Ce protocole décrit la méthode de réduction de l’apport alimentaire en acide folique ou en choline chez les souris femelles avant la grossesse dans le but d’étudier l’impact de l’alimentation maternelle sur les résultats de santé de la progéniture.
Article de méthode
Modifier les niveaux d’acide folique ou de choline dans l’alimentation maternelle pour étudier l’impact des carences sur les résultats de santé de la progéniture
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’alimentation maternelle pendant la grossesse et l’allaitement joue un rôle important dans le développement neurologique de la progéniture. Le métabolisme à un carbone (1C), qui s’articule autour de l’acide folique et de la choline, ainsi que d’autres vitamines B, joue un rôle clé lors de la fermeture du tube neural du fœtus en développement. Cependant, l’impact de ces carences nutritionnelles maternelles pendant la grossesse sur les résultats de santé de la progéniture après la naissance reste relativement indéfini. De plus, les carences alimentaires maternelles en acide folique ou en choline peuvent avoir un impact sur d’autres résultats de santé chez la progéniture, ce qui en fait un modèle précieux. Ce protocole vise à décrire la procédure à suivre pour induire une déficience du métabolisme 1C chez les souris femelles par des modifications alimentaires. Les femelles sont soumises à un régime alimentaire au sevrage, jusqu’à l’âge de 2 mois, pendant 4 à 6 semaines avant l’accouplement et restent au régime tout au long de la gestation et de l’allaitement. La progéniture de ces femelles peut être évaluée pour les résultats de santé. Les femelles peuvent être utilisées plusieurs fois pour générer une progéniture, et les tissus des femelles peuvent être collectés pour mesurer les métabolites 1C. Ce protocole donne un aperçu de la façon d’induire des carences alimentaires maternelles en acide folique ou en choline afin d’étudier les résultats de santé de la progéniture.
Introduction
L’alimentation maternelle pendant la grossesse et l’allaitement joue un rôle essentiel dans le développement de la progéniture. Le métabolisme à un carbone (1C) est un réseau métabolique clé qui intègre les signaux nutritionnels à la biosynthèse, à l’homéostasie redox et à l’épigénétique. L’acide folique et la choline sont des composants centraux du 1C qui jouent un rôle important dans la fermeture du tube neural. Il est largement recommandé aux femmes de prendre des suppléments d’acide folique et de choline pendant leurs années de procréation1. Bien que le rôle critique de l’acide folique dans le développement du fœtus soit clairement établi, les mécanismes sous-jacents en jeu restent flous. Il est recommandé aux femmes en âge de migrer de prendre de l’acide folique avant de tomber enceintes, car la fermeture du tube neural se produit au cours du premier trimestre2. Les femmes enceintes qui présentent une carence en acide folique ou en d’autres composants du 1C, comme la choline, ont une incidence plus élevée de naissances avec des anomalies du tube neural en raison de la forte demande de synthèse de nucléotides et d’autres processus requis par le début de la période de gestation3.
L’impact à long terme des régimes maternels déficients en métabolisme 1C sur les résultats de santé de la progéniture est mal compris. Des recherches menées par nos laboratoires, ainsi que par d’autres, ont démontré que les régimes alimentaires maternels déficients en acide folique ou en choline ont effectivement un impact sur les résultats de santé de la progéniture après un AVC ischémiqueà l’aide de modèles précliniques 4,5,6. L’impact de l’alimentation maternelle a également été démontré dans des études cliniques où des volumes cérébraux plus petits et des niveaux de méthylation modifiés ont été décrits7. La théorie des origines développementales de la santé et de la maladie (DOHaD) suggère que les maladies chroniques prospectives sont programmées in utero 8,9, et que l’alimentation maternelle joue un rôle important.
Ce protocole est conçu pour décrire la méthode de modification de la consommation alimentaire de 1C chez les souris femelles avant la grossesse, dans le but d’examiner les effets de la nutrition maternelle sur les résultats de santé de la progéniture.
