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Article de méthode

Cultiver un biofilm polymicrobien pertinent pour la fibrose kystique afin de sonder les phénotypes des communautés

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DOI :

10.3791/66785

⸱

19 avril 2024

 , 
1Département de Biologie, Université de Sherbrooke

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit un modèle de biofilm polymicrobien de quatre espèces de fibrose kystique pertinent pour les poumons qui peut être utilisé pour explorer l’impact des interactions bactériennes interespèces.

Résumé

La plupart des modèles in vitro n’ont pas la capacité de sonder pleinement les phénotypes bactériens émergeant des interactions complexes observées dans des environnements réels. Cela est particulièrement vrai dans le contexte des infections chroniques et polymicrobiennes difficiles à traiter détectées dans les voies respiratoires des personnes atteintes de mucoviscidose, une maladie génétique multiviscérale. Bien que de nombreuses études sur le microbiome aient permis de définir les compositions microbiennes détectées dans les voies respiratoires des personnes atteintes de mucoviscidose, aucun modèle in vitro n’a jusqu’à présent pleinement intégré les caractéristiques pulmonaires critiques pertinentes à la mucoviscidose. Par conséquent, il existe une lacune importante dans les connaissances sur la capacité d’étudier les mécanismes à l’origine de la pathogenèse des infections pulmonaires de la mucoviscidose d’espèces mixtes. Ici, nous décrivons un modèle de communauté microbienne de quatre espèces récemment développé, y compris Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis et Prevotella melaninogenica cultivés dans des conditions similaires à celles de la mucoviscidose. Grâce à l’utilisation de ce système, des phénotypes cliniquement pertinents, tels que la récalcitrance antimicrobienne de plusieurs agents pathogènes, ont été observés et explorés au niveau moléculaire. L’utilité de ce modèle in vitro réside dans son flux de travail standardisé qui peut faciliter l’étude des interactions interespèces dans le contexte des infections pulmonaires chroniques de la mucoviscidose.

Introduction

Les stratégies visant à éradiquer les microbes pathogènes tels que ceux détectés dans les voies respiratoires de la fibrose kystique (FK), une maladie génétique multiviscérale, échouent souvent1. C’est-à-dire que la présence de communautés microbiennes résilientes semblables à un biofilm qui se développent dans l’environnement pulmonaire riche en mucus peut provoquer des infections chroniques s’étendant sur plusieurs décennies2. De plus, bien que l’utilisation d’antimicrobiens de première ligne (Abx) et de modulateurs ait entraîné de meilleurs résultats chez les personnes atteintes de FK, l’approche clinique « un insecte, une infection » généralement employée contre les agents pathogènes canoniques de la FK tels que Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus s’est avérée inefficace pour résoudre les infections difficiles à traiter détectées dans les poumons de ces personnes 3,4, 5, 6, 7.

Au cours des deux dernières décennies, de nombreuses études ont changé notre compréhension de la maladie pulmonaire chronique de la mucoviscidose8. C’est-à-dire que les rapports indiquent que les infections détectées dans les voies respiratoires des personnes atteintes de fibrose kystique ne sont pas causées uniquement par un seul agent pathogène, mais sont plutôt de nature polymicrobienne8. De plus, bien que la pathogenèse des infections pulmonaires mixtes de la mucoviscidose soit encore mal comprise, les preuves cliniques montrent que les personnes atteintes de fibrose kystique qui sont co-infectées par S. aureus et P. aeruginosa dans leurs voies respiratoires ont une fonction pulmonaire plus détériorée que les individus colonisés par l’un ou l’autre de ces deux agents pathogènes9.

On suppose que les interactions interespèces entre les agents pathogènes de la mucoviscidose sont l’une des raisons pour lesquelles les infections à base de biofilm polymicrobien ne sont pas facilement éradiquées par l’utilisation de traitements de la mucoviscidose, ce qui finit par avoir un impact sur les résultats pour les patients3. À l’appui de cette affirmation, des études in vitro ont démontré que les interactions entre des microbes tels que P. aeruginosa, S. aureus et d’autres peuvent avoir un impact sur des phénotypes cliniquement pertinents tels que la réactivité d’Abx aux médicaments de première ligne contre la mucoviscidose, y compris la vancomycine et la tobramycine 6,10,11. Par conséquent, il reste à revoir les stratégies de traitement actuelles visant à éradiquer les agents pathogènes de la mucoviscidose dans le contexte des infections d’espèces mixtes.

