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Construction d’un modèle de xénogreffe orthotopique du cancer du poumon non à petites cellules imitant la progression de la maladie et prédisant les activités médicamenteuses

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DOI :

10.3791/66787

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10 mai 2024

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1Thomas J. Long School of Pharmacy, University of the Pacific

Dans cet article

Résumé

Cette étude présente un modèle orthotopique de cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) basé sur l’inoculation intrapulmonaire de sphéroïdes multicellulaires de cellules fluorescentes A549-iRFP. Le modèle récapitule les stades cliniques du CPNPC et répond au cisplatine, selon la surveillance dynamique in vivo de la fluorescence à grande longueur d’onde.

Résumé

Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) est une maladie hautement létale avec un microenvironnement tumoral complexe et hétérogène. Actuellement, les modèles animaux courants basés sur l’inoculation sous-cutanée de suspensions de cellules cancéreuses ne récapitulent pas le microenvironnement tumoral dans le CPNPC. Nous décrivons ici un modèle murin de xénogreffe orthotopique de cancer du poumon qui utilise l’inoculation intrapulmonaire de sphéroïdes multicellulaires tridimensionnels (MCS). Plus précisément, des cellules CPNPC humaines fluorescentes (A549-iRFP) ont été cultivées dans des microplaques de 96 puits à faible fixation avec du collagène pendant 3 semaines pour former des MCS, qui ont ensuite été inoculées intercostalement dans le poumon gauche de souris nues athymiques pour établir le modèle orthotopique de cancer du poumon.

Par rapport à la lignée cellulaire A549 d’origine, le MCS de la lignée cellulaire A549-iRFP a réagi de la même manière aux médicaments anticancéreux. Le signal fluorescent à longue longueur d’onde des cellules A549-iRFP est fortement corrélé avec les marqueurs communs de la croissance des cellules cancéreuses, notamment le volume des sphéroïdes, la viabilité cellulaire et le niveau de protéines cellulaires, permettant ainsi un suivi dynamique de la croissance du cancer in vivo par imagerie fluorescente. Après l’inoculation chez la souris, la xénogreffe A549-iRFP MCS a progressé de manière fiable à travers des phases ressemblant étroitement aux stades cliniques du CPNPC, y compris l’expansion de la tumeur primaire, l’émergence de tumeurs secondaires voisines et les métastases des cellules cancéreuses au poumon droit controlatéral et aux organes distants. De plus, le modèle a répondu au médicament anticancéreux de référence du poumon, le cisplatine, avec la toxicité attendue et une progression plus lente du cancer. Par conséquent, ce modèle murin de xénogreffe orthotopique de CPNPC servirait de plate-forme pour récapituler la progression de la maladie et faciliter le développement de médicaments anticancéreux potentiels.

Introduction

Parmi tous les troubles oncologiques, le cancer du poumon est non seulement celui qui cause le plus de pertes de vie, mais qui compte également le deuxième plus grand nombre de nouveaux patients chaque année aux États-Unis. Cette tumeur maligne dévastatrice constitue un obstacle majeur dans les soins de santé modernes, appelant à une compréhension plus approfondie de sa biologie complexe et à des modalités thérapeutiques plus efficaces2. Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) représente 85 % des cancers du poumon et a tendance à se transformer en tumeurs solides3. L’un des principaux défis du cancer du poumon est le microenvironnement tumoral dynamique et hétérogène, qui influence profondément la progression du cancer et les réponses aux interventions thérapeutiques 4,5,6. Une meilleure compréhension de l’interaction entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement à différents stades du CPNPC nécessite des modèles pathologiques affinés qui récapitulent les caractéristiques histologiques de la progression du CPNPC.

À cet égard, les modèles animaux orthotopiques apparaissent comme une voie prometteuse pour la recherche sur le CPNPC. Contrairementaux modèles de xénogreffes sous-cutanées couramment utilisés7, les modèles orthotopiques présentent des cellules cancéreuses qui sont directement inoculées dans l’organe d’origine. Pour le cancer du poumon, cela signifie implanter des cellules cancéreuses directement dans le tissu pulmonaire 8,9. Par conséquent, les modèles orthotopiques du cancer du poumon imitent mieux le microenvironnement tumoral natif, y compris les tissus, les vaisseaux et les composants immunitaires voisins, améliorant ainsi leur pertinence physiologique et clinique.

Les sphéroïdes multicellulaires tridimensionnels (MCS) représentent une autre approche prometteuse pour récapituler les caractéristiques de l’environnement tumoral. La plupart des cancers sont caractérisés par leur microenvironnement tumoral complexe, y compris les diverses interactions cellule-cellule, la matrice extracellulaire et les gradients d’oxygène et de nutriments10,11. Les cultures cellulaires 2D traditionnelles n’ont pas la complexité spatiale et structurelle nécessaire pour récapituler ces caractéristiques spécifiques aux tumeurs12. En revanche, les MCS de taille appropriée présentent une structure hétérogène avec un noyau hypoxique et nécrotique, qui récapitule non seulement le microenvironnement intratumoral, mais aussi la barrière physiologique contre la pénétration des médicaments, qui est un mécanisme majeur de résistance aux médicaments dans le traitement anticancéreux 13,14,15.

