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Mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA et sa validation

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DOI :

10.3791/66831

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3 mai 2024

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1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce protocole est basé sur la mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA. Nous utilisons la cytométrie en flux pour analyser l’annexine V et la double coloration 7-AAD pour détecter la mort cellulaire, en utilisant la cellule entière et en utilisant la microscopie électronique à balayage pour observer la morphologie de la membrane cellulaire.

Résumé

La mort cellulaire est un processus fondamental dans tous les organismes vivants. Le protocole établit un modèle de dépôt lipidique différencié du phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA) induit par le lipopolysaccharide (LPS) et l’adénosine triphosphate (ATP) pour observer la mort cellulaire. Le LPS combiné à l’ATP est une méthode d’induction inflammatoire classique, souvent utilisée pour étudier la pyroptose, mais l’apoptose et la nécroptose répondent également à la stimulation par LPS/ATP. Dans des circonstances normales, la phosphatidylsérine n’est localisée que dans le feuillet interne de la membrane plasmique. Cependant, dans les premiers stades de la pyroptose, de l’apoptose et de la nécroptose, la membrane cellulaire reste intacte et exposée à la phosphatidylsérine, et dans les stades ultérieurs, la membrane cellulaire perd son intégrité. Ici, la cytométrie en flux a été utilisée pour analyser la double coloration de l’annexine V et de la 7-aminoactinomycine D (AAD) afin de détecter la mort cellulaire des cellules entières. Les résultats montrent que des cellules substantielles sont mortes après une stimulation avec LPS/ATP. À l’aide de la microscopie électronique à balayage, nous observons les formes possibles de mort cellulaire dans les cellules individuelles. Les résultats indiquent que les cellules peuvent subir une pyroptose, une apoptose ou une nécroptose après stimulation avec LPS/ATP. Ce protocole se concentre sur l’observation de la mort des macrophages après stimulation avec LPS/ATP. Les résultats ont montré que la mort cellulaire après stimulation LPS et ATP n’est pas limitée à la pyroptose et que l’apoptose et l’apoptose nécrotique peuvent également se produire, aidant les chercheurs à mieux comprendre la mort cellulaire après stimulation LPS et ATP et à choisir une meilleure méthode expérimentale.

Introduction

La mort cellulaire est un processus physiologique fondamental chez tous les organismes vivants. Ces dernières années, des études substantielles ont montré que la mort cellulaire est impliquée dans l’immunité et l’équilibre de l’organisme. L’étude de la mort cellulaire nous aide à mieux comprendre l’apparition et le développement des maladies. Plusieurs formes de mort cellulaire programmée ont été décrites, et certaines cibles clés de ces processus ont été identifiées. La pyroptose, l’apoptose et la nécroptose sont les trois voies de mort cellulaire programmées définies génétiquement impliquées dans l’équilibre interne et la maladie1.

La pyroptose se caractérise par la formation de pores membranaires et la libération du contenu cellulaire. Les caspases activées ou granzymes clivent les gasdermines pour séparer leurs domaines N-terminaux, qui s’oligomérisent ensuite, se lient à la membrane et forment des pores 2,3,4. Le pore de gasdermine fournit un canal de sécrétion atypique à travers les membranes cellulaires, ce qui entraîne des réponses cellulaires en aval, y compris la libération de contenu et l’afflux d’ions 2,3,4. En fin de compte, les cellules subissent finalement une rupture de la membrane plasmique et une lyse pyroptotique facilitée par la ninjurine-15. Dans l’apoptose, Bax et Bak activés forment des oligomères sur la membrane externe mitochondriale et libèrent le cytochrome C, qui est régulé par un équilibre entre les protéines pro-apoptotiques et anti-apoptotiques de la famille BCL-2, les caspases initiatrices (caspases-8, -9 et -10) et les caspases effectrices (caspases-3, -6 et -7)1,6,7. Les changements morphologiques de l’apoptose comprennent la coloration membranaire, le rétrécissement cellulaire, la fragmentation nucléaire, la condensation de la chromatine et la formation de corps apoptotiques 6,8. La sérine/thréonine-protéine kinase 1 (RIPK3) et la kinase de lignée mixte de type domaine (MLKL) sont deux composants centraux en aval du mécanisme nécroptotique1. RIPK3 recrute et phosphoryle MLKL, p-MLKL oligomérise, s’associe à la membrane cellulaire, initie les perforations membranaires, provoque un afflux d’ions, augmente l’osmolarité intracellulaire et finalement la rupture cellulaire 6,9. Les gasdermines et MLKL se lient à la membrane plasmique et médient respectivement la pyroptose et la nécroptose, tandis que BAX/BAK médie l’apoptose en se liant à la membrane externe des mitochondries6.