L’étalon-or dans la prise en charge des infections pulmonaires microbiennes de la mucoviscidose repose en grande partie sur l’utilisation de tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST) pour guider les interventions cliniques12. Cependant, l’AST est généralement effectuée à l’aide de monocultures bactériennes cultivées dans des cultures riches et bien mélangées, ce qui ne reflète pas les conditions de croissance microbienne détectées dans les voies respiratoires de la mucoviscidose 3,13. Compte tenu de l’écart important entre les résultats pour les patients et le succès du traitement, les rapports cliniques préconisent maintenant le développement de nouvelles approches intégrant les caractéristiques critiques du poumon de la mucoviscidose12,14.

Peu d’études ont mis au point des systèmes multi-espèces bactériens pertinents pour la mucoviscidose in vitro contenant plus de deux agents pathogènes15,16. Cependant, ces modèles (1) ne reflètent pas entièrement la nature polymicrobienne et semblable à un biofilm du poumon de la mucoviscidose et (2) n’utilisent pas de conditions nutritionnelles et environnementales se rapprochant de celles détectées dans les voies respiratoires de la mucoviscidose15,16. Grâce à l’exploitation de grands ensembles de données et au calcul de grands ensembles de données sur les gènes de l’ARNr 16S dérivés de poumons de la FK, Jean-Pierre et ses collègues ont récemment mis au point un modèle de co-culture in vitro intégrant les caractéristiques mentionnées ci-dessus10. Ce système comprend P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. et Prevotella spp. cultivés dans des conditions semblables à celles des voies respiratoires de la mucoviscidose et stables jusqu’à 14 jours. Les auteurs ont également signalé une croissance spécifique de Prevotella spp. et plusieurs changements dans la réactivité Abx de ces agents pathogènes de la mucoviscidose par des mécanismes qui restent à identifier10. Ce système in vitro traitable a également offert la possibilité d’approfondir des questions à focalisation mécanique liées à la récalcitrance Abx d’une variante commune de P. aeruginosa fréquemment détectée dans les voies respiratoires de pwCF10. Par conséquent, l’objectif de ce protocole est de fournir à la communauté de recherche sur la fibrose kystique un flux de travail expérimental normalisé pour cultiver un biofilm in vitro qui a le potentiel d’être élargi pour s’attaquer à un certain nombre de questions pertinentes pour la fibrose kystique.

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Protocole

Les détails de tous les réactifs et équipements sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation d’un milieu d’expectoration artificiel

REMARQUE : Tout au long de ce protocole, le milieu artificiel d’expectoration (ASM) est défini comme le milieu pertinent pour la FC modifié à partir de SCFM2, précédemment publié par Turner et ses collègues17. Vous trouverez ci-dessous une description des étapes de préparation de ce support. Voir la table des matériaux pour faire des solutions mères et les conditions de stockage. Cette version de l’ASM diffère de celle de Turner et al.17 , car le pouvoir tampon de la version originale ne permet pas d’obtenir un pH stable dans le temps. C’est-à-dire que l’activité de fermentation exercée par Streptococcus spp. et les anaérobies comme Prevotella spp. entraîne l’acidification du milieu de croissance (observations non publiées). Par conséquent, la concentration en acide 3-morpholinopropane-1-sulfonique (MOPS) a été ajustée de 10 mM à 100 mM.

REMARQUE : La préparation d’une solution mère 2x ASM base (ASMb) facilite l’ajout de composants tels que la mucine, la gélose, l’eau, etc., sans affecter la concentration finale des molécules présentes dans ASM10,18. Les 2x ASMb peuvent être préparés à l’avance et conservés à 4 °C jusqu’à deux semaines dans un endroit sombre. Si le milieu jaunit, jetez-le.