Tirant parti à la fois des modèles animaux orthotopiques et des techniques de culture MCS, les MCS ont été inoculés à des souris immunodéprimées pour construire avec succès des modèles orthotopiques de cancer du sein et de cancer de la prostate16,17. Nous présentons ici la méthodologie détaillée pour construire et caractériser un modèle murin de xénogreffe orthotopique du cancer du poumon. Cette méthode utilise l’inoculation intrapulmonaire de MCS 3D dérivées de cellules cancéreuses du poumon humain fluorescentes (A549-iRFP)18. Ce modèle offre une occasion exceptionnelle d’observer la progression in vivo du cancer du poumon à travers des stades qui correspondent étroitement aux quatre stades cliniques du CPNPC. De plus, le cancer de xénogreffe de ce modèle a répondu au médicament anticancéreux du poumon cliniquement établi, le cisplatine.

Protocole

L’étude sur les animaux a été réalisée avec l’approbation du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Pacifique (Protocoles sur les animaux 19R10 et 22R10). Huit souris nude athymiques mâles âgées de 5 à 6 semaines, pesant de 20 à 25 g, élevées avec le régime alimentaire pour rongeurs référencé et hébergées dans des conditions exemptes d’agents pathogènes (FPS), ont été utilisées pour la présente étude. Les cages, la litière et l’eau potable ont été autoclavées et changées régulièrement. Un schéma de l’inoculation tumorale chez la souris est illustré à la figure 1. Voir le Tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et instruments utilisés dans ce protocole.

1. Mise en place d’un MCS tridimensionnel des cellules A549-iRFP

  1. Incuber des cellules A549-iRFP (adénocarcinome pulmonaire humain) dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 à 37 °C et les cultiver dans un milieu de croissance complet DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin, 1 % de pénicilline-streptomycine et 1 μg/mL de puromycine.
  2. Implantez des cellules A549-iRFP dans des microplaques sphéroïdes à fond rond à très faible adhérence à 96 puits à une densité d’ensemencement de 4 000 cellules/puits, en utilisant 100 μL de milieu de croissance complet complété par 0,3 % de collagène.
  3. Centrifuger les microplaques à 300 × g pendant 7 min à 4 °C pour faciliter la formation du MCS. Examinez la morphologie du MCS au microscope pour vous assurer de l’agrégation cellulaire après centrifugation.
  4. Après 48 h, ajouter 100 μL de milieu de croissance complet dans chaque puits pour obtenir un volume total de 200 μL de milieu de croissance par puits.
  5. Remplacer 100 μL de milieu de croissance dans chaque puits par un milieu de croissance complet frais tous les deux jours.

2. Caractérisation du MCS A549-iRFP

  1. Observez et imagez la morphologie du MCS à l’aide d’un microscope et estimez le volume du MCS par simulation avec le logiciel référencé de MATLAB sur la base des images du microscope à contraste de phase.
    1. Ouvrez une image MCS dans le logiciel ImageJ.
    2. Utilisez les sélections à main levée pour sélectionner le bord du MCS et l’ajouter au gestionnaire de retour sur investissement.
    3. Cliquez sur Modifier | Sélection | Créez un masque.
    4. Cliquez sur Modifier | Inverser.
    5. Cliquez sur Fichier | Enregistrer sous | Tiff.
    6. Ouvrez le logiciel ReViSP.
    7. Ouvrez l’image TIFF enregistrée en cliquant sur Parcourir.
    8. Cliquez sur Démarrer pour terminer la simulation MCS.
  2. Mesurez le signal fluorescent iRFP à l’aide du système d’imagerie infrarouge sur le canal 700 nm et quantifiez le signal fluorescent à l’aide d’un logiciel (par exemple, Image Studio).
    1. Ouvrez le logiciel Image Studio.
    2. Dans l’onglet Canaux , sélectionnez 700 et Intensité = 5.
    3. Dans l’onglet Commandes de balayage , sélectionnez 84 μm, Moyen, 0,0 mm et Retourner l’image. Gardez tout le reste par défaut.
    4. Cliquez sur Démarrer pour lancer l’analyse.
  3. Évaluez et quantifiez la viabilité cellulaire à l’aide du test de viabilité cellulaire 3D selon le protocole du fournisseur.
  4. Évaluez et quantifiez les protéines cellulaires à l’aide du dosage BCA conformément au protocole du fournisseur.

