Étude des effets des polluants environnementaux inhalés sur la fonction olfactive chez la souris

Résumé

Cet article fournit une description détaillée de l’expérience de test d’aliments enterrés et de discrimination sociale des odeurs pour évaluer les effets de l’exposition aux polluants environnementaux inhalés sur la fonction olfactive chez la souris.

Résumé

L’altération olfactive est un problème de santé publique important et permet de prédire de manière indépendante le risque de maladies neurodégénératives. L’exposition aux polluants environnementaux inhalés peut altérer l’olfaction ; Il est donc urgent de disposer de méthodes permettant d’évaluer les effets de l’exposition aux polluants environnementaux inhalés sur l’olfaction. Les souris sont des modèles idéaux pour les expériences olfactives en raison de leur système olfactif et de leurs caractéristiques comportementales très développés. Pour évaluer les effets de l’exposition aux polluants environnementaux inhalés sur la fonction olfactive chez la souris, un test détaillé des aliments enfouis et une expérience de discrimination sociale des odeurs est fourni, y compris la préparation de l’expérience, la sélection et la construction des installations expérimentales, le processus de test et les indices de temps. Pendant ce temps, l’équipement de chronométrage, les détails opérationnels et l’environnement expérimental sont discutés pour assurer le succès du test. Le sulfate de zinc est utilisé comme traitement pour démontrer la faisabilité de l’approche expérimentale. Le protocole fournit un processus opérationnel simple et clair pour évaluer les effets des polluants environnementaux inhalés sur la fonction olfactive chez la souris.

Introduction

La déficience olfactive est devenue un problème de santé publique notable et est indépendamment associée à un risque accru de maladies neurodégénératives. Cette condition peut nuire au bien-être général, contribuer au développement de symptômes dépressifs et entraîner une diminution de la qualité de vie. Son impact est principalement observé dans l’altération de la perception de la nourriture, l’entrave à la communication sociale et l’augmentation des sentiments négatifs¹. Divers facteurs, notamment la maladie sinusale, l’infection des voies respiratoires supérieures et les lésions cérébrales traumatiques, ont été considérés comme des facteurs contribuant à la déficience olfactive chez l’homme². Notamment, les polluants environnementaux inhalables tels que les PM2,5, estimés entre 2% et 16%, pénètrent dans le corps par l’air inspiré, traversent la cavité nasale et atteignent des régions spécifiques dédiées à l’olfaction où ils se déposent 3,4,5,6,7. Des découvertes récentes indiquent que les polluants environnementaux inhalables, y compris les PM2,5 et l’ammoniac, peuvent en effet endommager les neurones sensoriels olfactifs ^8,9,10. Cependant, une validation supplémentaire est nécessaire pour déterminer si de tels dommages conduisent directement à un dysfonctionnement olfactif. Par conséquent, une évaluation méticuleuse des effets des polluants environnementaux inhalables sur la fonction olfactive est d’une importance particulière.

Actuellement, de nombreux laboratoires de recherche utilisent des souris comme modèle alternatif de vertébré pour des expériences comportementales visant à comprendre les changements dans la fonction olfactive 11,12,13,14. Les souris ont été choisies comme système modèle privilégié pour l’étude de la communication chimique des vertébrés, et elles présentent une sensibilité olfactive remarquable cruciale pour la recherche de nourriture et^{la communication sociale}. De plus, l’éventail en constante évolution d’outils permettant d’observer et d’influencer le comportement des souris a rendu cette espèce exceptionnellement attrayante pour la recherche sur la fonction olfactive¹⁶.

Dans cette étude, nous avons utilisé le test des aliments enterrés et l’expérience de discrimination sociale des odeurs pour évaluer l’altération olfactive dans un modèle murin exposé à des polluants environnementaux inhalables. Pour améliorer la précision de l’évaluation, nous avons opté pour la méthode la plus représentative pour évaluer la fonction olfactive. Nous avons systématiquement affiné cette méthode pour en assurer la simplicité et la clarté, ce qui nous a permis d’évaluer efficacement l’ampleur du dysfonctionnement olfactif induit par les polluants environnementaux inhalables.

Protocole

Nous avons utilisé des souris mâles C57BL/6J (âge : 6-8 semaines ; poids : 20-22 g) pour tous les tests comportementaux. Les souris ont été soumises à des conditions stables (c’est-à-dire une température de 23 ± 1 °C, une humidité de 55 % ± 5 % et un cycle lumière-obscurité de 12/12 h avec les lumières allumées à 7 h). Tous les tests comportementaux ont été effectués entre 10h00 et 17h00. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique du Comité professionnel des expériences sur les animaux de l’Université de Qingdao. Après une période d’acclimatation d’une semaine, toutes les souris ont été exposées à des polluants environnementaux inhalables.