Bien que chaque voie ait des mécanismes et des résultats spécifiques, elles entraînent des changements similaires sur la membrane cellulaire. Dans des circonstances normales, la phosphatidylsérine (PS) n’est localisée que dans le feuillet interne de la membrane plasmique. Cependant, dans les premiers stades de la pyroptose, de l’apoptose et de la nécroptose, la PS sera exposée, à l’extérieur de la membrane plasmique. La caspase-3/caspase-7 active les familles TMEM16 et XKR, ce qui conduit à une membrane cellulaire asymétrique et extériorise la PS lors de l’apoptose10. L’influx de Ca2+ médié par la gasdermine D et MLKL entraîne une perte de symétrie de la bicouche phospholipidique sur la membrane cellulaire et l’exposition de PS. L’exposition se produit avant la perte d’intégrité de la membrane cellulaire11,12. Sur la base des changements similaires dans la membrane de ces trois types de mort cellulaire programmée, nous utilisons la cytométrie en flux pour analyser la double coloration de l’annexine V/7-aminoactinomycine D (7-AAD) afin de détecter la mort cellulaire. L’annexine V, une protéine de liaison aux phospholipides dépendante du calcium, a une grande affinité pour le PS, qui peut servir de sonde sensible pour détecter le PS exposé à la surface de la membrane plasmique13. Le 7-AAD est une coloration d’acide nucléique qui ne peut pas traverser toute la membrane cellulaire. Il est similaire à l’iodure de propidium (PI), un colorant d’acide nucléique couramment utilisé. Ils ont des caractéristiques de fluorescence similaires, mais le 7-AAD a un spectre d’émission plus étroit et moins d’interférences avec d’autres canaux de détection. En raison de ces similitudes, il ne suffit pas de faire la distinction entre la pyroptose, l’apoptose et la nécroptose. Nous avons utilisé la cytométrie en flux pour détecter la mort cellulaire à partir de cellules entières. Une deuxième méthode est utilisée pour capturer la membrane cellulaire à l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB) afin d’observer les formes possibles de mort cellulaire dans les cellules individuelles.

Nous avons établi un modèle de dépôt lipidique différencié du dépôt lipidique différencié dans le monocyte humain (THP-1) induit par le lipopolysaccharide (LPS) et l’adénosine triphosphate (ATP) pour observer la mort cellulaire. Ce protocole se concentre sur l’observation de la mort cellulaire plutôt que sur l’étude des mécanismes.

Protocole

1. Lignée cellulaire et culture cellulaire

  1. Cultiver la lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 dans un milieu de culture complet RPMI-1640 avec 10 % de sérum fœtal bovin, 1 % de pénicilline-streptomycine et 0,05 mM β-mercaptoéthanol. Cultivez les cellules à 37 °C dans de l’air humidifié à 5% de CO2 . Sous-culture des cellules tous les 2-3 jours.
    REMARQUE : THP-1 est une cellule de suspension, sélectionnez pour changer la moitié du milieu pour la sous-culture. Lors de l’observation de nombreux fragments cellulaires au microscope optique, centrifuger à 300 x g pendant 3 min à température ambiante. Remettez les cellules en suspension dans le milieu de culture cellulaire complet frais préchauffé.
  2. Utilisez des cellules (dans les passages 4 à 10) à la phase de croissance logarithmique pour toutes les expériences. Lorsque les cellules sont en bon état et en phase de croissance logarithmique, elles sont rondes, brillantes, denses et sans amas ni fragments cellulaires sous le microscope optique à 100 x.