3. Sélection MCS pour l’inoculation tumorale

REMARQUE : Une fois que les MCS ont été ensemencés dans des microplaques sphéroïdes et cultivés pendant 2 à 3 semaines avec un échange régulier de milieu de croissance, sélectionnez les MCS avec les caractéristiques appropriées suivantes pour l’inoculation tumorale.

  1. Observez la morphologie du MCS au microscope et choisissez un MCS de forme ronde avec des bords globalement lisses mais avec 5 à 10 bourgeonnements grossiers (flèches sur la figure 2F) et un diamètre compris entre 700 et 800 μm.
  2. Mesurez la fluorescence de l’iRFP (reportez-vous à l’étape 2.2) et sélectionnez le MCS dont les signaux fluorescents se situent à moins d’un écart-type de la moyenne.

4. Inoculation intrapulmonaire du MCS

REMARQUE : Utilisez un spray d’alcool isopropylique à 70% pour nettoyer le poste chirurgical et les outils avant de manipuler les animaux.

  1. Anesthésier chaque souris avec une injection IP de 80 mg/kg de kétamine et de 12 mg/kg de xylazine ; Pincez les pieds de la souris avec une pince pour assurer une anesthésie complète.
  2. Injecter 10 μL de chlorhydrate de buprénorphine (0,3 mg/mL) par voie sous-cutanée pour réduire la douleur.
  3. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir le dessèchement.
  4. Placez la souris en posture dorsale et fixez les membres en position d’étirement avec des rubans.
  5. Stérilisez la peau du dos avec des bâtonnets d’azote et d’alcool.
  6. Faites une incision de 0,5 à 1 cm à l’aide de ciseaux chirurgicaux sur le côté arrière gauche (figure 1B). Utilisez soigneusement des pinces pour séparer les tissus musculaires et adipeux jusqu’à ce que la paroi thoracique et le mouvement des poumons soient visibles.
  7. À l’aide d’une pipette, transférez un MCS sélectionné à partir d’une microplaque dans une boîte de Pétri en verre contenant du PBS glacé.
  8. Fixez une aiguille de 20 g sur une seringue en verre de 100 μL, prérefroidissez-les sur de la glace et prétirez 20 μL d’un mélange pré-refroidi de PBS et de Matrigel (1:1 v/v).
  9. À l’aide de la seringue, aspirez rapidement un MCS de la boîte de Pétri dans un volume minimum de mélange PBS-Matrigel, en maintenant le MCS dans la partie métallique de l’aiguille.
    REMARQUE : Gardez une prise ferme sur la seringue et le piston pour éviter que le MCS ne glisse hors de l’aiguille.
  10. Insérez doucement l’aiguille verticalement entre deux os de la côte jusqu’à ~3 mm de profondeur et injectez lentement tout le mélange de PBS et de Matrigel de 20 μL qui contient le MCS.
    REMARQUE : Évitez une force excessive lors de l’insertion pour éviter d’endommager les poumons, le système vasculaire ou le cœur.
  11. Retirez délicatement l’aiguille et appliquez une pommade antibiotique triple sur la plaie.
  12. Scellez l’incision avec des clips chirurgicaux, qui doivent être retirés après 2 semaines.
    REMARQUE : Ne suturez pas l’incision car les lignes de suture peuvent interférer avec l’imagerie par fluorescence. Les souris nues sont capables de guérir naturellement après la chirurgie.
  13. Placez l’animal sur un coussin chauffant infrarouge et couvrez-le de lingettes de laboratoire pour maintenir la température corporelle. Surveillez l’animal pendant au moins 30 à 60 minutes jusqu’à ce qu’il se réveille et se déplace correctement.
  14. Injecter 10 μL de chlorhydrate de buprénorphine (0,3 mg/mL) par voie sous-cutanée 3 fois par jour pendant les 48 premières heures pour réduire la douleur.

5. Suivi postopératoire

  1. Mesurez le poids corporel tous les 3-4 jours.
  2. Mesurez le signal fluorescent iRFP de la xénogreffe tumorale tous les 3-4 jours sur un système d’imagerie de petits animaux à un canal de 700 nm dans quatre postures : gauche, droite, dorsale et ventrale, tandis que les souris sont maintenues sous anesthésie par inhalation d’isoflurane (débit : 1,5-2 L/min d’oxygène contenant 1,5% d’isoflurane) pendant 2-3 min.
  3. Quantifier l’intensité fluorescente nette du cancer de la xénogreffe in vivo à l’aide d’un logiciel (p. ex., Image Studio).
    1. Utilisez un rectangle fixe (A1, 200 x 125 pixels) comme fenêtre d’échantillonnage pour la zone de la poitrine des souris.
    2. Utilisez la fonction à main levée pour tracer la forme des souris à l’intérieur du rectangle (A1) et mesurer l’intensité de la fluorescence (F1) dans la zone A1.
    3. Utilisez un autre rectangle plus petit (A2, 25 x 40 pixels) pour mesurer la fluorescence de fond (F2) des souris dans la région de la cuisse.
    4. Utilisez l’équation (1) pour calculer l’intensité fluorescente nette du cancer de la xénogreffe chez chaque souris :
      figure-protocol-1(1)

