Isolement des mitochondries pour l’analyse des supercomplexes mitochondriaux à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires

Summary

Ce protocole décrit une technique d’analyse des supercomplexes respiratoires lorsque seules de petites quantités d’échantillons sont disponibles.

Abstract

Au cours des dernières décennies, les preuves accumulées de l’existence de supercomplexes respiratoires (SC) ont changé notre compréhension de l’organisation de la chaîne de transport d’électrons mitochondriaux, donnant lieu à la proposition du « modèle de plasticité ». Ce modèle postule la coexistence de différentes proportions de SC et de complexes en fonction du tissu ou de l’état métabolique cellulaire. La nature dynamique de l’assemblage dans les SC permettrait aux cellules d’optimiser l’utilisation des combustibles disponibles et l’efficacité du transfert d’électrons, minimisant la génération d’espèces réactives de l’oxygène et favorisant la capacité des cellules à s’adapter aux changements environnementaux.

Plus récemment, des anomalies dans l’assemblage des cellules souches embryonnaires ont été rapportées dans différentes maladies telles que les troubles neurodégénératifs (maladie d’Alzheimer et de Parkinson), le syndrome de Barth, le syndrome de Leigh ou le cancer. Le rôle des altérations de l’assemblage des SC dans la progression de la maladie doit encore être confirmé. Néanmoins, la disponibilité d’un nombre suffisant d’échantillons pour déterminer l’état de l’assemblage du SC est souvent un défi. C’est le cas lors de biopsies ou d’échantillons de tissus qui sont petits ou qui doivent être divisés pour plusieurs analyses, avec des cultures cellulaires à croissance lente ou provenant de dispositifs microfluidiques, avec des cultures primaires ou des cellules rares, ou lorsque l’effet de traitements particuliers coûteux doit être analysé (avec des nanoparticules, des composés très coûteux, etc.). Dans ces cas, une méthode efficace et facile à appliquer est nécessaire. Cet article présente une méthode adaptée pour obtenir des fractions mitochondriales enrichies à partir de petites quantités de cellules ou de tissus afin d’analyser la structure et la fonction des CS mitochondriaux par électrophorèse native suivie de dosages d’activité en gel ou de western blot.

Introduction

Les supercomplexes (SC) sont des associations supramoléculaires^{entre les complexes 1,2} de la chaîne respiratoire individuelle. Depuis l’identification initiale des SC et la description de leur composition par le groupe de Schägger ^2,3, confirmée plus tard par d’autres groupes, il a été établi qu’ils contiennent des complexes respiratoires I, III et IV (CI, CII et CIV, respectivement) dans différentes stœchiométries. Deux populations principales de CS peuvent être définies, celles contenant des CI (et soit CIII seul, soit CIII et CIV) et de très haut poids moléculaire (MW, à partir de ~1,5 MDa pour les SC plus petits : CI + CIII₂) et celles contenant CIII et CIV mais pas CI, de taille beaucoup plus petite (comme CIII₂ + CIV avec ~680 kDa). Ces SC coexistent dans la membrane mitochondriale interne avec des complexes libres, également dans des proportions différentes. Ainsi, alors que l’IC se trouve principalement sous ses formes associées (c’est-à-dire dans les SC : ~80% dans le cœur bovin et plus de 90% dans de nombreux types de cellules humaines)³, le CIV est très abondant sous sa forme libre (plus de 80% dans le cœur bovin), l’ICII montrant une distribution plus équilibrée (~40% dans sa forme libre plus abondante, comme dimère, dans le cœur de bovin).

Bien que leur existence soit maintenant généralement acceptée, leur rôle précis est encore en débat 4,5,6,7,8,9,10. Selon le modèle de plasticité, différentes proportions de SC et de complexes individuels peuvent exister en fonction du type de cellule ou de l’état métabolique ^1,7,11. Cette nature dynamique de l’assemblage permettrait aux cellules de réguler l’utilisation des combustibles disponibles et l’efficacité du système de phosphorylation oxydative (OXPHOS) en réponse aux changements environnementaux ^4,5,7. Les CS pourraient également contribuer à contrôler le taux de génération d’espèces réactives de l’oxygène et participer à la stabilisation et au renouvellement des complexes individuels 4,12,13,14. Des modifications de l’état d’assemblage des CS ont été décrites en association avec différentes situations physiologiques et pathologiques^15,16 et avec le processus de vieillissement¹⁷.

Ainsi, des changements dans les motifs SC ont été décrits chez la levure en fonction de la source de carbone utilisée pour la croissance² et dans les cellules de mammifères en culture lorsque le glucose est substitué par le galactose⁴. Des modifications ont également été signalées dans le foie de souris après le jeûne⁸ et dans les astrocytes lorsque l’oxydation des acides gras mitochondriaux est bloquée¹⁸. De plus, une diminution ou des altérations des SC et de l’OXPHOS ont été observées dans le syndrome de Barth¹⁹, l’insuffisance cardiaque²⁰, plusieurs troubles métaboliques²¹ et neurologiques 22,23,24, et différentes tumeurs 25,26,27,28. La question de savoir si ces altérations de l’assemblage et des niveaux de SC sont une cause primaire ou représentent des effets secondaires dans ces situations pathologiques est encore à l’étude^15,16. Différentes méthodologies peuvent fournir des informations sur l’assemblage et la fonction des SC ; Il s’agit notamment des mesures d’activité ^8,29, de l’analyse ultrastructurale^30,31 et de la protéomique^32,33. Une alternative utile qui est de plus en plus utilisée et qui constitue le point de départ de certaines des méthodologies mentionnées précédemment est la détermination directe de l’état d’assemblage des SC par électrophorèse native bleue (BN), développée à cet effet par le groupe^de Schägger ^34,35.

