Un flux de travail en ligne pour sélectionner des amplificateurs spécifiques à des gènes et des tissus

Les amplificateurs sont des régions d’ADN non codantes qui régulent la transcription des gènes, le développement et la différenciation cellulaire ^1,2. La mutation des amplificateurs peut entraîner diverses maladies, notamment des troubles du développement, des cancers et d’autres conditions génétiques 3,4,5,6. Par conséquent, la compréhension des amplificateurs est primordiale pour comprendre l’expression des gènes, les mutations et les maladies.

Pour comprendre comment les amplificateurs interagissent avec leurs gènes cibles, il est important d’identifier leur emplacement dans le génome. Cependant, l’identification des emplacements des amplificateurs n’est pas toujours simple, car les amplificateurs peuvent être situés à la fois près du site de début de transcription (TSS) et beaucoup plus loin, s’étendant sur des dizaines à des centaines de kilobases 2,7,8,9.

Malgré leur emplacement génomique imprévisible, les amplificateurs présentent des signatures biochimiques et structurelles distinctes, ce qui leur permet d’être systématiquement tracés. En général, les amplificateurs ont tendance à être enrichis dans les régions intergéniques et introniques, avec un petit nombre trouvé dans les exons^{2 et 8}. Ils sont souvent marqués par des modifications spécifiques des histones et la liaison aux facteurs de transcription, qui définissent leurs rôles régulateurs et déterminent leur activité spatio-temporelle à travers différents stades de développement et tissus^10,11.

ChIP-seq est utilisé pour identifier les sites de liaison des facteurs de transcription (TFBS) et les marques de modification des histones, telles que le poinçon des amplificateurs, H3K4me1, les marques d’activateur, H3K27ac et les marques H3K4me3, qui sont enrichies dans les régions promotrices 1,12,13,14,15. Les techniques de capture de la conformation de la chromatine (3C) et leurs dérivés, tels que 4C, 5C, Hi-C et-PET, sont utilisés pour cartographier les interactions physiques entre les régions génomiques distantes. Alors que 3C cible des interactions spécifiques dans des tissus spécifiques, Hi-C offre une architecture à l’échelle du génome à travers les types de cellules^16,17.

En plus des méthodes actuelles, des approches spécialisées ont été développées pour caractériser les amplificateurs, y compris des bases de données d’amplificateurs regroupées, telles que EnhancerAtlas ou EnhancerFinder^18,19. Cependant, ces outils obligent souvent les chercheurs à intégrer plusieurs ensembles de données pour étudier plusieurs amplificateurs dans de nombreux tissus, ce qui peut être écrasant pour les biologistes sans expérience en bioinformatique et en exploration de données.

Nous décrivons ici un protocole convivial pour sélectionner des amplificateurs, entièrement basé sur les outils web existants. Cela permet aux chercheurs d’interroger un gène d’intérêt (GdI) et de récupérer les amplificateurs correspondants. Le protocole sélectionne les amplificateurs en fonction d’un ensemble spécifique de critères : modifications des histones, interactions chromatiniennes et spécificité tissulaire 1,12,13,14,15,16,17,20,21. Les amplificateurs présents dans les introns sont plus susceptibles de montrer une activité spécifique aux tissus par rapport aux amplificateurs intergéniques, qui sont positionnés dans les régions génomiques entre les gènes²². Pour assurer une couverture complète des amplificateurs actifs potentiels, nous avons défini la plage de recherche entre deux GdI voisins afin d’augmenter la probabilité de capturer des éléments régulateurs situés en dehors des corps de gènes. Nous avons utilisé un marqueur épigénétique spécifique à l’amplificateur, H3K4me1, et un marqueur d’amplification actif, H3K27ac, pour répertorier les candidats amplificateurs. Ces candidats ont ensuite été affinés sur la base de données Hi-C, en conservant les amplificateurs avec des interactions physiques avec le promoteur correspondant. Ce protocole est conçu pour guider les biologistes tout au long du processus d’identification des amplificateurs à l’aide d’outils Web accessibles au public. En intégrant des données d’interaction épigénétique et chromatinienne, l’approche décrite ici offre un cadre pratique pour générer des hypothèses sur les amplificateurs potentiels en vue d’une validation expérimentale ultérieure.

REMARQUE : Une procédure pas à pas est disponible à l’adresse https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow. Les données utilisées dans le protocole sont résumées dans les tableaux 1 et 2. Le dépannage est disponible dans le fichier supplémentaire 1.