1. Exposition aux polluants

1. Administration intranasale par instillation
   1. Dissoudre les polluants environnementaux inhalables dans une solution saline à 0,9 %. Utilisez une fois une solution de sulfate de zinc à 5 %, dont il a été démontré qu’elle provoque un dysfonctionnement olfactif¹⁷. Pour les souris témoins, administrer une solution saline normale à 0,9 %.
   2. Anesthésie la souris par injection intrapéritonéale de pentobarbital¹⁸ sodique et évalue la profondeur de l’anesthésie à l’aide du réflexe de pincement des orteils. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse. Placez la souris sur le dos sur une surface inclinée, la tête vers le bas.
   3. À l’aide d’un pistolet de pipetage, administrer 10 μL de la solution dans une narine de la souris, en laissant inhaler naturellement la solution dans la cavité nasale.
   4. Pour assurer le bien-être de la souris et prévenir toute gêne potentielle, répétez l’inhalation pour l’autre narine après un intervalle de 10 minutes.
   5. 3 jours après l’administration intranasale par instillation chez la souris, effectuez le test des aliments enterrés.

2. Test des aliments enterrés

1. Effectuez la privation de nourriture 18-24 h avant le test en retirant toutes les granulés de nourriture de la trémie alimentaire de la cage domestique. Changez les matériaux de litière pour les souris. Ne retirez pas la bouteille d’eau.
2. Disposez la table d’opération comme décrit ci-dessous.
   1. 1 h avant le début de l’essai, apportez la cage contenant les souris au bloc opératoire pour qu’elles se reposent.
   2. Aménagez la salle d’opération pendant cette période. Utilisez et marquez les cages de souris standard en PVC transparent comme A, car elles créent un environnement familier. Utilisez et marquez la cage d’essai comme B, qui est une cage d’écureuil standard en PVC transparent. Marquez la cage commune utilisée pour placer les souris après l’expérience comme cage C.
   3. Couvrez les cages A et B avec 3 cm de litière et mesurez-les à l’aide d’une règle. Disposez les cages côte à côte, avec une distance de 0,5 m entre chaque cage (figure 1).
   4. Définissez la zone d’expérimentation comme une zone d’un rayon de 2 m, le centre étant le centre des cages. Définissez la zone à l’extérieur de la portée de 2 m comme zone d’observation.
   5. Gardez la cage C et les cages contenant des souris non testées aussi loin que possible de la zone d’expérience.
3. Notez le temps nécessaire pour trouver de la nourriture comme décrit ci-dessous.
   1. Choisissez une position au hasard dans la cage B, enterrez la nourriture à 1 cm sous la surface de la litière et lissez la surface de la litière.
   2. Mettez la souris dans la cage A pendant 4 min. Transférez les souris dans la cage B à la fin du chronométrage, allumez l’appareil vidéo et retournez dans la zone d’observation.
   3. Lorsque la souris ramasse le bloc de nourriture avec sa patte avant, arrêtez l’enregistrement vidéo. Dans certains cas, on peut voir des souris manger la tête penchée sur la nourriture. Ce comportement indique également le succès de l’essai, même si la souris ne tient pas la nourriture avec sa patte avant.
   4. Enregistrez les données. Notez le temps écoulé entre le contact avec le tapis au fond de la cage B et la découverte de la nourriture pour chaque souris. Si les souris ne trouvent pas de nourriture après 4 minutes, enregistrez le temps de recherche comme un temps de retard de 240 s.
   5. Mettez la souris dans la cage C après le test.
   6. Retirez la nourriture de la cage B et mettez-la dans un sac scellé. Replacez la nourriture dans la cage B et testez la souris suivante après avoir changé le matériau de la litière, comme décrit ci-dessous.
      1. Pour les souris logées dans la même cage, testez avec le même ensemble de matériaux de litière dans la cage B. Pour les souris dans différentes cages, nettoyez la cage avec de l’alcool et remplacez les matériaux de litière.
   7. Ajoutez de la nourriture et de l’eau aux souris après l’expérience. Effectuez l’expérience de discrimination sociale des odeurs 1 jour plus tard.
      REMARQUE : Les masques doivent être portés tout au long du processus et les gants transparents doivent être changés une fois que chaque souris a terminé l’expérience pour éviter autant que possible les odeurs croisées. Gardez l’amplitude des mouvements aussi petite que possible pour éviter le stress de la souris.