Protocole
Ce protocole a été approuvé et tous les sujets animaux ont été utilisés conformément aux directives du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Midwestern (Protocole 2983). Des souris femelles C57BL/6J, âgées de 2 mois (poids corporel, ~20 g), ont été utilisées dans cette étude. En général, les souris femelles en âge de procréer peuvent être utilisées10. Pour éviter les effets de portée, plusieurs femelles doivent être utilisées pour chaque régime11. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.
1. Préparation expérimentale
- Procurez-vous un régime carencé en acide folique ou en choline auprès des fabricants commerciaux d’aliments pour rongeurs. Voir le tableau 1 pour la liste détaillée des micronutriments et des macronutriments, y compris la quantité exacte d’acide folique ou de choline nécessaire dans les régimes carencés.
REMARQUE : Un régime témoin correspondant doit également être commandé ; les détails sont énumérés dans le tableau 1. Ces régimes étaient basés sur AIN93G et contenaient les nutriments recommandés pour les rongeurs10. - En collaboration avec le fabricant, déterminez la coloration des régimes, car cela peut aider à la distribution de régimes corrects lors d’études expérimentales. Cette étude a utilisé le vert pour les régimes déficients en acide folique, le jaune pour la choline et le blanc pour le régime témoin. Ils sont tous facilement distinguables.
REMARQUE : Il n’y a aucune restriction sur la consommation d’eau. L’eau ne contient pas d’acide folique, de choline ou d’autres métabolites 1C.
2. Induire une carence alimentaire en acide folique ou en choline
- Avant de mettre les femelles au régime, pesez tous les animaux. On parlera de poids de référence.
- En fonction de la configuration individuelle de la cage de laboratoire (ventilée ou non, voir tableau des matériaux), remplacez ou complétez les granulés de régime spécial pour chaque cage quelques fois par semaine. Ne remplissez pas trop les hoopers de nourriture en cage avec des régimes spéciaux, car cela pourrait entraîner la détérioration des granulés une fois qu’ils interagissent avec la salive des animaux et la détérioration avec le temps.
REMARQUE : Assurez-vous que le bouillon diététique est stocké conformément aux directives du fabricant et utilisé avant la date de péremption. - Maintenez les souris femelles au régime pendant 4 à 6 semaines avant l’accouplement.
- Introduisez les souris mâles dans les cages femelles pour l’accouplement. Assurez-vous que les mâles sont introduits dans les cages des femelles après que les femelles ont suivi un régime spécial pendant au moins 4 à 6 semaines. Introduire un mâle dans une cage femelle pendant un à plusieurs jours.
REMARQUE : Dans la présente étude, les mâles ont été gardés avec les femelles pendant toute la durée de l’expérience (~4 mois) afin d’augmenter le nombre de petits produits, car l’accouplement chez les souris peut avoir lieu après la naissance12. Les femelles de plus de 6 mois n’ont été utilisées pour aucune étude. - Vérifiez quotidiennement les souris femelles pour un bouchon copulatoire, ce qui indique qu’une reproduction a eu lieu.
- Recueillez les mesures de poids des souris femelles chaque semaine pour suivre leur santé et leur état de grossesse.
REMARQUE : Il est sans danger pour les femelles d’être maintenues sur le régime pendant la grossesse (~21 jours) et la lactation (~21 jours). - Lorsque la progéniture est sevrée de la mère (~21 jours après la naissance), soumettez-la à un régime carencé en acide folique et en choline, ainsi qu’à un régime témoin. Pour plus de détails, consultez la section des résultats.
