Imagerie et quantification du système vasculaire hépatique de souris à l’aide de l’échographie Doppler ultrarapide

Résumé

L’échographie Doppler ultrarapide (UFUS) avec une résolution spatiale (100 μm) et une sensibilité élevées représente une modalité d’imagerie non invasive appropriée pour obtenir une vue qualitative complète du système vasculaire hépatique. L’UFUS facilite également les mesures quantitatives de la microvascularisation, dans le but d’améliorer notre compréhension des mécanismes des maladies vasculaires.

Résumé

L’imagerie in vivo non invasive du système vasculaire est un outil puissant pour étudier les mécanismes de la maladie chez les rongeurs. Pour obtenir une imagerie à haute sensibilité de la microvascularisation à l’aide de méthodes d’échographie Doppler, les modalités d’imagerie utilisant le concept d’imagerie ultrarapide sont préférées. En augmentant la fréquence d’images de l’échographe à des milliers d’images par seconde, il devient possible d’améliorer la sensibilité du flux sanguin jusqu’à 2 mm/s et d’obtenir des informations fonctionnelles sur la microcirculation par rapport à une sensibilité d’environ 1 cm/s dans les modes Doppler conventionnels. Bien que l’imagerie par ultrasons Doppler (UFUS) ait été adoptée en neurosciences, où elle peut capturer l’activité cérébrale par couplage neurovasculaire, elle présente de plus grands défis lors de l’imagerie du système vasculaire des organes abdominaux en raison de mouvements plus importants liés à la respiration. Le foie, positionné anatomiquement sous le diaphragme, est particulièrement sensible aux mouvements hors plan et aux mouvements respiratoires oscillants. Ces artefacts nuisent non seulement à l’imagerie Doppler, mais compliquent également l’analyse anatomique des structures vasculaires et le calcul des paramètres vasculaires. Nous présentons ici une analyse d’imagerie qualitative et quantitative du système vasculaire hépatique chez la souris par UFUS. Nous identifions les principales structures vasculaires anatomiques et fournissons des illustrations graphiques de l’anatomie macroscopique hépatique, en la comparant à une évaluation anatomique approfondie du système vasculaire hépatique basée sur des lectures Doppler. De plus, nous avons développé un protocole de quantification pour des mesures robustes du volume sanguin hépatique de la microvascularisation au fil du temps. Pour envisager d’autres recherches, l’analyse vasculaire qualitative fournit une vue d’ensemble complète et suggère une terminologie normalisée pour les chercheurs travaillant avec des modèles murins de maladies du foie. De plus, il offre la possibilité d’appliquer l’échographie comme méthode complémentaire non invasive pour inspecter les défauts vasculaires hépatiques in vivo et mesurer les altérations microvasculaires fonctionnelles en profondeur dans l’organe avant de démêler les anomalies des vaisseaux sanguins à l’échelle du micron en utilisant la coloration ex vivo sur des coupes de tissus.

Introduction

Les modèles murins précliniques sont largement utilisés pour étudier l’apparition et la progression de la maladie microvasculaire hépatique ^1,2. Le suivi longitudinal est avantageux, car les altérations capillaires sanguines se produisent à un stade précoce de la maladie avant l’apparition de l’inflammation et de la fibrose, ce qui peut entraîner une cirrhose au fil du temps¹. Pour étudier la progression de la maladie, des outils d’imagerie puissants sont essentiels pour visualiser et mesurer le fonctionnement des vaisseaux sanguins in vivo. L’échographie Doppler ultrarapide (UFUS) représente une modalité appropriée en raison de son faible coût, de sa portabilité, de sa simplicité et de sa capacité en temps réel, mais aussi parce qu’il s’agit d’une procédure non invasive et permettant de gagner du temps³. Par rapport à l’échographie Doppler conventionnelle, qui peut atteindre une résolution spatiale similaire mais est limitée à un flux sanguin important, l’UFUS permet de détecter un flux sanguin lent jusqu’à 2 mm/s à partir de 1 cm/s, ce qui permet de sonder la contribution de vaisseaux beaucoup plus petits⁴. L’UFUS améliore la sensibilité, ce qui est réalisé grâce à des transmissions d’ondes planes avec un large champ de vision en une seule insonification pour augmenter la fréquence d’images et donc le nombre d’images échographiques disponibles⁵. Le nombre élevé d’échantillons temporels améliore l’annulation du signal provenant du tissu et améliore la détection des échos réfléchis par les diffuseurs de sang, augmentant ainsi la sensibilité sans nécessiter d’agents de contraste⁶. En estimant l’énergie des échos de diffusion du sang grâce à l’estimation de la puissance Doppler, on obtient une quantité proportionnelle au volume sanguin de chaque pixel, même si les vaisseaux sanguins sont trop petits pour être résolus dans l’image⁷.