  1. Pour préparer 2x huile de base ASM, dans un bécher propre contenant 400 mL de diH2O, ajoutez ce qui suit en remuant :
    1. Ajouter 6,50 mL d’un 0,2 M NaH2PO4. H2O stock ; 6,25 mL d’une crosse de 0,2 M Na2HPO4  ; 348 μL d’une crosse KNO3 de 1 M ; 1,084 mL d’une crosse de 0,25 M K2SO4 .
    2. Ajouter 4,0 g de levure synthétique sans tryptophane ; 3,032 g de NaCl ; 20,92 g de MOPS ; 1,116 g de KCl et 0,124 g de NH4Cl.
    3. Ajouter 9,30 mL d’un bouillon d’acide L-lactique de 1 M ; 2,70 mL d’un stock de glucose de 1,1 M ; 1,75 mL d’une pâte de 1 M CaCl2,2H 2O ; 1,20 mL d’un stock de N-acétylglucosamine de 0,25 M et 1,00 mL d’un stock de FeSO 4,7H 2O de 3,6 mM.
    4. Ajouter 660 μL d’une pâte de tryptophane de 0,1 M ; 606 μL d’une crosse de 1 M MgCl2.6H 2O ; 0,60 g d’acide désoxyribonucléique provenant de spermatozoïdes de hareng ; 400 μL d’un stock de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC) de 250 mg/mL.
    5. Une fois tous les composants ajoutés, ajustez le pH à 6,80 avec un stock de NaOH de 5 M. Compléter à 500 mL avec du diH2O. Stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 μm et conserver à 4 °C.
  2. Pour préparer un bouillon de mucine de 10 mg/mL (2x), utilisez une bouteille en verre propre contenant 250 mL dediH2O et en remuant :
    1. Ajouter 5,0 g de mucine de l’estomac porcin - Type II. Mélangez la suspension pendant 10 min. Compléter à 500 mL avec diH2O.
    2. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Conserver à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
  3. Reconstituer l’ASM.
    REMARQUE : Cette étape doit être effectuée le jour de l’expérience.
    1. Mélangez un rapport volumique de 1:1 entre le stock ASMb 2x et le stock de mucine 10 mg/mL.
    2. Agitez soigneusement avant utilisation.

2. Préparation de milieux sélectifs de communautés polymicrobiennes

REMARQUE : Vous trouverez ci-dessous les quantités nécessaires pour préparer un volume de 1 L de support.

  1. Pour préparer la gélose au sel de mannitol (MSA) et la gélose d’isolement à Pseudomonas (PIA), suivez les instructions du fabricant.
  2. Pour préparer la gélose sélective Prevotella (PSA), dans une bouteille en verre propre, ajoutez ce qui suit :
    1. 30,0 g de bouillon de soja tryptique (TSB). 15,0 g d’agar-agar. 5,00 g d’extrait de levure. 0,50 g de chlorhydrate de L-cystéine.
    2. 10,0 mL d’un stock d’hémine de 0,5 mg/mL. 100 μL d’un stock de ménadione à 10 mg/mL.
    3. Ajouter 940 mL de diH2O et remuer. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.
    4. Une fois refroidi (c’est-à-dire que la bouteille peut être tenue à mains nues), ajoutez en remuant : 50,0 ml de sang de mouton défribriné. 2,00 mL d’un stock de kanamycine à 50 mg/mL. 150 μL d’un stock de vancomycine à 50 mg/mL. 500 μL d’une pâte de polymixine B de 10 mg/mL.
  3. Pour préparer la gélose sélective à streptocoques (SSA), dans une bouteille en verre propre, ajoutez ce qui suit :
    1. 30,0 g de TSB. 15,0 g d’agar-agar.
    2. Ajouter 950 mL de diH2O et remuer. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.
    3. Une fois refroidi (c’est-à-dire que la bouteille peut être tenue à mains nues), ajoutez en remuant : 50,0 ml de sang de mouton défribriné. 1,00 mL d’une pâte de polymixine B de 10 mg/mL. 1,00 mL d’un stock d’acide oxolinique de 10 mg/mL.
      REMARQUE : Verser dans des assiettes et conserver à 4 °C pendant un mois maximum. Avant utilisation, laissez sécher les plaques à température ambiante jusqu’à 24 h à l’avance avant de les inoculer. Le PSA a été validé avec P. melaninogenica et Prevotella intermedia. L’ASS a été validée avec S. sanguinis et le groupe des Streptococcus milleri (Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius et Streptococcus anginosus, désigné SMG). Il est fortement recommandé de valider de novo ces milieux sélectifs si de nouvelles souches doivent être testées.

