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Mesure de la respiration mitochondriale dans les fibres musculaires squelettiques humaines et murines par respirométrie à haute résolution

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DOI :

10.3791/66834

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4 octobre 2024

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1John T. Milliken Department of Medicine, Division of Nutritional Sciences and Obesity Medicine, Washington University School of Medicine, 2Nutrition and Obesity Research Center, Cellular and Molecular Biology Core, Washington University School of Medicine, 3Nutrition and Obesity Research Center, Animal Model Research Core, Washington University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode complète pour mesurer la phosphorylation oxydative mitochondriale dans les fibres musculaires squelettiques perméabilisées fraîches à partir de muscles humains ou de souris. Cette méthode permet de quantifier en temps réel la respiration mitochondriale et d’évaluer la préférence pour le carburant et la flexibilité métabolique tout en préservant les réseaux mitochondriaux existants et l’intégrité de la membrane.

Résumé

La fonction mitochondriale, pierre angulaire de la production d’énergie cellulaire, est essentielle au maintien de l’homéostasie métabolique. Son dysfonctionnement des muscles squelettiques est lié à des troubles métaboliques prévalents (par exemple, le diabète et l’obésité), aux dystrophies musculaires et à la sarcopénie. Bien qu’il existe de nombreuses techniques pour évaluer le contenu et la morphologie mitochondriaux, la méthode phare pour évaluer la fonction mitochondriale est la mesure de la phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS) par respirométrie. La quantification de l’OXPHOS mitochondrial donne un aperçu de l’efficacité de la production d’énergie oxydative mitochondriale et de la bioénergétique cellulaire. Un respiromètre haute résolution fournit des mesures très sensibles et robustes de l’OXPHOS mitochondrial dans les fibres musculaires perméabilisées en mesurant les changements en temps réel du taux de consommation d’oxygène mitochondrial. L’utilisation de fibres musculaires perméabilisées, par opposition aux mitochondries isolées, préserve les réseaux mitochondriaux, maintient l’intégrité de la membrane mitochondriale et, en fin de compte, permet des mesures plus pertinentes sur le plan physiologique. Ce système permet également de mesurer la préférence de carburant et la flexibilité métabolique - des aspects dynamiques du métabolisme énergétique musculaire. Ici, nous fournissons un guide complet pour les mesures mitochondriales d’OXPHOS dans les fibres musculaires squelettiques humaines et de souris à l’aide d’un respiromètre à haute résolution. Les groupes musculaires squelettiques sont composés de différents types de fibres qui varient dans leur préférence de carburant mitochondrial et leur bioénergétique. À l’aide d’un respiromètre à haute résolution, nous décrivons des méthodes d’évaluation des substrats glycolytiques aérobies et d’acides gras afin d’évaluer la préférence de carburant et la flexibilité métabolique d’une manière dépendante du type de fibre. Le protocole est polyvalent et applicable aux fibres musculaires humaines et de rongeurs. L’objectif est d’améliorer la reproductibilité et la précision des évaluations de la fonction mitochondriale, ce qui améliorera notre compréhension d’un organite important pour la santé musculaire.

Introduction

Les mitochondries sont la pierre angulaire de la production d’énergie cellulaire, ce qui les rend indispensables au maintien d’une homéostasie cellulaire et organique optimale. Ces organites à double membrane sont principalement responsables de la phosphorylation oxydative. Ce processus convertit efficacement les nutriments, tels que les sucres et les acides gras, en adénosine triphosphate (ATP), la monnaie cellulaire de l’énergie. Au-delà de leur rôle dans le métabolisme énergétique, les mitochondries sont également des régulateurs clés de divers processus cellulaires, notamment l’apoptose, l’homéostasie calcique et les espèces réactives de l’oxygène (ROS)1,2. En raison de leur rôle central dans le maintien de l’homéostasie cellulaire et organique, les perturbations de la fonction mitochondriale ont souvent des effets néfastes sur la santé des tissus et de l’organisme. Dans le muscle squelettique, le dysfonctionnement mitochondrial est associé à de nombreux états pathologiques, notamment les troubles métaboliques (par exemple, l’obésité, le diabète et les maladies cardiovasculaires), la sarcopénie et la dystrophie musculaire 3,4,5,6,7,8.

Le dysfonctionnement mitochondrial peut se manifester principalement par une altération du contenu, du nombre et de la morphologie mitochondriaux, ainsi que par une perturbation du métabolisme. Ainsi, parvenir à une compréhension complète du dysfonctionnement mitochondrial nécessite une approche intégrative et holistique. Les études de caractérisation initiales comprennent l’examen des niveaux d’expression des complexes protéiques de la chaîne respiratoire comme lecture du contenu mitochondrial, la quantification de l’ADN mitochondrial et des marqueurs de biogenèse comme mesure de la biogenèse mitochondriale, et l’imagerie sophistiquée par microscopie électronique pour évaluer la morphologie mitochondriale 9,10. D’autres évaluations de la fonction mitochondriale comprennent l’évaluation de la production cellulaire de ROS et d’ATP et du potentiel de la membrane mitochondriale9.