2. Différenciation des cellules THP-1

  1. Préparez une solution mère de PMA avec une concentration de 1 mM (dissoudre 1 mg de PMA dans 1,62 mL de diméthylsulfoxyde). Diluer la solution mère de PMA avec un milieu de culture cellulaire complet jusqu’à une concentration de travail finale de 100 nM.
  2. Recueillir les cellules dans la boîte de culture dans un tube à centrifuger stérile de 10 ml. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à température ambiante, remettre en suspension les cellules avec 3 mL de milieu de culture complet contenant du PMA.
  3. Ouvrez le compteur de cellules et le logiciel de comptage. Pipetez 20 μL de suspension cellulaire sur le panneau de compteur de cellules et insérez-le dans le panneau de compteur de cellules. Cliquez sur Aperçu B1, tournez le bouton en bas à droite de l’instrument et ajustez la distance focale pour que les cellules aient un centre lumineux avec des contours clairs sur le logiciel. Cliquez sur Compter pour commencer à compter.
  4. D’après les résultats du comptage, utiliser un milieu de culture complet contenant du PMA pour ajuster la densité cellulaire à 1 x 106 cellules/mL. Dans une plaque à 6 puits, incubez la plaque pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO2 avant de commencer le traitement.

3. Traitement des cellules THP-1

  1. Préparez une solution mère de LPS avec une concentration de 1 mg/mL (dissoudre 1 mg de LPS dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)). Diluer la solution mère de LPS avec un milieu sans sérum jusqu’à une concentration de travail finale de 1 μg/mL. Préparez une solution mère de Na2ATP à une concentration de 500 mM (dissoudre 0,3026 g d’ATP dans 1 mL de PBS).
  2. Aspirez le milieu contenant du PMA des puits et lavez-le avec du PBS 1x. Ajouter le milieu sans sérum au groupe témoin et le milieu sans sérum contenant du LPS au groupe modèle. Incuber la plaque pendant 6 h à 37 °C + 5% de CO2 avant de poursuivre le traitement.
  3. Après 6 h, ajouter la solution mère d’ATP au groupe modèle jusqu’à une concentration de travail finale de 500 nM. Incuber la plaque pendant 45 min à 37 °C + 5% de CO2 avant de continuer.