3. Préparation des milieux liquides bactériens et conditions de croissance

  1. Pour cultiver régulièrement P. aeruginosa et S. aureus, utilisez un milieu riche stérile (p. ex. bouillon de lysogénie ou TSB).
    1. Commencez les nuits de liquide en prélevant une seule colonie préalablement cultivée sur une plaque gélosée LB/TSB pendant 20 à 24 h à 37 °C.
    2. Cultivez les cultures de bouillon à 37 °C pendant la nuit en secouant à 250 tr/min pendant 16 à 18 h.
  2. Pour cultiver Streptococcus spp., utilisez du bouillon Todd Hewitt stérile complété par 0,5 % d’extrait de levure (THB-YE).
    1. Commencer la culture liquide pendant la nuit à partir d’une seule colonie préalablement cultivée sur une plaque de gélose TSB complétée par 5 % de sang de mouton défibriné (plaque de gélose au sang) pendant 24 h à 37 °C + 5 % de CO2.
    2. Cultivez les cultures de THB-YE en anaérobie ou à 37 °C + 5 % CO2 pendant la nuit sans agiter pendant 18 à 22 h.
  3. Pour cultiver Prevotella spp., préparez 1 L de milieu de croissance Prevotella (MGP) en ajoutant les éléments suivants dans une bouteille propre :
    1. 30,0 g de TSB. 5,00 g d’extrait de levure. 0,50 g de chlorhydrate de L-cystéine. 10,0 mL d’un stock d’hémine de 0,5 mg/mL et 100 μL d’un stock de ménadion de 10 mg/mL.
    2. Ajouter 990 mL de diH2O. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min. Enveloppez la bouteille dans du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière.
    3. Cultivez les colonies de Prevotella spp. sur une plaque de gélose au sang incubée en anaérobie à 37 °C pendant 48 h.
    4. Inoculer une seule colonie de MGP et cultiver pendant la nuit sans secouer à 37 °C en anaérobie pendant 24 h.
      REMARQUE : Les MGP peuvent être conservés à température ambiante jusqu’à deux semaines. Il est fortement recommandé d’effectuer des tests de stérilité sur chaque milieu de culture avant utilisation. Si vous n’utilisez pas de chambre anaérobie, il peut être nécessaire de commencer des nuits liquides de Prevotella spp. à partir d’une parcelle de colonies.

4. Préparation de l’expérience de co-culture

REMARQUE : La figure 1 représente un résumé du flux de travail expérimental. La mise en place de l’expérience peut se faire dans des conditions oxiques si le temps de préparation est inférieur à 1 h. Si l’on s’attend à ce que cela prenne plus de temps, il est fortement recommandé d’effectuer l’expérience à l’aide d’une chambre anaérobie (avec 10 % de CO2, 10 % de H2 et 80 % de gaz mélangé N2 ). Des bocaux anaérobies peuvent également être utilisés pour incuber les échantillons expérimentaux.

