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Évaluation des traits structurels chez Triticum aestivum et Zea mays pour la différenciation photosynthétique en C3 et C4 à l’aide de sections à main levée et semi-minces

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DOI :

10.3791/66843

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12 juillet 2024

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1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

Dans cet article

Résumé

L’évaluation des différences anatomiques entre les sections transversales des feuilles C3 et C4 permet de comprendre l’efficacité de la photosynthèse. Cet article décrit la préparation et l’examen des coupes transversales de feuilles à main levée et semi-minces, ainsi que les mises en garde concernant la préparation pour les espèces cultivées Triticum aestivum et Zea mays.

Résumé

L’efficacité accrue de la photosynthèse enC4 , par rapport au mécanisme enC3 , provient de sa capacité à concentrer le CO2 dans les cellules de gaine des faisceaux. L’efficacité de la photosynthèse en C4 et l’efficacité intrinsèque de l’utilisation de l’eau sont directement liées à la part des cellules du mésophylle et des feuilles des faisceaux, à la taille et à la densité des gaines des faisceaux, ainsi qu’à la taille, à la densité et à l’épaisseur de la paroi cellulaire des cellules des gaines des faisceaux. L’analyse microscopique rapide de ces traits peut être effectuée à main levée et sur des coupes semi-minces à l’aide de la microscopie optique conventionnelle, fournissant des informations précieuses sur l’efficacité photosynthétique dans les culturesC4 grâce à l’identification et à l’examen de types de cellules spécifiques. De plus, les erreurs dans la préparation à main levée et en coupe semi-mince qui affectent les mesures anatomiques et les diagnostics de type cellulaire sont présentées, ainsi que la façon d’éviter ces erreurs. Cette approche microscopique offre un moyen efficace de recueillir des informations sur l’acclimatation photosynthétique aux variations environnementales et aide à la sélection rapide des cultures pour les climats futurs.

Introduction

La photosynthèse est un processus fondamental où l’énergie lumineuse est convertie en énergie chimique, servant de pierre angulaire aux réseaux trophiques terrestres. La majorité des plantes suivent la voieC3 de la photosynthèse, où le principal produit photosynthétique est le glycérate 3-phosphate, un composé à trois atomes de carbone. La photosynthèse en C3 a évolué il y a plus de 2 milliards d’années dans l’atmosphère, abondante enCO2 et pauvre en O2,1. L’enzyme photosynthétique clé ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase/oxygénase (Rubisco), qui a évolué dans ces conditions, est sous-optimale pour les conditions actuelles de faible teneur en CO2 et de haute teneur en O2, car elle réagit de manière compétitive avec O2, initiant la photorespiration2. La photorespiration est une voie de gaspillage qui consomme de l’énergie au lieu de la produire et de libérer duCO2 comme sous-produit. Par conséquent, il est crucial de maintenir une concentration élevée de CO2 autour de la rubisco dans les chloroplastes pour éviter l’oxygénation 3,4. En raison de l’incapacitédes plantes C3 à concentrer le CO2, il y a une réduction importante duCO2 de l’air ambiant vers les chloroplastes, ce qui freine la photosynthèse et affecte la croissance des plantes et la production de biomasse 2,5,6.

Chez les plantesC3, la photosynthèse est limitée par l’entrée du CO2 à travers les stomates, sa diffusion à travers le mésophylle et l’activité biochimique des enzymes photosynthétiques. L’entrée du CO2 est d’abord limitée par la conductance stomatique, qui est contrôlée par les conditions environnementales telles que la température et l’humidité de l’air. Ensuite, le CO2 se diffuse à travers la phase gazeuse et liquide interne de la feuille jusqu’à la Rubisco7. Chez les plantesC3, toutes les étapes de la photosynthèse se produisent dans les chloroplastes des cellules du mésophylle, et les plantes doivent maintenir un afflux constant de CO2 de l’atmosphère dans les chloroplastes. La dépendance de la disponibilité du CO2 dans les chloroplastes sur l’ouverture des stomates, l’architecture du mésophylle et les caractéristiques individuelles des cellules et des chloroplastes rend les plantes vulnérables aux contraintes environnementales qui finissent par affecter la photosynthèse, comme la faible disponibilité de l’eau et les températures élevées 7,8,9,10, mettant particulièrement en évidence leur vulnérabilité aux conditions du changement climatique11.

