Cette étude présente un modèle orthotopique de cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) basé sur l’inoculation intrapulmonaire de sphéroïdes multicellulaires de cellules fluorescentes A549-iRFP. Le modèle récapitule les stades cliniques du CPNPC et répond au cisplatine, selon la surveillance dynamique in vivo de la fluorescence à grande longueur d’onde.
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Article de méthode
Construction d’un modèle de xénogreffe orthotopique du cancer du poumon non à petites cellules imitant la progression de la maladie et prédisant les activités médicamenteuses
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) est une maladie hautement létale avec un microenvironnement tumoral complexe et hétérogène. Actuellement, les modèles animaux courants basés sur l’inoculation sous-cutanée de suspensions de cellules cancéreuses ne récapitulent pas le microenvironnement tumoral dans le CPNPC. Nous décrivons ici un modèle murin de xénogreffe orthotopique de cancer du poumon qui utilise l’inoculation intrapulmonaire de sphéroïdes multicellulaires tridimensionnels (MCS). Plus précisément, des cellules CPNPC humaines fluorescentes (A549-iRFP) ont été cultivées dans des microplaques de 96 puits à faible fixation avec du collagène pendant 3 semaines pour former des MCS, qui ont ensuite été inoculées intercostalement dans le poumon gauche de souris nues athymiques pour établir le modèle orthotopique de cancer du poumon.
Par rapport à la lignée cellulaire A549 d’origine, le MCS de la lignée cellulaire A549-iRFP a réagi de la même manière aux médicaments anticancéreux. Le signal fluorescent à longue longueur d’onde des cellules A549-iRFP est fortement corrélé avec les marqueurs communs de la croissance des cellules cancéreuses, notamment le volume des sphéroïdes, la viabilité cellulaire et le niveau de protéines cellulaires, permettant ainsi un suivi dynamique de la croissance du cancer in vivo par imagerie fluorescente. Après l’inoculation chez la souris, la xénogreffe A549-iRFP MCS a progressé de manière fiable à travers des phases ressemblant étroitement aux stades cliniques du CPNPC, y compris l’expansion de la tumeur primaire, l’émergence de tumeurs secondaires voisines et les métastases des cellules cancéreuses au poumon droit controlatéral et aux organes distants. De plus, le modèle a répondu au médicament anticancéreux de référence du poumon, le cisplatine, avec la toxicité attendue et une progression plus lente du cancer. Par conséquent, ce modèle murin de xénogreffe orthotopique de CPNPC servirait de plate-forme pour récapituler la progression de la maladie et faciliter le développement de médicaments anticancéreux potentiels.
Introduction
Parmi tous les troubles oncologiques, le cancer du poumon est non seulement celui qui cause le plus de pertes de vie, mais qui compte également le deuxième plus grand nombre de nouveaux patients chaque année aux États-Unis. Cette tumeur maligne dévastatrice constitue un obstacle majeur dans les soins de santé modernes, appelant à une compréhension plus approfondie de sa biologie complexe et à des modalités thérapeutiques plus efficaces2. Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) représente 85 % des cancers du poumon et a tendance à se transformer en tumeurs solides3. L’un des principaux défis du cancer du poumon est le microenvironnement tumoral dynamique et hétérogène, qui influence profondément la progression du cancer et les réponses aux interventions thérapeutiques 4,5,6. Une meilleure compréhension de l’interaction entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement à différents stades du CPNPC nécessite des modèles pathologiques affinés qui récapitulent les caractéristiques histologiques de la progression du CPNPC.
À cet égard, les modèles animaux orthotopiques apparaissent comme une voie prometteuse pour la recherche sur le CPNPC. Contrairementaux modèles de xénogreffes sous-cutanées couramment utilisés7, les modèles orthotopiques présentent des cellules cancéreuses qui sont directement inoculées dans l’organe d’origine. Pour le cancer du poumon, cela signifie implanter des cellules cancéreuses directement dans le tissu pulmonaire 8,9. Par conséquent, les modèles orthotopiques du cancer du poumon imitent mieux le microenvironnement tumoral natif, y compris les tissus, les vaisseaux et les composants immunitaires voisins, améliorant ainsi leur pertinence physiologique et clinique.
