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Article de méthode

Isolement de cellules souches mésenchymateuses de Wharton et de leurs exosomes/petites vésicules extracellulaires dérivés

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DOI :

10.3791/66778

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11 novembre 2025

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1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire Hosted by Global Academic Foundation, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Ain Shams University, 4Department of Pharmacology and Biochemistry, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 5Health Research Center of Excellence, Drug Research and Development Group (DRD-G), The British University in Egypt

Dans cet article

Résumé

Le tissu du cordon ombilical est une source riche, facilement disponible et non invasive de cellules souches mésenchymateuses (CSM). Dans ce protocole, des étapes détaillées pour l’isolement et la caractérisation des CSM humaines en gelée de Wharton (CSM-WJ) sont fournies, suivies d’un protocole court simple pour isoler leurs exosomes dérivés ou petites vésicules extracellulaires.

Résumé

Dans le domaine de la médecine régénérative, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont suscité une attention particulière. Les CSM du tissu du cordon ombilical (CU), appelées gelée de Wharton, ont été particulièrement bien établies dans diverses applications. Par rapport à d’autres sources de CSM, les CSM en gelée de Wharton (WJ-MSC) offrent un certain nombre d’avantages et sont isolées de la CU, qui est généralement éliminée comme déchet médical. Les WJ-MSCs ne soulèvent donc pas de questions éthiques similaires à celles relatives aux cellules souches embryonnaires. Une technique d’explant simple et reproductible a été utilisée pour isoler les WJ-MSCs des tissus de colite ulcéreuse. Dans les cinq à dix jours suivant l’isolement, les WJ-MSC émergent sous forme de cellules adhérentes de forme fibroblastique. Après avoir été isolées, les cellules atteignent environ 80 % de confluence en 14 à 18 jours. Ensuite, dans le passage 3, les WJ-MSCs isolées ont été entièrement caractérisées en les induisant à se différencier le long des lignées mésenchymateuses adipogènes, ostéogéniques et chondrogènes. De plus, l’immunophénotypage des marqueurs de surface de groupe de différenciation (CD) négatifs, y compris CD34, CD14 et HLA-DR, ainsi que des marqueurs de surface MSC distinctifs tels que CD105, CD90, CD73 et CD44 ont été testés. De plus, le réactif précipitant a été utilisé dans une approche simple pour isoler les exosomes/petites vésicules extracellulaires (sEV) du milieu conditionné de ces WJ-MSC. Après avoir été isolés, les exosomes/sEV ont été observés au microscope électronique à transmission, et l’analyse de la taille des particules a été utilisée pour calculer leur taille moyenne. En résumé, les WJ-MSC fournissent un approvisionnement renouvelable, non invasif et facilement disponible de cellules souches qui peuvent être utilisées comme usines pour produire des exosomes/sEV. Ces WJ-MSC et leurs exosomes/sEV dérivés peuvent être utilisés dans un large éventail d’applications thérapeutiques et de recherche en aval.

Introduction

Il y a seulement quelques années, on pensait que les cellules souches prenaient la tête de la médecine 1,2. Cependant, la préoccupation éthique posée par les cellules souches embryonnaires (CSE) était un énorme obstacle entravant les progrès rapides dans le domaine3. Cela a suscité beaucoup d’intérêt pour l’exploration de sources renouvelables alternatives pour les cellules souches, en particulier celles qui peuvent être isolées postnatalement du cordon ombilical (CU)4. La CU se joint naturellement au placenta et au fœtus à l’intérieur d’une mère enceinte. Le rôle inné de la CU est de nourrir le fœtus en croissance avec un apport sanguin continu et suffisant à travers les vaisseaux sanguins et d’assurer la protection de ces vaisseaux en évitant toute torsion, compression ou pliage possible du fœtus pendant son mouvement5. Anatomiquement, la CU humaine se compose de deux artères et d’une veine qui sont intégrées dans un tissu conjonctif mucoïde et enfermées dans une couche externe de l’épithélium amniotique6. La matrice UC, ou le tissu conjonctif mucoïde entourant les trois vaisseaux ombilicaux, est connue sous le nom de « gelée de Wharton » (WJ) et est principalement composée de protéoglycanes et de collagène7.

Récemment, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont attiré beaucoup d’attention en tant que nouvelle modalité thérapeutique efficace pour un large éventail d’applications de médecine régénérative 7,8,9,10,11,12. Ce qui est le plus intriguant à propos des CSM, c’est leur facilité d’isolement, ainsi que leurs activités immunomodulatrices et leur multipuissance démontrées 13,14,15. D’autres avantages supérieurs des CSM en général et de ceux dérivés de WJ en particulier sont qu’aucun tératome ne se manifeste lors de la transplantation, contrairement aux CSE, et le fait qu’ils conservent leur propriété souche même après plusieurs passages cellulaires16,17. Ainsi, on pense maintenant que les CSM pourraient en effet fournir des interventions thérapeutiques révolutionnaires pour diverses maladies 8,18,19. Il est important de souligner qu’en 2006, l’International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) a défini des critères minimaux spécifiques pour une caractérisation correcte des CSM20. Tout d’abord, lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions de culture standard, les CSM sont censées être adhérentes au plastique. Deuxièmement, les CSM doivent exprimer des marqueurs de surface de groupe caractéristique de différenciation (CD) tels que CD90, CD105 et CD73, et ne doivent pas montrer l’expression d’autres marqueurs tels que CD14, CD34 et CD45. Troisièmement, les CSM doivent se différencier en lignées ostéogéniques, adipogènes et chondrogéniques in vitro20. À ce jour, les CSM ont été isolées à partir de plusieurs sources, y compris des tissus adultes tels que la moelle osseuse (BM), le tissu adipeux21, ainsi que des sources fœtales/périnatales comme le placenta, le sang UC (UCB) et la matrice UC22,23. Il convient de noter ici que lorsque l’on compare le taux de réussite de la récolte des CSM, il a été rapporté qu’il atteignait près de 100 % à partir des tissus WJ contre seulement environ 6 % pour UCB24,25. Ainsi, bien que l’UCB soit effectivement une riche source de cellules souches hématopoïétiques, elle est également considérée comme une bonne source de CSM, mais nettement inférieure à WJ 26,27,28.