1. Localisation du GdI (Figure 1)

1. Ouvrez le navigateur génomique EnsEMBL (https://www.EnsEMBL.org).
2. Choisissez l’assemblage du génome approprié correspondant à l’espèce et à la version.
3. Saisissez GoI dans le champ de recherche et cliquez sur Go.
4. Sélectionnez le lien vers l’ID de gène EnsEMBL approprié.
5. Cliquez sur le lien vers la visionneuse de l’onglet Région dans les détails , située sous la section de résumé, pour naviguer dans la région entourant le GdI.

2. Définition de la région de détection de l’amplificateur (Figure 2)

1. Identifiez les deux gènes voisins du GdI pour définir la région de détection. Utilisez la piste Gene Legend pour rechercher ces gènes, qui sont annotés en tant qu’éléments visuels liés à la fusion d’EnsEMBL/Havana dans la piste Basic Gene Annotations from GENCODE . Déterminez la directionnalité du GdI à l’aide des signes < et > sur le nom de gène approprié dans la piste GENCODE.
2. Cliquez et faites glisser pour sélectionner la région intergénique entre ces gènes, puis cliquez sur Aller à la région dans la fenêtre contextuelle pour visualiser la zone sélectionnée. Redéfinissez la région d’intérêt à tout moment en répétant cette étape.
3. (FACULTATIF) Personnalisez l’affichage en sélectionnant Ajouter/supprimer des pistes en haut du visualiseur de pistes. Modulez le niveau de zoom à l’aide des commandes de zoom/navigation situées au-dessus du visualiseur de pistes.

3. Analyse des marques d’histostones (Figure 3)

1. Dans la barre latérale de la visionneuse de l’onglet Région dans les détails , sélectionnez Configurer cette page.
2. Dans la barre latérale de l’affichage de l’onglet Configurer l’image de la région , sous la liste déroulante Régulation , sélectionnez Activité par cellule/tissu.
3. Utilisez la barre de recherche Cellules/Tissus pour rechercher et sélectionner les tissus d’intérêt. Vous pouvez également utiliser la barre de navigation alphabétique sous la barre de recherche pour trouver les tissus d’intérêt.
4. Sélectionnez l’onglet Expériences , à côté de Cellule/Tissu.
5. Sélectionnez H3K4me1 et H3K27ac comme marqueurs d’amplificateurs, et H3K4me3 comme marqueur de promoteurs.
6. Sélectionnez Configurer l’affichage des pistes.
7. Sélectionnez Afficher les traces pour visualiser les régions marquées H3K4me1 dans la région de détection de l’amplificateur et les régions marquées H3K4me3 en amont du GdI.
8. Pour les candidats amplificateurs, récupérez les coordonnées des régions génomiques marquées par H3K4me1 dans les régions de détection définies en cliquant sur les éléments visuels/encadrés colorés dans les pistes H3K4me1 nouvellement ajoutées. Cela révèle la fenêtre contextuelle « Hists & Pols », qui contient des informations sur l’emplacement génomique de l’élément dans la paire de bases (bp).
   1. Récupérez les candidats à l’amélioration active en choisissant les régions H3K4me1 où les éléments visuels/de boîte colorés de H3K4me1 et H3K27ac se chevauchent. La granularité du niveau de zoom peut affecter le nombre de candidats amplificateurs affichés dans cette piste.
   2. Vous pouvez également définir manuellement les régions d’intérêt pour chaque caractéristique génomique en cliquant et en faisant glisser la piste pour encapsuler les pics du graphique sous la piste H3K4me1/H3K27ac. Copiez les coordonnées de l’emplacement génomique dans un fichier texte et enregistrez-les au format .bed .
9. De même, pour les régions promotrices, répliquez l’étape 3.8 en utilisant la piste H3K4me3, en vous concentrant sur la région en amont du GdI.