4. Analyse par cytométrie en flux (Méthode 1)

  1. Préparation d’échantillons expérimentaux
    1. Ensemencez et incubez les cellules dans des plaques à 6 puits selon l’étape 2. Établissez quatre groupes de témoins sans traitement : un témoin sans colorant, deux témoins monocolores (un pour chaque colorant) et un témoin témoin double colorant. Établissez un groupe de traitement et traitez selon l’étape 3.
    2. Après le traitement, aspirez tout le surnageant des puits et lavez-le avec du PBS 2x. Ajouter 500 μL de trypsine à 0,05 % (non EDTA) dans chaque puits et incuber dans l’incubateur pendant 30 s.
    3. Ajouter 1 mL de milieu de culture complet RPMI-1640 dans chaque puits pour empêcher le détachement des cellules et recueillir les cellules dans le tube de 5 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à température ambiante.
    4. Ajouter 1 mL de PBS pour remettre les cellules en suspension. Placez les tubes avec les cellules dans un bain-marie à 37 °C pendant 3 min. Centrifuger tous les échantillons à 300 x g pendant 3 min à température ambiante.
    5. Diluer 200 μL de 5x tampon de liaison avec 800 μL d’eau distillée dans 1x tampon de liaison. Ajoutez 100 μL de 1x tampon de liaison pour remettre les cellules en suspension et transférez les cellules dans le tube de 5 mL.
    6. Ajouter 5 μL de solution d’Annexin V-PE dans un tube de cellules du groupe témoin pendant 10 min et 5 μL de solution 7-AAD dans un autre tube de cellules du groupe témoin pendant 5 min (en tant que témoins de coloration unique séparément). Agitez doucement chaque tube pour mélanger le colorant et incuber les échantillons à température ambiante à l’abri de la lumière. Ajouter 400 μL de PBS dans chaque tube et agiter doucement pour terminer l’incubation.
    7. Ajouter 5 μL de solution d’Annexin V-PE dans les tubes restants et incuber pendant 5 min à température ambiante. Agitez doucement chaque tube pour mélanger le colorant et incuber les échantillons à température ambiante à l’abri de la lumière. Après 5 min, ajouter 5 μL de solution de 7-AAD pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 400 μL de PBS dans chaque tube et agiter doucement pour terminer l’incubation.
    8. Filtrez la suspension cellulaire à l’aide d’un treillis en nylon de 35 μm qui fait partie des tubes à fond rond en polystyrène de 5 ml. Placez le tube sur de la glace et attendez le test. Mélangez doucement avant de tester, puis insérez-le dans l’instrument.
  2. Cytométrie en flux
    1. Utilisez un cytomètre de flux de tri cellulaire activé par fluorescence pour les tests. Ouvrez le logiciel d’analyse des données du cytomètre en flux et confirmez les performances du détecteur et du laser. Cliquez sur le cytomètre et choisissez Fluidics start, attendez que le système soit prêt. Excluez les bulles de la chambre d’écoulement en cliquant sur Cytomètre > Modes de nettoyage > Cellule d’écoulement de dégaz.
    2. Cliquez sur Expérience, sélectionnez successivement Nouveau dossier, Expérience, Échantillon, Tube et Modifier le nom. Une flèche de forme pentagonale à l’avant du tube devient verte lorsqu’elle est allumée.
    3. Cliquez sur l’icône du cytomètre FACSCelesta (icône de touche de raccourci), sélectionnez Paramètre, puis sélectionnez Signal FSC, SSC et PE . Cliquez sur l’icône de la feuille de calcul globale (icône de touche de raccourci) pour établir l’histogramme PE. Pour le cytomètre en flux utilisé dans cette étude, utiliser l’EP pour l’annexine V à 586 nm et tracer sur l’axe des abscisses ; PerCP-Cy5.5 pour 7-AAD à 700 nm et tracé sur l’axe Y.
    4. Insérez d’abord l’échantillon de contrôle non coloré dans l’instrument. Cliquez sur l’icône du tableau de bord d’acquisition (une icône de raccourci), acquérez un minimum de 10 000 événements de la population souhaitée. Exclure les débris à l’aide d’une porte (P1) sur un diagramme à points FSC-A et SSC-A. Ajustez le débit à la vitesse moyenne et enregistrez les données. Ajustez la tension pour placer la population de cellules sur la diagonale de l’histogramme FSC/SSC et cliquez sur Redémarrer. Ajustez le débit à la vitesse moyenne et enregistrez les données.
    5. Cliquez sur Tube suivant, exécutez les commandes de coloration unique d’Annexin V et de 7-AAD pour ajuster la compensation. Faites fonctionner les tubes restants et collectez des données.