Résultats

Caractérisation de l’A549-iRFP MCS
Les MCS A549-iRFP ont été cultivés avec succès dans des microplaques sphéroïdes à l’aide de collagène et de centrifugation. Lorsque les MCS ont atteint un diamètre d’environ 500 μm après 1 semaine, les MCS A549 et A549-iRFP ont été exposés à une variété de médicaments et de formulations anticancéreux pendant 3 jours, puis maintenus dans un milieu de croissance sans médicament pendant 4 jours supplémentaires. Le MCS A549-iRFP a présenté un modèle de réponse reflétant étroitement celui des cellules mères A549. Les MCS A549 et A549-iRFP ont montré des courbes dose-réponse et des valeurs IC50 similaires à celles du cisplatine, l’un des médicaments anticancéreux de première intention contre le cancer du poumon (Figure 2A). La viabilité des MCS A549 et A549-iRFP a été inhibée à des degrés similaires par d’autres médicaments ou formulations anticancéreux (Figure 2B).

Les MCS A549-iRFP ont été surveillés sur une période allant jusqu’à 6 semaines en fonction de la fluorescence de l’iRFP, de la viabilité cellulaire et des niveaux de protéines cellulaires. Le volume de MCS a été estimé par simulation logicielle basée sur les images du microscope à contraste de phase, et la morphologie simulée a montré des formes similaires à celles imagées par le microscope et le signal fluorescent (Figure 2C). La viabilité cellulaire de l’A549-iRFP MCS a été quantifiée par un test de viabilité cellulaire 3D, et le test a été validé avec des MCS de différentes tailles de 350 à 950 μm de diamètre. Aucune différence significative n’a été observée entre les différents rapports de volume entre le milieu de croissance contenant le MCS et le réactif d’essai, et entre les différents temps d’agitation de 5 minutes et de 10 minutes. (figure supplémentaire S1). Les quatre biomarqueurs ont augmenté avec le temps, avec des variations plus importantes à des moments ultérieurs (figure 2D). La fluorescence de l’iRFP a montré de fortes corrélations avec les trois autres mesures quantitatives plus traditionnelles du MCS : le volume (Pearson r = 0,9307, p < 0,0001), la viabilité cellulaire (Pearson r = 0,7666, p < 0,0001) et la protéine cellulaire (Pearson r = 0,7317, p < 0,0001) (figure 2E).

Progression tumorale chez la souris
Après une croissance de 2 à 3 semaines, les MCS A549-iRFP présentant des caractéristiques appropriées, notamment la morphologie, le diamètre du MCS, des bords rugueux appropriés et un signal fluorescent (pour des paramètres détaillés, voir la section 3 du protocole), ont été sélectionnés pour l’inoculation tumorale. Après la chirurgie d’inoculation tumorale, le poids corporel des souris porteuses de tumeurs a été mesuré tous les 3 jours et présenté sous forme de rapport de changement par rapport au poids du jour 0 juste avant la chirurgie. Le poids corporel de la souris a légèrement diminué après la chirurgie et s’est rétabli rapidement en 1 semaine. En l’absence de traitement, le poids corporel a augmenté progressivement jusqu’au ~Jour 40, mais a diminué drastiquement (~15%) au cours de la semaine suivante, conduisant à l’euthanasie (surdosage anesthésique en trois fois : 80 mg/kg de kétamine et 12 mg/kg de xylazine par injection IP) des souris selon les directives de l’IACUC (Figure 3A). Les souris porteuses de tumeurs ont été imagées tous les 3 jours dans quatre postures : gauche, dorsale, droite et ventrale. Parmi celles-ci, la posture gauche (où la tumeur est inoculée) et ventrale (où l’on peut observer les deux côtés des poumons) ont été sélectionnées comme postures clés pour la quantification de l’intensité de la fluorescence nette selon l’équation (1) (Figure 3B,C). L’intensité nette de fluorescence des deux postures a montré une tendance similaire de progression tumorale, la fluorescence du côté ventral augmentant légèrement plus lentement que du côté gauche.