Les WJ-MSC sont exceptionnelles par rapport à d’autres types de MSC car, bien qu’elles soient de véritables MSC (typiques), possédant des propriétés similaires à celles de leurs homologues adultes, elles possèdent également l’expression de divers marqueurs de pluripotence/ESCs17,29. En conséquence, on pense que les WJ-MSC se situent quelque part entre les cellules souches adultes et embryonnaires17. Il est intéressant de noter que les WJ-MSCs expriment à la fois les marqueurs humains MSCs et ESCs et sont capables de maintenir la souche pendant plusieurs passages16. Heureusement, lors de la transplantation, ils ne forment pas de tératomes17. Cela peut être élucidé par leur profil transcriptomique unique par rapport aux ESC, ainsi qu’à d’autres MSC29,30. Les WJ-MSC présentent divers avantages par rapport aux MSC adultes, et même par rapport aux autres types de cellules souches en général. Leurs moyens d’isolement sont facilement disponibles, via la CU qui est systématiquement jetée à la naissance, et est donc considérée comme un déchet médical. Par conséquent, contrairement aux CSE, les CSM-WJ n’ont pas de préoccupations éthiques, et contrairement aux CSM-BM, cela est isolé via une technique invasive31. De plus, comme d’autres types de CSM, les CSM-WJ n’expriment pas l’antigène D leucocytaire humain lié (HLA-DR), et en particulier l’expression de l’antigène G leucocytaire humain (HLA-G), ce qui leur confère un privilège immunitaire supplémentaire32. Cela suggère que les CSM-WJ présentent un rôle immunosuppresseur simulant ce qui se passe habituellement à l’interface fœtus-mère in vivo 33,34,35. Enfin, à l’instar de leurs analogues isolés de l’UCB, les WJ-MSC ont un grand potentiel pour le secteur bancaire36. Compte tenu de tous ces avantages, les WJ-MSC sont donc préconisées comme la nouvelle référence pour les thérapies basées sur les MSC30.

Il est intéressant de noter que de nombreuses recherches ont révélé que les CSM manifestent leurs effets thérapeutiques principalement via la signalisation paracrine. Dans de nombreux cas, de tels effets ont été signalés en réponse à des exosomes/petites vésicules extracellulaires (sEV) sécrétés par les CSM37. Les exosomes/sEV sont connus sous le nom de vésicules bioactives de taille nanométrique qui sont acquises à partir du système endomembranaire de la cellule. Ils agissent comme des navettes transférant des cargaisons spécifiques de protéines, d’ARNm, ainsi que d’ARN non codants comme les microARN et les longs ARN non codants (LncRNAs), comme un message dans une bouteille38. En conséquence, ils peuvent reprogrammer les cellules réceptrices et sont désignés comme des « signalosomes » manipulant les fonctions cellulaires essentielles39. Les exosomes/sEV dérivés des CSM ont démontré leur supériorité par rapport aux thérapies CSM en tant qu’alternative acellulaire possible. À l’instar de leurs CSM parentes, les exosomes/sEV provoquent des effets thérapeutiques et une régénération cellulaire dans plusieurs maladies. Cependant, contrairement à leurs cellules mères, ils peuvent traverser plus facilement les barrières biologiques. De plus, ils sont dépourvus de problèmes de sécurité critiques ; Ils ne présentent aucun risque de rejet immunitaire ou de formation de tumeurs à long terme40. De plus, les exosomes/sEV peuvent être utilisés pour des applications de thérapie génique comme moyen d’administration de médicaments, étant naturellement équipés pour transférer des informations génétiques41. Ainsi, les exosomes/sEV ont en effet ouvert de nouvelles voies passionnantes pour de nouvelles interventions thérapeutiques de diverses maladies 42,43,44.

Dans ce protocole, un protocole complet basé sur des explants pour l’isolement et la caractérisation des WJ-MSCs à partir de tissus UC est présenté. Il sera suivi d’un protocole concis pour l’isolement des exosomes/sEVs à partir des milieux conditionnés de ces WJ-MSC.

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Protocole

Toutes les expériences et procédures ont été réalisées conformément aux directives approuvées et ont été approuvées par les comités d’éthique de la Faculté de pharmacie de l’Université Ain Shams, Le Caire, Égypte (ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC# 220) et de la Faculté de pharmacie de l’Université britannique d’Égypte, Le Caire, Égypte (CL-2309). Les CU ont été obtenues après l’obtention du consentement éclairé signé du ou des parents.