Les sphéroïdes multicellulaires tridimensionnels (MCS) représentent une autre approche prometteuse pour récapituler les caractéristiques de l’environnement tumoral. La plupart des cancers sont caractérisés par leur microenvironnement tumoral complexe, y compris les diverses interactions cellule-cellule, la matrice extracellulaire et les gradients d’oxygène et de nutriments10,11. Les cultures cellulaires 2D traditionnelles n’ont pas la complexité spatiale et structurelle nécessaire pour récapituler ces caractéristiques spécifiques aux tumeurs12. En revanche, les MCS de taille appropriée présentent une structure hétérogène avec un noyau hypoxique et nécrotique, qui récapitule non seulement le microenvironnement intratumoral, mais aussi la barrière physiologique contre la pénétration des médicaments, qui est un mécanisme majeur de résistance aux médicaments dans le traitement anticancéreux 13,14,15.
Tirant parti à la fois des modèles animaux orthotopiques et des techniques de culture MCS, les MCS ont été inoculés à des souris immunodéprimées pour construire avec succès des modèles orthotopiques de cancer du sein et de cancer de la prostate16,17. Nous présentons ici la méthodologie détaillée pour construire et caractériser un modèle murin de xénogreffe orthotopique du cancer du poumon. Cette méthode utilise l’inoculation intrapulmonaire de MCS 3D dérivées de cellules cancéreuses du poumon humain fluorescentes (A549-iRFP)18. Ce modèle offre une occasion exceptionnelle d’observer la progression in vivo du cancer du poumon à travers des stades qui correspondent étroitement aux quatre stades cliniques du CPNPC. De plus, le cancer de xénogreffe de ce modèle a répondu au médicament anticancéreux du poumon cliniquement établi, le cisplatine.
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Protocole
L’étude sur les animaux a été réalisée avec l’approbation du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Pacifique (Protocoles sur les animaux 19R10 et 22R10). Huit souris nude athymiques mâles âgées de 5 à 6 semaines, pesant de 20 à 25 g, élevées avec le régime alimentaire pour rongeurs référencé et hébergées dans des conditions exemptes d’agents pathogènes (FPS), ont été utilisées pour la présente étude. Les cages, la litière et l’eau potable ont été autoclavées et changées régulièrement. Un schéma de l’inoculation tumorale chez la souris est illustré à la figure 1. Voir le Tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et instruments utilisés dans ce protocole.
1. Mise en place d’un MCS tridimensionnel des cellules A549-iRFP
- Incuber des cellules A549-iRFP (adénocarcinome pulmonaire humain) dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 à 37 °C et les cultiver dans un milieu de croissance complet DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin, 1 % de pénicilline-streptomycine et 1 μg/mL de puromycine.
- Implantez des cellules A549-iRFP dans des microplaques sphéroïdes à fond rond à très faible adhérence à 96 puits à une densité d’ensemencement de 4 000 cellules/puits, en utilisant 100 μL de milieu de croissance complet complété par 0,3 % de collagène.
- Centrifuger les microplaques à 300 × g pendant 7 min à 4 °C pour faciliter la formation du MCS. Examinez la morphologie du MCS au microscope pour vous assurer de l’agrégation cellulaire après centrifugation.
- Après 48 h, ajouter 100 μL de milieu de croissance complet dans chaque puits pour obtenir un volume total de 200 μL de milieu de croissance par puits.
- Remplacer 100 μL de milieu de croissance dans chaque puits par un milieu de croissance complet frais tous les deux jours.
2. Caractérisation du MCS A549-iRFP
- Observez et imagez la morphologie du MCS à l’aide d’un microscope et estimez le volume du MCS par simulation avec le logiciel référencé de MATLAB sur la base des images du microscope à contraste de phase.
- Ouvrez une image MCS dans le logiciel ImageJ.
- Utilisez les sélections à main levée pour sélectionner le bord du MCS et l’ajouter au gestionnaire de retour sur investissement.
- Cliquez sur Modifier | Sélection | Créez un masque.
- Cliquez sur Modifier | Inverser.
- Cliquez sur Fichier | Enregistrer sous | Tiff.
- Ouvrez le logiciel ReViSP.
- Ouvrez l’image TIFF enregistrée en cliquant sur Parcourir.
- Cliquez sur Démarrer pour terminer la simulation MCS.
- Mesurez le signal fluorescent iRFP à l’aide du système d’imagerie infrarouge sur le canal 700 nm et quantifiez le signal fluorescent à l’aide d’un logiciel (par exemple, Image Studio).
- Ouvrez le logiciel Image Studio.
- Dans l’onglet Canaux , sélectionnez 700 et Intensité = 5.