L’UFUS offre une combinaison favorable de résolution spatiale et temporelle, ce qui en fait un outil approprié pour l’évaluation qualitative de l’architecture vasculaire hépatique. Bien que l’utilisation d’un échographe soit relativement simple, une compréhension complète de l’anatomie du foie est nécessaire pour naviguer dans le système vasculaire hépatique des différents lobes hépatiques chez la souris. Des études récentes se sont concentrées sur la description de l’anatomie du foie murin et de l’arbre vasculaire hépatique à l’aide de la micro-tomodensitométrie 3D (μ-CT)^8,9. Même si certaines des différences morphologiques entre les foies humains et de souris sont bien documentées¹⁰, les recherches effectuées sur les rongeurs adoptent souvent des terminologies anatomiques pertinentes pour les humains, ce qui entraîne une certaine confusion dans le contexte des animaux quadrupèdes. Même une nomenclature normalisée reconnue, telle que Nomina Anatomica Veterinaria (NVA), manque d’informations suffisantes sur les terminologies cohérentes pour les structures vasculaires hépatiques des rongeurs¹¹. Au-delà du défi des structures anatomiques mal documentées chez les rongeurs, des difficultés encore plus grandes surgissent dans l’interprétation des lectures échographiques, en particulier lorsqu’une approche reproductible est attendue.

L’obtention d’informations fonctionnelles non invasives sur des organes vivants à différentes échelles spatiales pose des défis pour l’imagerie in vivo ³. Les modalités d’imagerie hépatique haut de gamme telles que la tomodensitométrie, l’imagerie par résonance magnétique et l’angiographie (IRM/MRA), ou l’imagerie Doppler conventionnelle utilisant des ondes focalisées sont essentielles pour évaluer la progression de la maladie, mais elles ne parviennent pas à capturer la plupart des dynamiques de flux sanguin, à l’exception de l’imagerie photoacoustique 12,13,14. L’UFUS a une sensibilité élevée et peut détecter un flux sanguin lent dans les petits vaisseaux, qui ne sont pas limités à un débit supérieur à un centimètre par seconde ^4,15. Récemment, nous avons développé une méthode d’imagerie personnalisée basée sur des considérations anatomiques à l’aide de l’UFUS, permettant une mesure fiable du volume sanguin hépatique dans un modèle murin avec une expansion vasculaire¹⁶.

Dans ce protocole, nous décrivons la procédure d’imagerie non invasive du foie par UFUS à l’aide d’une plateforme d’échographie disponible dans le commerce et développée à l’origine pour l’imagerie cérébrale fonctionnelle. Pour rationaliser le processus et améliorer la recherche d’informations, nous proposons une illustration complète du foie de souris avec une nomenclature anatomique et une méthode d’analyse complète. De plus, nous fournissons une représentation détaillée des lectures d’imagerie acquises à titre de référence, indiquant les structures anatomiques et les points de repère communs pour aider à la sélection du plan en fonction de l’opérateur. De plus, nous incluons une illustration pertinente des analyses qualitatives et quantitatives du système vasculaire hépatique.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément à la législation européenne (directive 2010/63/UE) et aux directives du gouvernement néerlandais et approuvées par le comité d’éthique animale du centre médical de l’université de Leiden.

1. Préparation de la souris pour l’imagerie UFUS (Timing ~ 10 min)

1. Préparation de la configuration d’imagerie
   1. Centrifugeuse de gel de transmission d’ultrasons dans des tubes de 50 mL à 100 x g pendant 3 à 5 min pour éviter la formation de bulles d’air.
   2. Allumez le coussin chauffant et réchauffez-le à 35 °C. Remplissez le réservoir d’eau imprimé en 3D avec de l’eau déminéralisée.
      REMARQUE : Les bulles d’eau ou les petites particules présentes dans l’eau peuvent perturber la mesure Doppler.
2. Anesthésie de l’animal
   1. Pesez l’animal. Des compagnons de portée mâles et femelles âgés de 8 à 16 semaines et pesant de 19 à 32 g ont été utilisés. Préparez un mélange anesthésique de kétamine avec une dose d’administration de 100 mg/kg et de xylazine 10 mg/kg dans 0,9 % de NaCl. Préparez le mélange stérile et frais tous les jours car le mélange n’est pas stable et peut perdre de sa puissance.
      REMARQUE : Le poids corporel préféré de l’animal se situe entre 23 et 30 g.
   2. Désinfectez le site d’injection, c’est-à-dire le quadrant inférieur droit ou gauche de l’abdomen, à l’aide de gaze et d’éthanol à 70 %. Injecter 10 μL/g de poids corporel (ip) à l’aide d’une aiguille de 27 g et d’une seringue jetable de 1 mL ou d’une seringue d’insuline de 30 g.
   3. Remettez l’animal dans une cage sur un coussin chauffant sans fermer le couvercle de la cage. Démarrer la minuterie.
      REMARQUE : L’anesthésie profonde devrait durer environ 40 min. Si une séance d’imagerie plus longue est souhaitée, envisagez d’utiliser une anesthésie réversible, telle que des mélanges de kétamine 60 mg/kg et de médétomidine 0,4 mg/kg dans 0,9 % de NaCl suivis d’une inversion avec injection sous-cutanée d’Atipamezole 1 mg/kg. L’anesthésie par injection est préférée à l’anesthésie par inhalation en raison de la configuration de l’imagerie.
   4. Vérifiez l’efficacité de l’anesthésie. Confirmez si l’anesthésie fonctionne en pinçant doucement les pattes arrière après environ 5 minutes. Si l’animal réagit toujours, attendez encore 2 à 3 minutes pour obtenir une anesthésie complète.
   5. Appliquez une pommade ophtalmique pour prévenir le dessèchement de la cornée et les traumatismes oculaires lorsque l’animal dort profondément. Vérifiez à nouveau les réflexes et ne commencez la procédure que lorsque l’animal ne montre aucune réaction au pincement.
3. Préparation de la zone d’imagerie (Figure 1)
   1. Coupez doucement le ventre de l’animal à l’aide d’une tondeuse vétérinaire pendant qu’il est placé sur un coussin chauffant. Effectuez la coupe très doucement sans appliquer de compression sur la poitrine ou l’abdomen.
   2. Appliquez la crème dépilatoire pendant 2 minutes maximum.
      ATTENTION : Ne prolongez pas le temps d’incubation de la crème dépilatoire, car cela pourrait provoquer une inflammation de la peau. Cela affecte non seulement la qualité de l’imagerie, mais peut également causer de l’inconfort à l’animal.
   3. Retirez la crème dépilatoire à l’aide de mouchoirs en papier et nettoyez doucement à l’eau tiède.
4. Positionnez l’animal et la configuration d’imagerie pour les mesures Doppler (Figure 2A).
   1. Positionnez l’animal dorsalement sur un coussin chauffant et fixez doucement les pattes à l’aide de ruban adhésif. Hydratez la peau avec une petite quantité d’eau tiède.
   2. Appliquez le gel de transmission d’ultrasons centrifugé directement sur la peau rasée à l’aide d’une seringue de 20 ml.
      REMARQUE : Les bulles d’air peuvent affecter l’imagerie Doppler et provoquer des artefacts.
   3. Placez le réservoir d’eau imprimé en 3D rempli d’eau au-dessus de l’animal. Assurez-vous que la hauteur du réservoir d’eau est adaptée à l’animal, à environ 1 mm au-dessus de celui-ci, et qu’elle ne serre pas l’animal.
   4. Vérifiez s’il y a de l’air entre le gel de transmission d’ultrasons et le thermoplastique polyméthylpentène (PMP) du réservoir d’eau.