REMARQUE : Lors de l’étude de l’impact de l’alimentation maternelle sur les résultats de santé de la progéniture, il est recommandé que la progéniture soit placée sur un régime témoin après avoir été sevrée. Le régime témoin doit contenir des quantités adéquates de vitamines et de nutriments pour la survie. - À la fin de l’étude (détermination des poids hebdomadaires pour surveiller l’état de santé général des femelles maintenues sous régime carencé en acide folique ou en choline), euthanasier les mères en utilisant une surdose de CO2 (dosage, déplacement de volume de 10 % à 30 % par minute, selon les protocoles approuvés par l’établissement) et prélever les tissus (étape 3) pour confirmer les carences alimentaires.
3. Prélèvement de tissus pour les mesures du 1C et des métabolites associés
REMARQUE : Lors de l’euthanasie d’animaux, il est important de s’assurer que les animaux ne réagissent pas à un pincement des orteils. Une fois que les animaux ne réagissent pas, la dissection des tissus peut commencer. Le tissu qui sera disséqué doit être déterminé à l’avance13,14, et les matériaux doivent être préparés. Ces matériaux comprennent des tubes pour le stockage, des outils de dissection appropriés et de la glace carbonique ou de l’azote liquide.
- Prélever du sang et des tissus hépatiques selon les protocoles précédemment publiés15,16.
- Prélever ~500-1000 μL de sang à l’aide d’une ponction cardiaque en suivant les étapes ci-dessous. Pour plus de détails, voir Parasuraman et al.17 :
- Faites une incision en forme de V à travers la peau et la paroi abdominale. Écartez les organes abdominaux et insérez une aiguille à travers le diaphragme et dans le cœur pour prélever l’échantillon de sang.
- Placez les échantillons de sang dans des tubes recouverts d’EDTA. Le tube peut être laissé à température ambiante jusqu’à ce que tous les échantillons aient été prélevés.
- Faites tourner les échantillons de sang dans une centrifugeuse à 1000-2000 x g pendant 7 min à 4 °C pour isoler le plasma sanguin. Prélever le plasma dans un tube à microfuge de 1,5 mL, puis le stocker à -80 °C jusqu’à l’analyse.
- Pour enlever le foie, ouvrez l’abdomen et disséquez tout le foie en suivant le protocole15 précédemment publié.
- Après avoir retiré le foie de la cavité corporelle, coupez le tissu en petits morceaux avec un petit ciseau et congelez-les à l’aide de glace sèche ou d’azote liquide.
REMARQUE : Les morceaux de tissu congelés peuvent être placés dans un tube de microcentrifugation cryogénique de 1,5 mL et maintenus à -80 °C jusqu’à l’analyse.
- Après avoir retiré le foie de la cavité corporelle, coupez le tissu en petits morceaux avec un petit ciseau et congelez-les à l’aide de glace sèche ou d’azote liquide.
- Prélever ~500-1000 μL de sang à l’aide d’une ponction cardiaque en suivant les étapes ci-dessous. Pour plus de détails, voir Parasuraman et al.17 :
Résultats
L’objectif de cette étude était d’étudier l’impact des carences alimentaires maternelles en acide folique ou en choline sur les résultats de santé de la progéniture. Les poids hebdomadaires ont été déterminés pour surveiller la santé globale des femelles maintenues avec un régime alimentaire déficient en acide folique ou en choline. Dans nos travaux précédents, aucun changement de poids corporel n’a été observé entre les groupes alimentaires maternels4. La figure 1 illustre les poids de référence et hebdomadaires des femelles qui ont suivi un régime témoin, un régime carencé en choline ou en acide folique au cours des quatre semaines précédant l’accouplement (F (1,144,4,577) = 11,96, p = 0,196). Une observation générale est que le nombre de descendants soumis à ces régimes spéciaux est inférieur à celui de la nourriture standard pour souris. Cela n’a pas été jugé statistiquement significatif.