Cette approche nécessite des procédures reproductibles et efficaces pour obtenir et solubiliser les membranes mitochondriales et peut être complétée par d’autres techniques telles que l’analyse de l’activité dans le gel (IGA), l’électrophorèse de seconde dimension et le western blot (WB). Une limite dans les études sur la dynamique des CS par électrophorèse BN peut être la quantité de cellules de départ ou d’échantillons de tissus. Nous présentons une série de protocoles pour l’analyse de l’assemblage et de la fonction des CS, adaptés des méthodes de groupe de Schägger, qui peuvent être appliqués à des échantillons de cellules ou de tissus frais ou congelés à partir de 20 mg de tissu.

Protocol

REMARQUE : La composition de tous les milieux de culture et tampons est précisée au tableau 1 et les détails relatifs à tous les matériaux et réactifs utilisés dans le présent protocole sont énumérés dans le tableau des matériaux.

1. Isolement des mitochondries à partir de cultures cellulaires

REMARQUE : Le volume minimum de cellules analysées a été de ~30-50 μL de cellules emballées (étape 1.4). Cela peut correspondre approximativement à au moins deux ou trois plaques de culture cellulaire de 100 mm ou à une plaque de 150 mm à 80-90% de la confluence, selon le type de cellule (entre 5 × 10⁶ et 10⁷ cellules dans les cellules dérivées de L929 ou MDA-MB-468). La rupture efficace des cellules est une étape critique.

1. Cultivez des cellules adhérentes jusqu’à une confluence d’environ 80 % ou des cellules suspendues jusqu’à une densité adéquate.
2. Récolter les cellules par centrifugation à 500 × g pendant 5 min (directement à partir de la suspension cellulaire dans le cas de cellules non adhérentes ou après trypsinisation standard avec une solution trypsine-EDTA de 0,05 % de trypsine et de 0,02 % d’EDTA dans 1x PBS, dans le cas de cellules adhérentes).
3. Laver les cellules 2x avec du PBS froid 1x et les sédimenter par centrifugation à 500 × g pendant 5 min.
   REMARQUE : À partir de ce point, toutes les étapes doivent être effectuées à 4 °C. Par conséquent, tous les réactifs doivent être froids et les tubes contenant des cellules ou des mitochondries doivent être conservés sur de la glace.
4. Après la deuxième centrifugation, jetez le surnageant, estimez le volume des pastilles cellulaires (cpv) et congelez les cellules à -80 °C pendant au moins 15 minutes pour faciliter la rupture de la membrane à l’étape 1.8.
   REMARQUE : Le protocole peut être arrêté à ce stade et les cellules peuvent être stockées à -80 °C pendant des semaines. Habituellement, des tubes gradués de 10 ou 15 mL à fond conique sont appropriés.
5. Laissez les cellules décongeler lentement sur de la glace.
6. Remettre en suspension la pastille de cellules garnies dans un volume de tampon hypotonique égal à 7 fois le cpv (10 mM MOPS, 83 mM de saccharose, pH 7,2) (par exemple, 100 μL de cellules compressées dans 700 μL de tampon).
   REMARQUE : Le volume doit être suffisant pour obtenir des pops efficaces (voir REMARQUE à l’étape 1.8).
7. Transférez la suspension cellulaire dans un homogénéisateur Potter-Dounce de la taille appropriée et laissez gonfler les cellules en les incubant dans de la glace pendant 2 min. Par exemple, pour un volume de 700 à 800 μL de suspension cellulaire, un homogénéisateur d’une capacité de 1 mL est adéquat.
8. Brisez les membranes cellulaires en effectuant huit à dix passages dans l’homogénéisateur couplé à un pilon en téflon motorisé tournant à 600 tr/min.
   REMARQUE : Lors de la réalisation des coups, il est important de créer un vide qui augmentera l’efficacité de la rupture cellulaire ainsi que les actions hypotoniques et de congélation pour le gonflement et la fragilité des membranes, respectivement. S’il est bien fait, un son « pop » se fera entendre lors de l’abaissement de l’homogénéisateur avec un mouvement rapide à chaque coup.
9. Ajoutez le même volume de tampon hypertonique à la suspension cellulaire (7x le cpv) (30 mM MOPS, 250 mM de saccharose, pH 7,2) pour générer un environnement isotonique.
10. Transvaser l’homogénat dans un tube de 10 à 15 mL et centrifuger dans un rotor fixe à 1 000 × g pendant 5 min à 4 °C.
    REMARQUE : Le tube d’origine contenant les cellules intactes peut être utilisé à cette fin.
11. Transvasez le surnageant, qui contient la fraction mitochondriale, dans des tubes de polypropylène de 1,5 ml.
12. FACULTATIF : Pour augmenter le rendement des mitochondries, remettre la pastille en suspension à partir de l’étape 1.10 en 7 fois le volume cellulaire de la pastille du tampon A (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M de saccharose, pH 7,4) en pipetant de haut en bas et centrifuger à 1 000 × g pendant 5 min à 4 °C. Combinez le nouveau surnageant avec le précédent avant de passer à l’étape 1.13.
13. Centrifuger dans un microfuge à 16 000 × g pendant 2 min à 4 °C pour recueillir la fraction brute mitochondriale.
14. Jeter le surnageant et remettre en suspension chaque pastille enrichie en mitochondries avec 0,5 mL de tampon A, en combinant le contenu de deux tubes en un seul, et centrifuger dans les mêmes conditions que celles décrites à l’étape 1.13. Répétez le même processus jusqu’à ce que tout le matériau se trouve dans un seul tube.
15. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille finale avec 300 μL de tampon A et quantifier la concentration en protéines mitochondriales à l’aide du test de Bradford. Centrifugez à nouveau comme précédemment et passez à la section 3.

2. Isolement des mitochondries à partir de petites quantités de tissus animaux

REMARQUE : La quantité minimale de tissu pour appliquer ce protocole avec une certaine confiance dépend du type de cellule et de son abondance mitochondriale, mais pourrait être de ~20-30 mg de tissu dans la plupart des cas. Les échantillons de tissus peuvent être des matériaux frais ou des échantillons congelés. Dans ce dernier cas, laisser décongeler les échantillons dans un tampon d’homogénéisation placé sur de la glace avant de commencer la procédure.