2. Fonctionnement de la sonde et sélection du plan (Timing ~ 10 min)

1. Démarrez le logiciel et créez une session expérimentale sur le système. Démarrez le logiciel de numérisation.
   REMARQUE : Le logiciel de numérisation est intégré au système.
2. Centrez les moteurs en cliquant sur Oui dans la fenêtre contextuelle. Un système motorisé est utilisé pour contrôler à distance la sonde à l’aide d’un logiciel de balayage. En centrant les moteurs, la sonde se déplacera automatiquement dans trois directions, c’est-à-dire verticalement, latéralement et tournée. Assurez-vous qu’aucun objet n’entrave la trajectoire de la sonde pour éviter d’endommager l’équipement.
   REMARQUE : Il est crucial de centrer les moteurs ; Le non-respect de cette consigne peut entraîner un dysfonctionnement logiciel.
3. Créez une nouvelle session expérimentale en sélectionnant Session dans le menu. Remplissez les informations requises dans le panneau de session, y compris Projet, Sujet, Session, Nom d’utilisateur, Commentaire et Balise. Cliquez sur Valider.
   REMARQUE : La session doit être créée avant d’acquérir ou d’enregistrer des données d’imagerie. Les informations de session peuvent être modifiées au cours de l’expérience, mais gardez à l’esprit que cela modifiera également la destination de l’enregistrement des données.
4. Positionnez la sonde. La sonde à ultrasons linéaire de 15 MHz avec 128 éléments est reliée au système par un système motorisé composé d’un module moteur à quatre axes, c’est-à-dire trois sens de mouvement de translation et un sens de rotation.
   1. Allez dans le menu Déplacer la sonde et utilisez le système de positionnement contrôlé par ordinateur pour déplacer la sonde dans l’eau du réservoir d’eau imprimé en 3D. Utilisez les boutons de commande indiqués en position Sonde pour déplacer les moteurs, en définissant les pas en mm pour le mouvement de translation (X, Y et Z) ou en ° pour le mouvement de rotation (R). Pour éviter les accidents dans la direction Z, définissez la limite Z dans Sécurité.
      REMARQUE : Il est crucial que les éléments de la sonde soient en contact avec l’eau. Cependant, évitez de déplacer complètement la sonde dans l’eau, car cela pourrait endommager l’équipement. Si les moteurs ne peuvent pas atteindre la position, un avertissement Hors de l’espace de travail s’affiche.
   2. Enregistrez les coordonnées comme position de référence en cliquant sur Définir l’accueil. Ne modifiez pas les translations et les rotations en même temps, car R est relatif à X, Y et Z. Cliquez toujours sur Définir la page d’accueil avant de modifier R.
   3. Définissez les paramètres d’imagerie et de visualisation. Allez dans le menu Vue en direct et cliquez sur Jouer pour sélectionner le plan qui vous intéresse.
      ATTENTION : Ne lancez qu’une Live view ou une acquisition lorsque les éléments de la sonde à ultrasons sont entourés d’un milieu correspondant à l’impédance acoustique pour assurer la durée de vie de l’équipement et éviter la surchauffe.
5. Choisissez les paramètres d’imagerie dans Préréglage.
   1. Chargez une séquence d’ultrasons ultrasensibles Doppler de 10 ms avec le bouton Charger la séquence , par exemple, 11 ondes planes composées (angles de -10° à 10°) avec une tension d’imagerie de 25 V et une fréquence d’images Doppler de 10 ms.
      REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’utiliser une séquence Doppler rapide (par exemple, 10 ms) pour imager et filtrer les mouvements respiratoires de l’organe pendant l’analyse.
   2. Définissez une profondeur d’imagerie comprise entre 1 mm et 50 mm, avec une profondeur d’image maximale de 50 mm. Le réglage par défaut est une profondeur de 9 mm de 1 mm à 10 mm, avec une profondeur recommandée comprise entre 2 mm et 12 mm.
      REMARQUE : Selon la taille de l’animal et le réservoir d’eau, la profondeur d’imagerie peut être adaptée à des besoins spécifiques.
6. Sélectionnez les paramètres de visualisation.
   1. Choisissez le Doppler pour imager le système vasculaire.
      REMARQUE : L’intensité des pixels dans l’UA représente le volume sanguin et ne doit être comparée que lors de l’utilisation de la même sonde et de la même séquence.
   2. Choisissez Moyenne pour appliquer la moyenne temporelle afin d’optimiser le rapport signal/bruit.
      REMARQUE : La moyenne temporelle des images augmente la qualité de l’image, mais réduit la fréquence d’images. En fonction de l’objectif, un compromis approprié doit être fait.
   3. Choisissez Compression d’image : Logarithmique (élevée), Racine carrée (intermédiaire) ou Linéaire (faible). Vous pouvez également adapter la plage de contraste automatiquement ou manuellement à l’aide de curseurs pour les options de contraste élevé et faible.
      REMARQUE : Les données ne sont pas affectées par le choix de la compression de l’image ; Cela n’affecte que l’affichage de l’imagerie en temps réel.
   4. Sélectionnez l’échelle de la palette de couleurs du noir au blanc en cochant l’option Gris ou du noir rougeâtre au jaune en cochant Chaud.
7. Sélection du plan (Figure 2B)
   1. Sélectionnez le plan d’imagerie sur les repères anatomiques. Basculez entre la visualisation du Doppler et le mode B pour vous familiariser avec l’anatomie des lobes hépatiques et du système vasculaire.
   2. Arrêtez la vue En direct en cliquant sur l’icône Arrêter .
   3. Allez dans le menu Déplacer la sonde pour naviguer dans la sonde et sélectionnez un plan en cliquant sur Définir pour enregistrer les coordonnées comme position de référence. Assurez-vous que l’arbre vasculaire est bien défini et visible avec le moins de signal hors plan possible.
   4. Retournez dans le menu Vue en direct et cliquez sur l’icône Arrêter .