1. Isolement des CSM-WJ du cordon ombilical humain

  1. Placez environ 30 à 40 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un récipient (sac de collecte scellé) pour recueillir le cordon ombilical (UC) (environ 15 cm de long) immédiatement après l’accouchement. Conservez le CU collecté sur de la glace et traitez-le dans un délai maximum de 4 à 5 heures après la collecte.
    REMARQUE : L’échantillon ne peut pas être traité après 4-5 h, car cela diminuerait considérablement le rendement des CSM. Assurez-vous que le PBS et le récipient sont stériles.
  2. Préparez un milieu de culture complet pour les CSM-WJ composé d’un milieu modifié Eagle de Dulbecco à faible teneur en glucose (LG-DMEM) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 100 μg/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 0,25 μg/mL d’amphotéricine B.
  3. Placez 3 ml de milieu complet par puits dans des plaques à 6 puits, puis placez ces plaques à 6 puits contenant des milieux dansun incubateur à 37 °C et à 5 % de CO2 pour les réchauffer et les préparer.
  4. Dans l’enceinte de biosécurité, préparez huit boîtes de culture cellulaire de 10 cm, chacune remplie de 10 ml de PBS stérile.
  5. Soigneusement, à l’aide d’une pince stérilisée, transférez la CU du sac en plastique scellé dans la première boîte de Pétri contenant du PBS pour laver le sang (répétez cette étape jusqu’à ce que tout le sang soit lavé de l’échantillon).
  6. Vaporisez de l’éthanol à 70 % sur un écouvillon stérile et utilisez-le pour essuyer le CU pendant 30 s.
  7. Transférez l’UC dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de PBS stérile pour éliminer tout résidu d’éthanol.
  8. Transférez l’UC dans une autre boîte de Pétri préalablement remplie de PBS stérile et, à l’aide de ciseaux stériles, coupez l’UC en petits morceaux (environ 3 cm chacun). Ensuite, déplacez ces morceaux de 3 cm de long dans une autre boîte de Pétri avec du PBS frais et stérile pour éviter que du sang ne soit libéré pendant le processus de coupe.
    REMARQUE : À partir de ce moment, les pièces UC doivent être maintenues sur la glace, ainsi que toutes les étapes de traitement ultérieures. Ceci est vraiment important pour éviter la libération de matière gélatineuse et assurer le succès de la procédure d’isolement des WJ-MSC du tissu UC. Le traitement de la CU collectée dans un délai maximum de 4 à 5 heures est crucial pour le succès du processus d’isolement. Auparavant, la CU était traitée dans des délais plus longs après la collecte et, malheureusement, la procédure n’a pas donné de résultats positifs (données non présentées).
  9. Commencez à traiter les morceaux de CU un par un (sur de la glace) dans une boîte de Pétri remplie de PBS stérile. Utilisez des ciseaux stériles et des pinces pour couper les vaisseaux sanguins et isoler le tissu de la gelée de Wharton (WJ). Placez ensuite les morceaux de WJ transparents dans une autre boîte de Pétri remplie de PBS stérile sur de la glace.
    REMARQUE : Lors de l’isolement du tissu WJ de la pièce UC, la première incision est faite sur le côté transparent de la pièce UC, loin des vaisseaux sanguins, pour éviter de couper à travers le vaisseau. Ensuite, les vaisseaux sanguins sont clampés, coupés et retirés.
  10. Répétez l’étape précédente sur toutes les pièces de CU pour obtenir un tissu WJ clair sans vaisseaux sanguins.
    REMARQUE : Changez la boîte de Pétri PBS, si nécessaire, pendant le traitement des morceaux de CU et l’ablation des vaisseaux sanguins, si la solution PBS devient sanglante ou peu claire pendant l’isolement des tissus WJ.
  11. Lavez les morceaux de WJ collectés avec du PBS en les transférant dans une boîte de culture cellulaire fraîche de 10 cm remplie de PBS stérile.
  12. À l’aide d’un scalpel et d’une pince stériles et tranchants, coupez les tissus WJ collectés en petits morceaux de 10 mm de long.
  13. Transférez les morceaux de WJ dans les plaques à 6 puits préalablement préparées à l’étape 1.3. Placez 5 à 6 morceaux de WJ par puits, puis incubez les plaques à 6 puits contenant des explants de tissu WJ dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 à 37 °C dans l’incubateur de CO2 et laissez sans être dérangé pendant 3 jours.