5. Imagerie MEB (Méthode 2)

  1. Préparation d’échantillons expérimentaux
    1. Ensemencez et incubez les cellules dans des plaques à 6 puits selon l’étape 2 et traitez selon l’étape 3.
    2. Après le traitement, aspirez tout le surnageant des puits et lavez-vous 2 fois avec du PBS. Ajouter 500 μL de trypsine à 0,05 % (non EDTA) dans chaque puits et incuber dans l’incubateur pendant 30 s.
    3. Ajouter 1 mL de milieu de culture complet RPMI-1640 dans chaque puits pour empêcher le détachement des cellules et recueillir les cellules dans le tube de 5 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à température ambiante.
    4. Fixer les cellules avec 500 μL de fixateur de microscope électronique (2,5 % de dialdéhyde d’acide glutarique, 100 mM de sels de phosphore) pendant 2 h à température ambiante, puis une nuit à 4 °C.
    5. Préparez une solution d’alun de chrome : Ajoutez 1,0 g de gélatine à 100 ml d’eau ultrapure, à 70 °C de chauffage au bain-marie et remuez uniformément. Ajouter 0,05 g d’alun de chrome, mélanger uniformément et filtrer avec du papier filtre. Trempez le verre de couverture propre dans une solution d’alun de chrome pendant 2 h à 37 °C et séchez-le dans un four à 37 °C pour une utilisation ultérieure.
      REMARQUE : Le but est d’empêcher le détachement des cellules pendant l’expérience.
    6. Prélever les cellules à partir d’une solution fixe. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à température ambiante. Ajoutez 100 μL de PBS et soufflez doucement les cellules. Déposez la suspension de la cellule sur la vitre de protection, laissez reposer pendant 5 min. Aspirez tout le surnageant et lavez 3 fois avec du PBS pendant 5 minutes à chaque fois.
      REMARQUE : L’opération doit être effectuée en douceur pour éviter le détachement des cellules. Ne secouez pas vigoureusement, déplacez-vous lentement et ajoutez lentement du liquide le long de la paroi.
    7. Ajouter 500 μL de fixation d’acide osmique à 1 % pendant 1 heure. Aspirez tout le surnageant et lavez 3 fois avec du PBS pendant 5 minutes à chaque fois.
    8. Déshydrater successivement les échantillons dans une série de concentrations d’éthanol (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) pendant 15 min par solution d’EtOH.
      REMARQUE : Les verres de protection peuvent être conservés à 100% EtOH pendant plusieurs jours à 4 °C mais ils doivent sécher dès que possible pour éviter une déshydratation excessive.
    9. Allumez le sécheur à point critique, ouvrez le réservoir de CO2 , refroidissez la chambre à 10 °C. Enveloppez rapidement l’échantillon avec du papier filtre lorsque la pression de la chambre est de 0 psi et placez-le dans la chambre.
    10. Ouvrez la vanne d’entrée, observez à travers la fenêtre d’observation du CO2 , augmentez le niveau de CO2 liquide entre les deux lignes rouges (ne dépassez pas la limite supérieure), fermez la vanne d’entrée. Faites tremper l’échantillon pendant 10 min. Ouvrez simultanément les soupapes d’entrée et d’échappement pour égaliser le CO2 pendant 1 min (le CO2 liquide déplace l’EtOH). Fermez la soupape d’échappement pour élever le niveau de CO2 liquide à la position spécifiée, fermez la soupape d’admission.
    11. Réglez la température à 35 °C et la pression à 1250 psi. Une fois que la température et la pression se stabilisent, dépressuriser à 100 psi/min. Retirez l’échantillon lorsque la pression de la chambre est nulle et éteignez l’instrument.
    12. Montez les échantillons sur des supports d’échantillons en aluminium MEB à l’aide d’un ruban conducteur. Utilisez une coucheuse par pulvérisation cathodique pour recouvrir les échantillons d’une couche (2-5 nm) d’or.
  2. Imagerie
    1. Utilisez le MEB à émission de champ froid à haute résolution pour l’imagerie. Réglez la tension d’accélération du MEB à 3 kV. Réglez la distance de travail à 10 mm. Réglez le grossissement sur 1 000x pour observer le panorama. Réglez le grossissement sur 5 000x et 20 000x pour localiser la membrane plasmique et imager l’échantillon.
      REMARQUE : Le processus de visualisation des macrophages THP-1 différenciés par PMA via le MEB est similaire à celui d’autres types de cellules et de tissus et dépend des instruments utilisés. La référence14 fournit un protocole SEM détaillé avec des vidéos d’accompagnement.

Résultats

Les échantillons de cellules ont été traités comme décrit dans le protocole et la détection par cytométrie en flux a été effectuée. Les cellules normales ne peuvent pas être colorées avec de l’Annexine V et du 7-AAD (Annexine V-/7-AAD-). Dans les premiers stades de la pyroptose, de l’apoptose et de la nécroptose, la PS a été exposée et liée à l’annexine V, mais la membrane cellulaire était encore intacte et excluait le 7-AAD de l’espace extracellulaire (Annexine V+/7-AAD-). Dans les stades ultérieurs, la membrane cellulaire perd son intégrité, les cellules sont simultanément colorées par l’annexine V et le 7-AAD, montrant des résultats doublement positifs (Annexine V+/7-AAD+). Les cellules nécrotiques n’ont été colorées qu’avec du 7-AAD (Annexine V-/7-AAD+). La figure 1 montre qu’après la stimulation LPS/ATP, les cellules de la région Q2 ont augmenté de manière significative, indiquant la mort cellulaire.

