la rotation de la plaque s’éloigne de la pointe de l’aiguille (figure 3A)
- En regardant de côté, utilisez le bouton de réglage grossier (Figure 2, a) pour abaisser l’aiguille vers la surface de la plaque abrasive. Arrêtez-vous lorsque l’aiguille touche presque la surface du liquide.
- Utilisez le zoom pour réduire le grossissement du microscope, puis déplacez le microscope de manière à ce que l’aiguille soit au centre du champ de vision. Une fois au centre de la vue, augmentez le grossissement, en ajustant la position du manipulateur de manière à ce que la pointe de l’aiguille reste au centre de la vue. Une fois au grossissement maximal, arrêtez la plaque de meulage et focalisez le microscope sur la surface de la plaque abrasive, puis redémarrez immédiatement la rotation de la plaque une fois la surface nette. L’aiguille n’est peut-être pas en vue à ce stade.
- À l’aide du bouton de réglage grossier du manipulateur, abaissez l’aiguille vers la plaque abrasive. Dans le champ de vision, une image de l’aiguille et une ou plusieurs ombres de l’aiguille seront visibles. Lorsque l’aiguille et la ou les ombres de l’aiguille sont sur le point de se toucher, passez au bouton de réglage fin du manipulateur et continuez à abaisser l’aiguille jusqu’à ce que l’aiguille et ses ombres semblent se toucher. À ce stade, lisez l’étrier (Figure 2, c) et notez la lecture. La surface de la plaque abrasive se trouve au niveau ou en dessous de cette lecture d’étrier.
REMARQUE : Il est difficile de voir quand l’aiguille touche la surface de la plaque abrasive rotative, de sorte que l’aiguille peut ne pas toucher la plaque abrasive à ce stade. - Laissez l’aiguille rester à ce niveau de lecture de l’étrier pendant 5 à 10 s.
- À l’aide du bouton de réglage fin du manipulateur, soulevez l’aiguille en vous assurant qu’elle reste sous la surface de l’agent mouillant. Arrêtez la rotation de la plaque abrasive pendant quelques secondes et observez si des bulles s’échappent de la pointe de l’aiguille. Si des bulles sont présentes, passez à l’étape 2.15. S’il n’y a pas de bulles, passez à l’étape 2.14.
- Remettez l’aiguille sur la lecture de l’étrier à l’aide du bouton de réglage fin du manipulateur, puis déplacez-la un peu plus bas et prenez une nouvelle lecture de l’étrier, puis répétez les étapes 2.12-2.13.
- Redémarrez la plaque abrasive pour voir si la formation de bulles est observable pendant la rotation de la plaque. Si des signes de formation de bulles sont visibles pendant la rotation de la plaque, l’ouverture de l’extrémité de l’aiguille est probablement trop grande pour les micro-injections d’embryons sensibles, telles que les injections d’embryons de moustiques. Si la formation de bulles n’est pas visible lors de la rotation de la plaque abrasive, l’ouverture de l’aiguille est idéale pour une utilisation dans les procédures nécessitant une aiguille d’ouverture tranchante et petite.
- Utilisez le bouton de réglage de la trajectoire du manipulateur pour soulever l’aiguille au-dessus de la plaque abrasive jusqu’à une position suffisamment haute au-dessus de la plaque pour que l’aiguille ne heurte rien pendant que l’ensemble du manipulateur est tourné pour éloigner l’aiguille de la plaque abrasive et du microscope.
- Une fois que l’aiguille est dans une position où elle peut être retirée sans rien heurter, abaissez la pression d’air à zéro, retirez l’aiguille et placez-la dans une boîte de rangement pour aiguilles (une boîte de Pétri avec du ruban adhésif double ou de la pâte à modeler pour maintenir les aiguilles biseautées) jusqu’à utilisation.
3. Détermination de la taille relative de l’ouverture de l’aiguille biseautée
REMARQUE : La détermination des tailles d’ouverture relatives de l’aiguille biseautée est effectuée à l’étape 2.13. Les étapes ci-dessous décrivent plus en détail ce processus.
- Une fois que des bulles sont observées à l’étape 2.13, alors que la plaque abrasive ne tourne pas, diminuez lentement la pression de l’air en tournant le bouton de réglage du régulateur (figure 1, R) jusqu’à ce que les bulles cessent de s’écouler de la pointe de l’aiguille. Notez la pression à laquelle les bulles cessent de s’écouler de la pointe.