  14. Le 4èmejour après la mise en place des explants de tissu WJ, ajoutez soigneusement 1 mL de milieu par puits en prenant soin de ne pas déranger les explants.
    REMARQUE : Évitez de toucher ou de rayer le bas de la plaque où les pièces WJ sont fixées.
  15. Répétez l’étape précédente le 6ème jour après avoir placé les explants de tissu WJ.
  16. Le 8e jour après la mise en place des explants de tissu WJ (c’est-à-dire près d’une semaine après la pose de l’explant), commencez à changer la moitié du milieu par puits tous les deux jours jusqu’au 12au 14e jour après la mise en place de l’explant. Remplacez la moitié du milieu de culture de chaque puits en prélevant environ 2,5 ml de chaque puits et en ajoutant 2,5 ml de milieu chaud complet (37 °C).
    REMARQUE : Retirez le support de la surface du puits et évitez de toucher ou de rayer le bas de la plaque où les pièces WJ sont fixées. Les WJ-MSC apparaissent généralement sous et autour des explants de tissu WJ dans les 5 à 10 jours suivant la mise en place des explants.
  17. Observez régulièrement les plaques à 6 puits sous un microscope inversé (grossissement de 10x), et si les cellules libérées prolifèrent et que leur confluence augmente, atteignant 50-60 %, passez à l’étape suivante ; Si ce n’est pas le cas, répétez l’étape 1.16. encore. Les pièces WJ rétrécissent considérablement en taille au fil du temps.
  18. Retirez délicatement les explants WJ fixés au fond des puits et retirez tous les supports. Le retrait des pièces d’explant WJ se fait généralement entre le 12et le 14e jour après leur placement initial.
    REMARQUE : Inclinez légèrement les plaques à un angle de 45° tout en retirant le support pour vous assurer que tout le support est retiré.
  19. Lavez chaque puits avec 2 ml de PBS, remuez doucement l’assiette, puis jetez le PBS. Répétez cette étape de lavage deux fois.
    REMARQUE : Ajoutez doucement du PBS à la paroi du puits et évitez de toucher le fond des puits pour éviter toute perturbation des cellules.
  20. Ajouter doucement 2 mL de milieu complet chaud par puits (milieu dont la composition est exacte à celle décrite à l’étape 1.2) et incuber les plaques à 6 puits dans des conditions humidifiées avec 5 % de CO2 à 37 °C.
  21. Changez complètement le milieu tous les deux jours (2 ml de milieu complet par puits) jusqu’à ce que les cellules atteignent environ 80 % de confluence.
  22. Lorsque les cellules atteignent environ 80 % de confluence, faire passer les cellules à l’aide de la trypsine-EDTA dans des flacons de culture cellulaire T25 (le total des cellules obtenues à partir d’une plaque à 6 puits peut être passé dans un ballon de culture T25, utiliser 8 à 9 mL de milieu complet par ballon T25). Ces WJ-MSCs sont désignées par des cellules P1.
    REMARQUE : Ne laissez pas les cellules trop longtemps avec Trypsin-EDTA pour éviter les effets toxiques ; Habituellement, 3 minutes suffisent pour le détachement des cellules. Différents fournisseurs peuvent fournir de la trypsine-EDTA avec une puissance variable. Par conséquent, cela doit être pris en compte lors de la spécification de la durée d’incubation.
  23. Changez de média tous les deux jours. Une fois que les cellules ont atteint une confluence d’environ 80 %, faire passer les cellules à l’aide de la trypsine-EDTA dans des fioles de culture cellulaire T75 (le nombre total de cellules obtenues à partir d’une fiole de culture T25 peut être passé dans une fiole de culture T75 ; utiliser 15 à 18 mL de milieu complet par fiole T75) ; ces WJ-MSCs sont désignées par des cellules P2.
  24. Changez de média tous les deux jours. Une fois que les cellules ont atteint une confluence d’environ 80 %, détachez les cellules à l’aide de trypsine-EDTA, puis ensemencez les WJ-MSC à une densité d’environ 0,75 x 106-1 x 106 cellules par fiole T75. Ces WJ-MSC sont désignées par des cellules P3.
    REMARQUE : Utilisez des cellules entre P3 et P5 pour les expériences futures décrites dans ce protocole.
  25. Cryoconserver les WJ-MSC isolés dans de l’azote liquide à l’aide d’un milieu de cryoconservation composé de 80 % de FBS, de 10 % de milieu complet (comme décrit à l’étape 1.2) et de 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO).
    REMARQUE : La Figure 1 présente une présentation schématique de l’ensemble des étapes d’isolement des WJ-MSC.