1. Pesez ou estimez le plus fidèlement possible la quantité (mg) de tissu.
2. Coupez le tissu avec une paire de ciseaux et faites 3-4 lavages dans un tampon d’homogénéisation à l’aide d’une passoire en prenant soin de ne pas perdre les petits morceaux.
   REMARQUE : Cette étape est plus importante dans les tissus comme le muscle squelettique ou le cœur que dans le cerveau ou les tissus plus mous dont les cellules peuvent être facilement désagrégées directement par l’étape d’homogénéisation.
3. Ajouter un milieu d’homogénéisation frais (4 mL par gramme de foie, 10 mL par gramme de cœur, de tissu adipeux brun (MTD) ou de muscle, et 5 mL par gramme de cerveau ou de rein ; voir la composition spécifique du tampon pour chaque cas dans le tableau 1).
4. Transférez les morceaux de tissu avec tampon dans l’homogénéisateur et suivez le protocole optimal d’homogénéisation et d’isolement des mitochondries en fonction du tissu sélectionné.
5. Isolement des mitochondries du foie, de la rate et des reins
   1. Homogénéisez avec quatre à six coups de haut en bas dans l’Elvehjem-Potter avec un pilon en téflon motorisé à 600 tr/min.
   2. Transférez le tissu homogénéisé dans un tube à centrifuger stérile. Centrifugeuse dans un rotor oscillant à 1 000 × g pendant 5 min à 4 °C.
   3. Remplissez des tubes en polypropylène de 1,5 mL avec le surnageant obtenu à l’étape précédente. Centrifuger pendant 2 min à 16 000 × g dans un microfuge à 4 °C et procéder ci-dessous comme décrit précédemment (étapes 1.13 à 1.15)
6. Isolement des mitochondries à partir d’échantillons cardiaques et musculaires
   1. Homogénéiser en six à huit coups dans l’Elvehjem-Potter avec un pilon en téflon motorisé à 600 tr/min. Transférez le tissu homogénéisé dans un tube à centrifuger stérile.
   2. Centrifugeuse dans un rotor oscillant à 1 000 × g pendant 5 min à 4 °C. Versez le surnageant dans des tubes en polypropylène propres de 1,5 ml.
      REMARQUE : Une deuxième homogénéisation de la pastille obtenue à l’étape 2.6.2 peut être effectuée avec 4-5 coups supplémentaires et 1/2 volume de tampon d’homogénéisation pour augmenter le rendement mitochondrial. Le nouveau surnageant (après centrifugation à nouveau à 1 000 × g pendant 5 min à 4 °C) peut être combiné avec le précédent avant de passer à l’étape 2.6.3. Une alternative pour augmenter le rendement brut en mitochondries consiste à dissocier les échantillons de tissus cardiaques et musculaires dans une solution de trypsine avant homogénéisation^36,37. Dans ce cas, la trypsine doit être efficacement inactivée/éliminée avant que les membranes mitochondriales ne soient solubilisées avec la digitonine (étape 3.2).
   3. Centrifuger à 16 000 × g dans un microfuge pendant 2 min à 4 °C pour obtenir la fraction mitochondriale brute.
   4. Jeter le surnageant et remettre en suspension chaque pastille enrichie en mitochondries avec 0,5 mL de tampon AT, en combinant le contenu de deux tubes en un seul et centrifuger dans les mêmes conditions que celles décrites à l’étape 2.6.3. Répétez le même processus jusqu’à ce que tout le matériau se trouve dans un seul tube.
   5. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille finale avec 300 μL de tampon A (sans BSA) et quantifier la concentration en protéines mitochondriales à l’aide du test de Bradford. Centrifugez à nouveau comme précédemment et passez à la section 3.
7. Isolement des mitochondries du cerveau
   1. Homogénéisez les morceaux du cerveau en 10 à 15 coups à l’aide d’un homogénéisateur en verre de type Dounce avec un pilon en verre à entraînement manuel. Transférez le tissu homogénéisé dans un tube à centrifuger stérile.
   2. Centrifugeuse dans un rotor oscillant à 1 000 × g pendant 5 min à 4 °C.
   3. Recueillir le surnageant dans un tube à centrifuger propre.
   4. Remettre en suspension la pastille obtenue lors de l’étape de centrifugation précédente dans le même volume de milieu AT utilisé lors de la première homogénéisation. Réhomogénéiser la pastille en répétant le processus décrit à l’étape 2.7.1 en utilisant 5 à 10 passes et centrifuger la suspension dans un rotor oscillant à 1 000 × g pendant 5 min à 4 °C.
   5. Retirez le surnageant et ajoutez-le dans le tube préparé à l’étape 2.7.3. Centrifuger à 10 000 × g dans un rotor à angle fixe pendant 10 min à 4 °C pour obtenir la fraction mitochondriale brute.
   6. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans la moitié du volume initial d’homogénéisation (étape 2.7.1) du milieu AT. Répartissez la suspension mitochondriale dans des tubes en polypropylène propres de 1,5 ml et centrifugez à 16 000 × g dans un microfuge pendant 2 min à 4 °C.
   7. Jeter le surnageant et remettre en suspension chaque pastille enrichie en mitochondries avec 0,5 mL de tampon AT, en combinant le contenu de deux tubes en un seul et centrifuger dans les mêmes conditions que celles décrites à l’étape 2.7.6. Répétez le même processus jusqu’à ce que tout le matériau se trouve dans un seul tube.
   8. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille finale avec 300 μL de tampon A (sans BSA) et quantifier la concentration en protéines mitochondriales à l’aide du test de Bradford. Centrifugez à nouveau comme précédemment et passez à la section 3.
8. Isolement des mitochondries à partir des MTD
   1. Homogénéisez avec huit à dix coups de haut en bas dans l’Elvehjem-Potter avec un pilon en téflon motorisé à 600 tr/min. Transférez le tissu homogénéisé dans un tube à centrifuger stérile.
   2. Centrifugeuse dans un rotor oscillant à 1 000 × g pendant 5 min à 4 °C.
   3. Remplissez des tubes de polypropylène de 1,5 mL avec le surnageant obtenu à l’étape précédente en évitant la couche de graisse supérieure.
      REMARQUE : Une deuxième homogénéisation de la pastille obtenue à l’étape 2.8.2 peut être effectuée pour augmenter le rendement mitochondrial. Le nouveau surnageant (après centrifugation à 1 000 × g pendant 5 min à 4 °C) peut être combiné avec le précédent avant de passer à l’étape 2.8.4.
   4. Centrifugeuse pendant 2 min à 16 000 × g pendant 2 min dans une microfuge à 4 °C.
   5. Jeter le surnageant et remettre en suspension chaque pastille enrichie en mitochondries avec 0,5 mL de tampon AT2 en combinant le contenu de deux tubes en un seul et centrifuger dans les mêmes conditions que celles décrites à l’étape 2.8.4. Répétez le même processus jusqu’à ce que tout le matériau se trouve dans un seul tube.
   6. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille finale avec 300 μL de tampon A (sans BSA) et quantifier la concentration en protéines mitochondriales à l’aide du test de Bradford. Centrifugez à nouveau comme précédemment et passez à la section 3.