Compte tenu des défis posés par les inefficacités de la voieC3, ainsi que par les limites du maintien de niveaux optimaux de CO2 et de la sensibilité aux facteurs environnementaux, chez certaines plantes, une autre voie, la voie de photosynthèseC4, a évolué. De manière caractéristique, les plantes C4 ont deux voies biochimiques séparées dans l’espace ; la fixation initiale du CO2 se produit dans les cellules du mésophylle par la phosphoénolpyruvate carboxylase, qui a une affinité plus élevée pour le CO2 que le rubisco et manque également d’activité d’oxygénation. Le produitC4 formé est ensuite transporté vers les cellules de gaine du faisceau, où il est décarboxylé, et le CO2 est à nouveau libéré et fixé par la rubisco (photosynthèse en C3)12,13,14. La plus grande affinité de la PEP carboxylase pour le CO2 et les parois cellulaires épaisses des cellules de la gaine du faisceau permet la concentration du CO2 dans les cellules de la gaine du faisceau, et ainsi, les plantes C4 minimisent la photorespiration en séparant spatialement la fixation du CO2 et le cycle de Calvin. L’adoption de la trajectoire C4 met en évidence la réponse adaptative de la nature aux contraintes environnementales, offrant un aperçu des stratégies potentielles pour améliorer la productivité et la résilience des cultures dans des conditions climatiques changeantes15.

L’anatomie spécialisée de la structure foliaire chez les plantes C4 est caractérisée par des nervures entourées de cellules de gaine vasculaire élargies contenant des chloroplastes et avec une disposition radiale des cellules du mésophylle dans un anneau externe formant un motif autour des cellules de la gaine de faisceau. Les cellules du mésophylle sont à proximité des cellules de la gaine du faisceau, ce qui permet un transport rapide et continu des métabolites entre les deux types de cellules. L’arrangement de cette cellule est typique des plantes C4 et est appelé anatomie de Kranz16. Chez les espèces C3, la spécialisation et la disposition des cellules du mésophylle peuvent varier, mais les cellules de la gaine du faisceau sont nettement plus petites et ont peu de chloroplastes ou pas de chloroplastes du tout. L’anatomie spécifique de Kranz permet de concentrer le CO2 dans les chloroplastes dans les cellules de la gaine du faisceau où se trouve l’enzyme C-3-carboxylante Rubisco, entravant efficacement la photorespiration 4,17,18. Malgré son arrangement apparemment complexe, ces changements se sont produits indépendamment à plusieurs reprises dans l’évolution des angiospermes, indiquant qu’il s’agit d’une voie évolutive relativement réalisable 19,20,21, et que divers taxons se trouvent à un stade intermédiaire entre le métabolisme du carbone C3 et C4, appelé C3-C 4 ou C2, avoir des capacités de concentration et de réassimilation du CO2 22,23,24,25.

De nombreuses plantesC4 sont des cultures d’une grande importance économique, et la modification génétique des culturesC3, comme le riz, pour améliorer leur résilience climatique et garantir le rendement a été un sujet d’intérêt au cours des dernières décennies26,27. Cependant, les efforts d’ingénierie nécessitent une compréhension détaillée de l’anatomie spécialisée duC4 et de la façon dont il contrôle la photosynthèse 2,28.