Parce que les mitochondries sont essentielles à la production d’énergie cellulaire et à l’homéostasie, une caractéristique pour évaluer la fonction mitochondriale est de mesurer la phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS). La respirométrie à haute résolution des fibres musculaires perméabilisées permet de mesurer les changements en temps réel du taux de consommation d’oxygène mitochondrial comme lecture des changements dynamiques de l’activité de la chaîne respiratoire mitochondriale OXPHOS 9,11,12. L’application de modulateurs et d’inhibiteurs chimiques sélectifs permet de mesurer l’activité de différents complexes respiratoires directement et séquentiellement. Bien que des mitochondries isolées puissent être utilisées en respirométrie, l’utilisation de fibres musculaires fraîches et perméabilisées maintient les réseaux mitochondriaux endogènes et l’intégrité de la membrane, permettant ainsi des mesures plus pertinentes sur le plan physiologique. De plus, étant donné que les différents types de fibres musculaires ont des préférences de substrat et des taux de respiration différents, ce système permet de mesurer les changements de préférence de carburant et de flexibilité métabolique en fonction du typede fibre 13.

Nous décrivons ici un protocole complet pour les mesures mitochondriales d’OXPHOS à l’aide de fibres musculaires squelettiques humaines ou de souris dans un système de respiromètre à haute résolution. Il s’agit de méthodes permettant de quantifier la respiration mitochondriale de l’oxygène dans les fibres oxydatives ou glycolytiques en utilisant soit du pyruvate, soit de la palmitoyl-carnitine comme substrat. Ce protocole permet l’utilisation d’autres substrats de combustible pour répondre à des questions métaboliques spécifiques relatives aux défauts d’utilisation du substrat et à la préférence de carburant.

Protocole

Toutes les procédures sur les souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Washington. Des souris de n’importe quel sexe, âge et poids peuvent être utilisées pour ces expériences et dépendront de la nature de la question expérimentale que l’on cherche à aborder. Les souris utilisées ici sont des souris adultes (âgées de 12 à 16 semaines) mâles de type sauvage C57BL/6. Toutes les procédures humaines ont été approuvées par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université de Washington. Les sujets de l’étude ont consenti à l’utilisation des données, et les données représentatives des sujets humains incluses dans ce protocole proviennent d’une étude publiée14. Les données proviennent de femmes ménopausées non diabétiques (55-75 ans). Le tableau 1 présente les détails de la préparation des réactifs nécessaires à l’essai. Des renseignements sur les réactifs, les outils et les machines utilisés dans l’essai sont répertoriés dans la table des matériaux. Une vue d’ensemble schématique du protocole est présentée à la figure 1.

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Figure 1 : Schéma de la respirométrie à haute résolution sur des échantillons de muscles squelettiques perméabilisés. La méthode détaillée dans ce manuscrit est divisée en 6 sections : 1) préparation des tampons et réactifs respiratoires, 2) préparation des instruments et des réactifs le jour du test, 3) préparation et perméabilisation des échantillons musculaires, 4) préparation de l’échantillon et de l’instrument, 5) exécution du test de respiration et 6) analyse des données. Créé avec BioRender.com Cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Préparation du test et étalonnage de l’instrument

  1. Le jour de l’essai, prélever le nombre nécessaire d’aliquotes de chaque composé respiratoire (blebbistatine, palmitoyl-carnitine, glutamate, malate, ADP, succinate, cytochrome C, FCCP) et décongeler sur de la glace. Décongeler des flacons de BIOPS et de MiR05 sur de la glace.
  2. Préparer les solutions de saponine et de pyruvate comme indiqué au tableau 1. Préparez une solution de travail de MiR05 comme dans le tableau 1. Préparer 5 mL de solution de travail de MiR05 par instrument (2 chambres). Augmentez l’échelle selon vos besoins.
  3. Allumez le système de respirométrie haute résolution et le système d’aspiration. Retirez les bouchons, retirez la solution de stockage d’éthanol à 70 % sous vide et remplissez la chambre avec du grade moléculaire ultrapur H2O. Retirez H2O par vide et remplissez. Répétez l’opération pour un total de 3 lavages. Après le lavage final, ajoutez 2 ml de MiR05 (sans créatine ni blébbistatine) dans chaque chambre.
  4. Ouvrez le logiciel de respirométrie. Une fois le logiciel lancé, une fenêtre contextuelle s’ouvre pour les paramètres de l’instrument. Réglez la vitesse d’agitation de la chambre sur 750 tr/min, la température sur 37 °C et l’intervalle d’enregistrement des données sur 2 s. Réglez le gain sur 1 et la tension de polarisation sur 800 mV pour les capteurs d’oxygène. Cliquez sur Se connecter à Oxygraph pour établir la communication avec l’instrument.
  5. Une fois la communication établie, une boîte de dialogue s’ouvre pour nommer et enregistrer le fichier expérimental. Enregistrez le fichier avec la date actuelle et l’étalonnage. Après avoir enregistré le fichier, une boîte de dialogue contextuelle s’affiche pour les détails de l’expérience. Aucune information n’est nécessaire pour le cycle d’étalonnage et la boîte peut être fermée.
  6. Enregistrez la concentration d’oxygène pendant au moins 30 minutes pour permettre aux chambres de se réchauffer et d’enregistrer les signaux pour l’étalonnage de l’air. Cela peut être fait lors de la préparation des fibres musculaires, comme détaillé à l’étape 2 ci-dessous.
  7. À la fin de la période d’étalonnage, marquez une région d’étalonnage dans la région où la concentration d’oxygène (ligne bleue) est stable. Pour ce faire, maintenez la touche Maj et le bouton gauche de la souris enfoncés et faites glisser le pointeur sur une région de la chronologie.
  8. Ouvrez la fenêtre d’étalonnage en accédant à l’étalonnage de l’Oxygraph > de l’O2. Pour l’étalonnage de l’air, sélectionnez le repère généré à l’étape 1.8. Cliquez sur Calibrer et copier dans le presse-papiers.
  9. Répétez les étapes 1.6-1.8 pour le reste de la chambre. Effectuez l’étalonnage de l’air quotidiennement. Arrêtez l’enregistrement de l’étalonnage de l’air et sauvegardez le fichier en vous déconnectant de l’instrument. Une fois que les échantillons sont prêts, passez à l’étape 3 pour effectuer le test.