3. Expérience de discrimination sociale des odeurs

1. Collecte d’urine
   1. Prélever séparément l’urine de souris mâles sexuellement matures et de souris femelles et aliquote dans des tubes en volumes égaux¹⁹. Emballez dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL avec 300 μL d’urine dans chaque tube.
   2. Conservez les échantillons à -80 ° C jusqu’à utilisation. Agitez les tubes pour répartir uniformément l’échantillon après décongélation. Ne décongelez pas et ne congelez pas l’échantillon à plusieurs reprises.
2. Disposez la table d’opération comme décrit ci-dessous.
   1. 1 h avant le début de l’essai, apportez la cage contenant les souris au bloc opératoire pour qu’elles se reposent.
   2. Disposez la salle d’opération pendant cette période comme décrit aux étapes 2.2.2 à 2.2.5.
3. Notez le temps nécessaire pour trouver de l’urine comme décrit ci-dessous.
   1. Faites une rainure avec du ruban adhésif autour de chacun des deux côtés larges de la cage B, suffisamment grande pour contenir le tube de la microcentrifugeuse contenant 300 μL d’urine mâle et femelle. Placez les tubes et gardez les deux couvercles de tube fermés pour l’instant.
   2. Mettez la souris dans la cage A et réglez un compte à rebours pendant 4 min. Ouvrez les deux tubes de la cage B à la fin du chronométrage.
   3. Transférez la souris en position médiane de la cage B, à la même distance des deux tubes, puis allumez l’équipement d’enregistrement vidéo et retirez-vous doucement et lentement vers la zone d’observation.
   4. Lorsque la souris renifle la paroi/la bouche du tube ou même à l’intérieur du tube, le tube est senti avec succès. À ce moment, appuyez sur le chronomètre et enregistrez le temps comme le temps de sentir le tube (M s), puis continuez à enregistrer le temps de séjour (X s) jusqu’à ce que la souris s’éloigne du tube.
   5. Continuez à chronométrer l’heure en reniflant l’autre tube. Lorsque la souris renifle la paroi/la bouche du tube ou même à l’intérieur du tube, le tube est senti avec succès. Appuyez sur le chronomètre et notez le temps qu’il a fallu pour sentir l’autre tube (N s), puis continuez à enregistrer le temps de séjour (Y s) jusqu’à ce que la souris s’éloigne du tube.
   6. Transférez la souris dans la cage C à la fin de l’expérience.
   7. Changez les tubes d’urine et le matériau de litière de la cage B après chaque test sur la souris. Mettez l’urine de rat utilisée dans un sac propre selon le sexe.
   8. Changez de gants et testez la souris suivante comme décrit ci-dessus.
4. Effectuez l’expérience dans un laboratoire sans odeur évidente. Évitez les produits personnels qui émettent de fortes odeurs. Portez des gants et des masques tout au long de la procédure pour éviter autant que possible la traversée des odeurs. Gardez l’amplitude des mouvements aussi petite que possible pour éviter le stress de la souris.

Résultats

Les polluants environnementaux inhalables altèrent la fonction olfactive chez la souris. Il a été démontré que le zinc atmosphérique émis par les incinérateurs et les véhicules à moteur est un polluant inhalé qui peut entraîner une inflammation allergique des poumons²⁰. Le sulfate de zinc est considéré comme l’un des composés typiques à l’origine d’un dysfonctionnement olfactif²¹. Par conséquent, nous utilisons du sulfate de zinc comme traitement pour exposer les souris par instillation intranasale et testons en utilisant le test de nourriture enterrée et l’expérience de discrimination sociale des odeurs. Dans l’essai d’enfouissement des aliments, il a fallu plus de 240 s aux souris exposées au sulfate de zinc pour trouver la nourriture par rapport au groupe témoin (figure 2). Les souris privées de nourriture avec une olfaction normale trouvent généralement la nourriture enterrée en 1 minute. Lorsque les souris ont développé un dysfonctionnement olfactif, il leur a fallu plus de temps pour trouver de la nourriture ou même ne pouvaient pas trouver de nourriture. Par rapport au groupe témoin, les souris du groupe exposé ont mis plus de temps à trouver de la nourriture, avec des cas où elles n’ont pas pu trouver de nourriture dans les 240 s, indiquant des dommages à la fonction olfactive.