  1. Préparation des monocultures et co-cultures
    REMARQUE : Effectuez toutes les étapes de centrifugation à 10 000 x g pendant 2 min à température ambiante. Pour les co-cultures, mélangez les échantillons bactériens juste avant d’inoculer les plaques de 96 puits. En règle générale, un volume de 1 mL pour les souches de P. aeruginosa et de S. aureus est prélevé dans les cultures de nuit. Pour Streptococcus spp. et Prevotella spp., les volumes pendant la nuit peuvent varier entre 2 et 4 mL. Ces volumes peuvent être ajustés en fonction du nombre de conditions à tester.
    1. À l’aide du liquide bactérien des cultures de nuit, effectuez les étapes suivantes :
      1. Pour les souches de P. aeruginosa et de S. aureus , laver deux fois avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
      2. Pour Streptococcus spp. et Prevotella spp., laver une fois avec du PBS stérile.
        REMARQUE : Utilisez une pipette pour jeter soigneusement les surnageants, car les granulés peuvent facilement être perdus.
      3. Après les lavages, remettre en suspension chaque granule dans 1 mL d’ASMb dilué dans l’eau.
      4. Faites une dilution de 1:10 de chaque échantillon dans du PBS stérile et mesurez la DO600.
      5. Ajustez toutes les cultures à un OD600 de 0,2 en ASM.
      6. À l’aide des suspensions DO600 = 0,2, diluer dans l’ASM les échantillons bactériens jusqu’à une DOfinale de 600 de 0,01 (pour chaque microbe) pour les monocultures et les co-cultures.
      7. Vortex à fond pendant 5 s.
        REMARQUE : Par exemple, pour préparer un total de 1 mL de suspension d’ASM en monoculture de P. aeruginosa à600 OD = 0,01, ajoutez 50 μL de P. aeruginosa à600 OD = 0,2 à un volume de 950 μL d’ASM. Pour la coculture, prélever 50 μL de chaque suspension de P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. et Prevotella spp. à une DOde 600 = 0,2 et ajouter à 800 μL d’ASM.
      8. À l’aide d’une pipette, ajouter 100 μl de suspensions de monoculture et de coculture dans trois puits séparés d’une plaque en plastique stérile à fond plat à 96 puits.
      9. Incuber la plaque (sans agiter) pendant 24 h à 37 °C dans des conditions anoxiques.
        REMARQUE : D’autres tensions d’oxygène (par exemple, microxie, normoxie) peuvent également être utilisées ici. Cependant, le modèle a été développé et validé dans des conditions anoxiques. Confirmez l’inoculum de départ en diluant en série les suspensions bactériennes de mono et de co-culture, et le placage sur PIA, MSA, SSA et PSA est fortement recommandé. La concentration initiale visée pour chaque espèce bactérienne est de 1 × 10à 7 UFC/mL (P. aeruginosa), de 3,5 × à 106 UFC/mL (S. aureus), de 1,2 × à 106 UFC/mL (Streptococcus spp.) et de 4,6 × 10à 6 UFC/mL (Prevotella spp.). L’inoculum bactérien peut également être modifié, comme le décrivent Jean-Pierre et ses collègues10.
  2. Remplacez le média après la formation du biofilm.
    1. Après 24 h d’incubation, prélever les cellules non attachées (planctoniques) par aspiration à l’aide d’une pipette multicanaux.
    2. Réapprovisionnez les biofilms préformés avec 100 μL d’ASM frais ou le traitement souhaité (par exemple, antibiotiques, métabolites, etc.).
    3. Incuber la plaque pendant 24 h supplémentaires à 37 °C dans des conditions anoxiques.
      REMARQUE : Ces étapes peuvent être effectuées en aérobie si elles sont effectuées rapidement (c’est-à-dire moins de 1 min). Sinon, veuillez utiliser une chambre anaérobie.

5. Collecte et placage des échantillons

  1. Après les 24 heures supplémentaires d’incubation, aspirez les cellules non attachées (planctoniques) à l’aide d’une pipette multicanaux.
    REMARQUE : La fraction planctonique peut être conservée, diluée en série et plaquée sur des milieux sélectifs ou jetée.
  2. Lavez délicatement les biofilms deux fois avec 125 μL de PBS stérile et jetez les volumes.
  3. Ajoutez 50 μL de PBS stérile et détachez les biofilms en grattant doucement les cellules de la plaque à l’aide d’un réplicateur à 96 broches.
  4. Transférez les cellules de biofilm remises en suspension dans la rangée A d’une nouvelle plaque stérile à 96 puits.
    REMARQUE : La plaque à 96 puits contiendra du PBS stérile dans les rangées B à H.
  5. Effectuez une dilution en série de 10x des fractions planctoniques (si nécessaire) et du biofilm.
  6. Déposer 3 à 5 μL de chaque échantillon de dilution sur PIA, MSA, SSA et PSA.
  7. Laissez sécher les points d’inoculation.