2. Prélèvement et perméabilisation des fibres musculaires squelettiques

  1. Isolement de tissus de souris
    1. Pour chaque échantillon à analyser, remplissez un puits d’une boîte de culture à 12 puits avec 1 ml de BIOPS. Placer l’assiette sur de la glace pour refroidir.
    2. Après avoir euthanasié la souris par inhalation de dioxyde de carbone suivie d’une luxation cervicale, prélevez le muscle squelettique d’intérêt, en vous assurant d’enlever tout le tissu conjonctif et la graisse (Figure 2A). Placez le muscle dans l’un des puits contenant BIOPS. Placer sur de la glace jusqu’à la préparation des fibres.
      REMARQUE : Tout muscle squelettique peut être examiné à l’aide de ce protocole - le type de muscle examiné dépendra de la question expérimentale que l’on cherche à aborder. Dans le cas des muscles squelettiques avec des types de fibres mixtes, tels que le gastrocnémien, il est possible de séparer le tissu en sections blanches et rouges pour mesurer principalement les fibres à contraction rapide (sections blanches) et les fibres à contraction lente (sections rouges) (Figure 2B).
  2. Isolement des tissus humains
    1. Prélever des tissus selon le protocole clinique14. Rincez rapidement le tissu avec du PBS froid et stérile et placez-le dans un tube conique contenant 2 ml de solution BIOPS. Gardez le mouchoir sur de la glace jusqu’à la préparation des fibres.
  3. Préparation des fibres
    1. La perméabilisation aura lieu dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits. Ajoutez 2 ml de solution BIOPS à un ensemble de puits et 2 ml de MiR05 à un autre ensemble de puits. Un ensemble de puits sera nécessaire pour chaque échantillon analysé.
    2. Remplissez un plateau de glace et placez une boîte de Pétri en verre à l’envers sur la glace. Assurez-vous de toujours garder le muscle sur la glace.
    3. Transférez les échantillons de muscle prélevés sur la plate-forme réfrigérée de la boîte de Pétri à l’aide d’une pince. À l’aide de deux pinces à pointe fine et d’un microscope à dissection avec une source lumineuse, nettoyez doucement le tissu en enlevant les tendons, les fascias et le tissu adipeux qui sont attachés au muscle.
    4. Une fois que tous les tissus non musculaires étrangers ont été retirés, séparez doucement les fibres musculaires à l’aide de la pince à pointe fine jusqu’à ce qu’elles deviennent de petits faisceaux de fibres translucides d’une longueur de 0,75 à 1,0 mm (Figure 2C-D). Après avoir séparé les fibres, utilisez la pince pour transférer les faisceaux de fibres dans un puits sur la plaque à 6 puits contenant la solution BIOPS sur glace.
    5. Ajouter 20 μL de solution de saponine à 5 mg/mL dans chaque puits BIOPS et incuber la plaque sur de la glace tout en la balançant doucement dans une pièce froide pendant 20 min.
    6. Après le traitement aux saponines, transférez les fibres musculaires dans le puits contenant le MiR05 pour les rincer avant le dosage. Incuber sur glace en se balançant doucement dans une chambre froide pendant 15 min.
    7. Une fois l’incubation des fibres dans MiR05 terminée, rassemblez les fibres à l’aide d’une pince tranchante et épongez doucement les fibres musculaires sur une lingette de travail. Tarez un tube de microcentrifugation en plastique de 1,5 ml sur une balance fine et placez 2 à 3 mg de fibres dans le tube. Notez le poids final de la fibre sur le côté de chaque tube. Placez le tube sur de la glace. Répétez l’opération avec d’autres échantillons. Passez immédiatement à l’étape 3.