Lorsque les souris femelles sont nourries avec des régimes pauvres en 1C, soit en acide folique, soit en choline, il y a des changements dans les métabolites dans les tissus corporels qui traitent le 1C. Les mesures du 1C et des métabolites associés peuvent être prises à l’aide de diverses techniques. Dans la présente étude, la chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse en tandem avec chromatographie liquide à ultra-performance (UPLC) a été utilisée, comme décrit précédemment12. Les mesures hépatiques (tableau 2) et plasmatiques (tableau 3) de 1C pour l’homocystéine totale, la S-adénosylméthionine (SAM), la S-adénosylhomocystéine (SAH), la méthionine, la cystathionine, la bétaïne et la choline sont présentées. Il existe différentes façons de mesurer ces métabolites ; LC-MS n’est qu’un moyen.
Les données présentées dans les tableaux 2 et 3 montrent quelques changements mineurs dans les concentrations de métabolites. Les mesures actuelles ont été prises lorsque les femelles s’accouplent avec des régimes pendant 6 mois. Il peut être préférable de mesurer les métabolites après 4 semaines ou après une à deux grossesses. Les données du foie et du plasma ont été analysées à l’aide d’ANOVA à facteur unique et de logiciels statistiques et graphiques. Tout effet significatif du régime ANOVA avec les comparaisons par paires de Tukey, ainsi que les comparaisons par paires entre le régime témoin et les régimes déficients en acide folique ou en choline.
Figure 1 : Poids corporel de souris femelles maintenues avec un régime suffisant et déficient en carbone. Poids corporel des souris femelles avant le début des régimes spécialement formulés (baseline), puis poids hebdomadaires pendant 4 semaines sur le contrôle (CD), ainsi que des régimes déficients en acide folique (FADD) et en choline (ChDD). Les données sont présentées sous la forme d’une moyenne + d’une erreur-type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Métabolisme à un seul carbone et rôles biologiques associés (méthylation et synthèse des nucléotides). Les enzymes sont indiquées par des cercles noirs. Abréviations : BHMT, bétaïne homocystéine méthyltransférase ; CHDH, choline déshydrogénase ; COMT, catéchol-O-méthyltransférase ; DHFR, dihydrofolate réductase ; dTMP, désoxythymidine monophosphate ; dTTP, désoxythymidine triphosphate ; dUMP, désoxyuridine monophosphate ; dUTP, désoxyuridine triphosphate ; FR, récepteur du folate ; MTHFR, méthylènetétrahydrofolate réductase ; MTR, méthionine synthase ; MTRR, méthionine synthase réductase ; RFC, porteur réduit de folate ; SAM, S-adénosylméthionine ; SAH S-adénosylhomocystéine ; et TS, thymidylate synthase. Cette figure est modifiée de Jadavjiet al.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Liste des teneurs en micro- et macronutriments dans les régimes de contrôle du métabolisme à un carbone, d’acide folique et de carences en choline. L’alimentation déficiente en acide folique contient 0,3 mg/kg d’acide folique. Le régime alimentaire déficient en choline contient 300 mg/kg de bitrate de choline. Les valeurs sont indiquées dans le tableau en rouge et entre parenthèses. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Concentrations maternelles de métabolites à un carbone dans les tissus hépatiques isolés. Ces données sont adaptées de Hurley et al.4. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 3 : Concentrations maternelles de métabolites à un carbone dans le plasma isolé. Ces données sont adaptées de Hurley et al.4. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Discussion
Lors de la mise en œuvre de ce protocole dans les laboratoires de recherche, il y a plusieurs notes importantes que les chercheurs doivent prendre en compte avant de commencer les expériences. Tout d’abord, dans la fabrication d’un régime alimentaire, il faut disposer d’un délai suffisant pour fabriquer le régime avant le début de l’étude expérimentale. Les délais de livraison peuvent varier d’une entreprise à l’autre, et l’expédition du régime doit également être prise en compte. Les souris femelles en âge de procréer (~2-2,5 mois) peuvent être placées sur le régime 4-6 semaines avant l’accouplement 4,6,14. Des études antérieures n’ont utilisé que des souris C57Bl/6J 4,5,6,18, mais d’autres groupes ont utilisé des souris BALB/c dans des études similaires 19,20,21.