Nous utilisons le MEB pour capturer la surface de la membrane plasmique, en observant directement les caractéristiques de la membrane à partir d’une seule cellule. La figure 2A montre les cellules de contrôle, la figure 2B-D montre les cellules après stimulation LPS/ATP. Nous avons observé des cellules présentant des caractéristiques de pyroptose, y compris une bulle membranaire et une membrane de rupture (Figure 2B), des cellules présentant des caractéristiques apoptotiques, y compris une bulle membranaire et un rétrécissement cellulaire (Figure 2C), et des cellules présentant des caractéristiques de nécroptose, y compris un gonflement cellulaire et une membrane de rupture (Figure 2D).

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Figure 1 : Détection de la double coloration de l’annexine V/7-AAD à l’aide de la cytométrie en flux. (A) Coloration négative de l’annexine V et 7-AAD négative (Q4), double coloration de l’annexine V positive et 7-AAD négative (Q3), coloration de l’annexine V positive et 7-AAD positive (Q2), et coloration de l’annexine V négative et 7-AAD positive (Q1). (B) Données quantitatives pour (A). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (n = 3), test t non apparié, **p < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Images de microscopie électronique à balayage de macrophages THP-1 différenciés par PMA. (A) Groupe témoin, grossissement 5 000x/20 000x. (B, C, D) Le groupe LPS/ATP montre une bulle de membrane, une rupture de la membrane (↑), un gonflement cellulaire (↑) et un rétrécissement cellulaire (↑) à un grossissement de 5 000x/20 000x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Dans ce manuscrit, deux méthodes ont été utilisées pour détecter la mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA. La double coloration à l’annexine V/7-AAD a été utilisée, et les résultats ont été analysés par cytométrie en flux à partir de la coloration globale. Comme pour les autres analyses cytométriques en flux, un groupe de cellules non colorées et deux groupes de cellules monocolorées ont été mis en place pour exclure les résultats faussement positifs et faussement négatifs. Les résultats montrent qu’après une stimulation LPS/ATP, plusieurs cellules ont perdu l’intégrité de la membrane, ce qui indique que la mort cellulaire peut s’être produite. Cette méthode de détection nous permet d’évaluer la mort cellulaire à partir de cellules entières. Il convient de noter que la double coloration à l’annexine V/7-AAD n’est pas suffisante pour distinguer la pyroptose, l’apoptose et la nécroptose. Dans les premiers stades de ces trois formes, le PS sera exposé à l’extérieur de la membrane plasmique, et la coloration à l’annexine V est positive. L’intégrité de la membrane est perdue au cours de la phase tardive de ces trois formes, et les résultats de la coloration montrent une coloration doublement positive. Par conséquent, nous avons utilisé le MEB pour observer davantage les formes possibles de mort cellulaire qui pourraient se produire.

Dans l’apoptose, la formation de pores BAX/BAK sur la membrane externe mitochondriale, un rétrécissement cellulaire ultérieur et une coloration de la membrane cellulaire se produisent. La nécroptose utilise MLKL pour ouvrir les pores de la membrane cellulaire, tandis que le signal de la pyroptose active la gasderpine pour former des pores dans la membrane cellulaire. Il convient de noter que la pyroptose et la nécroptose s’accompagnent toutes deux d’une rupture de la membrane cellulaire au stade final. Cependant, les pores de la gasedermine sont beaucoup plus grands que les pores de MLKL, de sorte que les pores de la gasdermine n’ont pas de sélectivité ionique. Les cellules nécroptotiques présentent un gonflement significatif de la morphologie15. Ils se terminent finalement par une rupture de la membrane. Quelle que soit la voie de signalisation en amont de l’activation de la perméabilité de la membrane cellulaire, les modifications de la membrane cellulaire accompagnent ces trois formes de mort cellulaire. Nous avons utilisé le MEB pour observer davantage la membrane cellulaire, ce qui fournit un moyen intuitif d’examiner la mort cellulaire. Nous avons observé les caractéristiques de la pyroptose, y compris la bulle de la membrane et la membrane de rupture, et la nécroptose, y compris le gonflement des cellules et la membrane de rupture, compatibles avec les caractéristiques étudiées par les chercheurs précédents15. Nous avons observé des bulles membranaires et un rétrécissement cellulaire, cohérents avec les caractéristiques de l’apoptose étudiées par les chercheurs précédents16.