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Figure 2 : Séparation des fibres musculaires squelettiques de la souris. (A) Morphologie macroscopique du gastrocnémien de souris après la récolte. (B) Dissection du gastrocnémien en segments rouges (gauche) et blancs (droite). (C) Fibres musculaires séparées mécaniquement. (D) Une image 10x de fibres musculaires séparées avec succès. La barre d’échelle est de 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Préparation des échantillons de muscle dans le respiromètre

  1. Aspirez le MiR05 utilisé pour l’étalonnage de l’instrument comme indiqué à l’étape 1 ci-dessus et ajoutez 2,1 ml de solution MiR05 fonctionnelle dans chaque chambre.
  2. Lancez un nouveau fichier pour l’expérience en utilisant les mêmes paramètres d’instrument que ceux détaillés à l’étape 1.5. au-dessus. Définissez le nom du fichier et enregistrez les paramètres.
  3. Après avoir défini le nom du fichier, la boîte de dialogue suivante de l’écran affichera des détails expérimentaux spécifiques. Entrez les informations sur l’échantillon et le poids de chaque échantillon ajouté à chaque chambre. Fermez la boîte de dialogue.
  4. Une fois dans le nouveau fichier expérimental, paramétrez l’étalonnage en ouvrant la fenêtre d’étalonnage de l’O2. Cliquez sur Copier à partir d’un fichier et sélectionnez le fichier enregistré à l’étape 1.9. au-dessus. Cliquez sur le bouton Calibrer et copier dans le presse-papiers . Répétez le processus pour la chambre restante.
  5. À l’aide d’une pince fine, transférez soigneusement les faisceaux de fibres musculaires dans la solution de respiration pour la chambre appropriée. Répétez l’opération pour la chambre restante.
  6. Placez les bouchons sur la chambre et fermez soigneusement la chambre à moitié en poussant les bouchons à mi-chemin vers le bas. Une fois que les joints toriques des bouchons s’engagent avec la paroi de la chambre et qu’il y a une résistance, utilisez un mouvement de torsion tout en poussant vers le bas pour fermer. Lorsque la chambre est à moitié fermée, une petite bulle d’air peut être observée en haut de la chambre.
    REMARQUE : Les fibres perméabilisées sont soumises à des limitations de diffusion d’oxygène dans des conditions respiratoires normales. Pour contourner cette limitation, le test est effectué à des concentrations élevées d’oxygène11.
  7. Remplissez une seringue en plastique de 10 ml avec de l’oxygène pur provenant d’un réservoir d’oxygène. Placez l’aiguille longue et émoussée fournie avec l’instrument sur la seringue. Placez l’aiguille dans la première chambre et délivrez lentement environ 1 ml d’oxygène dans la chambre.
  8. Surveillez la concentration d’oxygène dans la chambre dans le logiciel de respirométrie. Lorsque la concentration d’oxygène dans la chambre atteint 350-400 nmol/mL, tournez doucement le bouchon tout en poussant vers le bas pour fermer complètement la chambre. Regardez à l’intérieur de la chambre et assurez-vous qu’il ne reste pas de bulles d’air. En cas de bulle d’air, rouvrez la chambre avec précaution et rapidité, ajoutez 100 μL de solution de travail MiR05 supplémentaire et refermez rapidement la chambre. Répétez l’opération avec les chambres restantes.
  9. Les concentrations d’oxygène doivent être maintenues au-dessus de 250 nmol/mL pendant l’essai. Ajoutez de l’oxygène supplémentaire au besoin en ouvrant partiellement la chambre, en ajoutant plus d’oxygène de la seringue dans la bulle d’air et en refermant soigneusement la chambre.
  10. Normalisez les données de flux d’oxygène en fonction de la masse de tissu utilisée pour l’expérience. Pour ajuster les graphiques, modifiez la mise en page pour refléter O2 Flux (pmol O2 / (s x mg)). Dans le menu de mise en page, sélectionnez la mise en page 06 - Flux spécifique par unité d’échantillonnage. Les données seront maintenant présentées normalisées en fonction de la quantité de tissu dans chaque chambre.