L’établissement de l’anatomie C4 Kranz est une condition préalable à la réalisation de l’objectif ambitieux d’ingénierie de la photosynthèse C4 dans les cultures C3 25. Cependant, la compréhension actuelle de la régulation de l’anatomie de Kranz et les méthodes permettant de dépister rapidement ses principaux traits anatomiques sont limitées, ce qui rend difficile l’identification des espèces hybrides. Des études antérieures ont montré que les caractéristiques clés régulant l’efficacité photosynthétique chez les plantesC3 etC4 comprennent la distance internervaire, le diamètre du complexe de gaine du faisceau et la taille des cellules de la gaine du faisceau14,29. Ces caractéristiques peuvent être facilement criblées à l’aide de coupes à main levée et analysées quantitativement à l’aide de sections semi-minces. Ici, nous décrivons la méthode d’évaluation des traits qui permettent le diagnostic de différenciation anatomiqueC3 etC4 par microscopie croisée et optique à main levée, à savoir la surface de la gaine du faisceau, la distance internervaire et la fréquence des veines.

Protocole

1. Conditions de croissance des plantes

  1. Choisissez du blé (Triticum aestivum L. Var. Winter Wheat, « Fredis ») et du maïs (Zea mays L. Var. Saccharata, « Golden Bantam ») comme plantes représentatives C3 et C4 , respectivement. Cultivez les deux espèces de plantes dans une chambre de croissance contrôlée à partir de graines.
  2. Maintenir l’humidité relative à 55 % avec la température de l’air à 25 °C/18 °C (jour/nuit) avec une période de lumière de 12 h. Maintenir la densité de flux de photons photosynthétiques (Q) à la surface de la plante à 1200 μmol/m2/s pour représenter ses conditions de croissance naturelles. Cultivez toutes les plantes à une concentration ambiante de CO2 de 400 μmol/mol.
  3. Arrosez les plantes tous les 2ème jours avec de l’eau distillée et fertilisez avec la solution de Hoagland 10 jours après la levée des plantules. Cultivez les plantes dans les conditions données pendant 60 jours et utilisez des feuilles complètement déployées pour des analyses microscopiques.

2. Préparation et visualisation des sections à main levée

  1. Sélectionnez 3 feuilles matures non sénescentes de chaque plante et conservez-les dans de l’eau distillée. À l’aide d’une nouvelle lame de rasoir unilatérale, effectuez une coupe de nivellement pour former un angle droit avec la surface de la feuille afin de vous assurer que les sections sont des sections transversales perpendiculaires à la surface de la feuille.
  2. Placez l’échantillon de feuille sur une plaque de verre sur un morceau de cire dentaire pour stabiliser l’échantillon et éviter de glisser. Coupez en déplaçant la lame vers le bas sur l’échantillon de feuille pour couper proprement à travers les cellules. Conservez les sections transversales dans de l’eau distillée.
  3. Montez les échantillons sur une lame de verre en les plaçant sur une gouttelette d’eau et en les recouvrant d’une lamelle en verre pour la visualisation et l’imagerie microscopiques. Évitez de piéger les bulles d’air.
  4. Visualisez la lame sous un microscope optique composé à un grossissement de 10x et 20x. Enregistrez les images conformément au guide du logiciel, ainsi que l’échelle appropriée.