La xénogreffe MCS dans ce modèle orthotopique a progressé à travers des phases distinctes reflétant les quatre stades cliniques du CPNPC (Figure 3D)18,19,20. Vers le 8e jour après l’inoculation du MCS, une fluorescence concentrée est apparue dans le poumon gauche, signifiant l’établissement d’une tumeur localisée conforme au CPNPC de stade 1 en milieu clinique. Vers le 11e jour, la fluorescence s’est considérablement intensifiée et/ou dispersée sur plusieurs sites du poumon gauche, indiquant la présence d’une ou plusieurs tumeurs ressemblant à un CPNPC de stade 2. Par la suite, vers le 18e jour, une augmentation des signaux fluorescents a été observée du côté ventral, suggérant une progression de la xénogreffe semblable à celle du stade 3. De plus, l’examen anatomique et l’imagerie ex vivo ont révélé une croissance tumorale à la surface du cœur, une caractéristique importante du CPNPC de stade 3. Vers le 27e jour après l’inoculation du MCS, une fluorescence perfusée est apparue des deux côtés du poumon, et l’anatomie de la poitrine ouverte a révélé une croissance tumorale perfusée dans le cœur, la trachée et les principaux vaisseaux sanguins, indiquant une métastase cancéreuse semblable à un CPNPC de stade 4.

Réponse des souris porteuses d’une tumeur au cisplatine
Une étude pilote d’efficacité a été menée sur ce modèle murin de cancer du poumon orthotopique. Dix jours après l’inoculation de la tumeur, 5 mg/kg de cisplatine ou de solution saline normale ont été injectés par la veine de la queue de souris porteuses de tumeurs, une injection par semaine, soit un total de deux injections. Les images du côté ventral sur des souris porteuses de tumeurs sont présentées dans la figure 4A. Le poids corporel et la fluorescence tumorale ont été surveillés tous les 3-4 jours. Par rapport au groupe salin normal, les souris du groupe cisplatine ont perdu beaucoup de poids corporel après chaque injection de cisplatine, mais se sont rétablies dans les semaines qui ont suivi le traitement au cisplatine (Figure 4B). L’intensité nette de fluorescence dans le groupe cisplatine a montré une tendance à l’augmentation plus lente que celle dans le groupe salin (Figure 4C). À la fin de la surveillance de la fluorescence in vivo, les animaux ont été sacrifiés et leurs poumons ont été disséqués et imagés par fluorescence. Après normalisation par la protéine tissulaire totale, il a été confirmé que l’intensité fluorescente des poumons disséqués chez les souris du groupe cisplatine était inférieure à celle du groupe salin normal. (Figure 4E). Dans l’imagerie par fluorescence ventrale (Figure 4A), les images dans les rectangles rouges indiquent la première fois où la fluorescence tumorale a été visualisée dans les poumons gauche et droit, ce qui est un indicateur clé de métastases tumorales au stade IV du CPNPC. Le cisplatine, l’un des médicaments de première intention contre le cancer du poumon, a ralenti les métastases tumorales du poumon gauche au poumon droit (Figure 4D).