4. Respirométrie à haute résolution

  1. Lorsque la concentration d’oxygène (ligne bleue) et le flux d’O2 (ligne rouge) se sont stabilisés après l’ajout d’oxygène, commencez le protocole de respiration. L’oxygène peut être considéré comme stable lorsque la ligne bleue est plate ou qu’elle diminue lentement. Le flux O2 doit également être plat et à moins de 5 pmol O2 / s x mg.
  2. Ajouter tous les réactifs à l’aide de seringues en verre. Il est important de ne pas utiliser la même seringue pour les substrats, les inhibiteurs et les découpleurs. Ayez une seringue distincte pour chacun. Après avoir ajouté chaque composé, enregistrez le flux d’oxygène pendant 1 à 2 minutes après que le taux respiratoire se soit stabilisé avant d’ajouter le réactif suivant.
  3. Mesure de la respiration
    1. À l’aide d’une seringue en verre de 10 μL, ajoutez 2,5 μL de malate 0,8 M dans chaque chambre. Appuyez sur F4 pour marquer la chronologie et étiqueter le repère avec M. Enregistrez un flux stable O2 pendant 1 à 2 min.
    2. Ajoutez des réactifs spécifiques aux nutriments comme décrit ci-dessous.
      1. Glycolytique aérobie : À l’aide d’une seringue en verre de 10 μL, ajoutez 10 μL de glutamate 2 M et 5 μL de pyruvate 2 M dans chaque chambre. Appuyez sur F4 pour marquer la chronologie et étiquetez la marque avec G P. Enregistrez un flux stable O2 pendant 1 à 2 min.
      2. Acide gras : À l’aide d’une seringue en verre de 10 μL, ajoutez 10 μL de glutamate 2 M et 10 μL de palmitoyl-carnitine 10 mM dans chaque chambre. Appuyez sur F4 pour marquer la chronologie et étiquetez la marque avec G PC. Enregistrez un flux O2 stable pendant 1 à 2 min.
    3. À l’aide d’une seringue en verre de 25 μL, ajoutez 20 μL d’ADP 0,5 M (avec MgCl2) dans chaque chambre. Appuyez sur F4 pour marquer la chronologie et étiqueter la marque avec ADP. Enregistrez un flux O2 stable pendant 1 à 2 min.
    4. À l’aide d’une seringue en verre de 25 μL, ajoutez 20 μL de succinate 1 M dans chaque chambre. Appuyez sur F4 pour marquer la chronologie et étiqueter la marque avec S. Enregistrez un flux stable O2 pendant 1 à 2 min.
    5. À l’aide d’une seringue en verre de 10 μL, ajoutez 5 μL de cytochrome C de 4 mM dans chaque chambre. Appuyez sur F4 pour marquer la chronologie et étiquetez la marque avec Cyt C. Enregistrez un flux stable O2 pendant 1 à 2 min.
    6. Titrer en trois bolus de 1 μL de FCCP de 1 mM à l’aide d’une seringue en verre de 10 μL. Il y a généralement un effet de mélange lors de l’ajout de FCCP qui entraîne une brève diminution des niveaux de flux O2 . Attendez que le flux O2 augmente et se stabilise avant de passer à l’étape suivante. Appuyez sur F4 après chaque ajout pour marquer la chronologie et étiqueter la marque avec FCCP. Enregistrez un flux stable d’O2 pendant 1 min après chaque ajout.
  4. Lorsque le test de respiration est terminé, retirez doucement les bouchons en les tournant et en tirant vers le haut. Rincez les chambres 3 fois avec du H2O ultra-pur à partir d’une bouteille à jet d’eau, puis 3 fois avec de l’éthanol à 70 % à partir d’une bouteille à jet d’eau. Après le rinçage final à l’éthanol, remplissez les chambres avec de l’éthanol à 70 % pour le stockage.
  5. Placez les bouchons dans les chambres jusqu’à ce que vous sentiez une résistance. Ne fermez pas complètement les bouchons. Placez des capuchons sur les bouchons, enregistrez le fichier de test et déconnectez l’instrument du logiciel de respirométrie. Éteignez l’instrument.

5. Analyse des données

  1. Ouvrez le fichier d’analyse dans le logiciel de respirométrie. Extraire des données à partir de régions de flux d’oxygène stables obtenues après injection de composés respiratoires.
  2. Pour marquer les régions d’intérêt, maintenez la touche Maj enfoncée, cliquez sur le bouton gauche de la souris et faites glisser la boîte sur la région stable du débit de flux O2 pour les étapes de test détaillées ci-dessous.
  3. Stades de dosage 14,15,16,17,18,19,20
    1. Marquez la chronologie après l’ajout de malate/glutamate/pyruvate (protocole glycolytique aérobie) ou de malate/glutamate/palmitoyl-carnitine (protocole des acides gras). Ce taux représente le taux de respiration du Complexe I État 2 (LEAK(n)).
    2. Marquez la chronologie après l’ajout d’ADP. Ce taux représente le taux de respiration du Complexe I État 3 (CI OXPHOS).
    3. Marquez la chronologie après l’ajout de succinate. Ce taux représente le taux de respiration du complexe I+II État 3 (IC+II OXPHOS).
    4. Marquez la chronologie après avoir ajouté le cytochrome C. Ce taux représente le taux de respiration du Complexe I+II+État Cytochrome 3 (IC+II+Cyt C OXPHOS).
    5. Marquez la chronologie du titrage FCCP avec le débit de flux O2 le plus élevé. Ce taux représente la fréquence respiratoire maximale (MAX ETS).
  4. Récupérez les valeurs de données des régions marquées sur la chronologie en sélectionnant Marquer > Statistiques. Copiez le débit de O2 (pmol O2/(s x mg)) de la chambre marquée dans une feuille de calcul.
  5. Répétez le marquage et l’extraction des données pour les chambres supplémentaires.
  6. Calculez le rapport de contrôle respiratoire (RCR) en divisant l’état 3 du complexe I+II (après l’addition de succinates) par l’état 2 du complexe I (avant l’addition de l’ADP).

Résultats

Les figures 3 et 4 montrent les graphiques d’oxygène des protocoles de respirométrie aérobie glycolytique et d’acide gras, respectivement, pour des fibres musculaires gastrocnémiennes murines rouges et blanches correctement préparées. Des résultats quantifiés représentatifs sont également présentés à titre de référence. La figure 5 montre un graphique d’oxygène de la respirométrie glycolytique aérobie dans des échantillons de biopsie musculaire humaine correctement préparés. Des résultats quantifiés représentatifs sont également présentés. Notez que pour les figures 3, 4 et 5, l’ajout de cytochrome C après l’ajout d’ADP ne produit pas d’impact sur le flux d’oxygène, indiquant que la membrane mitochondriale externe de l’échantillon est intacte. La figure 6 montre un graphique d’oxygène de la respirométrie glycolytique aérobie où l’ajout de cytochrome C après l’ADP entraîne un pic (augmentation de 40 %) du flux d’oxygène, indiquant que la membrane mitochondriale externe a été endommagée et que l’échantillon ne doit donc pas être utilisé pour la respirométrie - les raisons potentielles de ce résultat peuvent être une manipulation inappropriée ou la congélation/décongélation des tissus, prolonger la perméabilisation des tissus, et ne pas utiliser de tissus fraîchement isolés.