- Dans l’onglet Commandes de balayage , sélectionnez 84 μm, Moyen, 0,0 mm et Retourner l’image. Gardez tout le reste par défaut.
- Cliquez sur Démarrer pour lancer l’analyse.
- Évaluez et quantifiez la viabilité cellulaire à l’aide du test de viabilité cellulaire 3D selon le protocole du fournisseur.
- Évaluez et quantifiez les protéines cellulaires à l’aide du dosage BCA conformément au protocole du fournisseur.
3. Sélection MCS pour l’inoculation tumorale
REMARQUE : Une fois que les MCS ont été ensemencés dans des microplaques sphéroïdes et cultivés pendant 2 à 3 semaines avec un échange régulier de milieu de croissance, sélectionnez les MCS avec les caractéristiques appropriées suivantes pour l’inoculation tumorale.
- Observez la morphologie du MCS au microscope et choisissez un MCS de forme ronde avec des bords globalement lisses mais avec 5 à 10 bourgeonnements grossiers (flèches sur la figure 2F) et un diamètre compris entre 700 et 800 μm.
- Mesurez la fluorescence de l’iRFP (reportez-vous à l’étape 2.2) et sélectionnez le MCS dont les signaux fluorescents se situent à moins d’un écart-type de la moyenne.
4. Inoculation intrapulmonaire du MCS
REMARQUE : Utilisez un spray d’alcool isopropylique à 70% pour nettoyer le poste chirurgical et les outils avant de manipuler les animaux.
- Anesthésier chaque souris avec une injection IP de 80 mg/kg de kétamine et de 12 mg/kg de xylazine ; Pincez les pieds de la souris avec une pince pour assurer une anesthésie complète.
- Injecter 10 μL de chlorhydrate de buprénorphine (0,3 mg/mL) par voie sous-cutanée pour réduire la douleur.
- Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir le dessèchement.
- Placez la souris en posture dorsale et fixez les membres en position d’étirement avec des rubans.
- Stérilisez la peau du dos avec des bâtonnets d’azote et d’alcool.
- Faites une incision de 0,5 à 1 cm à l’aide de ciseaux chirurgicaux sur le côté arrière gauche (figure 1B). Utilisez soigneusement des pinces pour séparer les tissus musculaires et adipeux jusqu’à ce que la paroi thoracique et le mouvement des poumons soient visibles.
- À l’aide d’une pipette, transférez un MCS sélectionné à partir d’une microplaque dans une boîte de Pétri en verre contenant du PBS glacé.
- Fixez une aiguille de 20 g sur une seringue en verre de 100 μL, prérefroidissez-les sur de la glace et prétirez 20 μL d’un mélange pré-refroidi de PBS et de Matrigel (1:1 v/v).
- À l’aide de la seringue, aspirez rapidement un MCS de la boîte de Pétri dans un volume minimum de mélange PBS-Matrigel, en maintenant le MCS dans la partie métallique de l’aiguille.
REMARQUE : Gardez une prise ferme sur la seringue et le piston pour éviter que le MCS ne glisse hors de l’aiguille. - Insérez doucement l’aiguille verticalement entre deux os de la côte jusqu’à ~3 mm de profondeur et injectez lentement tout le mélange de PBS et de Matrigel de 20 μL qui contient le MCS.
REMARQUE : Évitez une force excessive lors de l’insertion pour éviter d’endommager les poumons, le système vasculaire ou le cœur. - Retirez délicatement l’aiguille et appliquez une pommade antibiotique triple sur la plaie.
- Scellez l’incision avec des clips chirurgicaux, qui doivent être retirés après 2 semaines.
REMARQUE : Ne suturez pas l’incision car les lignes de suture peuvent interférer avec l’imagerie par fluorescence. Les souris nues sont capables de guérir naturellement après la chirurgie. - Placez l’animal sur un coussin chauffant infrarouge et couvrez-le de lingettes de laboratoire pour maintenir la température corporelle. Surveillez l’animal pendant au moins 30 à 60 minutes jusqu’à ce qu’il se réveille et se déplace correctement.
- Injecter 10 μL de chlorhydrate de buprénorphine (0,3 mg/mL) par voie sous-cutanée 3 fois par jour pendant les 48 premières heures pour réduire la douleur.
5. Suivi postopératoire
- Mesurez le poids corporel tous les 3-4 jours.