3. Préparation des sections semi-minces

  1. Couper des sections d’environ 3 mm x 5 mm dans les zones intercostales le long de la nervure médiane des feuilles de Z. mays et de T. aestivum sur une plaque de verre, comme à l’étape 2.2. Assurez-vous que la longueur de la section coupée longe le grain de la feuille.
  2. Placez la matière végétale dans une seringue avec 1 mL de tampon de fixation (4 % d’aldéhyde glutarique dans un tampon phosphate 0,1 M, pH = 6,9, tableau 1).
  3. Tenez la seringue verticalement, évacuez l’air et, en tenant un doigt sur l’extrémité, pompez la seringue pour créer un vide. Répétez l’opération jusqu’à ce que les échantillons se trouvent au fond de la seringue, ce qui indique une infiltration réussie.
  4. Transférez le contenu de la seringue dans un flacon en verre étiqueté et conservez-le à 4 °C pendant 48 h avant de passer à l’étape suivante (tableau 2).
  5. Pour chaque flacon, retirez délicatement le fixateur à l’aide d’une pipette et ajoutez le tampon phosphate jusqu’à ce que l’échantillon soit couvert. Laisser agir 30 min. Répétez cette étape 3 fois.
  6. Retirer le tampon phosphate à l’aide d’une pipette et ajouter le tétroxyde d’osmium (ATTENTION) jusqu’à ce que l’échantillon soit couvert. Les échantillons et autres matières organiques deviendront noirs. Utilisez des gants doubles. Laisser reposer 1 h.
  7. Prélever la solution précédente à l’aide d’une pipette et recouvrir les échantillons d’eau distillée. Laisser agir 30 min Répétez cette étape 3 fois et utilisez des gants doubles.
  8. Prélever la solution précédente à l’aide d’une pipette et recouvrir les échantillons avec la solution d’eau distillée 50/50 et d’éthanol. Laisser agir 30 min. Répétez cette étape avec des solutions d’eau distillée et d’éthanol des séries suivantes : 30/70, 20/80, 10/90 et 2x à 100 % d’éthanol. Les échantillons dans l’une de ces solutions peuvent être laissés toute la nuit à 4 °C.
  9. Prélever la solution précédente à l’aide d’une pipette et recouvrir les échantillons d’une solution 1/3 de résine et d’éthanol. Placez les échantillons sur une plaque mélangeur et laissez reposer 2 h. Répétez cette étape avec des solutions résine-éthanol des séries suivantes : 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 et 2x à 100 % de résine. Les échantillons dans l’une de ces solutions peuvent être laissés toute la nuit à 4 °C.
  10. Couvrez les cavités d’un moule d’enrobage plat (16 cavités, dimensions de la cavité : 14 L x 4,8 L x 3 P (mm)) avec 100 % de résine et placez les échantillons à une extrémité de la cavité. Préparez des étiquettes en papier écrites au crayon pour chaque échantillon et placez-les à l’autre extrémité de la cavité.
  11. Remplissez complètement toutes les cavités avec 100% de résine et redressez les échantillons et les étiquettes s’ils ont bougé. Couvrez le moule avec un film d’enrobage et polymérisez dans un four conformément aux directives du produit en résine acrylique.
  12. Placez le bloc polymérisé avec l’échantillon dans le porte-échantillon de l’ultramicrotome. Coupez le bloc à l’aide d’un couteau en verre rugueux jusqu’à ce que le tissu devienne visible et que l’excès de résine soit éliminé.
  13. Découpez des sections semi-fines transversalement (1 μm) à l’aide d’un couteau en verre ou en diamant. Prélevez les sections à l’aide d’une boucle d’inoculation métallique à la surface de l’eau et placez-les sur une lame de verre. Faites sécher la lame sur une plaque chauffante (60 °C) pour fixer les sections sur le verre.
  14. Colorer les parties fixées avec du bleu de toluidine (solution aqueuse à 1 %) pendant 5 s avant de rincer à l’eau distillée et de sécher à nouveau sur la plaque chauffante.
    REMARQUE : Assurez-vous que le processus de fixation chimique est effectué sous une hotte. Les couteaux en verre doivent être remplacés périodiquement pour assurer des coupes nettes qui permettent des sections sans déchirures ni distorsions.