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Figure 3 : Consommation d’oxygène chez la souris. Les résultats montrent la consommation d’oxygène chez les gastrocnémiens (A) rouges et (B) blancs selon le protocole du pyruvate. Flux d’état 2 suite à l’ajout de malate, de glutamate et de pyruvate (teinte bleue, CI LEAK). Une stimulation significative de la consommation d’O2 est observée après l’administration d’ADP (teinte verte, CI OXPHOS), avec une respiration plus poussée après l’ajout de succinate (teinte violette, CI+II OXPHOS). Le cytochrome C n’a pas induit d’augmentation significative (<15%), indiquant que la membrane mitochondriale externe est intacte (teinte orange, CI+II+Cyt C OXPHOS). Les mitochondries sont découplées suite à l’ajout de FCCP (teinte jaune, MAX ETS). La ligne bleue représente la concentration d’oxygène dans une chambre fermée. La ligne rouge représente le taux de consommation d’oxygène (flux O2). Composés ajoutés : Malate (m), Glutamate (g), Pyruvate (p), Adénosine diphosphate (ADP), Cytochrome C (cyt c), Cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP). (C) Le graphique à barres reflète les résultats représentatifs (n=8). Les données sont représentées sous forme ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Consommation d’oxygène chez la souris. Les résultats montrent la consommation d’oxygène chez les gastrocnémiens (A) rouges et (B) blancs en utilisant le protocole palmitoyl-carnitine. Flux d’état 2 suite à l’ajout de malate, de glutamate et de palmitoyl carnitine (teinte bleue, CI LEAK). Une stimulation significative de la consommation d’O2 est observée après l’administration d’ADP (teinte verte, CI OXPHOS), avec une respiration plus poussée après l’ajout de succinate (teinte violette, CI+II OXPHOS). Le cytochrome C n’a pas induit d’augmentation significative (<15%), indiquant que la membrane mitochondriale externe est intacte (teinte orange, CI+II+Cyt C OXPHOS). Les mitochondries sont découplées suite à l’ajout de FCCP (teinte jaune, MAX ETS). La ligne bleue représente la concentration d’oxygène dans une chambre fermée. La ligne rouge représente le taux de consommation d’oxygène (flux O2). Composés ajoutés : Malate (m), Glutamate (g), Palmitoyl Carnitine (pc), Adénosine Diphosphate (ADP), Cytochrome C (cyt c), Cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP). (C) Le graphique à barres reflète les résultats représentatifs (n = 7). Les données sont représentées sous forme ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Résultats représentatifs de la consommation d’oxygène dans le vaste latéral humain à l’aide du protocole du pyruvate. (A) Flux d’état 2 après l’ajout de malate, de glutamate et de pyruvate (teinte bleue, CI LEAK). Une stimulation significative de la consommation d’O2 est observée après l’administration d’ADP (teinte verte, CI OXPHOS), avec une respiration plus poussée après l’ajout de succinate (teinte violette, CI+II OXPHOS). Le cytochrome C n’a pas induit d’augmentation significative (<15%), indiquant que la membrane mitochondriale externe est intacte (teinte orange, CI+II+Cyt C OXPHOS). Les mitochondries sont découplées suite à l’ajout de FCCP (teinte jaune, MAX ETS). La ligne bleue représente la concentration d’oxygène dans une chambre fermée. La ligne rouge représente le taux de consommation d’oxygène (flux O2). Composés ajoutés : Malate (m), Glutamate (g), Pyruvate (p), Adénosine diphosphate (ADP), Cytochrome C (cyt c), Cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP). (B) Le graphique à barres reflète les résultats représentatifs obtenus à partir de biopsies du vaste latéral (n = 24). Les données sont représentées sous forme ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Résultat représentatif démontrant une intégrité compromise de la membrane mitochondriale externe chez le gastrocnémien rouge de souris. Flux d’état 2 suite à l’ajout de malate, de glutamate et de pyruvate (teinte bleue, CI LEAK). Une stimulation significative de la consommation d’O2 est observée après l’administration d’ADP (teinte verte, CI OXPHOS), avec une respiration plus poussée après l’ajout de succinate (teinte violette, CI+II OXPHOS). Le cytochrome C a induit une augmentation significative de la consommation d’O2 (>15%), indiquant des dommages à la membrane mitochondriale externe. La ligne bleue représente la concentration d’oxygène dans une chambre fermée. La ligne rouge représente le taux de consommation d’oxygène (flux O2). Composés ajoutés : Malate (m), Glutamate (g), Pyruvate (p), Adénosine diphosphate (ADP), Cytochrome C (cyt c), Cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Préparation des réactifs des composés respiratoires et des solutions respiratoires. Les détails de la préparation des réactifs nécessaires à l’essai sont présentés, y compris les concentrations finales de la pâte et la façon de les préparer et de les stocker. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Ce protocole fournit un protocole modèle complet et simple pour évaluer la fonction mitochondriale dans les fibres musculaires squelettiques perméabilisées pour les échantillons humains et murins. Il y a plusieurs avantages à utiliser des fibres perméabilisées au lieu de mitochondries isolées. L’un des principaux avantages est que l’utilisation de fibres perméabilisées nécessite de petites quantités (2 à 5 mg) de tissu, ce qui rend cette méthode adaptée à la fois aux échantillons de biopsie musculaire humaine et aux muscles de souris. Un autre avantage par rapport aux mitochondries isolées est que l’architecture cellulaire reste intacte, assurant la préservation des interactions structurelles et fonctionnelles entre les mitochondries et les composants cellulaires 12,21,22,23.