4. Analyse de capture de la conformation de la chromatine (Hi-C) (Figure 4)

1. Accédez au portail de données 4DN (https://data.4dnucleome.org/). Dans le graphique à barres empilées principal de la page d’accueil de 4DN (Figure 5), assurez-vous que l’option Ensembles d’expériences est sélectionnée comme axe Y, que le type d’expérience est sélectionné comme axe des X et que le graphique est regroupé par organisme.
2. Le long de l’axe X de la carte à barres principale, trouvez la barre Hi-C in situ. Cliquez sur la partie de la barre qui est regroupée pour les ensembles d’expériences humaines, puis cliquez sur le bouton Parcourir dans la fenêtre contextuelle. Filtrez les ensembles de données pertinents à l’aide du panneau latéral gauche.
3. Cliquez sur le lien dans la colonne Titre de l’échantillon biologique pertinent pour le tissu d’intérêt.
4. Cliquez sur Explorer les données dans l’onglet Fichiers traités pour explorer plus en détail l’ensemble de données Hi-C.
5. Entrez les coordonnées du promoteur identifié dans le tissu d’intérêt (à partir de l’étape 3.9) et marquez la région horizontalement en cliquant avec le bouton droit de la souris sur la carte thermique (Figure 4). Les lignes ajoutées garantissent que la région du promoteur est suivie visuellement sur la carte thermique. Pour supprimer les lignes accidentelles, cliquez avec le bouton droit de la souris sur la ligne et sélectionnez Règle horizontale/verticale et Fermer la série.
6. Entrez les coordonnées de tous les amplificateurs de contrôle validés expérimentalement²³ pour calculer le seuil d’interaction en fonction de leur minimum. Il a déjà été confirmé que ces amplificateurs de contrôle interagissent avec la région promotrice, servant de points de référence pour définir l’interaction significative minimale.
7. Définissez le seuil promoteur-amplificateur, à l’aide des amplificateurs de contrôle, en fonction du score d’interaction non nul le plus bas selon la clé de couleur sur le côté droit de la matrice.
8. Entrez les coordonnées génomiques de toutes les régions associées à H3K4me1 (à partir de l’étape 3.8) et marquez verticalement sur la carte thermique Hi-C. Cela permet d’obtenir un modèle de vérification croisée, où l’intersection entre les amplificateurs marqués H3K4me1 (verticales) et la région promotrice (horizontale) peut être examinée pour des interactions significatives.
   1. Ensuite, filtrez les régions qui interagissent faiblement en comparant les scores d’interaction des régions marquées H3K4me3 avec le seuil d’interaction (étape 4.6).
   2. Sélectionnez les coordonnées génomiques qui présentent des fréquences d’interaction supérieures au seuil défini dans la carte thermique du portail 4DN. Ces régions apparaissent sous forme de signaux plus concentrés (plus sombres) dans la carte thermique, sauf au format BED.

Pour illustrer l’utilisation du protocole présenté, nous avons étudié le gène TBX5 dans le cœur humain, en explorant les amplificateurs associés à TBX5 à l’aide du flux de travail complet impliquant des données H3K4me1, H3K27ac et Hi-C. TBX5 est un gène qui contribue au développement des membres et du cœur, y compris la formation des quatre chambres et la séparation du septum24. La mutation de ce gène est l’une des principales causes du syndrome de Holt-Oram (HOS), qui provoque des anomalies des membres et des cardiopathies congénitales (CHD), y compris des anomalies du septum24. La mutation des amplificateurs cardiaques associés à TBX5 peut influencer de manière critique la CHD24. Une étude antérieure a découvert trois amplificateurs TBX5 connus dans des tissus spécifiques au cœur humain - à savoir « Enhancer 2 », « Enhancer 9 » et « Enhancer 16 » (Fichier supplémentaire 2), dont il a été démontré qu’ils avaient des phénotypes comparatifs chez les souris transgéniques23.

Nous avons étudié les régions enrichies en H3K4me1 et H3K27ac entre RBM19 et TBX3, qui sont deux gènes flanquants en aval et en amont de TBX5 chez l’homme, afin de récupérer des amplificateurs présumés au locus TBX5 (Figure 1 et Figure 2). Pour identifier les amplificateurs spécifiques du cœur, les cellules du muscle cardiaque ont été choisies. Les régions présumées de l’amplificateur cardiaque TBX5 ont été récupérées sous forme de coordonnées (chr12 : début-fin), et 22 régions associées à H3K4me1 et H3K27ac ont été identifiées (figure 3 et fichier supplémentaire 3). Des amplificateurs cardiaques TBX5 présumés ont été extraits de la base de données génomique EnsEMBL pour croiser les données Hi-C contenues dans la base de données 4DNucleome (Figure 4). Cela a été fait pour évaluer les interactions possibles entre les amplificateurs potentiels et le promoteur cardiaque TBX5 . Selon le protocole décrit ici, il a été confirmé que 21 des 22 régions génomiques interagissent avec le promoteur TBX5 (chr12 : 114400143-114410103) dans les cellules du muscle cardiaque (Fichier supplémentaire 4). Il y avait une région qui n’avait pas d’interaction physique avec le promoteur (Figure 4, étape 4.8). Enfin, nous avons comparé ce protocole avec ces amplificateurs validés biologiquement et la base de données actuelle de référence des amplificateurs cardiaques, VISTA Cardiac Enhancers Browser, et avons révélé d’autres amplificateurs non actuellement capturés par la base de données25.