4. Imagerie des échantillons

  1. Imagerie de coupes de feuilles fraîches
    1. Installez le microscope optique composé avec le logiciel fourni conformément au manuel.
    2. Placez la diapositive en verre sur la scène. Ajustez l’oculaire et visualisez la section à 10x pour obtenir une vue d’ensemble, puis aux objectifs 20x et 40x.
    3. À chaque objectif, naviguez dans le canal en direct, concentrez-vous sur la zone d’intérêt et localisez les cellules de la gaine du faisceau autour de la veine.
    4. Une fois le focus effectué, cliquez sur le bouton Geler et ajoutez l’échelle en appuyant sur le bouton Barre d’échelle dans l’onglet Outils. Enregistrez l’image au format . Format TIF pour l’analyse d’images.
  2. Imagerie de lames infiltrées de résine
    1. Configurez le microscope optique automatisé en liaison avec le logiciel fourni sur l’ordinateur.
    2. Chargez le canal transparent et placez la lame sur la platine du microscope. Faites la mise au point sur la section à l’aide d’un grossissement d’objectif de 40x et ajustez la luminosité pour vous assurer que toutes les structures cellulaires sont visibles.
    3. Définissez la zone d’emplacement de la section à l’aide de la fonction de navigation pour vous assurer que toute la section est imagée , puis cliquez sur le bouton Assembler.
    4. Cliquez sur Terminé , puis sur Démarrer pour permettre au microscope d’imager toute la coupe. Ouvrez le logiciel d’analyse d’images et ouvrez les tuiles prises au microscope.
    5. À l’aide de la fonction Aligner, assurez-vous que les tuiles ne se chevauchent pas. Après avoir généré l’image, ajustez le positionnement, la luminosité et la rotation à l’aide de l’onglet Ajuster.
    6. Imprimez l’échelle sur l’image avant de l’enregistrer dans . TIF.
  3. Mesures anatomiques à l’aide du logiciel ImageJ
    1. Ouvrez le logiciel ImageJ et chargez l’image en la faisant glisser dans la fenêtre.
    2. À l’aide de l’outil Ligne, calibrez l’échelle comme suit : tracez une ligne sur la barre d’échelle, choisissez Analyser > Définir l’échelle, remplacez la distance connue par la longueur de la barre d’échelle et remplacez l’unité de longueur par l’unité correcte.
    3. Mesurez la caractéristique potentielle en sélectionnant l’outil Ligne, en traçant une ligne à travers la zone d’intérêt et en appuyant sur la touche M .
    4. Pour les mesures de surface, sélectionnez l’outil de sélection de polygones et dessinez autour du tissu d’intérêt. Terminez en appuyant sur la touche M . Les mesures s’affichent sous la forme d’une fenêtre contextuelle, qui peut être copiée dans une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie des données.

Résultats

La figure 1A montre l’orientation correcte de la coupe de la feuille pour la coupe fraîche et la microscopie optique. La méthode de coupe de sections fraîches à l’aide d’un rasoir unilatéral et d’une feuille de cire dentaire est illustrée à la figure 1B. Les sections résultantes sont illustrées à la figure 1C.

La figure 2 montre des coupes à main levée de feuilles représentatives de la plante C3 T. aestivum et de la plante C4 Z. mays. Les cellules de la gaine du faisceau sont visibles autour de la veine, le maïs ayant des cellules plus rondes et plus vertes, indiquant une présence plus élevée de chloroplastes. Il est possible d’obtenir l’épaisseur des feuilles et la surface totale de la gaine du faisceau à partir de ces images ; Cependant, il n’est pas possible de caractériser davantage le mésophylle avec cette méthode.

La figure 3 montre des coupes transversales semi-minces de T. aestivum et de Z. mays. Avec cette méthode, tous les tissus de la feuille sont visibles et mesurables. L’anatomie de Kranz est évidente chez Z. mays, avec des cellules mésophylles disposées autour des veines. Les gaines des faisceaux sont élargies et remplies de chloroplastes, notamment concentrés vers les cellules du mésophylle. Cela permet un échange rapide de métabolites entre les cellules de la gaine du faisceau et les cellules du mésophylle. À partir de ces images, les caractéristiques structurelles suivantes des feuilles ont été mesurées : distance internervaire entre les petites et les grandes nervures, diamètre de la gaine du faisceau, surface totale de la gaine du faisceau, surface des veines, fraction de la surface des cellules de la gaine du faisceau, surface des cellules de la gaine du faisceau, fréquence des veines dans un rayon de 500 μm et épaisseur de la feuille. Les boîtes à moustaches de la figure 4 montrent la différence entre ces caractères entre T. aestivum et Z. mays. Tous les traits sauf un, la distance internervaire entre les grandes veines, sont significativement différents à un intervalle de confiance de 95 % avec une valeur p < 0,05.