L’utilisation du pyruvate, du malate et du glutamate dans notre protocole de glycolyse aérobie fournit une évaluation complète et à large spectre de l’apport en NADH au complexe I 24,25,26,27,28. Bien que cette approche globale fournisse une évaluation de l’activité du complexe I dans des conditions métaboliques holistiques et physiologiquement pertinentes, l’utilisation du pyruvate-malate ou du glutamate-malate peut être une approche expérimentale plus appropriée. Par exemple, l’utilisation de glutamate-malate peut révéler des différences dans la fonction mitochondriale liées au catabolisme des acides aminés29. Nous encourageons les chercheurs à examiner attentivement l’approche appropriée à utiliser pour leur modèle de recherche spécifique.

Bien que ce protocole se concentre sur l’utilisation de substrats pour évaluer l’activité mitochondriale, l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques peut être nécessaire pour atteindre des objectifs expérimentaux. Par exemple, la roténone peut être utilisée pour inhiber le complexe I 12,21,30, l’oligomycine utilisée pour inhiber le complexe V (ATP synthase)12,21 et l’antimycine A pour bloquer le complexe III12,21 pour l’évaluation de la respiration non mitochondriale. Le protocole fourni ci-dessus peut facilement être adapté pour inclure l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques. Il est important de noter qu’une mise en garde concernant l’utilisation d’inhibiteurs est que ces composés sont collants et nécessitent un nettoyage approfondi pour être éliminés de la chambre de l’instrument. Nous constatons que l’utilisation d’une solution de BSA à 10 % pendant 60 minutes est suffisante pour l’élimination des inhibiteurs résiduels.

La respiration LEAK fait référence au taux de consommation d’oxygène qui est indépendant de la synthèse de l’ATP. Ce taux représente le flux de protons dans la matrice mitochondriale à partir de la membrane mitochondriale interne. Il existe trois méthodes acceptées pour évaluer la consommation d’oxygène indépendamment de la synthèse de l’ATP (LEAK). La première, LEAK(n), mesure le taux de consommation d’oxygène en présence de substrats mais sans ajout d’adénylates (ADP ou ATP)31,32,33. Cet état LEAK représente la fuite intrinsèque de la membrane mitochondriale. La deuxième méthode, LEAK(t), est mesurée en présence d’ATP34 et la troisième, LEAK(o), est mesurée en présence de l’inhibiteur de l’ATP-synthase oligomycine35, 36, 37. Ce protocole utilise LEAK(n) pour cette évaluation, mais en fonction des objectifs et des modèles expérimentaux, d’autres méthodes de mesure du flux d’oxygène LEAK peuvent être appropriées.

Pour ce dos, MiR05 est complété par de la créatine (3 mg/mL) et de la blebbistatine (10 μM). Le transport mitochondrial de l’ADP est facilité par la créatine kinase (CK), et la créatine est ajoutée à la solution respiratoire pour saturer l’activité de la CK38,39. Les fibres musculaires peuvent se contracter spontanément et sont également sensibles à la contraction induite par l’ADP. Pour évaluer l’activité respiratoire mitochondriale sans l’influence de la contraction, la blebbistatine a été ajoutée pour inhiber l’activité contractile des fibres38. De plus, des études sur le muscle humain suggèrent que la capacité respiratoire peut être influencée par la méthode de biopsie (microbiopsie par rapport à l’aiguille de Bergstrom) et que cette différence peut être due à des différences de longueur de fibre obtenue40,41. Les fibres plus courtes peuvent être plus susceptibles d’être endommagées pendant la préparation, et l’utilisation de la blebbistatine aide à préserver la fonction. Il peut y avoir certaines conditions où la relaxation des fibres ne correspond pas aux objectifs de la recherche et, dans ce cas, la blébbistatine peut être exclue de la solution MiR05.

La perméabilisation des fibres musculaires squelettiques avec la saponine génère des pores dans la membrane plasmique permet aux substrats et aux inhibiteurs de pénétrer librement dans la cellule. La saponine a une grande affinité pour le cholestérol, qui est riche et abondant dans les membranes plasmiques cellulaires, tandis que les membranes mitochondriales sont pauvres en cholestérol42,43. On s’attend à ce que le traitement aux saponines utilisé pour la préparation des fibres dans ce protocole préservera l’intégrité de la membrane mitochondriale. Des dommages aux mitochondries peuvent également survenir en raison des forces de cisaillement qui résultent de la séparation mécanique du tissu en fibres. Nous suggérons que la séparation des tissus en faisceaux de fibres soit effectuée rapidement et avec une manipulation minimale. Pour évaluer les lésions mitochondriales potentielles, nous avons inclus le titrage du cytochrome C dans le protocole de respiration. Le cytochrome C ne peut pas passer à travers une membrane mitochondriale externeintacte 12, par conséquent, toute augmentation du flux d’O2 après l’ajout de cytochrome C indique que des dommages à la membrane mitochondriale externe se sont produits pendant le processus de préparation de l’échantillon. Dans l’une de nos études récentes, nous avons constaté que le flux d’O2 augmentait de 8 %15 après l’ajout de cytochrome C, validant que l’utilisation de saponine suggérée dans ce protocole ne provoque pas de dommages mitochondriaux. Nous suggérons que tout échantillon présentant une augmentation supérieure à 15 % du flux d’O2 après l’ajout du cytochrome C devrait être exclu de l’analyse44. Cette étape est incluse strictement comme une mesure de contrôle de la qualité et non comme une évaluation de l’activité du Complexe IV.