Des résultats similaires ont été observés dans l’expérience de discrimination sociale des odeurs. Chez les souris exposées au sulfate de zinc, ni l’urine mâle ni l’urine femelle n’ont pu être reniflées pendant le temps d’observation défini (Figure 3A). Au-delà du temps fixé, les souris exposées au sulfate de zinc ont brièvement reniflé l’urine des femelles et des mâles, mais le temps de reniflement était significativement inférieur à celui des souris témoins (figure 3B). Lorsque des volumes égaux d’urine femelle et mâle sont présentés en même temps, les souris mâles préfèrent généralement l’urine femelle²². Les souris du groupe exposé avaient besoin de plus de temps pour distinguer l’urine femelle de l’urine mâle ou ne pouvaient même pas les distinguer. Plus précisément, par rapport au groupe témoin, les souris du groupe exposé ont passé plus de temps à sentir l’urine et ont passé moins de temps à proximité de l’urine.

Figure 1 : disposition de la table d’opération. Les cages A et B ont été maintenues à une distance de 0,5 m. L’équipement d’enregistrement vidéo a été contrôlé au-dessus de la cage B par le support de téléphone portable, et le champ vidéo a été ajusté pour enregistrer l’environnement interne de la cage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Résultats d’analyses d’aliments enterrés. Analyse statistique des souris témoins et des souris exposées au sulfate de zinc à la recherche de nourriture. Les souris du groupe témoin ont trouvé de la nourriture dans les 30 s, et les souris exposées au sulfate de zinc ont trouvé de la nourriture pendant plus de 240 s, ce qui a été calculé comme 240 s. Un test t sur échantillon indépendant a été utilisé pour comparer les différences entre les deux groupes. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type (n = 3 souris par groupe) ; ** p < 0,01. Si un animal n’a pas trouvé la nourriture après 240 s, le temps nécessaire pour trouver de la nourriture a été enregistré comme étant de 240 s, comme c’était le cas pour tous les animaux traités. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Expérience de discrimination sociale des odeurs. (A) Analyse statistique des souris témoins et des souris exposées au sulfate de zinc à la recherche d’urine. Les souris du groupe témoin ont trouvé de l’urine dans les 30 secondes, et les souris exposées au sulfate de zinc ont passé plus de 240 secondes à chercher de l’urine femelle ou mâle, ce qui a été compté comme 240 s. Si un animal n’a pas trouvé le flacon d’urine après 240 s, le temps nécessaire pour trouver le flacon a été enregistré comme étant de 240 s, comme ce fut le cas pour tous les animaux traités. (B) Le temps de séjour en contact avec l’urine a été analysé statistiquement pour les souris témoins et les souris exposées au sulfate de zinc. Un test t sur échantillon indépendant a été utilisé pour comparer les différences entre les deux groupes. Les données sont présentées ± moyenne de l’écart-type (n = 3 souris par groupe) ; ** p < 0,01, * p < 0,5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Cet article présente deux protocoles fondamentaux conçus pour l’évaluation rapide de l’altération olfactive chez la souris. Divers polluants environnementaux inhalables entraînent des niveaux distincts de dysfonctionnement olfactif chez la souris. Le test de la nourriture enterrée est utilisé pour évaluer la capacité à détecter les odeurs volatiles, tandis que l’expérience de discrimination des odeurs sociales évalue la capacité de l’animal à discerner et à différencier diverses odeurs sociales. Le protocole sert ici à évaluer les effets toxiques des polluants environnementaux sur la fonction olfactive.

Les polluants environnementaux inhalés, y compris l’ozone, l’ammoniac et les gaz d’échappement diesel, possèdent des odeurs qui peuvent influencer la perception olfactive des souris lors de l’inhalation d’échantillons^23,24. Il est crucial de noter que la réalisation d’expériences comportementales chez la souris immédiatement après la fin de l’exposition pourrait potentiellement donner des résultats faussement négatifs²². Pour répondre à cette préoccupation, nous avons mis en œuvre des mesures visant à améliorer la fiabilité des expériences. Plus précisément, les cages ont été nettoyées à fond et les matériaux de litière ont été remplacés après la période d’exposition. Par la suite, des expériences comportementales ont été menées avec un intervalle de 24 heures après l’exposition^22. Cet ajustement procédural vise à garantir des résultats précis et significatifs.