- Mesurez le signal fluorescent iRFP de la xénogreffe tumorale tous les 3-4 jours sur un système d’imagerie de petits animaux à un canal de 700 nm dans quatre postures : gauche, droite, dorsale et ventrale, tandis que les souris sont maintenues sous anesthésie par inhalation d’isoflurane (débit : 1,5-2 L/min d’oxygène contenant 1,5% d’isoflurane) pendant 2-3 min.
- Quantifier l’intensité fluorescente nette du cancer de la xénogreffe in vivo à l’aide d’un logiciel (p. ex., Image Studio).
- Utilisez un rectangle fixe (A1, 200 x 125 pixels) comme fenêtre d’échantillonnage pour la zone de la poitrine des souris.
- Utilisez la fonction à main levée pour tracer la forme des souris à l’intérieur du rectangle (A1) et mesurer l’intensité de la fluorescence (F1) dans la zone A1.
- Utilisez un autre rectangle plus petit (A2, 25 x 40 pixels) pour mesurer la fluorescence de fond (F2) des souris dans la région de la cuisse.
- Utilisez l’équation (1) pour calculer l’intensité fluorescente nette du cancer de la xénogreffe chez chaque souris :
(1)
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Résultats
Caractérisation de l’A549-iRFP MCS
Les MCS A549-iRFP ont été cultivés avec succès dans des microplaques sphéroïdes à l’aide de collagène et de centrifugation. Lorsque les MCS ont atteint un diamètre d’environ 500 μm après 1 semaine, les MCS A549 et A549-iRFP ont été exposés à une variété de médicaments et de formulations anticancéreux pendant 3 jours, puis maintenus dans un milieu de croissance sans médicament pendant 4 jours supplémentaires. Le MCS A549-iRFP a présenté un modèle de réponse reflétant ...
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Discussion
La construction de l’A549-iRFP MCS est une procédure de laboratoire simple et hautement reproductible qui peut être traduite en formation de MCS pour plusieurs lignées cellulaires. Le MCS généré à l’aide de la centrifugation et du collagène présente une structure tumorale plus intégrale et solide en 3-4 jours. Cette méthode assure la formation de sphéroïdes robustes qui conservent leur structure intégrale pendant de longues périodes, généralement 2-3 semaines ou même plus jusqu’à ce que de petits bourgeons commencent à é...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions SAAG et SEED de l’Université du Pacifique. Nous remercions le Dr William Chan de nous avoir accordé l’accès au système d’imagerie infrarouge Odyssey 205 et le Dr John Livesey de nous avoir accordé l’accès au lecteur de plaques SpectraMax iD3. Nous remercions la Dre Melanie Felmlee pour les conseils techniques sur les protocoles pour les animaux.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 100 et micro ; L Seringue en verre | Hamilton | Part/REF #80601 | |
| Aiguille 20 g | Thermo Fisher Scientific Inc. | 826D | |
| 96 puits à très faible fixation ; | Corning | 15-100-173 | |
| A549-iRFP | Imanis Life Sciences ; | CL082-STAN | |
| AIN-93M Régime alimentaire pour rongeurs matures ; | Recherche Diets, Inc. | ||
| souris nue athymique | Charles River Laboratories, Inc. | Code de souche : 490 ; homozygote | |
| BCA | Pierce | 23227 | |
| Chlorhydrate de buprénorphine | Patterson Vétérinaire | Numéro NDC : 42023-179-05 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9683 | |
| Collagen | Gibco A1064401 | ; | |
| DMEM | Corning | MT10013CV | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Cytiva HyClone | SH3039603 | |
| ImageJ | Outil open source (https://imagej.net/ij/) | N/A | |
| Image Studio ; | LI-COR | Version 5.2 | |
| Isoflurane | Patterson | Numéro NDC vétérinaire : 17033-0091-25 | |
| Kétamine | Patterson | Numéro NDC vétérinaire : 50989-0161-06 | |
| Microscope ; | Numéro de | modèle Keyence : BZ-X710 | |
| Matrigel | Corning | CB-40234 | |
| Odyssey Infrared Imaging 205 System ; | LI-COR | Numéro de modèle : 9140 | |
| PBS | Corning | MT21040CV | |
| Pearl Trilogy système d’imagerie pour petits animaux ; | LI-COR | Numéro de modèle : 9430 | |
| Pénicilline-Streptomycine ; | Corning | MT30002CI | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| logiciel ReViSP de MATLAB ; | Outil open source sur Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/) | N/A | |
| Surgical Clips--AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Xylazine | Patterson Veterinary | NDC Number : 61133-6017-01 |
Références
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Réimpressions et autorisations