2. Caractérisation de WJ-MSC isolées par immunophénotypage à l’aide de l’analyse cytométrique en flux pour divers marqueurs de surface CD

  1. Détachez les cellules à l’aide de la trypsine-EDTA au passage 4. Lavez les cellules avec du PBS deux fois et comptez leur nombre à l’aide d’un hémocytomètre.
    REMARQUE : Un temps d’incubation minimal (3 min) pendant la trypsinisation est essentiel pour détacher les cellules avec succès sans exercer de dommages. Une incubation prolongée avec la trypsine-EDTA peut endommager les marqueurs de surface cellulaire et affecter négativement les résultats du test d’immunophénotypage.
  2. Incuber environ 100 000 cellules (dans des conditions sombres) pendant 20 minutes à 4 °C avec des anticorps monoclonaux humains marqués à la phycoérythrine (PE) ou à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) comme suit : Anti-CD90 PE, Anti-CD73 PE, Anti-CD105 FITC, Anti-CD44 PE, Anti-CD34 PE, Anti-CD14 PE et Anti-HLA-DR FITC, et utiliser des cellules non colorées comme témoins
  3. Rincer les cellules avec du PBS et les remettre ensuite en suspension dans 500 μL de tampon FACS ; Analyser à l’aide de la cytométrie en flux45.