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Figure 1 : Organigramme de l’étude. (A) Ensemencement de cellules A549-iRFP dans des microplaques sphéroïdes pour former un MCS à l’aide du collagène et de la centrifugation. (B) Inoculation intrapulmonaire d’A549-iRFP MCS avec des caractéristiques appropriées dans le poumon gauche d’une souris pour construire le modèle de xénogreffe orthotopique de cancer du poumon, imitant les quatre stades du cancer du poumon en milieu clinique. La seringue blanche contenant un MCS indique l’inoculation d’une tumeur tandis que les deux seringues rouges indiquent un traitement médicamenteux administré par la veine de la queue. Abréviation : MCS = sphéroïde multicellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Caractérisation du SCM A549-iRFP. (A) Courbes dose-réponse du SCM A549-iRPF et du SCM A549 au cisplatine après une exposition de 3 jours et une croissance sans médicament pendant 4 jours (écart-type ± moyenne, N = 3-4). (B) Viabilité cellulaire de l’A549-iRFP MCS après une exposition de 3 jours à des traitements anticancéreux (cisplatine, paclitaxel ou deux formulations médicamenteuses développées en interne) et une croissance sans médicament de 4 jours (moyenne ± écart-type, N = 3-4). (C) Études morphologiques de MCS représentatifs d’A549-iRFP après 1 à 6 semaines de culture par microscopie en phase de contraste (C1, barre d’échelle = 500 μm), microscopie confocale fluorescente (C2) et simulation logicielle (C3). (D) Changement dynamique de la fluorescence iRFP, du volume, de la viabilité cellulaire et de la protéine cellulaire du MCS A549-iRFP sur 1 à 6 semaines (N = 10 pour la fluorescence et le volume de l’iRFP ; N = 5 pour la viabilité cellulaire et la protéine cellulaire). (E) Corrélation de la fluorescence iRFP de A549-iRFP MCS avec les trois autres mesures de croissance traditionnelles (volume, viabilité cellulaire et protéine cellulaire) sur 1 à 6 semaines (N = 60). (F) Un exemple de MCS A549-iRFP présentant des caractéristiques appropriées pour l’inoculation tumorale (barre d’échelle = 500 μm). Abréviation : MCS = sphéroïde multicellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Progression tumorale dans le modèle murin orthotopique de CPNPC. (A) Changement du poids corporel des souris après l’inoculation de la tumeur (Moyenne ± MEB, N = 5). (B) Changement dynamique de l’intensité de la fluorescence nette chez les souris porteuses d’une tumeur sur la base de l’imagerie du côté gauche (N = 5). (C) Changement dynamique de l’intensité de la fluorescence nette chez les souris porteuses de tumeurs sur la base de l’imagerie du côté ventral (N = 5). (D) Progression du cancer imitant les quatre stades cliniques du CPNPC. Imagerie du côté gauche, imagerie du côté ventral, observation anatomique (les flèches jaunes indiquent la présence de tumeurs dans le poumon et à la surface du cœur) et imagerie ex vivo de souris porteuses de tumeurs représentatives à quatre stades. Cette figure est tirée de Huang et al.18. Abréviation : NSCLC = cancer du poumon non à petites cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Réponse des souris porteuses d’une tumeur au cisplatine. (A) Imagerie du côté ventral de souris porteuses d’une tumeur après un traitement avec une solution saline ou du cisplatine (les images dans des rectangles rouges indiquent quand la fluorescence tumorale peut être visualisée pour la première fois dans les poumons gauche et droit). (B) Changement du poids corporel des souris porteuses de tumeurs après des traitements au sérum physiologique ou au cisplatine (moyenne ± MEB, N = 3-4). (C) Changement dynamique de l’intensité de la fluorescence nette chez les souris porteuses de tumeurs après des traitements au sérum physiologique ou au cisplatine basé sur l’imagerie du côté ventral (moyenne ± MEB, N = 3-4). (D) Pourcentage de souris présentant une fluorescence tumorale sur les poumons gauche et droit. (E) Intensité fluorescente normalisée des poumons disséqués chez des souris sacrifiées à la fin de l’imagerie fluorescente in vivo (moyenne ± MEB, N = 3-4). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Essai de viabilité cellulaire 3D sur A549-iRFP MCS de différents diamètres. (A) ~350 μm ; (B) ~550 μm ; (C) ~750 μm ; (D) ~950 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La construction de l’A549-iRFP MCS est une procédure de laboratoire simple et hautement reproductible qui peut être traduite en formation de MCS pour plusieurs lignées cellulaires. Le MCS généré à l’aide de la centrifugation et du collagène présente une structure tumorale plus intégrale et solide en 3-4 jours. Cette méthode assure la formation de sphéroïdes robustes qui conservent leur structure intégrale pendant de longues périodes, généralement 2-3 semaines ou même plus jusqu’à ce que de petits bourgeons commencent à émerger. En utilisant la centrifugation et le collagène, nous avons normalisé la formation des MCS, assurant ainsi leur cohérence et leur fiabilité dans notre modèle expérimental. Cette approche améliore la reproductibilité de nos résultats et minimise la variabilité de la cinétique de croissance tumorale, fournissant ainsi une plate-forme plus robuste pour l’étude de la biologie tumorale et des interventions thérapeutiques.

Contrairement aux cultures cellulaires monocouches 2D traditionnelles, les MCS 3D peuvent se développer sur une période beaucoup plus longue, au moins 6 semaines dans cette étude. Pour surveiller la croissance et la progression du cancer, une mesure quantitative dynamique à long terme est très bénéfique. De nombreux tests MCS 3D existants sont destructeurs pendant les mesures, limitant ainsi leur utilité pour les évaluations à long terme. La nature non destructive de la mesure des signaux fluorescents iRFP permet une surveillance continue et à long terme de la croissance des cellules cancéreuses dans les MCS 3D. Cette caractéristique est particulièrement précieuse pour évaluer les effets d’une exposition chronique à des agents anticancéreux et pour capturer l’évolution dynamique des cellules cancéreuses au fil du temps. Les signaux fluorescents iRFP émis par le MCS 3D A549-iRFP ont montré une forte corrélation avec les mesures quantitatives traditionnelles de la croissance des sphéroïdes, y compris le volume des sphéroïdes, la viabilité cellulaire et les niveaux de protéines cellulaires. Cela met en évidence la fiabilité des signaux fluorescents en tant qu’indicateur pour évaluer la croissance des cellules cancéreuses dans le MCS. La grande longueur d’onde des signaux fluorescents iRFP permet de quantifier la croissance et la progression du cancer chez les petits animaux, ce qui est essentiel pour le développement préclinique de médicaments anticancéreux.