La figure 4 montre une collection de boîtes à moustaches qui représentent les différences de traits anatomiques entre T. aestivum et Z. mays, illustrant les différences entre les structures de gaine des faisceaux C3 et C4 . Il existe une distinction significative entre les distances internervaires entre les espèces cultivées, le diamètre de la gaine du faisceau (dans les mêmes conditions de croissance), la fraction des cellules de la gaine du faisceau et du matériel non photosynthétique (c.-à-d. les veines) et la fréquence des nervures dans une section de 500 μm de largeur - ce qui est fortement indicatif de ce qui est attendu entre l’anatomie des feuilles en C3 et en C4 .

La figure 5 montre quelques exemples d’erreurs susceptibles de se produire lors de la découpe ou de la préparation des échantillons. L’anatomie des feuilles dans ces images est masquée ou déformée et n’est donc pas fiable pour la caractérisation. Une surcoloration au bleu de toluidine peut se produire dans des sections coupées avec l’ultramicrotome dans lesquelles la coloration est laissée trop longtemps, obscurcissant ainsi la structure cellulaire (Figure 5A,B). Des erreurs courantes peuvent se produire lors du protocole d’infiltration dans lequel la résine ne pénètre pas complètement dans les tissus foliaires (Figure 5C,D). Les sections transversales des feuilles qui sont coupées le long du grain produisent des cellules oblongues dans lesquelles les cellules du mésophylle et de la gaine du faisceau ne peuvent pas être localisées ni mesurées correctement (figures 5F, G et H).

Des analyses statistiques ont été effectuées dans R (version 4.3.1) pour créer des boîtes à moustaches. Les traits anatomiques des feuilles ont été mesurés en trois exemplaires (3 feuilles par plante, 3 plantes par espèce).

Configuration de chromatographie en coupe de feuille ; Extraction de pigments verts. Schéma des étapes de séparation des pigments.
Figure 1 : Méthode correcte pour couper des sections transversales de feuilles fraîches. (A) L’orientation des sections de feuilles afin d’obtenir une section transversale. (B) Technique de coupe des feuilles à l’aide d’une lame de rasoir unilatérale sur un morceau de cire dentaire plate. (C) Les coupes transversales résultantes se présentent sous la forme de minces lamelles de feuilles prêtes à être montées sur une lame de verre et observées au microscope. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Microscopie en coupe transversale de la structure des feuilles de la plante, échelles de 50 m et 100 m, détail du tissu vasculaire.
Figure 2 : Coupes à main levée de feuilles représentatives. (A) La plante C3 Triticum aestivum (grossissement de 400x) ; et (B) la planteC4 Zea mays à (grossissement de 200x). Le type de cellule est indiqué par des flèches, où V = veine, BSC = cellule de gaine de faisceau et MC = cellule du mésophylle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Schéma d’anatomie végétale montrant la coupe transversale du faisceau vasculaire avec des étiquettes pour les tissus et les structures.
Figure 3 : Coupes transversales semi-minces. (A) Zea mays et (B) Triticum aestivum pour montrer les différences dans les gaines des faisceaux et les positions des chloroplastes chez les espèces C4 avec anatomie de Kranz (A) et les espèces C3 sans anatomie de Kranz (B). Abréviations : Tl = épaisseur de la feuille, BS = gaine du faisceau, SV = petite veine, ID = distance internervaire et LV = grande nervure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Boîtes à moustaches comparant T. aestivum et Z. mays à l’aide du test T ; les métriques incluent SY-HD, LV-ID et VBA.
Figure 4 : Boîtes à moustaches montrant la différence des traits anatomiques entre Triticum aestivum et Zea mays. (A) distance internervaire entre les petites veines, (B) distance internervaire entre les grandes veines, (C) diamètre de la gaine du faisceau, (D) surface totale de la gaine du faisceau, (E) surface des veines, (F) fraction de la surface des cellules du faisceau, (G) surface des cellules du faisceau, (H) fréquence des veines dans un rayon de 500 μm et (I) de l’épaisseur de la feuille. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Images microscopiques de coupes transversales de tissus végétaux, mettant en évidence la structure cellulaire et l’anatomie.
Figure 5 : Exemples d’erreurs courantes qui peuvent se produire dans le traitement des tissus, indiquées par des flèches rouges. Surcoloration dans les échantillons noyés dans la résine acrylique blanche LR (A) Triticum aestivum et (B) Zea mays ; déchirures de la résine dans des sections incrustées dans la résine époxy de Spurr (C) Ceratozamia robusta et (D) Dioon mejiae ; Coupes à main levée de T. aestivum montrant (E) une section transversale et (F) une section longitudinale ; biais dans la coupe en raison de coupures obliques chez (G) Annona muricata et (H) Encephalartos villosus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