3. Acquisition par balayage Doppler (durée ~ 20 min)

1. Lancez une acquisition Doppler avec un framerate de 10 ms.
   1. Allez dans le menu 2D de l’US pour visualiser les variations hémodynamiques dans le temps dans une position spécifique (Figure 3). Pour augmenter le contraste, administrer un bolus de 50 μL de microbulles injectées par voie intraveineuse (iv) avec une concentration de 2 x 10⁸ microbulles par mL dans la veine de la queue.
   2. Dans la touche Préréglage, définissez la durée totale d’enregistrement en secondes (30 s). Choisissez un mode continu sans pause entre les images en réglant le temps entre les images sur 0 s.
   3. Appuyez sur le bouton Enregistrer pour démarrer l’acquisition 2D. L’enregistrement peut être annulé en appuyant sur le bouton Arrêter . Les données peuvent être perdues lorsque l’acquisition est interrompue avant la fin de l’acquisition.
2. Visualisez et adaptez l’enregistrement acquis.
   1. Modifiez le contraste et la palette de couleurs si vous le souhaitez en appuyant sur Visualisation. Rejouez l’enregistrement si nécessaire en faisant défiler les images avec le curseur, qui est inclus dans la fonction Temps.
3. Enregistrez les données.
   1. Donnez un nom à l’enregistrement acquis afin d’enregistrer le fichier au format .scan dans le dossier de session. Une fenêtre pop-up de sauvegarde des données est automatiquement proposée à la fin de chaque enregistrement. Les données sont enregistrées automatiquement.
4. Lancez une autre acquisition en cliquant sur l’onglet Préréglage et répétez l’opération à partir de l’étape 3.1.1.
5. Retirez le dispositif d’imagerie et prenez soin de l’animal.
   1. Allez dans le menu Déplacer la sonde pour déplacer verticalement la sonde à l’extérieur du réservoir d’eau imprimé en 3D. Retirez la configuration et le gel à ultrasons et défixez l’animal.
   2. Euthanasier l’animal lorsque le plan expérimental atteint le point final ; Sinon, passez aux étapes suivantes.
   3. Appliquez un peu de crème hydratante sur la zone de la peau rasée de l’animal si des mesures longitudinales sont prévues.
   4. Remettez l’animal dans la cage et laissez-le se réveiller de l’anesthésie sous une lampe chauffante pour éviter l’hypothermie. Surveillez l’animal pendant sa convalescence.
   5. Remettez l’animal dans le râtelier de la cage ventilé individuellement lorsqu’il marche à nouveau normalement. Terminez les expériences sur les animaux de laboratoire avant d’analyser l’ensemble des données.