3. Préparation des échantillons pour l’analyse de Blue Native

1. Remettre en suspension les fractions mitochondriales (obtenues à partir de cultures ou de tissus de cellules de mammifères) dans un tampon d’échantillon BN (50 mM de NaCl, 50 mM d’imidazole, 5 mM d’acide aminocaproïque, 4 mM de PMSF) pour obtenir une concentration protéique d’environ 10 mg/mL. Voir le tableau 2 pour les rendements attendus pour les différents types d’échantillons.
2. Solubiliser les membranes mitochondriales en ajoutant de la digitonine (solution mère à 10 %) pour obtenir un rapport de 4 g de digitonine/g de protéine mitochondriale (4 μL de stock de digitonine à 10 % pour 10 μL de la suspension mitochondriale préparée à l’étape 3.1).
   REMARQUE : Le rapport détergent/protéines (g/g) doit être optimisé pour chaque type d’échantillon afin d’obtenir des résultats reproductibles ; 2 à 8 g de digitonine / g de protéine mitochondriale se sont avérés optimaux pour la plupart des tissus^34,35.
3. Mélangez en pipetant doucement de haut en bas. Incuber les échantillons sur glace pendant 5 min.
   REMARQUE : Après cette étape, la suspension mitochondriale doit devenir plus claire (passage de l’opaque au translucide) ; Sinon, cela pourrait indiquer que la quantité de détergent est insuffisante pour une solubilisation correcte de la membrane.
4. Centrifuger à pleine vitesse dans un microfuge (20 000 × g environ) pendant 25 min à 4 °C pour éliminer les matériaux insolubles.
5. Recueillir le surnageant dans un tube frais. Ajouter au surnageant un volume de 5 % de G-250 (Coomassie Blue G-250 5 % dans de l’acide aminocaproïque 0,75 M) équivalent à 1/3 du volume initial de remise en suspension (étape 3.1, cela correspondrait à une proportion finale de 1,6 g de Coomassie/g de protéine) et mélanger par pipetage.
6. Conserver sur la glace avant de charger le gel ou congeler les aliquotes à -80 °C.

4. Électrophorèse sur gel natif bleu

REMARQUE : L’électrophorèse est réalisée en chambre froide (4-8 °C). S’il n’y a pas d’installation de chambre froide, un bloc de refroidissement peut être introduit dans le réservoir d’électrophorèse. Des gels commerciaux de polyacrylamide natif à 3-13%²⁹ sont utilisés, mais des gels faits maison des concentrations de gradient souhaitées peuvent également être utilisés^38,39.

1. Chargez les chambres supérieure et inférieure avec la cathode froide A et les tampons d’anode, respectivement. Vous pouvez également charger les échantillons dans les puits avant de remplir soigneusement la chambre supérieure avec le tampon cathodique A.
   REMARQUE : Des tampons d’électrophorèse commerciaux sont utilisés dans notre laboratoire, mais ils peuvent être préparés comme indiqué dans le tableau 1.
2. Charge entre 30 et 100 μg de protéine mitochondriale.
   REMARQUE : Habituellement, 30 à 50 μg de protéines (pour WB) ou 40 à 100 μg de protéines (pour IGA) sont chargés par puits dans un gel à 10 voies (puits de 0,5 x 0,15 cm). Le tampon cathodique A contient du bleu Coomassie G-250 et a une couleur bleu intense qui rend difficile la visualisation des puits de gel pour le chargement des échantillons. Il est pratique de marquer le centre de chaque puits, avec un marqueur rouge, par exemple, pour aider à placer la pointe de la pipette pendant cette étape. Les marqueurs de poids moléculaire natifs peuvent être utiles lors de la mise en place de la technique BN-PAGE pour confirmer que les gels de gradient sont correctement formés et que le motif des complexes et des SC est le bon.
3. Fonctionner à 80-100 V pendant 25-30 min puis à 160-180 V, en limitant le courant à 12 mA/gel, jusqu’à ce que le colorant atteigne le fond du gel (~125-165 min au total).
4. Si des dosages d’activité dans le gel (IGA) doivent être effectués, remplacez le tampon cathodique A par le tampon cathodique B lorsque le front du colorant se trouve au milieu du gel (~1 h après le début du cycle).
   REMARQUE : Bien que les gels puissent être documentés sans aucune coloration juste après le passage puisque certaines bandes sont visibles (principalement le complexe V, qui peut être considéré comme un fabricant « interne » avec un MW de ~600 kDa) en raison de leur liaison au colorant G-250, généralement, les SC et les complexes individuels ne seront pas visibles sans coloration ou tests IGA. Les gels à utiliser dans les dosages IGA ou pour la WB ne doivent pas être colorés ou fixés.
5. Démontez le gel de la cassette et poursuivez avec la coloration au bleu de Coomassie (section 5), l’analyse IGA (section 6) ou l’immunodétection WB (section 7).