Nous avons effectué une comparaison croisée des 21 amplificateurs TBX5 récupérés par le protocole présenté ici avec les bases de données existantes. Nous avons récupéré 4 amplificateurs TBX5 du navigateur VISTA Cardiac Enhancer (fichier supplémentaire 5)25. Sur les 4 amplificateurs cardiaques identifiés par VISTA, 3 amplificateurs, hs2329, mm1282 et m370, chevauchaient les régions identifiées par ce protocole de détection d’amplificateurs en ligne (Figure 5). Chacun des amplificateurs prédits partageait également les régions génomiques avec les amplificateurs précédemment validés expérimentalement de Smemo et al.23, Enhancer 2 (chr12:114025907-114026275, GRCh38) et Enhancer 16 (chr12:114415466-114420433, GRCh38), alors qu’ils n’ont pas montré de chevauchement avec Enhancer 9 (chr12:114263402-114266886, GRCh38). L’un des amplificateurs identifiés par VISTA, hs498 , n’a pas chevauché les amplificateurs prédits par ce protocole ou les amplificateurs validés expérimentalement par Smemo et al.23 (Figure 5), même si la région a montré un chevauchement partiel avec les marques H34Kme1 (Figure 5). De même, Enhancer 9 n’a pas chevauché les amplificateurs prédits par ce pipeline, mais a été associé à des marques H3K4me1 (figure 5).