4. Analyse quantitative (Temps ~ 1 h)

1. Ouvrez le script d’analyse gui_analysis.m disponible dans le Fichier supplémentaire 1.
2. Sélectionnez le balayage et définissez les paramètres quantitatifs dans les paramètres : 10 régions d’intérêt (ROI) avec une taille de voxel de 2 x 2. Choisissez 40 ms pour chaque image afin d’effectuer l’intégration Doppler.
3. Dessiner la périphérie vasculaire de l’organe ; les 10 ROI sont automatiquement prépositionnés entre des artères clairement visibles et peuvent être ajustés manuellement si nécessaire (Figure 4A). Fermez la boîte de dialogue flottante lorsque vous êtes satisfait du positionnement. Assurez une acquisition stable (Figure 4B) pour un calcul robuste du volume sanguin, en évitant les acquisitions affectées par de forts artefacts de mouvement (Figure 4C).
4. Quantifiez le volume sanguin hépatique moyen en U.A. des 10 ROI totaux en estimant automatiquement la moyenne et l’écart-type des valeurs du cadre silencieux dans l’enregistrement de 30 s (Figure 4D).
   REMARQUE : Le tableau de données des intensités des retours sur investissement peut être copié/collé directement dans un fichier de tableur.
5. Répétez l’analyse pour au moins deux plans supplémentaires, -0,3 mm et -0,6 mm, dans une direction caudale. Quantifiez toutes les données d’acquisition avant d’effectuer l’analyse statistique.
6. Vérifiez l’écart-type des intensités sur l’ensemble de l’image et déterminez une coupure comme moyenne globale (μ) avec 2 écarts-types (2σ) pour exclure objectivement les mesures sensibles aux artefacts de mouvement (Figure 4E).
   REMARQUE : La moyenne et l’écart-type des valeurs de cadre silencieux estimées sur l’ensemble de l’image sont fournis dans la première ligne du tableau de données.
   ATTENTION : Les artefacts de mouvement empêchent une quantification robuste et doivent être identifiés objectivement sur la base de l’analyse de l’ensemble de l’image temporelle.
7. Prenez la moyenne de tous les volumes sanguins hépatiques moyens quantifiés sur 3 plans différents dans 30 zones d’intérêt par animal à l’étape 4.3 (Figure 4F). Appliquez le test ROUT de 1 % dans un logiciel d’analyse statistique pour identifier les retours sur investissement aberrants avant d’obtenir une moyenne de 30 points d’intérêt par animal. Pour améliorer l’estimation du volume sanguin, enregistrez des plans supplémentaires par animal.
8. Pour administrer un traitement par véhicule, désinfectez le site d’injection, c’est-à-dire le quadrant inférieur droit ou gauche de l’abdomen, à l’aide de gaze et d’éthanol à 70 %. Injecter 20 μL de solution saline ou de DMSO ip à l’aide d’une aiguille 27G et d’une seringue jetable de 1 mL ou d’une seringue à insuline de 30G ou administrer 100 μL de méthylcellulose (hydroxypropylique) par gavage à l’aide d’une aiguille d’alimentation réutilisable de 30G à embout rond. Plot des données de 3 cohortes recevant une solution saline ou du DMSO par ip ou administration orale (po) de cellulose (Figure 4G). Effectuez l’analyse à l’aveugle sans révéler l’état et/ou le traitement reçu.
   REMARQUE : L’administration du véhicule n’a aucun impact sur les mesures du volume sanguin.

Résultats

Conformément au protocole, l’imagerie du système vasculaire hépatique est facilitée sur la base de la standardisation des structures anatomiques et de la terminologie correspondante (Figure 1). Afin de proposer une nomenclature standardisée pour les chercheurs utilisant des modèles hépatiques précliniques, nous avons schématiquement représenté le positionnement hépatique commun dans la cavité abdominale de souris (Figure 1A), fourni la disposition structurelle des différents lobes hépatiques (Figure 1B), et spécifié le réseau vasculaire artériel (Figure 1C). Dotée d’une expertise anatomique, l’imagerie UFUS in vivo a été réalisée à l’aide d’un réservoir d’eau imprimé en 3D pour réduire les artefacts de mouvement (Figure 2A). L’impédance acoustique a été corrigée en introduisant la sonde dans l’eau et en appliquant du gel de transmission d’ultrasons directement sur la peau rasée de l’animal. En adoptant cette configuration, la respiration et d’autres artefacts de mouvement sont réduits puisque la sonde n’est pas en contact direct avec la poitrine et l’abdomen en mouvement de l’animal. De cette façon, nous avons visualisé la structure vasculaire des lobes droit et gauche, qui sont facilement accessibles par l’UFUS en raison de leur emplacement superficiel (Figure 2B). D’autres lobes hépatiques, tels que le lobe caudé et le lobe carré, sont situés plus profondément dans le corps, ce qui rend plus difficile l’identification anatomique correcte du système vasculaire hépatique par l’UFUS.