6. Incubation des plaques sélectives et comptage des unités formant colonies (UFC)

  1. Pour P. aeruginosa et S. aureus, incuber à 37 °C pendant 18 à 20 h.
  2. Pour Streptococcus spp, incuber à 37 °C dans des conditions anoxiques pendant 24 h.
  3. Pour Prevotella spp, incuber à 37 °C dans des conditions anoxiques pendant 48 h.
  4. Après l’incubation, comptez les colonies (~10-35 par endroit) et calculez l’UFC par ml.
  5. Tracez les données à l’aide d’un outil de visualisation.

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Résultats

Comme le montre la figure 2, plusieurs phénotypes ont été rapportés, notamment (1) une réduction du nombre de cellules viables de P. aeruginosa et de S. aureus lors de la culture de communautés planctoniques mixtes par rapport à la monoculture, (2) une augmentation de la croissance polymicrobienne des cellules de S. sanguinis et, (3) une croissance des communautés mixtes de P. melaninogenica comme précédemment rapporté par Jean-Pierre et ses collègues

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Discussion

L’utilité de ce système de co-culture in vitro cliniquement informé réside dans sa capacité à détecter des fonctions bactériennes spécifiques polymicrobiennes. C’est-à-dire que grâce à l’utilisation de ce modèle, nous avons signalé des phénotypes microbiens allant de la croissance spécifique à la communauté de Prevotella spp. (figure 2) à des changements de sensibilité à l’Abx de la FK de première ligne de P. aeruginosa, S. aur...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucune divulgation.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr George A. O’Toole et le Dr Thomas H. Hampton pour leur rôle important dans la conception et l’élaboration du modèle de communauté polymicrobienne in vitro . Nous remercions la Dre Sophie Robitaille pour ses commentaires utiles sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation de la fibrose kystique JEAN21F0 à F.J-P. La figure 1 du manuscrit a été créée à l’aide de BioRender.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Fisher ScientificNC0387928Préparez un stock de chloroforme à 250 mg/mL directement dans le flacon. Maintenir à -20° ;C. Concentration finale 200 &mu ; g/mL dans 2x base ASM.
Acide 3-morpholinopropane-1-sulfonique (MOPS)SigmaM1254Concentration finale 200 mM dans une base ASM 2X.
Réplicateur à 96 brochesFisher Scientific05-450-9Des réplicateurs jetables peuvent également être utilisés. Chat #NC1567338.
Plaque étalon stérile à 96 puits avec couvercleFisher Scientific62406-081
AgarFisher ScientificDF0145-17-0
AnaeroPack 2,5 L Pot rectangulaireFisher Scientific23-246-385
CaCl2*2H2O  ;Fisher ScientificC79-500Préparez un stock de 1 M dans l’eau et filtrez la stérilisation avec un 0,22 &mu ; Filtre M. Concentration finale 3,5 mM dans 2x base ASM.
mouton défribrinéPour préparer les plaques de croissance pour Streptococcus et Prevotella.
Acide désoxyribonucléique provenant de spermatozoïdes de harengSigmaD7290Concentration finale 1,2 mg/mL dans 2x base ASM.
FeSO4*7H2O  ;Fisher ScientificAA1449830Préparez un stock de 1 mg/mL (3,6 mM) dans de l’eau et filtrez, stérilisez avec un 0,22 &mu ; Filtre M. Conserver enveloppé dans du papier d’aluminium. Concentration finale 0,0072 mM dans 2x base ASM.
GasPaksFisher ScientificB260678
GlucoseFisher ScientificD16-3Préparer comme un stock de 20 % (1,1 m) dans de l’eau et stériliser par autoclave. Concentration finale 6 mM dans 2x base ASM.