Pour assurer la cohérence de ce modèle de CPNPC orthotopique, les MCS doivent être soigneusement sélectionnés pour l’inoculation intrapulmonaire. Une taille et une intensité fluorescente similaires du MCS sont nécessaires pour minimiser la variation ; l’inoculation d’un MCS plus grand a tendance à provoquer une plus grande variation de la progression tumorale. De plus, le contrôle de la rugosité de la surface MCS joue un rôle essentiel dans la réduction de la variation. Alors que certains MCS ont conservé leurs bords lisses à mesure qu’ils grandissaient, d’autres affichaient des bords plus rugueux au fur et à mesure de leur croissance. Dans nos mains, le MCS intégral, semblable à une tumeur solide, après 2-3 semaines de croissance en culture cellulaire avec 5 à 10 bourgeons sur les bords, a produit une croissance tumorale plus uniforme chez les souris, tandis que ceux sans bords rugueux ou ceux avec des structures relâches et trop de bourgeonnements ont produit des modèles de croissance tumorale plus diversifiés après l’inoculation.

Au cours du processus de transfert MCS, il est essentiel de manipuler l’aiguille de 20 G avec beaucoup de soin. Le MCS doit être conservé à l’intérieur du biseau ou de la partie métallique de l’aiguille pour limiter les dommages potentiels. Le choix de la taille de l’aiguille a été fait délibérément pour trouver un équilibre entre assurer la viabilité du MCS pendant l’inoculation et minimiser les dommages potentiels aux poumons des souris. Des aiguilles plus grandes pourraient potentiellement endommager les tissus de la souris. Si le MCS se coince dans l’aiguille ou si plusieurs points fluorescents sont observés dans les premiers jours suivant l’inoculation, cela peut indiquer que le MCS inoculé a été endommagé pendant l’inoculation. Les souris présentant ces caractéristiques ont été exclues d’études ultérieures et classées comme inoculées infructueuses.

Les sphéroïdes multicellulaires (MCS) ont été inoculés dans le poumon gauche plutôt que dans le poumon droit sur la base de considérations anatomiques. Le poumon gauche a deux lobes empilés l’un sur l’autre, offrant une zone cible plus cohérente et plus accessible par rapport au poumon droit, qui a trois lobes situés côte à côte. Ainsi, le poumon gauche permet une inoculation très fiable dans une zone spécifique, à savoir le lobe supérieur gauche, ce qui contribue à réduire les variations d’origine et de progression de la tumeur.

Outre la fluorescence thoracique iRFP, le poids corporel des souris porteuses de tumeurs sert d’indicateur corroborant important de la charge tumorale. Au fur et à mesure que le cancer de la xénogreffe progressait après l’inoculation du MCS, les souris ont d’abord montré un comportement normal, y compris manger, boire et faire des activités lorsqu’elles étaient éveillées, jusqu’au 40e jour environ, lorsque la lourde charge tumorale, comme le montre la forte fluorescence iRFP thoracique, a entraîné une baisse notable du poids corporel et la perte du comportement normal. Suivant les directives humaines, les animaux ont été euthanasiés avec une perte de poids de 15 à 20 %. Bien que le moment de la perte de poids varie d’un lot à l’autre, il correspond à la perte d’un comportement animal normal et peut donc également être utilisé comme un indicateur fiable de la santé animale.

La progression du cancer dans le modèle orthotopique du CPNPC a été principalement surveillée par imagerie fluorescente latérale gauche et ventrale, qui a montré une croissance tumorale constante et régulière après l’inoculation du MCS. La fluorescence de la face ventrale a montré une augmentation plus lente que celle du côté gauche, probablement en raison (1) de la profondeur de l’injection et (2) de la présence de tumeurs orthotopiques et sous-cutanées aux stades avancés du cancer. Plus précisément, le MCS a été inoculé à travers les os des côtes dans le thorax, qui l’a déposé sur la surface dorsale du poumon gauche, nécessitant ainsi un délai pour que le MCS se développe jusqu’à la surface ventrale du poumon gauche pour être imagé. Au fur et à mesure que la tumeur grandissait, elle s’étendait parfois sur la surface interne de la paroi thoracique, la rapprochant ainsi du scanner fluorescent pour donner des signaux plus élevés pour l’imagerie du côté gauche. Par conséquent, l’imagerie fluorescente sur la face ventrale présentait plus précisément la tumeur dans le poumon, mais prenait généralement plus de temps pour détecter la tumeur. À la fin de l’imagerie fluorescente in vivo , les animaux ont été sacrifiés et soumis à une dissection thoracique ouverte et à une imagerie ex vivo , qui ont non seulement confirmé l’établissement de la tumeur orthotopique à partir de l’inoculation MCS, mais ont également montré de multiples caractéristiques anatomiques qui récapitulaient les quatre stades cliniques du CPNPC chez l’homme.