Après avoir démontré l’importance des indications anatomiques et des interprétations standardisées et communément acceptées des structures vasculaires, nous avons effectué plusieurs scintigraphies Doppler dans divers plans pour fournir une vue d’ensemble complète de la vascularisation hépatique imagée par l’UFUS amélioré par contraste chez la souris (Figure 3). Nous avons délimité le réseau artériel hépatique des lobes hépatiques individuels, c’est-à-dire les lobes latéraux gauche (LL), médial gauche (LM), latéral droit (RL) et médial droit (RM). De plus, les artères principales sont marquées, telles que l’aorte abdominale (AA), l’artère hépatique (HA), l’artère hépatique latérale gauche (LLHA) et l’artère hépatique médiale droite (ARHA). Il est important de noter que les lobes hépatiques peuvent être positionnés légèrement différemment en fonction de l’emplacement et du mouvement péristaltique de l’intestin grêle (SM), ainsi que de l’état de remplissage de l’estomac (S). Cette vue d’ensemble de l’ensemble du système vasculaire hépatique de la souris fournit un atlas vasculaire complet pour l’imagerie hépatique in vivo par l’UFUS.

Une sélection précise des plans anatomiques est cruciale pour obtenir une lecture quantitative dérivée d’un lobe de foie. Des mesures robustes du volume sanguin peuvent être obtenues en sélectionnant manuellement 10 régions d’intérêt (ROI) par plan (Figure 4A). Pour une quantification fiable du volume sanguin de la microcirculation, une acquisition stable est nécessaire avec une faible variation des intensités moyennes d’image. Celle-ci est déterminée sur la base de la valeur moyenne de l’image (MIV) de l’ensemble de l’image au fil du temps (Figure 4B), contrairement à un enregistrement sensible à des artefacts de mouvement importants (Figure 4C). Pour gérer les artefacts de mouvement, la sélection automatique d’une faible MIV a été utilisée pour quantifier de manière fiable les mesures du volume sanguin hépatique (Figure 4D) en traçant l’écart-type de toutes les MIV temporelles faibles d’une image entière (Figure 4E). Les balayages Doppler de plusieurs plans par animal montrent une intra- et une inter-variabilité acceptables à l’intérieur et entre les souris de 3 cohortes différentes après un traitement aberrant sur 30 ROI par animal avec un test ROUT de 1 % (Figure 4F). Pour améliorer l’estimation du volume sanguin par animal, il est recommandé d’enregistrer des plans supplémentaires ou d’augmenter le nombre de retours sur investissement sélectionnés par avion. De plus, les lectures du volume sanguin peuvent être utilisées pour surveiller le traitement médicamenteux, en ciblant spécifiquement la microvascularisation. En administrant le véhicule par deux voies d’administration, nous avons démontré qu’il n’y a pas d’effet sur les mesures du volume sanguin hépatique (Figure 4G). Ces résultats indiquent que la délétion du gène ou l’administration du traitement n’est pas affectée par l’administration d’un véhicule, ce qui garantit une conception expérimentale robuste. Dans l’ensemble, un protocole quantitatif objectif et reproductible est fourni pour les recherches futures visant à explorer les anomalies vasculaires hépatiques dans divers modèles murins.