- Augmentez la pression de l’air jusqu’à ce que des bulles s’écoulent à nouveau de la pointe de l’aiguille. Plus la pression est élevée, plus l’ouverture de l’aiguille est petite.
- Déplacez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle puisse être retirée en toute sécurité, étapes 2.16 et 2.17.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
La procédure décrite ci-dessus produit des aiguilles de micro-injection toujours tranchantes. Les aiguilles pointues se caractérisent par leur capacité à s’insérer dans un chorion mou des embryons d’insectes, tels que des embryons de moustiques, avec peu ou pas de résistance de la membrane embryonnaire. Lorsque les embryons de moustiques sont micro-injectés pour la modification génétique, la membrane embryonnaire est relativement élastique. Si vous poussez une aiguille émoussée contre la membrane embryonnaire, vous la fe...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
La modification génétique des moustiques repose sur une micro-injection précise des matériaux de modification (plasmides, ARN guides ou protéines) dans les embryons de pré-blastoderme 3,4,5,6,7,8. Les aiguilles pointues qui percent facilement l’embryon lors de l’injection
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
L’auteur n’a rien à divulguer.
Remerciements
L’auteur tient à remercier les personnes suivantes. Le personnel de l’installation de transformation des insectes de l’Université du Maryland : Channa Aluvihare, Robert Alford et Daniel Gay. Sans leur travail dévoué, l’installation de transformation des insectes n’existerait pas. Vanessa Meldener-Harrell pour la relecture de ce manuscrit.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Microcapillaires de 1,0 mm de diamètre extérieur | World Precision Instruments | ||
| socle biseautée | Sutter Instruments | 008 | |
| Clip d’aile de vélo | VeloOrange | R-clip 4-pack | https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack |
| Boom Stand Microscope | AmScope | AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope ou équivalent | |
| BV-10 Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| Plaque abrasive diamantée ; | Sutter Instruments | 104F | Plaque abrasive diamantée - extra fine (tailles de pointe 0,2 & ; micro ; à 1,0 & micro) |
| Joint, Buna-N | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 11761-2-pkg | Utilisé pour sceller la connexion sur les connecteurs en T ou en L, s’il n’est pas déjà inclus avec ces pièces |
| Collier | de serrage Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 5000-2-pkg | |
| Connecteur de tuyau | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | CT4-pkg | Need 5 raccords de tuyau |
| Porte-aiguille de micro-injection | World Precision Instruments | MPH3-10 Porte-aiguille | pour microcapillaires de 1mm de diamètre extérieur |
| P-2000 | Sutter Instruments | Tout extracteur d’aiguille | |
| Photo-Flo 200 Solution | B& H Photo, Vidéo et Audio | BH #KOPF200P ; MFR #1464510 | agent mouillant |
| Manomètre | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | PG-100 | Mèche de référence 0-100 psi |
| Mèche de référence | Sutter Instruments | X050300 | |
| Porte-mèche de référence | Sutter Instruments | M100019 | |
| Régulateur | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 01-Mar | Besoin de ports #10-32 pour les connexions |
| Feuille d’emballage en caoutchouc 6 inx 6 in | Danco | Modèle # 59849 | |
| T raccord | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 15002-2-pqt | |
| filetée | Soit une tige filetée, soit une barre avec extrémité filetée. Les fils doivent être de 10 à 32. | ||
| Tube en uréthane | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | Référence : URH1-0804-BLT-050 |
Références
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable Element Vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
- O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W. Transformation systems in insects. Methods Mol Biol. 260, 227-254 (2004).
- Handler, A. M., James, A. A. Insect Transgenesis: Methods and Applications. , CRC Press. Boca Rato. (2000).
- Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection. Cold Spring Harbor Protocols. , 10.1101/pdb.prot107686 (2023).
- Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex Quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38 (5), 701-710 (2001).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol Biol. 10 (6), 597-604 (2001).
- Adelman, Z. N., Jasinskiene, N., James, A. A. Development and applications of transgenesis in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Mol Biochem Parasitol. 121 (1), 1-10 (2002).
- Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient. Insect Mol Biol. 11 (4), 291-297 (2002).
- Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution. Cold Spring Harb Protoc. , 10.1101/pdb.prot108203 (2023).
- Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 mutagenesis in Phlebotomus papatasi: The immune deficiency pathway impacts vector competence for Leishmania major. mBio. 10 (4), e01941(2019).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18 (1), 81-84 (2000).
- BV-10 Micropipette Beveler Operation Manual Rev. 3.00. , Available from: https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html (2018).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