5. Coloration au gel

1. Teindre le gel pendant 10 à 15 minutes à température ambiante (RT) à l’aide de solutions de colorant bleu Coomassie (colorant Coomassie R-250 à 0,25 % dans du méthanol à 40 %, acide acétique à 10 % ; colorer pendant 10 à 15 min).
2. Décolorer avec plusieurs lavages (généralement 4-5 x 15 min) dans du méthanol à 40 % et 10 % d’acide acétique à RT.
3. Documentez le gel.

6. Essais d’activité sur gel (IGA)

1. Préparez des solutions IGA pour l’analyse des différents complexes respiratoires avant la fin de l’électrophorèse et maintenez-les dans l’obscurité (en utilisant des boîtes en plastique de couleur foncée ou en les recouvrant de papier d’aluminium, par exemple). La composition de chaque tampon est détaillée dans le tableau 1.
2. Placez le gel ou les couloirs à utiliser dans une boîte en plastique la plus petite possible pour l’accueillir.
3. Ajoutez suffisamment de volume de la solution appropriée pour couvrir le gel (généralement 5 ou 10 ml pour 5 ou 10 voies de gel, respectivement) et incubez à RT en secouant doucement (60-80 tr/min) et à l’abri de la lumière.
   REMARQUE : Le temps d’incubation dépend du complexe à analyser ainsi que de la nature et de la quantité d’échantillon chargé ; CI et CIV sont les plus faciles et les plus rapides à donner des résultats. Ainsi, l’activité CI commence généralement à devenir visible après quelques minutes, tandis que CII et CIV ont besoin de ~30 min pour être observées et le CV de ~1,5-2 h. Dans tous les cas, la réaction peut se poursuivre pendant des heures et le taux d’intensification du signal peut être réduit en déplaçant l’incubation dans une chambre froide (4-6 °C), par exemple pour une incubation d’une nuit (ON). L’activité CIII ne fonctionne que pour l’électrophorèse native claire (CN), pas pour BN³⁴.
4. Lorsque les bandes appropriées se sont développées, arrêter les réactions en retirant les solutions de dosage, en lavant 2 fois avec de l’eau distillée et en fixant le gel avec 40 % de méthanol plus 10 % d’acide acétique (sauf pour le CV qui n’est fixé qu’avec du méthanol) pendant 30 min.
   1. Pour analyser l’activité CIV après détection de CI par IGA, laver le gel 2x avec de l’eau distillée, documenter l’activité CI, incuber le gel (sans le fixer !) avec 50 mM de tampon de phosphate de potassium (pH 7,2) 2x pendant 30 min, puis avec le tampon de réaction CIV complet jusqu’à ce que les bandes IV complexes apparaissent (généralement en incubant ON à RT ou 4 °C).
5. Documentez les gels.
   REMARQUE : Pour l’activité ATPase, comme les bandes développées sont blanches, lorsque vous documentez le gel, placez-le sur un fond sombre afin que les bandes transparentes soient visibles.

7. Analyse par transfert Western

1. Préparez le tampon de transfert conformément au tableau 1 et maintenez-le à 4 °C jusqu’à la fin de l’électrophorèse.
2. Placez le gel dans un plateau et ajoutez le tampon de transfert. Incuber à RT pendant 10-15 min.
3. Découper un morceau de membrane PVDF de la même taille que le gel et l’activer dans du méthanol pendant 10 s sous agitation. Laver plusieurs fois à l’eau distillée et ajouter un tampon de transfert. Incuber à RT pendant 10-15 min en secouant doucement.
4. Préparez le sandwich de transfert, de bas en haut, en évitant les bulles entre le gel et la membrane, dans l’ordre suivant : face noire de la cassette-éponge-papier buvard-gel-membrane-papier buvard-éponge-côté transparent de la cassette.
5. Fermez et verrouillez la cassette et placez le sandwich dans le réservoir de transfert dans le bon sens pour le transfert (côté noir vers le pôle négatif).
6. Remplissez le réservoir de transfert avec le tampon de transfert, ajoutez un agitateur magnétique pour agiter le tampon et connectez l’alimentation électrique à 80 V pendant 2 h ou à 100 V pendant 1 h. Effectuez le transfert entre 4 et 8 °C (par exemple dans la chambre froide) et avec un bloc de refroidissement dans le système de transfert.
7. Récupérer la membrane et poursuivre avec un protocole standard de western blot, en utilisant des anticorps spécifiques pour les différents complexes respiratoires à détecter²⁹.

Results

Les rendements en mitochondries obtenus selon les protocoles décrits ci-dessus varient en fonction de plusieurs facteurs tels que la lignée cellulaire ou le type de tissu, la nature des échantillons (c’est-à-dire si des tissus frais ou congelés sont utilisés) ou l’efficacité du processus d’homogénéisation. Les rendements attendus de mitochondries provenant de différentes lignées cellulaires et tissus sont rassemblés dans le tableau 2. Une fois que les fractions mitochondriales ont été obtenues, l’étape suivante est l’analyse du profil des SC respiratoires, qui est effectuée après la solubilisation brute de l’échantillon mitochondrial et la séparation électrophorétique par BN-PAGE, suivie d’une analyse IGA ou d’une immunodétection WB. La figure 1 montre l’aspect des bandes de gel non colorées juste après l’exécution et le motif des bandes après la coloration standard de Coomassie d’une lignée cellulaire cultivée et d’un échantillon mitochondrial de foie de souris.