Figure 1 : Guide étape par étape pour localiser le GdI dans le navigateur génomique EnsEMBL. L’utilisateur ouvre d’abord la page d’accueil d’EnsEMBL (1.1), sélectionne l’espèce (humaine) et saisit le gène dans la barre de recherche (1.2-1.3). Dans la liste des résultats, l’ID de gène approprié est sélectionné (1.4), ce qui ouvre la page de résumé du gène. L’utilisateur clique ensuite sur le lien hypertexte Région en détail (1.5) pour visualiser la région génomique entourant le GdI, y compris les éléments voisins et les caractéristiques régulatrices. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Définition de la région de détection de l’amplificateur autour du GdI à l’aide du navigateur génomique EnsEMBL. Pour définir la région de détection de l’amplificateur, identifiez les deux gènes voisins flanquant le GdI à l’aide des annotations génétiques de base de la piste GENCODE, où les gènes sont représentés par des blocs jaune foncé étiquetés avec des annotations EnsEMBL/Havana fusionnées. La direction transcriptionnelle de chaque gène est indiquée par des pointes de flèche (< ou >) à côté du nom du gène (2.1). Pour sélectionner la région intergénique entre les gènes voisins, cliquez et faites glisser sur la région d’intérêt, puis choisissez Aller à la région dans la fenêtre contextuelle pour zoomer (2.2). Pour ajouter des annotations réglementaires ou liées à l’amplificateur, cliquez sur Ajouter/supprimer des pistes (2.3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Configuration des pistes de modification des histones dans la région de détection de l’amplificateur à l’aide du navigateur génomique EnsEMBL. Dans la barre d’outils de gauche, cliquez sur Configurer cette page (3.1) pour accéder au panneau de configuration de la piste et accédez à « Activité par cellule/tissu » dans la section Régulation (3.2). Dans l’onglet ouvert, sélectionnez la section « Expériences » (3.3) et utilisez la barre de recherche Cellules/Tissus pour localiser et sélectionner le tissu qui vous intéresse (cellule du muscle cardiaque) (3.4). Dans le panneau des marques d’histones (3.5), activez H3K4me1 et H3K27ac en tant que marques d’amplification actives et H3K4me3 en tant que marque de promoteur, puis cliquez sur « Configurer l’affichage des pistes » (3.6). Après avoir confirmé les sélections de pistes, cliquez sur « Afficher les pistes » (3.7) pour revenir à la visionneuse de génome. Les pics de marques d’histones sont maintenant représentés dans la région de détection (3.8) sous forme de blocs colorés sous l’étiquette tissulaire correspondante (jaune : H3K4me1, bleu : H3K27ac et orange : H3K4me3). Fenêtre contextuelle « Hists & Pols » contenant les coordonnées génomiques de la région par paires de bases (chr :start-end), qui peuvent être copiées et enregistrées pour une analyse en aval. Une pop-up « Hists & Pols » apparaît après avoir cliqué sur les éléments colorés du morceau. La fenêtre contextuelle contient les coordonnées génomiques de la région par paires de bases (par exemple, chr12:11443450-114451611 pour la région promotrice), qui peuvent être copiées et enregistrées pour l’analyse en aval (3.8). De même, pour extraire des amplificateurs candidats, privilégiez les régions où les pics H3K4me1 et H3K27ac se chevauchent, comme le montre l’alignement vertical des pics et des boîtes sur les pistes (3.9). Les régions qui se chevauchent peuvent être sélectionnées directement en cliquant sur leurs cases ou en cliquant-glissant manuellement sur les pics alignés pour définir une région (par exemple, chr12:114400143-114410103 pour une région candidate active). Les coordonnées affichées dans la fenêtre contextuelle doivent être enregistrées au format BED pour une validation ou une visualisation en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Visualisation des interactions promoteur-amplificateur de la chromatine à l’aide de cartes thermiques Hi-C du portail de données sur les nucléomes 4D. La page d’accueil du portail de données 4D Nucleome affiche un graphique à barres empilées résumant les types d’expériences disponibles par organisme. L’ensemble de données « in situ Hi-C » pour les échantillons humains est sélectionné en cliquant sur la section correspondante de la barre (4.1). Une liste filtrée d’ensembles de données pertinents s’affiche. un ensemble de données Hi-C dérivé de cellules H9 différenciées en myoblastes cardiaques est sélectionné (4.2). L’ensemble de données sélectionné (4.3) s’ouvre dans le navigateur HiGlass via le bouton Explorer les données (4.4). La région génomique d’intérêt est saisie dans la boîte de coordonnées (4.5), et la matrice de contact est rendue sous la forme d’une carte thermique à l’échelle des couleurs. Les couleurs plus foncées (rouge foncé à noir) indiquent une fréquence de contact de chromatine plus forte, tandis que les couleurs plus claires (blanc à orange) représentent des interactions plus faibles. Une règle horizontale est placée à la coordonnée du promoteur, et des règles verticales sont tracées aux positions de trois amplificateurs de contrôle validés expérimentalement (4.6). Ces intersections sont utilisées pour définir un seuil d’interaction strict, défini par le signal visible le plus fort (couleur la plus foncée) parmi les contacts promoteur-amplificateur (4.7). Des règles verticales supplémentaires sont tracées aux emplacements des amplificateurs candidats marqués H3K27ac et H3K4me1 (à partir de l’étape 3.8). Les candidats dont les intersections promoteur-amplificateur sont égales ou plus foncées que le seuil sont retenus, tandis que ceux dont les signaux sont plus faibles (carrés de couleur plus claire) sont exclus (4.8). Les coordonnées conservées sont extraites manuellement et enregistrées au format BED pour les analyses en aval. (a. Enhancer 2, b. Enhancer 9 et c. Enhancer 16) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Vue génomique du navigateur des amplificateurs TBX5 prédits par rapport aux amplificateurs cardiaques et aux amplificateurs de contrôle validés par VISTA. Les instantanés du navigateur génomique affichent la plage de recherche de l’amplificateur (ÉTAPE 2), comparant les amplificateurs prédits récupérés par le protocole Web (en bas) avec les amplificateurs validés par VISTA (en haut) et les amplificateurs de contrôle validés expérimentalement (au centre). Le panneau principal montre le locus génomique complet avec des éléments régulateurs annotés, y compris les pics H3K4me1 (jaune), H3K27ac (bleu) et H3K4me3 spécifiques aux cellules du muscle cardiaque (orange). Trois figures zoomées capturent l’alignement entre les éléments récupérés par le protocole, VISTA et les amplificateurs de contrôle. Le chevauchement avec les amplificateurs de contrôle est encadré par des cases rouges. Les coordonnées de chaque sous-région sont affichées dans les panneaux inférieurs du navigateur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Données utilisées dans l’étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Outils Web utilisés dans l’étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Fichier supplémentaire 1 : Instructions de dépannage pour EnsEMBL Genome Browser. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 2 : Un fichier BED au format GRCh38, les amplificateurs de contrôle cardiaque TBX5 validés expérimentalement 23. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Un fichier BED au format GRCh38, activateurs cardiaques TBX5 récupérés par STEP3 auprès d’EnsEMBL. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 4 : Un fichier BED au format GRCh38, des amplificateurs cardiaques TBX5 récupérés par STEP4 auprès d’EnsEMBL. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 5 : Un fichier BED au format GRCh38, activateurs cardiaques TBX5 récupérés du navigateur d’amplificateurs cardiaques VISTA25. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les auteurs ne signalent aucun intérêt concurrent.