3. Évaluation du potentiel de différenciation des WJ-MSC isolés vers diverses lignées mésenchymateuses

  1. Différenciation adipogénique
    1. Remettez les cellules en suspension dans un milieu de prolifération complet (comme décrit à l’étape 1.2). Ensuite, cultivez les cellules à une densité de 3,7 x 104 cellules/puits (0,5 mL milieu/puits) dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Ensuite, incuber dans des conditions humidifiées de 5 % de CO2 à 37 °C. Ensuite, tous les deux jours, changez de média jusqu’à ce que les cellules atteignent presque 100 % de confluence ; Cela prend généralement environ 3 à 4 jours.
    2. Retirez le milieu de prolifération et remplacez-le par un milieu de différenciation adipogénique pour induire l’adipogenèse. Compléter le milieu LG-DMEM avec 100 μg/mL de streptomycine, 100 U/mL de pénicilline, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B et le supplément adipogénique fourni dans la trousse d’identification fonctionnelle des cellules souches mésenchymateuses. Par la suite, changez le milieu doucement (0,5 mL/puits) tous les 3 jours et évitez de perturber les vacuoles lipidiques.
    3. Après environ 21 jours, à l’aide d’un examen microscopique, colorer les vacuoles lipidiques avec du rouge d’huile pour évaluer la différenciation adipogénique.
    4. Préparez une solution mère fraîche de rouge d’huile ; dissoudre 30 mg de colorant rouge d’huile dans 10 mL d’isopropanol et laisser reposer pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Ensuite, préparez une solution de travail en mélangeant 2 parties d’eau doublement distillée (ddH2O) avec 3 parties de solution mère, en les mélangeant bien et en la laissant reposer pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, filtrez à l’aide d’un filtre de 0,22 ou 0,45 μm.
      REMARQUE : Pour de meilleurs résultats de coloration, préparez fraîchement la teinture rouge huile.
    5. Pour une documentation réussie de la différenciation adipogénique, lavez les cellules deux fois avec du PBS et fixez-les avec du formol à 10 % tamponné neutre (0,75 ml/puits) pendant 15 min. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec du PBS à l’aide de 1 mL/puits (avant de jeter le PBS après chaque lavage, incubez les cellules pendant environ 5 min).
      REMARQUE : Les cellules maintenues dans des milieux de prolifération (décrites à l’étape 1.2) sont utilisées comme cellules témoins non induites. Ajoutez lentement du formol à tampon neutre sur les parois, et non directement sur les cellules, pour éviter les dommages cellulaires. Après le lavage final avec du PBS, l’aspiration complète du PBS est cruciale avant d’ajouter la solution de travail de coloration rouge huile pour éviter les taches inefficaces.
    6. Après le lavage final, colorez les cellules (1 mL/puits) avec une solution de travail Oil Red et incubez-les pendant 60 min à 37 °C. Ensuite, retirez et jetez la solution de coloration et rincez doucement les cellules deux fois avec du PBS. Ensuite, au microscope, observez les gouttelettes lipidiques colorées.
  2. Différenciation ostéogénique
    1. Remettez les cellules en suspension dans un milieu de prolifération complet (comme décrit à l’étape 1.2). Ensuite, dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits, ensemencez 7,4 x103 cellules/puits (ajouter 0,5 mL de milieu/puits) et incubez-les pendant 3 jours dans des conditions humides à 5 % de CO2 à 37 °C pour atteindre près de 70 % de confluence.
    2. À environ 70 % de confluence, remplacer les milieux de prolifération par des milieux d’induction de différenciation incorporant le supplément ostéogénique - fourni dans le kit d’identification fonctionnelle des cellules souches mésenchymateuses - dans un milieu LG-DMEM complété par 10 % de FBS, ainsi que 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 0,25 μg/mL d’amphotéricine B.
    3. Remplacez le milieu de différenciation une fois tous les 3 jours et poursuivez l’induction ostéogénique pendant environ 21 jours.
    4. Préparez une solution de travail de coloration rouge d’alizarine S ; apportez 9 mL de ddH2 Oet dissolvez-y 200 mg de colorant rouge d’alizarine S, puis utilisez de l’hydroxyde d’ammonium et du HCl pour ajuster le pH à 4,1-4,3. Ensuite, complétez le volume à 10 mL avec du ddH2O. Ensuite, filtrez la solution à l’aide d’un filtre (0,22 ou 0,45 μm) pour éliminer les précipités.
    5. À la fin de la période d’induction, rincez les cellules deux fois avec du PBS, puis fixez-les à l’aide de formol à 10 % tamponné neutre (0,75 ml/puits) et laissez-les reposer pendant 15 min. Ensuite, rincez les cellules deux fois avec du PBS (1 ml/puits) et assurez-vous d’incuber les cellules pendant 5 minutes à chaque rinçage.
      REMARQUE : Les cellules maintenues dans des milieux de prolifération (décrites à l’étape 1.2) sont utilisées comme cellules témoins non induites.
    6. Ajouter la solution de travail rouge d’alizarine à 2 % préparée à l’étape 3.2.4 aux cellules fixes de l’étape précédente et incuber dans l’obscurité pendant environ 45 à 60 minutes à température ambiante.
    7. Ensuite, jetez la solution de coloration et rincez les cellules avec du ddH2O deux fois, puis avec du PBS une fois, puis évaluez la différenciation ostéogénique réussie au microscope en observant la matrice extracellulaire riche en calcium colorée.
  3. Différenciation chondrogénique
    1. Remettez les cellules en suspension dans un milieu de prolifération complet (comme décrit à l’étape 1.2). Ensuite, dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits, ensemencez 7,4 x 103 cellules/puits (ajoutez 0,5 mL de milieu/puits) et incubez-les dans des conditions humides à 5 % de CO2 à 37 °C pendant 3 jours pour atteindre près de 90 % de confluence.
    2. À environ 90 % de confluence, commencer à induire la différenciation chondrogénique en utilisant du DMEM/F12 sans sérum complété par de l’insuline-transferrine sélénium (ITS) et un supplément chondrogénique - fourni avec le kit d’identification fonctionnelle des cellules souches mésenchymateuses - ainsi que 0,25 μg/mL d’amphotéricine B, 100 U/mL de pénicilline, 2 mM de L-glutamine et 100 μg/mL de streptomycine46.
      REMARQUE : Le milieu d’induction complet de différenciation chondrogénique est maintenu dans l’obscurité à 2-8 °C.
    3. Poursuivre l’induction de la différenciation chondrogénique pendant environ 21 jours ; Pendant ce temps, changez de support tous les 3 jours.
    4. Préparez la solution de travail de coloration au bleu d’Alcian comme suit : Préparez d’abord de l’acide acétique glacial à 3 % dans du ddH2O (ajoutez 3 ml d’acide acétique glacial et remplissez jusqu’à 100 ml avec du ddH2O). Ensuite, préparez une solution de coloration au bleu d’Alcian en ajoutant 20 mg à 20 ml de solution d’acide glaciaire à 3 %, en la maintenant au repos pendant environ 30 minutes, puis en filtrant à l’aide d’un filtre de 0,22 μm ou 0,45 μm pour éliminer les précipités.
    5. À la fin de la période d’induction, rincez les cellules deux fois avec du PBS, puis fixez-les à l’aide de formol tamponné neutre à 10 % (0,75 ml/puits) et laissez-les reposer pendant 15 min. Après cela, lavez les cellules deux fois avec du PBS (1 ml/puits). Assurez-vous d’incuber les cellules pendant 5 minutes à chaque fois.
      REMARQUE : Les cellules maintenues dans des milieux de prolifération (comme décrit à l’étape 1.2) sont utilisées comme cellules témoins non induites.
    6. Incuber les cellules fixes dans la solution de travail préparée à 0,1 % de bleu d’Alcian pendant environ 60 min à 37 °C. Rincez les cellules avec du ddH2O deux fois et avec du PBS une fois pour éliminer la coloration résiduelle. Ensuite, à l’aide d’un examen microscopique, observez les protéoglycanes sulfatés colorés.