Dans l’expérience d’enterrement de la nourriture, un paramètre clé était le temps mis par les souris pour localiser la nourriture cachée. Il convient de noter que les souris stressées ont tendance à présenter une activité accrue et une concentration réduite pendant les tests, ce qui peut potentiellement conduire à des résultats faussement positifs 25,26,27,28. Par conséquent, il est impératif de s’assurer que les souris restent calmes et ne sont pas soumises à un stress excessif pendant la phase de test. Pour éviter toute interférence potentielle, les souris ont été transférées de leur logement à la zone d’essai 1 h avant l’expérience. Cette étape a été prise pour permettre aux souris de s’acclimater et de réduire le stress. Pour faciliter l’enregistrement précis du temps, l’enregistreur vidéo a été activé lorsque les souris ont été introduites dans la cage expérimentale B, puis les observateurs se sont immédiatement retirés dans la zone d’observation. Les observateurs ont été positionnés à une distance optimale de 2 m de la cage, assurant une observation claire sans causer de perturbation. Les critères d’identification de la découverte réussie de nourriture comprenaient des cas où les souris utilisaient leurs pattes avant ou penchaient la tête sur la nourriture. Les deux comportements ont été considérés comme indiquant la recherche de nourriture, ce qui correspond aux normes largement acceptées¹⁹. Dans les cas où plusieurs souris d’un même groupe de dose devaient être testées, on s’est assuré qu’elles n’étaient pas renvoyées dans leur cage d’élevage d’origine, mais qu’elles étaient temporairement placées dans une cage C ordinaire. Ce n’est qu’après avoir testé toutes les souris dans la même cage qu’elles sont retournées collectivement à leur logement d’origine. Compte tenu de l’odeur potentielle des aliments analysés, des précautions ont été prises de les conserver dans des sacs hermétiques au préalable et de les refermer ou de les placer dans des contenants hermétiques après utilisation. Ces mesures ont été mises en œuvre afin de maintenir l’intégrité des conditions expérimentales et d’assurer des résultats fiables.

Dans les expériences de discrimination sociale des odeurs, il est essentiel d’utiliser des échantillons d’urine dérivés de souris sexuellement matures¹⁹. La détermination de la maturité sexuelle est basée sur l’âge des souris, un paramètre qui varie selon les différentes souches de souris. Après le prélèvement, il est recommandé de conserver l’urine masculine et féminine séparément dans un réfrigérateur à -80 °C. Des études antérieures utilisaient des chronomètres à des fins de chronométrage. Cependant, cette méthode présentait des limites, telles que le fait que les observateurs étaient situés à une distance considérable de la cage expérimentale, ce qui entraînait des problèmes potentiels tels que des observations peu claires et un timing imprécis 19,22,29. Pour relever ces défis, nous avons amélioré les procédures de chronométrage en incorporant un équipement vidéo au lieu d’un chronomètre. Cette modification facilite non seulement l’acquisition de données plus précises, mais permet également la collecte de données auprès de plusieurs groupes expérimentaux.

Dans ces expériences, le dispositif vidéo a été utilisé pour enregistrer le comportement des souris, ce qui a l’avantage de réduire la fréquence d’images de la vidéo et de permettre aux observateurs d’enregistrer plus précisément le temps des diverses activités comportementales des souris, compensant ainsi la déficience que les observateurs ne pouvaient pas observer le comportement des souris dans la zone d’observation. Cependant, l’inconvénient de l’utilisation d’un équipement d’enregistrement vidéo est que le temps d’analyse augmentera. À la fin de l’expérience, nous devions revoir la vidéo pour enregistrer le temps des différentes activités comportementales de chaque souris. Lorsque le nombre de souris est important, il est nécessaire d’analyser la vidéo de chaque souris, ce qui augmentera la charge de travail du laboratoire.

Les résultats de la recherche indiquent que divers polluants environnementaux inhalables peuvent avoir un impact négatif sur la fonction olfactive. Cet article présente une approche rapide, simple et raisonnablement précise pour évaluer la toxicité olfactive associée aux polluants environnementaux inhalables. Cette méthode est cruciale dans la réalisation d’évaluations des risques de dysfonctionnement olfactif attribué aux polluants environnementaux chez les sujets humains.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,5 à 10 &mu ; L  ; micropipette ajustable	Eppendorf, Allemagne	3123000225	Instillation intranasale
saline à 0,9 %	Solarbio	7647-14-5	Dissoudre les polluants
Sulfate de zinc anhydre	Macklin	7733-02-0	Exposer les souris
Tube à centrifuger (2 mL)	Biosharp Incorporated	BS-20-M	Placer l’urine
Balance électronique	Changzhou Ohaus Co.	EX125DZH	Poids anesthésiques et polluants
GraphPad Prism	GraphPad Software	8.0.1	analyse statistique
Détecteur de poussière portable	TSI  ; DuatTrak incorporé	8532	Souris exposées par inhalation
Matériel d’enregistrement vidéo	Apple Inc.	iPhone 6s Plus	Le temps d’activité des souris a été enregistré
Mélangeur Vortex	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.	Vortex-5  ;	Solution de mélange