Dans des études antérieures, la combinaison de LPS et d’ATP était souvent utilisée pour induire la pyroptose. Il est intéressant de noter que nous avons observé des caractéristiques de l’apoptose et de la nécroptose. Bien que les trois formes puissent se produire dans la mort cellulaire induite par le LPS/ATP, des études antérieures ont montré que la pyroptose reste le mode de mort dominant. Le LPS est l’un des modèles moléculaires associés aux agents pathogènes les plus caractérisés. L’ATP libéré par les cellules mourantes a une concentration élevée dans la cellule. L’ATP extracellulaire est l’un des modèles moléculaires associés au danger17. Le LPS/ATP est une méthode de stimulation classique en deux étapes pour induire la pyroptose. La recherche a montré que l’ajout d’ATP aux cellules stimulées par le LPS peut activer rapidement la caspase-118, tandis que le silençage du gène de la caspase-1 peut inverser de manière significative la mort cellulaire induite par le LPS/ATP19. Dans des études antérieures, nous avons également constaté l’activation induite par le LPS/ATP des protéines cibles apoptotiques et nécroptotiques20,21. Bien que le LPS/ATP soit un inducteur classique de la pyroptose, il peut également induire l’apoptose et la nécroptose.

En fait, ces trois formes n’existent souvent pas indépendamment, et la diaphonie entre les étages du signal. Par exemple, les protéines de gasdermine ciblent les mitochondries pour favoriser la libération du cytochrome c afin d’améliorer la voie apoptotique mitochondriale22. L’activation de la caspase-3 peut cliver la gasdermine E, puis déclencher la pyroptose23. Une étude suggère que la signalisation MLKL/PIPK3 est impliquée dans l’activation des inflammasomesNLRP3 24. Cette diaphonie complexe a conduit au concept de PANoptose, définie comme une voie de mort cellulaire programmée inflammatoire régulée par le complexe PANoptosome avec des caractéristiques clés de pyroptose, d’apoptose et/ou de nécroptose qui ne peuvent être expliquées par aucune de ces seules voies de mort cellulaire programmée25. Lorsque le concept de PANoptosis a été proposé, les scientifiques ont décrit l’occurrence de la mort cellulaire programmée de manière plus complète, ce qui met également en évidence la complexité de la mort cellulaire programmée. En attendant, cela indique également les limites de cette méthode de recherche. Bien que la pyroptose soit considérée comme dominante dans la mort cellulaire induite par le LPS/ATP, on ne peut pas déterminer la proportion de ces formes de mort ou si elles existent toutes, même si elles impliquent d’autres formes de mort programmée. Il peut s’agir d’un domaine à explorer à l’avenir.

Ce protocole est basé sur la mort des macrophages induite par le LPS et l’ATP. Nous avons décrit une méthode de test de l’ensemble à l’individu, qui est également applicable à d’autres modèles et cellules. Les résultats indiquent que les cellules peuvent avoir subi une pyroptose, une apoptose ou une nécroptose, qui ne se limite pas à la pyroptose, ce qui aide les chercheurs à mieux comprendre la mort cellulaire après une stimulation LPS et ATP et à choisir une meilleure méthode expérimentale. Dans des études précédentes, la double coloration Annexin V/7-AAD ou Annexin V/PI était couramment utilisée pour indiquer l’apparition de l’apoptose26,27, certains chercheurs l’ont également utilisée pour étudier l’apoptose28. En fait, nous ne pouvons pas distinguer les trois types de mort cellulaire par ces doubles colorations. Ce protocole rappelle aux chercheurs, en particulier aux débutants, que la double coloration de l’Annexine V/7-AAD ou de l’Annexine V/PI ne peut pas déterminer qualitativement le type de mort cellulaire. Il ne peut que montrer les dommages et la mort cellulaires dans leur ensemble ou indiquer que la cellule a peut-être subi une forme de mort. Dans des recherches plus ciblées, il est nécessaire d’introduire un groupe témoin qui inhibe d’autres décès pour montrer que la mort programmée de manière concluante est à portée de main. De même, d’autres recherches mécanistes permettront d’étudier les cibles critiques de différentes morts programmées.