Dans la figure 2A, B, des différences claires entre les modèles d’assemblage des CS dans les cellules humaines et de souris après l’utilisation de tests IGA peuvent être observées. Ainsi, le complexe libre I est observé dans les cellules de souris alors qu’il n’est pas détectable dans les mitochondries humaines. Le modèle complexe IV-IGA est très similaire dans les deux lignées cellulaires humaines (Figure 2B) tout en présentant des différences entre les deux lignées cellulaires de souris analysées dans la Figure 2A. Ces différences sont dues au fait que les cellules BL6 expriment une variante mutante de SCAF1⁸.

Les modèles SC, obtenus avec le protocole d’isolement mitochondrial décrit ici pour fonctionner avec de petits échantillons, sont maintenus par rapport aux protocoles « conventionnels » utilisés pour les échantillons plus grands. On peut le voir sur la figure 2C, en comparant les voies 1 et 6 (obtenues après isolement mitochondrial à l’aide d’un protocole conventionnel à partir de 3 g de foie et 1,1 g de BAT) avec, respectivement, les voies 2 et 5 (obtenues à l’aide des protocoles présentés ici à partir d’environ 0,1 g des deux tissus). Comme proposé dans le modèle de plasticité, la proportion relative de complexes respiratoires et de CS varie en fonction du type de cellule et de l’état métabolique. Comme le montre la figure 2C, D, les différents tissus présentent différents modèles d’assemblage SC. Ainsi, les mitochondries cérébrales présentent de très faibles niveaux de complexe libre I et une proportion plus élevée de SC par rapport aux autres tissus, et la BAT se caractérise par ses faibles niveaux de CV (Figure 2A) et ses quantités élevées de SC III + IV (Figure 2D). Les mitochondries cardiaques présentent des niveaux élevés de CS et de CV. Les modèles d’assemblage des CV sont très similaires entre la lignée cellulaire cultivée et un échantillon mitochondrial de foie de souris (Figure 2E).

L’assemblage de la SC peut également être analysé par la WB, comme le montre la figure 3 , pour deux échantillons obtenus à partir de cellules de contrôle de la rate et de cellules tumorales. Dans ce cas, 30 à 50 μg de protéine mitochondriale sont généralement suffisants pour détecter les différents complexes et SC avec les anticorps spécifiques. La figure 4 montre quelques-uns des principaux pièges qui peuvent survenir lors de l’application de ces protocoles. De mauvais gradients de gel peuvent produire des schémas de migration anormaux et indésirables, comme dans la figure 4A, voie 1, où les SC restent près du puits dans la partie supérieure de la voie en raison d’une concentration d’acrylamide supérieure à la normale dans le gel. L’incubation des échantillons, même pour des périodes relativement courtes, à des températures élevées (ici 37 °C et 40 °C pendant 10 min) provoque une dégradation des SC et des CI (Figure 4A , couloirs 2-4). De même, le rapport détergent/protéines est essentiel pour obtenir de bons résultats et une résolution adéquate du gel. En dessous d’un rapport de 2 g de digitonine/g de protéine, la résolution de la bande est progressivement réduite et à la concentration la plus faible (0,5 g/g), seule une tache dans la zone correspondant aux CS est visible (Figure 4B).