HeminSigma51280Dissoudre 100 mg d’hémine dans 2 mL de 1 M de NaOH, puis augmenter le volume à 200 mL avec de l’eau. Conserver dans une bouteille ambrée ou une bouteille ordinaire enveloppée de papier d’aluminium à 4 °C.
K2SO4Fisher ScientificP304-500Préparer un stock de 0,25 M dans l’eau et filtrer stériliser avec un Filtre M. Concentration finale 0,54 mM dans 2x base ASM.
KanamycinePréparez une solution mère de 50 mg/mL dans de l’eau. Filtrer la stérilisation avec un 0,22 &mu ; m filtrer et stocker à 4 ° ;C.
KClFisher ScientificP217-500Concentration finale 30,0 mM dans 2x base ASM.
KNO3Fisher ScientificP263-500Préparez un stock de 1 M dans l’eau et filtrez-le pour le stériliser avec un 0,22 &mu ; Filtre M. Concentration finale 0,70 mM dans 2x base ASM.
Chlorhydrate de L-cystéineFisher ScientificAAA1038922
Acide L-lactique  ;SigmaL1750Préparez un stock de 1 M dans l’eau et filtrez pour le stériliser avec un 0,22 & Filtre M. Ajuster le pH à 7,0. Concentration finale 18,6 mM dans 2x base ASM.
L-TryptophaneSigmaT0254Préparez un stock de 0,1 M dans du NaOH 0,2 M et filtrez la stérilisation avec un & Filtre M. Conserver au réfrigérateur à 4 ° ; C enveloppé dans du papier d’aluminium. Concentration finale 0,132 mM dans 2x base ASM.
Mannitol Salt AgarFisher ScientificB11407Préparer en suivant les recommandations du fabricant.
MenadioneSigmaM5625Préparez une solution mère de 10 mg/mL dissoute dans de l’éthanol à 96-100 %. Conserver à 4 ° ; C enveloppé dans une feuille d’aluminium. Vortex avant utilisation.
MgCl2*6H2O  ;Fisher ScientificAA12288A9Préparez un stock de 1 M dans l’eau et filtrez, stérilisez avec un 0,22 &mu ; Filtre M. Concentration finale 1,21 mM dans 2x base ASM.
Mucine de l’estomac porcin - Type II  ;SigmaM2378Préparez un bouillon de 10 mg/mL (2x) dans de l’eau et mélangez soigneusement avant l’autoclavage. Maintenir à 4 °C.
Na2HPO4Fisher ScientificS375-500 Préparerun stock de 0,2 M dans l’eau et filtrer stériliser avec un Filtre M. Concentration finale 2,5 mM dans 2x base ASM.
N-acétylglucosaminenbsp ;SigmaA8625Préparez un stock de 0,25 M dans l’eau et filtrez-le pour le stériliser avec un produit de 0,22 & Filtre M. Conserver le stock réfrigéré à 4 °C. Concentration finale 0,6 mM dans 2x base ASM.
NaClFisher ScientificS271-500Concentration finale 103,7 mM dans 2x base ASM.
NaH2PO4*H2OFisher ScientificS369-500Préparer un stock de 0,2 M dans l’eau et filtrer la stérilisation avec un récipient de 0,22 &mu ; Filtre M. Concentration finale 2,6 mM dans 2x base ASM.
NaOHFisher ScientificS318-500Préparez une solution mère de 5 M. Utiliser pour ajuster le pH de la matière première de base ASM 2x.
NH4ClFisher ScientificA661-500Concentration finale 4,6 mM dans 2x base ASM.
oxoliniquePréparer une solution mère de NaOH à 10 mg/mL 0,5 M. Filtrer la stérilisation avec un 0,22 &mu ; m filtrer et stocker à 4 ° ;C.
Polymixine BPréparer une solution mère à 10 mg/mL dans l’eau. Filtrer la stérilisation avec un 0,22 &mu ; m filtrer et stocker à 4 ° ;C.
Pseudomonas Isolation Agar FisherScientificDF0927-17-1Préparer en suivant les recommandations du fabricant.
Todd Hewitt BrothFisher ScientificDF0492-17-6Préparer en suivant les recommandations du fabricant.
Bouillon de soja tryptiqueFisher ScientificDF0370-17-3Préparer en suivant les recommandations du fabricant.
VancomycinePréparez une solution mère à 50 mg/mL dans de l’eau. Filtrer la stérilisation avec un 0,22 &mu ; m filtrer et stocker à 4 ° ;C.
Extrait de levureFisher ScientificB11929
Levure synthétique sans tryptophane  ;SigmaY1876Concentration finale 8,0 mg/mL dans 2x base ASM.
Sang de Acide

Références

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