Alors que la respirométrie à haute résolution excelle dans la fourniture de mesures très sensibles et fiables de la consommation d’oxygène, une limitation notable de l’instrumentation est que seuls deux échantillons peuvent être mesurés simultanément par instrument. Cela nécessite une attention particulière lors de la conception d’études impliquant des cohortes avec plusieurs échantillons. Bien qu’il puisse être tentant d’effectuer des mesures sur divers ensembles d’échantillons tout au long de la journée, nous conseillons fortement aux chercheurs de prendre en compte l’influence du rythme circadien sur le métabolisme. Des recherches sur les muscles squelettiques humains et rongeurs ont révélé une influence de l’horloge biologique sur la fonction mitochondriale45,46. Par conséquent, nous recommandons d’effectuer des mesures sur plusieurs jours au même moment de la journée pour tenir compte de ces fluctuations circadiennes.

Enfin, pour garantir des mesures de respirométrie reproductibles et robustes, le respiromètre doit faire l’objet d’un nettoyage, d’un entretien et d’un étalonnage réguliers. L’étalonnage de l’air, tel qu’il est détaillé dans le protocole, doit être effectué quotidiennement. Nous conseillons aux utilisateurs d’effectuer également un étalonnage mensuel complet (à la fois aérien et zéro) des capteurs d’oxygène polarographiques. Les utilisateurs doivent se référer à la documentation et au site Web du fabricant pour plus d’informations sur cette méthode d’étalonnage et pour obtenir des instructions sur l’entretien régulier de l’instrument.

La respirométrie à haute résolution reste la référence pour mesurer la respiration mitochondriale. La méthode détaillée dans ce protocole facilite l’évaluation robuste de la capacité mitochondriale dans les muscles squelettiques des rongeurs et des humains. Ce protocole a été appliqué à des études évaluant la fonction mitochondriale associée à des modèles génétiques murins15,16, dans le contexte d’une maladie rénale chronique19, après l’administration de suppléments alimentaires14,20 et l’exercice17,18.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les recherches dont il est question dans cette publication ont été financées par le Nutrition Obesity Research Center, la subvention P30 DK056341 des NIH et la subvention K01 HL145326 des NIH.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 et micro ; L Seringue Hamilton (seringue en verre)ThermoFisher14-813-125Pour le dosage de la respiration titrage
25 µ ; L Seringue Hamilton (seringue en verre)ThermoFisher14-813-133Pour le titrage du test de respiration
ADPMerck117105Essai de respirométrie
Plat de dissection en verre noir ScinticaDD-90-S-BLKPour la préparation d’échantillons
BlebbistatinSigmaB0560Solution de travail MiR05
BSA, sans acides grasSigmaA6003Solution MiR05
Carbonate de calciumSigmaC4830BIOPS Solution
CréatineSigma27900Solution MiR05 de travail
Cytochrome CSigmaC7752Test respiratoire
DatLabOroboros InstrumentsN/ALogiciel de respirométrie
Dithiothreitol (DTT)  ;SigmaD0632BIOPS Solution
D-SucroseSigma84097MiR05 Solution
EGTASigmaE4378BIOPS & Solution MiR05
FCCPSigmaC2920Dosage
GlutamateSigmaG1626Dosage
HEPESSigmaH7523MiR05
Solution Imidazole  ;Sigma56750BIOPS Solution
KH2PO4  ;SigmaP5379MiR05 Solution
Acide lactobioniqueSigma153516MiR05 Solution
MalateSigmaM1000Dosage
MES hydrate  ;SigmaM8250BIOPS Solution
MgCl2 - 6 H2O  ;SigmaM2670BIOPS & MiR05 Solution
Oroboros Oxygraph-2K (O2K)System Oroboros Instruments10203-03Respiromètre haute résolution
Palmitoyl-CarnitineSigmaP4509Dosage
respiratoire Hydroxyde de potassiumSigmaP1767BIOPS Solution
Pince à épiler de précisionFisher17-467-168Pour la préparation des échantillons
SaponineSigmaS2149pour la perméabilisation des fibres
ATP sodiqueSigmaA2383BIOPS Solution
Phosphocréatine sodiqueSigmaP7936BIOPS Solution
Pyruvate de sodiumSigmaP2256Essai respiratoire
SuccinateSigmaS2378Essai respiratoire
Taurine  ;SigmaT0625BIOPS & La solution MiR05
respiratoire respiratoire respiratoire

Références

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