Figure 1 : Anatomie du foie murin. (A) Vue d’ensemble schématique du positionnement du foie dans la cavité abdominale sous le diaphragme de la souris. (B) Description schématique du foie murin à quatre lobes hépatiques, c’est-à-dire le lobe gauche, le carré, le caudé et le lobe droit, et la triade porte composée de la veine porte, de l’artère hépatique et du canal biliaire. (C) Illustration schématique du réseau artériel du système vasculaire haptique. Identification des artères hépatiques (HA) et des branches (ramus) avec nomenclature latine fournie. Abréviation : HA = Artère hépatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Imagerie par échographie Doppler ultrarapide (UFUS) du système vasculaire hépatique chez la souris. (A) Vue d’ensemble schématique du dispositif expérimental pour l’imagerie in vivo non invasive. (B) Illustrations schématiques de la direction de l’imagerie et des représentants associés des lobes médiaux droit et gauche, ainsi que du lobe latéral gauche, imagés par UFUS. Abréviation : AA = Aorte abdominale, LLL = Lobe latéral gauche, LML = Lobe médial gauche, RML = Lobe médial droit. Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Échographie Doppler ultrarapide avec contraste représentative du système vasculaire hépatique murin. Une vue d’ensemble de l’ensemble du système vasculaire hépatique d’une souris adulte imaginée dans 3 positions, c’est-à-dire latérale droite, médiale et latérale gauche, dans 4 plans du crâne vers la caudale. La référence est située directement sous le diaphragme imagé en médial et à 1 cm latéral à droite et à gauche, avec les mêmes plans dans une direction caudale. Abréviation : AA = Aorte abdominale, HA = Artère hépatique, LLL = Lobe latéral gauche, LLHA = Artère hépatique latérale gauche, LML = Lobe médial gauche, RLL = Lobe latéral droit, RMHA = Artère hépatique médiale droite, LMR = Lobe médial droit, SI = Intestin grêle, S = Estomac. Barre d’échelle 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 : Mesure quantitative du volume sanguin hépatique par échographie Doppler ultrarapide (UFUS). (A) Représentants du lobe médial (ML) de souris témoins adultes de type sauvage C57BL/6 dans le plan 1 sélectionnées sous le diaphragme, correspondant à 0 mm, plan 2 à -0,3 mm et plan 3 à -0,6 mm avec une sélection de 10 régions d’intérêt (ROI). Barre d’échelle 1 mm. Illustration d’un Doppler de puissance de 30s avec (B) acquisition stable (gris) et (C) mouvement tissulaire (rouge) basé sur des valeurs d’image moyennes en unités arbitraires (U.A.) de l’image entière pour une évaluation quantitative. (D) Reconnaissance automatisée des faibles intensités (U.A.) pour la mesure quantitative du volume sanguin dans le temps. (E) Écart-type (écart de Saint) de faibles intensités tracé pour identifier les acquisitions instables (rouge) causées par des artefacts de mouvement indiqués par une coupure de la moyenne globale (μ) du nombre (N) d’animaux de 3 cohortes avec 2 écarts-types (2σ) évaluation de l’écart-type (SD) de faibles intensités (U.A.) en condition physiologique (gris) chez les souris témoins adultes de type sauvage C57BL/6. (F) La quantification des changements de volume sanguin mesurés in vivo au fil du temps en moyenne sur 3 plans, c’est-à-dire 30 ROI au total par animal, est représentée par l’intensité des pixels (U.A.). Détection des valeurs aberrantes par test ROUT 1 %. (G) Il n’y a pas de différence entre le type de véhicule de livraison et la voie d’administration. La cohorte 1 (n = 6) a reçu une injection intrapéritonéale (ip) de solution saline, la cohorte 2 (n = 3) une injection ip de DMSO et la cohorte 3 (n = 6) une administration orale (po) de cellulose. ANOVA à un facteur avec le test de comparaisons multiples de Dunnett, ns P > 0,05. Abréviation : A.U. = Unités arbitraires, DMSO = Diméthylsulfoxyde de méthyle, ip = Intrapéritonéale, po = Administration orale, ROI = Région d’intérêt, St. Deviation = Écart-type, UFUS = Échographie Doppler ultrarapide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Échographie Doppler ultrarapide (UFUS) script quantitatif des mesures du volume sanguin hépatique. Script gui_analysis.m fournit une interface graphique pour le positionnement automatique de la région d’intérêt (ROI) pour les mesures de volume sanguin. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans ce protocole, nous montrons comment effectuer une imagerie UFUS non invasive du système vasculaire hépatique de souris. Nous présentons une description détaillée de la procédure d’imagerie, englobant la manipulation des animaux, le fonctionnement de l’échographe et l’analyse des données pour calculer les changements de volume sanguin in vivo. Pour faciliter l’interprétation des données échographiques, nous fournissons un aperçu complet des structures anatomiques qui peuvent être clairement visualisées par l’UFUS. De plus, nous décrivons une procédure de quantification standardisée pour des mesures robustes des paramètres vasculaires. Il est possible d’obtenir une résolution appropriée sans l’utilisation d’un agent de contraste, ce qui permet une évaluation quantitative sûre et simple du volume sanguin hépatique de la microcirculation. Nous mettons l’accent sur l’utilisation d’une nomenclature anatomique normalisée pour éviter la confusion et les erreurs d’interprétation, en particulier lors de l’évaluation des mesures quantitatives de la microvascularisation.

L’imagerie UFUS de la vascularisation murine a déjà été rapportée, principalement dans le domaine des neurosciences⁷. L’imagerie cérébrale n’est pas affectée négativement par les artefacts de mouvement, contrairement au foie, qui est très sensible aux mouvements respiratoires. En raison de sa position anatomique sous le diaphragme, l’épilation dans la région abdominale doit être effectuée très doucement pour éviter d’introduire une respiration irrégulière en minimisant les forces physiques sur la poitrine et la région abdominale. De plus, l’obtention d’un degré d’anesthésie approprié est essentielle pour assurer une respiration oscillante régulière, un facteur qui peut être relativement facilement corrigé dans les étapes de post-traitement. La sensibilité de l’UFUS a été améliorée ici par l’application d’un filtre de décomposition en valeurs singulières (SVD) pour supprimer les artefacts de mouvement⁶ et par la censure supplémentaire des images à mouvement élevé. Les vidéos Doppler à haute fréquence d’images sont acquises ici à 10 ms pour nous permettre de visualiser et de mesurer l’effet du mouvement respiratoire sur des images qui ont généré des pics de grande valeur en raison d’artefacts de mouvement. La fréquence respiratoire pourrait alors être identifiée à partir du pic dans la transformée de Fourier rapide du signal d’image moyen, et les images de crête correspondantes correspondant au mouvement élevé de l’organe peuvent être écartées.