4. Isolement des exosomes/sEVs à partir de milieux conditionnés par WJ-MSCs

  1. Remettre en suspension les CSM-WJ dans un milieu de prolifération complet (comme décrit à l’étape 1.2) et ensemencer des plaques de culture tissulaire à 6 puits avec ces CSM-WJ à une densité de 150 000 cellules/puits (milieu de 2 mL/puits) et les incuber à 37 °C dans des conditions humides à 5 % de CO2.
  2. Préparez le milieu de collecte d’exosomes sans sérum (SF) comme suit : Milieu modifié Dulbecco’s Eagle à faible teneur en glucose (LG-DMEM) complété par 2 mM de L-glutamine, 100 μg/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 0,25 μg/mL d’amphotéricine B.
    REMARQUE : Le milieu de collecte des exosomes a la même composition que le milieu de prolifération complet (décrit à l’étape 1.2), mais sans FBS.
  3. Suivez les plaques à 6 puits (préparées à l’étape 4.1) et remplacez le milieu tous les deux jours à l’aide du milieu de prolifération (comme décrit à l’étape 1.2). Observez les cellules au microscope jusqu’à ce qu’elles atteignent environ 75-80 % de confluence.
  4. Lorsque la confluence de 70 % est atteinte, laver les cellules deux fois avec du PBS (1 mL/puits), puis ajouter un milieu de collecte d’exosomes sans sérum (1,5 mL/puits) (décrit à l’étape 4.2) et incuber pendant 48 h à 37 °C dans des conditions humides à 5 % de CO2.
  5. Après 48 h, prélever les milieux conditionnés WJ-MSCs à partir des plaques de culture tissulaire à 6 puits placées à l’étape précédente dans des tubes de prélèvement par centrifugation de 15 mL. Ensuite, effectuez les étapes de centrifugation et de filtration séquentielles suivantes pour éliminer le média conditionnécollecté 47.
    REMARQUE : À l’aide d’un colorant d’exclusion au bleu de trypan suivi d’un comptage des cellules à l’aide de l’hémocytomètre, évaluer le pourcentage de viabilité des cellules initialement utilisées pour obtenir le milieu conditionné recueilli ; Les cellules viables doivent idéalement être supérieures à 90 %. Ensuite, stockez la pastille de cellule collectée à -80 °C au cas où elle serait nécessaire pour de futures investigations.
    1. Centrifuger le milieu conditionné collecté à 300 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer toutes les cellules en suspension. Ensuite, collectez le surnageant et effectuez l’étape de centrifugation suivante pour ce surnageant collecté (milieu conditionné).
    2. Centrifuger le milieu conditionné obtenu à l’étape 4.5.1 à 3000 x g pendant 15 min à 4 °C pour éliminer les cellules nécrotiques ainsi que les débris cellulaires.
      REMARQUE : Les étapes de centrifugation sont de préférence effectuées à 4 °C, mais peuvent également être effectuées à température ambiante avec des résultats similaires.
    3. Filtrez le surnageant obtenu à l’étape précédente en le passant à travers un filtre de 0,22 μm dans un tube de polypropylène de collecte neuf de 50 mL pour éliminer tous les débris cellulaires résiduels et les gros VE.
      REMARQUE : Le média filtré conditionné peut être utilisé immédiatement pour les étapes ultérieures d’isolement des exosomes/sEV, stocké au réfrigérateur à 4 °C et utilisé pendant pas plus de 3 jours, ou stocké à -80 °C pour un stockage à long terme jusqu’à ce que l’isolement des exosomes/sEV soit nécessaire. Il est préférable que les fluides conditionnés nettoyés et stockés à -80 °C soient traités dans un délai maximum de 1 à 3 mois ; le plus tôt sera le mieux.
  6. Placer 7,5 mL de milieu conditionné effacé (obtenu à l’étape 4.5) dans un tube à centrifuger de 15 mL et ajouter 1,5 mL de réactif. Ajouter le réactif au milieu dans un rapport de 1:5 (c.-à-d. 1 mL de réactif de précipitation Exoquick-TC pour 5 mL de milieu). Ensuite, retournez le tube de haut en bas et agitez-le plusieurs fois pour assurer un bon mélange du réactif de précipitation avec le milieu.
    REMARQUE : Le réactif précipitant est un réactif lourd et visqueux. Ainsi, le volume requis doit être retiré lentement et soigneusement pour s’assurer que le volume prévu est complètement transféré.
  7. Conservez le tube contenant le milieu avec le réactif de précipitation à 4 °C en position verticale debout pendant une nuit d’environ 16 h (au moins 12 h).
  8. Le lendemain, centrifuger le mélange mili/réactif de précipitation à 1500 x g pendant 30 min à 4 °C. Après centrifugation, la pastille d’exosomes/sEVs se présente sous la forme d’une très petite pastille blanche ou beige qui s’est déposée au fond du tube.
    REMARQUE : Cette étape de centrifugation peut également être effectuée à température ambiante avec des résultats similaires. Dans le cas où la pastille d’exosome/sEVs n’est pas visible à la fin de cette étape de centrifugation, un temps de centrifugation supplémentaire à 3000 x g pendant 20 à 30 min supplémentaires à 4 °C peut être ajouté. Parfois, la pastille d’exosomes/EVs reste invisible même après le temps de centrifugation prolongé, ce qui signifie qu’il y a une petite quantité d’exosomes/sEVs. Dans ce cas, procédez au protocole en laissant le fond 5-10 μL du tube.
  9. Aspirer le surnageant et centrifuger le mélange de milieu résiduel/réactif de précipitation à 1500 x g pendant 5 min à 4 °C. Ensuite, très soigneusement, aspirez les traces de liquide restantes sans perturber les exisosomes/sEVs précipités.
  10. Suspendre les exisosomes/sEVs dans 100-300 μL de PBS stérile en fonction de la taille et de la visibilité des granulés. Ensuite, ces exosomes/sEV peuvent être soit utilisés immédiatement, soit stockés dans un ultra-congélateur à -80 °C pour des expériences ultérieures.
    REMARQUE : Dans le cas où vous commencez avec plus d’un tube de centrifugation pour le même milieu (décrit à l’étape 4.9), et que les pastilles d’exosomes/sEVs (obtenues à l’étape 4.10) sont invisibles, les pastilles d’exosomes/sEVs collectées sur chacun d’eux peuvent être regroupées en utilisant environ 100 à 300 μL de PBS stérile pour suspendre tous les granulés regroupés.
  11. Quantifier les exosomes/sEV collectés en fonction de leur teneur en protéines à l’aide d’une trousse de quantification des protéines d’acide bicinchoninique (BCA) disponible dans le commerce, comme indiqué par le fabricant.
    REMARQUE : La figure 2 présente une présentation schématique de toutes les étapes d’isolement des exosomes/sEV dérivés des WJ-MSCs.

5. Imagerie d’exosomes/sEVs isolés par microscopie électronique à transmission (MET)

  1. Mettre en suspension des exosomes/sEV fraîchement isolés dans 100 à 300 μL de PBS stérile en fonction de la taille et de la visibilité des pastilles (comme décrit précédemment à l’étape 4.11).
    REMARQUE : Il est de loin préférable d’utiliser des exosomes/sEV fraîchement isolés plutôt que congelés pour l’imagerie TEM
  2. Pipeter 20 μL de suspension d’exosomes/sEVs sur une grille recouverte de carbone et laisser sécher pendant 10 min.
  3. Fixez les exosomes/sEV placés à l’aide d’une solution de glutaraldéhyde (2 % dans de l’eau distillée) pendant environ 15 min.
  4. Ensuite, colorez les exosomes/sEV fixes avec de l’acétate d’uranyle à 2 % et laissez-les pendant environ 3 minutes dans l’obscurité, puis examinez-les au microscope électronique à transmission (TEM) (grossissement de 20000) en utilisant les paramètres TEM par défaut.