De plus, lors de la préparation de l’expérience, nous avons constaté qu’il existe actuellement de nombreuses procédures expérimentales détaillées pour le MEB des cellules adhérentes, avec peu de description des cellules en suspension. Nous fournissons ici une description plus détaillée de la méthode de préparation des échantillons pour les cellules suspendues. L’étape 5.5 est une étape nécessaire pour aider à immobiliser les cellules en suspension sur les lames de cellules. Les opérations ultérieures doivent être effectuées en douceur pour éviter le détachement des cellules. En plus de la solution d’alun de chrome, la poly-L-lysine peut également immobiliser les cellules.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous exprimons notre grande gratitude à Jiayi Sun et Lu Yang de l’Institut innovant de médecine et de pharmacie chinoises de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu, pour leur aide en cytométrie en flux, à Cuiping Chen du Laboratoire d’État des ressources de la médecine chinoise du sud-ouest, pour leur aide en microscopie électronique à balayage. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [82104491], la Fondation des sciences naturelles du Sichuan [2023NSFSC0674] et la Fondation des sciences postdoctorales de Chine [2021M693789].

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
solution d’enzymes pancréatiques à 0,25 % (à l’exclusion de l’EDTA)BOSTER Biological Technology co.ltdPYG0068
5 mL Tube à fond rond en polystyrèneCORNING352235
5 mL Tube à centrifugerLabgic Technology Co., Ltd.  ;BS-50-M
Plaque à 6 puits  ;Sorfa Life Science Research Co., Ltd220100
Annexin V-PE / 7-AAD kit d’analyse d’apoptoseAbsin (Shanghai) Biological Technology co.ltdabs50007Annexin V-PE, 7-AAD, 5× ; Tampon de liaison, solution de contrôle positif de l’apoptose
Celculture CO2 incubateurEsco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.N/A
Boîte de culture cellulaire, 100 mmSorfa Life Science Research Co., Ltd230301
Compteur de cellules fluorescentes K2Nexcelom Bioscience LLCCellomètre K2
Chambres de comptageNexcelom Bioscience LLCCHT4-SD100-002
Machine à centrifugerHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., LtdL530
alun de chrome  ;Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.
lunettes de protection, 9 mmLabgic Technology Co., Ltd.BS-09-RC
séchoir à point critiqueQuorum TechnologiesK850
diméthylsulfoxyde BOSTERBiological Technology co.ltdPYG0040
microscope électronique fixateurServicebio Technology co.ltd  ;G11022,5 % dialdéhyde glutarique, sels phosphoreux 100 mM
balance électroniqueSHIMADZUATX124
éthanol absoluChengdu Kelong Chemical Co., Ltd2021033102
cytomètre en fluxBecton,Dickinson and CompanyFACSCanto figure-materials-1
d’analyse par cytométrie en fluxBecton,Dickinson and CompanyBD FACSDivaTM Logiciel
gélatineGuangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA00256
Microscope électronique à balayage à balayage à émission de champ froid haute résolutionTITACHIRegulus 8100
lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1Procell Life Science& Technology Co., Ltd.CL0233
microscope inversé  ;Leica Microsystems Co., LtdDMi1
IR Vortex MixerVELP Scientifica SrlZX4
lipopolysaccharide  ;Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  ;L8880LPS est dérivé d’Escherichia coli 055 :B5
Na2ATPBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  ;A8270
phorbol-12-myristate-13-acétate  ;Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  ;P6741
solution saline tamponnée au phosphateServicebio Technology co., Ltd ;G4202
PipetteEppendorf AGN/A
pointes de pipette, 10 &mu ; LServicebio Technology co., Ltd ;Pointes de pipette T-10PL
, 1 mL  ;Servicebio Technology co.ltd ;T-1250L
pointes de pipette, 200 &mu ; LServicebio Technology co., Ltd ;T-200L
RPMI-1640 milieu de culture completProcell Life Science& Technology Co., Ltd.CM0233RPMI-1640 + 10 % FBS + 0,05mM &beta ;-mercaptoéthanol + 1 % P/S
RPMI-1640 milieux de culture  ;Shanghai  ; BasalMedia  ; Technologies Co., LTD.
fluide de gaineBECKMAN COULTER8546733
pulvérisateurCressington Scientific Instruments Ltd108
bain-marie thermostatiqueGUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd  ;HH-1
PA04354logiciel K211104

Références

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