L’alimentation manufacturée utilisée dans cette étude contient 1 % de succinylsulfathiazole pour aider à réduire la synthèse de folate par la flore intestinale ; C’est une autre raison pour laquelle un régime témoin doit être utilisé, car il contient les mêmes antibiotiques que ceux présents dans les régimes déficients. Une fois que l’aliment a été fabriqué et expédié, son stockage est vital. Il est important de suivre les instructions du fabricant afin que le régime puisse durer pendant toute la durée de l’étude expérimentale. Il est important de noter que la nourriture de souris standard est formulée avec des niveaux élevés d’acide folique et de choline pour soutenir la grossesse et la santé globale des colonies de souris. Par conséquent, l’utilisation d’un régime témoin dans les études visant principalement à explorer les effets d’une carence en acide folique et/ou en choline doit être utilisée. Pour de telles études expérimentales, il est recommandé d’obtenir des régimes témoins des fabricants contenant la quantité minimale recommandée d’acide folique (2,0 mg/kg) ou de bitrate de choline (1150 mg/kg)10 (tableau 1).
De plus, la combinaison de l’acide folique alimentaire et de la carence en choline chez les femelles n’a pas encore été essayée. L’acide folique et la choline sont tous deux d’importants donneurs de méthyle, et il y a une forte demande pour eux pendant la grossesse pour la progéniture en développement. Des travaux antérieurs ont démontré que le métabolisme de l’acide folique et de la choline est étroitement lié à une fonction cérébrale normale16,17. Cela a également été démontré par d’autres dans d’autres tissus18,19. On ne sait pas si un régime alimentaire déficient en acide folique et en choline produirait une progéniture viable.
Lors de l’examen de la conception expérimentale, il est important de noter que les carences alimentaires en 1C chez les mâles ont un impact négatif sur les résultats de santé de la progéniture11. Il s’agit d’un point important à prendre en compte lorsque vous placez des mâles dans des cages avec des femelles nourries avec un régime pauvre en acide folique ou en choline. À ce stade, l’impact d’une carence alimentaire à court terme chez les hommes reste inconnu.
La reproduction réussie de souris peut présenter des défis dans le progrès expérimental. Il est recommandé de consulter le personnel de soins aux animaux de l’établissement ou la littérature, y compris les fournisseurs qui élèvent des souris avec succès. La pesée hebdomadaire des femelles a permis de suivre la progression de la grossesse.
L’impact à long terme des carences maternelles en 1C pendant la grossesse sur les résultats de santé de la progéniture nécessite des recherches plusapprofondies 4,14. Ce protocole a décrit comment induire des carences alimentaires maternelles en acide folique ou en choline dans un modèle murin, ainsi que comment le confirmer. Pour déterminer d’autres marqueurs potentiels de carences alimentaires en acide folique ou en choline, assurez-vous de consulter la figure 2 18. Ce modèle expérimental facilite l’étude des carences alimentaires maternelles en acide folique ou en choline pendant la grossesse et l’allaitement sur les résultats de santé à long terme de la progéniture.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tubes de 1,5 mL | Eppendorf | ||
| C57BL/6 Souris femelles | Charles River | 27 | Les souris peuvent également être élevées en maison. |
| Régime déficient en choline | Envigo | TD.06119 | |
| Régime de contrôle | Envigo | TD.190790 | |
| Tubes | |||
| Régime déficient en acide folique | Envigo | TD.01546 | |
| Prisme | https://www.graphpad.com/features | ||
| Logement pour rongeurs | Lab Products, LLC | One CageRacks ventilés & Cages | |
| Chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) | Sciex, Framingham, MA | 5500 QTrap | |
| Chromatographie liquide ultra-performance (UPLC) | Shimadzu, Columbia, MD, États-Unis | Nexera |
Références
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Réimpressions et autorisations