Figure 1 : Schéma des complexes mitochondriaux et des supercomplexes après séparation BNGE de mitochondries perméabilisées à la digitonine d’une lignée cellulaire de culture (L929^Balbc) et du foie de souris. Les couloirs de gauche (1 et 2) représentent l’aspect du gel non coloré juste après le passage, où seul le CV est détectable, tandis que les couloirs de droite (3 et 4) montrent le motif des bandes après la coloration de Coomassie. Abréviations : BNGE = électrophorèse sur gel natif bleu ; CV = complexe V ; SC = supercomplexes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyse IGA de mitochondries isolées de différentes lignées cellulaires et tissus de souris. (A,B) Activité en gel des complexes indiqués dans les mitochondries isolées de (A) lignées cellulaires de souris ou (B) humaines. L929^Balbc est une lignée cellulaire transmissible générée dans notre laboratoire en transférant des mitochondries de plaquettes de souris Balb/cJ vers des cellules néo ρ°L929 comme décrit précédemment^40,41. Les fibroblastes BL6 sont une lignée cellulaire immortalisée générée dans notre laboratoire à partir d’une biopsie de l’oreille d’une souris BL6. (C) Profils CI-IGA à partir de mitochondries de souris isolées à l’aide soit d’une méthode conventionnelle commençant avec 3 g de foie (voie 1) et avec 1,1 g de BAT (voie 6), soit du protocole présenté ici et commençant avec environ 0,1 g de tissu dans tous les cas (voie 2, foie ; voie 3, cœur ; voie 4, cerveau, et voie 5 BAT). (D) Modèles CIV-IGA (réalisés après CI-IGA montré dans le panneau 2C, voies 2-5) dans le foie, le cœur, le cerveau et les mitochondries BAT de souris. (E) Analyse de l’activité CV-IGA dans des cellules cultivées et du foie de souris. Environ 60 à 75 μg de protéines mitochondriales par voie ont été chargés. Abréviations : IGA = activité dans le gel ; SC = supercomplexes ; IC = complexe I ; MTD = tissu adipeux brun. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Immunodétection WB des différents complexes et supercomplexes mitochondriaux dans des échantillons de rate. Après la séparation par PAGE Blue Native des complexes mitochondriaux et des SC obtenus à partir d’échantillons de contrôle de la rate (Rate M9) et de la tumeur (Tumeur M9), ils ont été transférés sur une membrane PVDF et hybridés séquentiellement avec des anticorps qui reconnaissent les sous-unités CI, CIII, CIV et CII indiquées (panels A-D, respectivement). Environ 50 μg de protéines mitochondriales ont été chargés par voie. Les astérisques indiquent le signal restant d’un western blot précédent. Abréviations : SC = supercomplexe ; IC = complexe I ; CIII = complexe III ; CIV = complexe IV ; CII = complexe II. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Pièges de l’analyse SC par Blue-Native PAGE. Analyse CI IGA de mitochondries isolées à partir (A) de foie de souris frais et (B) de foie de rat congelé dans différentes conditions de solubilisation. (A) Voie 1, mauvaise concentration de gradient de gel (8-13% au lieu des 3-13% normaux). Couloirs 2 à 4, échantillons incubés pendant 10 min sur de la glace ou à 37 °C et 40 °C avant le chargement, respectivement. (B) Profil après IGA pour l’IC des mitochondries obtenues à partir du foie de rat congelé en utilisant différents rapports digitonine/protéine pour la solubilisation. Abréviations : SC = supercomplexe ; PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide ; IC = complexe I ; IGA = activité dans le gel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Douleur moyenne	Composition
Tampon hypotonique	10 mM de MOPS, 83 mM de saccharose, pH 7,2
Tampon hypertonique	30 mM MOPS, 250 mM de saccharose, pH 7,2
Tampon d’homogénéisation A	10 mM de Tris, 1 mM d’EDTA, 0,32 M de saccharose, pH 7,4
tampon d’homogénéisation AT	225 mM de mannitol, 1 mM d’EGTA, 75 mM de saccharose, 0,01 % BSA pH 7,4
Tampon d’homogénéisation AT2	225 mM de mannitol, 1 mM d’EGTA, 75 mM de saccharose, 0,02 % BSA pH 7,4
Tampon d’échantillonnage BN	50 mM de NaCl, 50 mM d’imidazole, 2 mM d’acide aminocaproïque, 1 mM d’EDTA pH 7,0
La solution Digitonin	10 % de digitonine dans 50 mM de NaCl, 50 mM d’imidazole, 5 mM d’aminocaproïque, 4 mM de PMSF
Tampon de chargement BN	5% Coomassie Blue G dans de l’acide aminocaproïque 0,75 M
Tampon cathodique BN A	50 mM de tricine, 15 mM de Bis-Tris pH = 7,0 (4 °C), 0,02 % G-250 (bleu brillant Coomassie G-250)
Tampon cathodique BN B	50 mM de tricine, 15 mM de Bis-Tris pH = 7,0 (4 °C), 0,002 % G-250
Tampon d’anode BN	50 mM de bis-tris, pH = 7,0
Substrat IGA complexe I	5 mM de Tris-HCl pH 7,4, 0,1 mg/mL de NADH, 2,5 mg/mL de nitroblue tétrazolium (NBT)
Substrat IGA Complex II	50 mM de tampon phosphate de potassium pH 7,4, 20 mM de succinate de sodium, 0,2 mM de méthosulfate de phénazine (PMS), 2,5 mg/mL de NBT
Substrat IGA complexe III	50 mM tampon phosphate de potassium pH 7,2, 0,05% diaminobenzidine (DAB)
Substrat IGA IV complexe	Même solution que CIII plus 50 μM cytochrome c
Substrat IGA complexe V	35 mM Tris, 270 mM glycine pH 8,3, 14 mM MgSO4, 0,2% Pb(NO3)2, 8 mM ATP
Solution de coloration	Colorant Coomassie R-250 à 0,25% dans 40% de méthanol et 10% d’acide acétique
Solution de détachage/fixation	40 % de méthanol, 10 % d’acide acétique
Tampon de transfert	48 mM de Tris, 39 mM de glycine, 20% de méthanol

Tableau 1 : Tampons et composition des supports

Type de cellule/tissu	Montant de départ	Rendement attendu (μg de protéine mitochondriale)	Nombre de voies (50-60 μg/voie)
Cellules cultivées
MDA-MB-468	100 μL vpc	300 à 400 μg	6-9
Dérivé de 143B	100 μL vpc	200 à 350 μg	4-7
Fibroblastes de souris	100 μL vpc	150 à 200 μg	3-5
Cœur	100 mg	400 à 500 μg	10-12*
Muscle squelettique	100 mg	300 à 400 μg	8-10*
Foie	100 mg	400 à 500 μg	8-10
Rate	50 mg	150 à 250 μg	3-5
CHAUVE-SOURIS	100 mg	200 à 300 μg	4-6
Cerveau	100 mg	250 à 300 μg	5-8

Tableau 2 : Rendements attendus des mitochondries de différents types de cellules et de tissus de souris. Les fractions mitochondriales obtenues à partir du cœur ou du muscle squelettique sont plus pures que celles obtenues à partir d’autres tissus. Ainsi, de plus petites quantités peuvent être chargées dans les gels (*).

Discussion

Les adaptations méthodologiques introduites dans les protocoles décrits ici visent à éviter les pertes et à augmenter le rendement tout en maintenant les activités du complexe mitochondrial (ce qui est crucial lorsque la disponibilité de quantités suffisantes d’échantillons est compromise) et à reproduire le modèle de SC attendu du tissu ou de la lignée cellulaire (voir Figure 2C). Dans ce but et comme une grande pureté mitochondriale n’est pas nécessaire pour détecter correctement les SC, le nombre d’étapes, de temps et de volumes a été réduit chaque fois que cela était possible.

Ainsi, après homogénéisation et élimination des noyaux et des cellules ininterrompues par centrifugation à basse vitesse, les surnageants contenant les mitochondries sont transférés dans des tubes en polypropylène de 1,5 mL, et les centrifugations ultérieures pour obtenir les fractions mitochondriales brutes sont effectuées dans un microfuge en augmentant la vitesse et en réduisant les temps et les volumes par rapport aux protocoles conventionnels. Cela permet de traiter plusieurs échantillons dans un délai relativement court : on estime que 10 échantillons peuvent être traités en ~2-2,5 h (depuis le début de l’homogénéisation (étape du protocole 1.6. ou équivalent pour les tissus) jusqu’à l’obtention de la fraction des SCs prête à être chargée dans un gel (étape du protocole 3.7) et minimise les pertes tout en conservant les activités. Une autre modification par rapport aux protocoles originaux du groupe de Schägger est de substituer, après la solubilisation membranaire pour l’obtention de la fraction SCs, une étape d’ultracentrifugation par une simple centrifugation par microfuge (étape 3.4 du protocole).