L’imagerie Doppler échographique reproductible au sein d’un même animal au fil du temps, ainsi qu’entre des animaux de poids corporels différents, peut encore se heurter à plusieurs limites. Tout d’abord, le positionnement du foie peut être influencé par des facteurs tels qu’un estomac très rempli et un mouvement péristaltique de l’intestin. Cette influence est particulièrement prononcée lorsque l’on choisit le lobe hépatique latéral gauche comme référence. Par conséquent, nous recommandons de choisir le lobe latéral gauche uniquement chez les animaux de grande taille et de préférer le lobe médial droit ou gauche chez les animaux plus petits. Deuxièmement, des mouvements respiratoires lourds non oscillants peuvent se produire chez les animaux en détresse, ce qui entraîne des artefacts de mouvement difficiles à corriger et, par conséquent, ne peuvent pas être utilisés pour le calcul du volume sanguin. Ainsi, un choix d’anesthésie approprié, ainsi qu’un dosage adapté au poids corporel, sont cruciaux. Enfin, la limite de résolution limite la visualisation de la microvascularisation hépatique, c’est-à-dire que les vaisseaux sanguins peuvent être visualisés avec des diamètres allant jusqu’à 100 mm³.

L’utilisation d’agents de contraste a récemment été proposée pour obtenir une image détaillée du système vasculaire de la souris en suivant les microbulles. Une telle approche permet d’atteindre une résolution spatiale élevée et de fournir des mesures quantitatives de la vitesse sanguine¹⁷. Cependant, le suivi des microbulles reste très difficile pour le déplacement des organes internes, surtout lorsqu’ils sont acquis en 2D.

Ici, nous avons montré que des mesures stables du volume sanguin hépatique obtenues par Doppler ultrarapide pouvaient être acquises chez des souris témoins de trois cohortes recevant différents véhicules administrés par injections ip ou gavage oral. Récemment, de telles mesures du volume sanguin ont été utilisées avec succès dans un modèle murin de maladie du foie¹⁶. Pour élaborer, l’expansion vasculaire a été détectée au niveau de la microscopie électronique et confirmée par des mesures quantitatives à l’aide de l’UFUS. Cette étude a mis en évidence la sensibilité de l’évaluation in vivo pour étudier les défauts vasculaires aux niveaux fonctionnel et quantitatif, même avec une angioarchitecture hépatique préservée, ce qui est prometteur pour le diagnostic clinique et le suivi.

En résumé, ce protocole sert de guide pour les études qualitatives et quantitatives non invasives du système vasculaire hépatique chez la souris. Il peut également être utilisé pour un suivi longitudinal en raison de sa procédure non invasive et simple. De plus, il a le potentiel de fournir des évaluations fonctionnelles des vaisseaux sanguins.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(Hydroxypropyl)méthylcellulose HPMC	Sigma-Aldrich	H7509	0,5 % HPMC
Centrifugeuse ZentriMix 380 R	Hettich	3200
Tubes à centrifuger 50 mL conique Stérile Polypropylène	CELLSTAR	tubes 227 261
Embouts en coton	Meditip Clean	G80215
Eau déminéralisée	dans la maison
Crème dépilatoire	à proximité pharmacie
Diméthyl sulfoxyde (DMSO)	Sigma	D2650-5X5ML
stérile Absolu d’éthanol	FRESENIUS KABI	010-0622-1
Aiguille d’alimentation, réutilisable	FST Fine Science Tools	18064-20
Pince à pointe fine Dumont #5 Pince	FST Fine Science Tools	11252-00
Compresses de gaze 5 x 5 cm	Klinipress	175 004
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	Version 9
Script d’analyse de l’interface graphique	Inserm	gui_analysis.m	a besoin d’un balayage Doppler de 10 ms
Coussin chauffant 17 x 17 cm, 6 W	ThermoLux Acculux	461265
Seringue à insuline 30G 0,30 x 8 mm, 0,3 mL et 0,5 mL	BD Microfine + Demi	25636
Kétamine Aneskétine	Dechra	REG NL 111764	100 mg/mL
Kimwipes KIMTECH essuie-glace à faible peluche	ULINE	S-8115
Ruban de laboratoire 19 mm x 50 m x 0,125 mm	Stokvis	M451
Logiciel MATLAB	MathWorks	Version R2022b
Crème hydratante	à proximité pharmacie
Aiguille jaune 30G 0,3 x 13 mm	BD Microlance	304000
Pommade ophtalmique Oculentum Simplex	Added Pharma	220201
Mouchoirs en papier	dans la maison
Marqueur de laboratoire permanent	VWR	52877-310
Solution saline physiologique (NaCl 0,9 %)	FRESENIUS KABI	B102986	stérile
Récipient jetable pour objets tranchants Distributeur médical 2,5 L	APmedical	UN3291
Coffre-fort stérile Tubes de 1,5 mL	Eppendorf	0030 120.086
Seringue 1 mL	BD Plastipak	303172
Seringue 20 mL Luer-Lok	BD Plastipak	300629
Timer	West Bend	40053
Tondeuse	Exacta Aesculap	GT416
Ultrafast plateforme d’échographie	Iconeus &   ; INSERM 'Échographie biomédicale' ART	Iconeus Un prototype	avec une séquence de 10ms
Gel de transmission d’ultrasons Aquasonic 100	Parker Laboratories INC.	BT-025-0037N
Réservoir d’eau imprimé en 3D 10 x 10 x 1,5 cm polyméthylpentène (PMP) 0,125 mm	GoodFellow Cambridge limité	ME311100/2	Fichier CAD sur demande
Xylazine Sedamun	Dechra	REG NL 10084	20 mg/mL