6. Détermination de la taille moyenne d’exosomes/sEVs isolés à l’aide d’un analyseur de taille de particules

  1. Diluer des exosomes/sEV fraîchement isolés avec du PBS stérile pH 7,4 dans un rapport de 1:250.
  2. Mesurez la distribution granulométrique moyenne d’exosomes/sEV isolés à l’aide d’un analyseur de taille de particules à 25 °C.

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Résultats

Isolement et caractérisation des WJ-MSCs

Comme le montre la figure 3, de petites cellules semblables à des fibroblastes sont apparues sous et autour des tissus des explants WJ dans les 5 à 10 jours suivant l’ensemencement de ces explants (Figure 3A). Ces WJ-MSC libérés continuent de proliférer et atteignent généralement...

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Discussion

Dans ce protocole, nous avons pu présenter des étapes détaillées pour isoler les WJ-MSCs du tissu humain de la CU et également pour isoler leurs exosomes/sEVs dérivés. La CU est une source non invasive inexploitée facilement accessible pour obtenir des CSM, et aucun équipement spécial pour la collecte ou le traitement n’est nécessaire 11,15,30,32,48....

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Déclarations de divulgation

Tous les co-auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts associé à ce travail.

Remerciements

Ce travail a été partiellement financé par l’Université Ain Shams - Subvention de soutien à la recherche du plan stratégique (2024/2025), Égypte, et le Centre de recherche en nanotechnologie (NTRC) - Prix d’accès (2019/2020), Université britannique en Égypte (BUE), Le Caire, Égypte.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, États-UnisA3157
Alizarin Red SSigma-Aldrich, États-UnisA5533
Hydroxyde d’ammoniumFisher Scientific, Allemagne1336-21-6
Anticorps pour l’humain CD-105, FITCR& D systems Inc., MN, États-UnisFAB10971F
Anticorps pour l’humain CD-14, PEBeckman Coulter, États-UnisIM0650U
Anticorps pour l’humain CD-34, PEBeckman Coulter, États-UnisIM1420
Anticorps pour l’humain CD-44, PEBeckman Coulter, États-UnisA32537
Anticorps pour l’humain CD-73, PER& D systems Inc., MN, États-UnisFAB5795P
Anticorps pour l’humain CD-90, PER& D systems Inc., MN, États-UnisFAB2067P
Anticorps pour l’HLA-DR HUMAIN, FITCBeckman Coulter, États-UnisIM1638U
Kit de quantification des protéines à base d’acide bicinchoninique (BCA)Thermofisher23227
Armoire de biosécurité, écoulement laminaire, MSC AdvantageThermo Scientific, États-Unis
CO2Incubateur, Forma DirectThermo Scientific, États-Unis
Centrifugeuse de refroidissementSigma, Allemagne
Centrifugeuse de refroidissementEppendorf, Allemagne
CytoFLEX CytoFLEX Flow Cytomètre   ;Beckman Coulter, FL, États-Unis
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Fisher Scientific, AllemagneBP231-100
DMEM - Faible glucose 1 g/LLonza, Suisse12-707F
DMEM/F12  ;Lonza, Suisse12-719F
Eau sans ADNSE/ARNAseGibco Thermo Fisher, États-Unis10977-035
Éthanol absolu, grade en biologie moléculaireSigma-Aldrich, Allemagne24103
ExoQuick-TCBiosciences des systèmes (SBI), États-UnisEXOTC50A-1Agent précipitant
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibco Thermo Fisher, Brésil10270-106
Formaldéhyde 37 %Fisher ScientificBP531-500
Acide acétique glaciaireSigma Aldrich, AllemagneA38S-500
Solution de glutaraldéhyde   ;SigmaG7776
Acide chlorhydrique (HCl)Fisher Scientific, AllemagneA144-212
Microscope inverséOlympus, Japon
L-GlutamineGibco Thermo Fisher, États-Unis25030-024
Kit d’identification fonctionnelle des cellules souches mésenchymateuses   ;R& D systems Inc., MN, États-UnisSC006
Lecteur de microplaquesChromate, Awareness Technologies, États-Unis
Tache rouge huileSigma-Aldrich, États-UnisO0625
Pénicilline-Streptomycine-AmphotéricineGibco Thermo Fisher, États-Unis15240062
Solution sésale tamponnée au phosphate, 1x, sans Ca/MgLonza, SuisseBE17-516F
Bain d’eau secouéDaihan Wisebath, Corée
Filtre à seringue, 0,2 micronCorning, États-Unis431224
Microscope électronique à transmissionJEM-1200EX II, Jeol, Allemagne
Bleu de Trypan  ;Gibco Thermo Fisher, États-Unis15250061
Trypsine-Versène-EDTA, 1xLonza, SuisseCC-5012
Solution d’acétate d’uranyle (2 %)Electron Microsopy Sciences, États-Unis22400-2
Spectrophotomètre UV-VisibleShimadzu, Japon
TourbillonSciLogex
Zeta-sizer Nano ZNMalvern Panalytical Ltd, Royaume-Uni & nbsp ;Analyseur de taille de particule

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