Il y a quelques étapes critiques dans la procédure. Tout d’abord, l’efficacité de la rupture cellulaire, en particulier dans le cas de cellules cultivées (voir note après l’étape 1.8 du protocole) et particulièrement dans le cas de petites cellules. Les tissus et les lignées cellulaires présentent un degré de difficulté variable dans la rupture cellulaire : par exemple, dans le cœur et les muscles, cette étape est généralement moins efficace que dans le foie ou la rate, mais elle est compensée en rendement car les premiers ont un contenu mitochondrial plus élevé. Une alternative pour améliorer le rendement mitochondrial lorsqu’il est isolé du muscle ou du cœur serait le traitement des échantillons avec de la trypsine avant l’homogénéisation. Le cerveau est un autre tissu qui présente une faible efficacité dans la rupture cellulaire en raison de l’homogénéisation manuelle, qui est plus douce et moins efficace et probablement aussi en raison de la plus grande variation des types de cellules dans ce tissu, comme il a été rapporté précédemment ⁴². Cela peut être partiellement compensé par une deuxième étape d’homogénéisation comme suggéré dans notre protocole (étape 2.7.4). D’autre part, si la rupture cellulaire est excessive, l’échantillon final contenant des CS pourrait être contaminé par des fragments d’ADN nucléaire qui pourraient interférer avec le fonctionnement électrophorétique. Ce problème se manifeste par une augmentation de la viscosité de l’échantillon lorsque la digitonine est ajoutée pour solubiliser les membranes mitochondriales et peut être résolu par un traitement avec de la DNAse I.

Deuxièmement, si le rapport détergent/protéine est trop faible, cela entraînerait une solubilisation membranaire moins efficace et la possibilité de formation d’agrégats. Cela pourrait se manifester dans les gels par une faible résolution dans les SC de haut poids moléculaire (voir Figure 4) ou par un CIV donnant plusieurs bandes correspondant aux oligomères⁴³. Si le ratio est trop élevé, cela pourrait conduire à une désagrégation des SC (principalement des CI-SC). Troisièmement, il est important d’éviter de chauffer les échantillons pendant toute la procédure (voir la figure 4) et d’éviter les cycles répétés de congélation-décongélation, car ils peuvent affecter l’état de l’assemblage du SC.

Le tableau 2 présente un résumé des rendements attendus pour plusieurs types de cellules et d’échantillons de tissus. Les valeurs sont approximatives et dépendront de l’efficacité de la rupture de la cellule et de la nature de la source. Dans le cas des tissus, si le matériau de départ est congelé, il a tendance à donner un rendement plus élevé qu’avec des échantillons frais. Une estimation du nombre de voies (en considérant une charge comprise entre 50 et 60 μg de protéine mitochondriale par voie) qui peuvent être chargées est présentée.

Les protocoles présentés ici couvrent une variété de tissus et de types de cellules avec de petites variations, ils peuvent être utilisés avec des échantillons frais ou congelés et nécessitent un équipement simple et un coût relativement faible, n’impliquant pas l’utilisation de kits de purification ou de gradients coûteux. Cependant, ils peuvent nécessiter certaines adaptations pour être utilisés avec des types de cellules ou des échantillons particuliers, ainsi que lorsque des populations mitochondriales spécifiques, telles que les mitochondries synaptiques cérébrales ou les mitochondries sous-sarcolemmales musculaires, par exemple, font l’objet d’analyses.

Étant donné que les rôles physiologiques précis ainsi que l’implication potentielle des CS dans des situations pathologiques restent à définir, l’analyse de leur dynamique et des facteurs affectant leur assemblage, leur stabilité et leur fonction est nécessaire. Nos protocoles peuvent représenter des outils précieux qui permettent d’obtenir des résultats reproductibles sur les modèles de SC avec de petites tailles d’échantillons et à partir d’une variété de types de cellules et de tissus, en particulier lorsque plusieurs conditions expérimentales doivent être comparées²⁹.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acide acétique	PanReac	131008
Acide aminocaproïque	Fluka Analytical	7260
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Bis Tris	Acrons Organics	327721000
Bradford assay	Biorad	5000002
Coomassie Blue G-250	Serva	17524
Coomassie Blue R-250	Merck	1125530025
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C2506
Diamino  ; benzidine (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
EDTA	PanReac	131669
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Acides gras libres BSA	Roche	10775835001
Glycine	PanReac	A1067
Homogénéisateur Pilon en téflon	Deltalab	196102
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
K2HPO4	PanReac	121512
KH2PO4	PanReac	121509
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Méthanol	Labkem	MTOL-P0P
MgSO4	PanReac	131404
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MTCO1 Anticorps monoclonal	Invitrogen	459600
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NADH	Roche	10107735001
NativePAGE 3 à 12 % Mini Protein Gels	Invitrogen	BN1001BOX
NativePAGE Additif de tampon cathodique (20x)	Invitrogen	BN2002
NativePAGE Tampon de fonctionnement (20x)  ;	Invitrogen	BN2001
NDUFA9 Anticorps monoclonal	Invitrogen	459100
Nitroblue Sel de tétrazolium (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876
Pb(NO3)2	Sigma-Aldrich	228621
Membrane PDVF	Amersham	10600023
Méthasulfate de phénazine (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625
Pierce ECL Substrat	Thermo Scientific	32106
PMSF	Merck	PMSF-RO
SDHA Anticorps monoclonal	Invitrogen	459200
Succinate de sodium	Sigma-Aldrich	S2378
Streptomycine/pénicilline	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
Tris	PanReac	A2264
UQCRC1 Anticorps monoclonal	Invitrogen	459140
XCell  ; SureLock Mini-Cell	Invitrogen	; EI0001