Dans l’étude pilote d’efficacité, la forte corrélation entre l’imagerie ex vivo des poumons et l’imagerie in vivo des souris porteuses de tumeurs corrobore la fiabilité de la méthodologie d’imagerie dynamique par fluorescence in vivo . Le modèle orthotopique du CPNPC a répondu de manière fiable aux traitements anticancéreux à la fois par le ralentissement de la croissance tumorale en tant qu’indicateur clé de l’efficacité thérapeutique et par la perte de poids corporel en tant qu’indicateur clé de la toxicité du médicament. De telles réponses ont démontré que le modèle était un outil précieux pour l’évaluation préclinique et le développement de candidats médicaments anticancéreux. Les métastases, une caractéristique du cancer du poumon, ont été récapitulées fidèlement dans le modèle et, plus important encore, ont été entravées de manière fiable par le médicament anticancéreux cisplatine. Une croissance tumorale plus lente a été observée avec seulement deux injections de cisplatine dans cette étude pilote, ce qui suggère qu’un effet anticancéreux plus significatif du cisplatine résulterait d’un régime plus cliniquement pertinent de quatre doses hebdomadaires.

Le modèle orthotopique du CPNPC de ce rapport présente plusieurs avantages importants par rapport à un certain nombre de modèles animaux courants de cancer du poumon. Par rapport aux modèles de xénogreffes sous-cutanées du cancer du poumon, ce modèle offre un microenvironnement tissulaire plus pertinent autour des tumeurs ; Par rapport au modèle de souris génétiquement modifié, ce modèle offre des procédures expérimentales plus pratiques et une progression tumorale et une survie animale plus reproductibles. Une comparaison complète entre ce modèle et d’autres modèles de cancer du poumon est disponible dans notre publication précédente18. À l’instar d’autres modèles animaux de xénogreffes, l’une des limites de ce modèle est l’absence d’un système immunitaire complet, qui est un composant important des cancers humains. De plus, le MCS inoculé dans ce modèle développe occasionnellement la tumeur primaire de xénogreffe sur la surface interne de la paroi thoracique. Par conséquent, des procédures expérimentales permettant de détecter et de minimiser facilement un tel développement devraient être incluses dans les études futures afin d’améliorer ce modèle. De plus, des études impliquant les deux sexes seront menées afin d’obtenir une compréhension plus complète de la biologie tumorale et des réponses au traitement du CPNPC. En conclusion, le modèle murin de xénogreffe orthotopique du cancer du poumon de ce rapport constitue un outil pionnier et robuste pour récapituler la progression du cancer du poumon et pour évaluer les traitements anticancéreux. Ce modèle recèle un immense potentiel pour faire progresser notre compréhension de la pathologie du CPNPC et pour développer les interventions thérapeutiques correspondantes.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions SAAG et SEED de l’Université du Pacifique. Nous remercions le Dr William Chan de nous avoir accordé l’accès au système d’imagerie infrarouge Odyssey 205 et le Dr John Livesey de nous avoir accordé l’accès au lecteur de plaques SpectraMax iD3. Nous remercions la Dre Melanie Felmlee pour les conseils techniques sur les protocoles pour les animaux.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100 et micro ; L Seringue en verreHamiltonPart/REF #80601
Aiguille 20 gThermo Fisher Scientific Inc.826D
96 puits à très faible fixation  ;Corning15-100-173
A549-iRFPImanis Life Sciences  ;CL082-STAN
AIN-93M Régime alimentaire pour rongeurs matures  ;Recherche Diets, Inc.
souris nue athymiqueCharles River Laboratories, Inc.Code de souche : 490 ; homozygote
BCAPierce23227
Chlorhydrate de buprénorphinePatterson VétérinaireNuméro NDC : 42023-179-05
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromegaG9683
CollagenGibco A1064401  ;
DMEMCorningMT10013CV
Sérum fœtal bovin (FBS)Cytiva HyCloneSH3039603
ImageJOutil open source (https://imagej.net/ij/)N/A
Image Studio  ;LI-CORVersion 5.2
IsofluranePattersonNuméro NDC vétérinaire : 17033-0091-25
KétaminePattersonNuméro NDC vétérinaire : 50989-0161-06
Microscope  ;Numéro demodèle Keyence : BZ-X710
MatrigelCorningCB-40234
Odyssey Infrared Imaging 205 System  ;LI-CORNuméro de modèle : 9140
PBSCorningMT21040CV
Pearl Trilogy système d’imagerie pour petits animaux  ;LI-CORNuméro de modèle : 9430
Pénicilline-Streptomycine  ;CorningMT30002CI
PuromycinThermo Fisher Scientific Inc.
logiciel ReViSP de MATLAB  ;Outil open source sur Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)N/A
Surgical Clips--AutoClip SystemFine Science Tools12020-00
XylazinePatterson VeterinaryNDC Number : 61133-6017-01
14 Microplaque sphéroïde à D10012MAAJ67236XF

Références

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