SolutionPréparationVolume final
Base pour tampon 1Dissoudre 7,12 g de Na2HPO4 . 2H2O dans 200 mL d’eau distillée200 ml
Base pour tampon 2Dissoudre 7,12 g de NaH2PO4 . 2H2O dans 200 ml d’eau distillée200 ml
Solution tampon de phosphateMélangez 36 mL de base 1, 14 mL de base 2 et 50 mL d’eau distillée100 ml
Solution fixatriceMélangez 9,25 mL de glutaraldéhyde à 5 % (attention : voir tableau des matériaux), 12,5 mL de tampon phosphate et 28,25 mL d’eau distillée. Conserver à 4 °C.50 ml

Tableau 1 : Recette de la solution fixatrice.

PasDescriptionDuréeRépéter
1Rinçage avec tamponRetirez délicatement le fixateur à l’aide d’une pipette et ajoutez le tampon phosphate jusqu’à ce que l’échantillon soit couvert. Laisser agir 30 min.Durée : 30 minutes3 fois
2Coloration au tétroxyde d’osmium à 1 %(Attention : voir le tableau des matériaux) : Retirez le tampon phosphate à l’aide d’une pipette et ajoutez le tétroxyde d’osmium jusqu’à ce que l’échantillon soit couvert. Les échantillons et autres matières organiques deviendront noirs. Utilisez des gants doubles.Durée : 60 minutes1
3Rinçage des échantillons à l’eau distilléePrélever la solution précédente à l’aide d’une pipette et recouvrir les échantillons d’eau distillée. Laisser agir 30 min. Répétez cette étape 3 fois. Utilisez des gants doubles.Durée : 30 minutes3 fois
4Infiltration série éthanolPrélever la solution précédente à l’aide d’une pipette et recouvrir les échantillons avec la solution d’eau distillée 50/50 et d’éthanol. Laisser agir 30 min. Répétez cette étape avec des solutions d’eau distillée et d’éthanol des séries suivantes : 30/70, 20/80, 10/90 et 100 % d’éthanol.Durée : 30 minutes1
5Infiltration série résine-éthanolPrélever la solution précédente à l’aide d’une pipette et recouvrir les échantillons d’une solution 1/3 de résine et d’éthanol. Placez les échantillons sur une plaque mélangeur et laissez reposer 2 h. Répétez cette étape avec des solutions résine-éthanol des séries suivantes : 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 et 100 % résine.Durée : 120 minutes1
6Conserver au réfrigérateur pendant 72 h avant la polymérisation
7Polymériser les sections de feuilles infiltrées selon les spécifications du produit pour obtenir des échantillons enrobés de résine.

Tableau 2 : Protocole d’infiltration de résine.

Discussion

Dans cet article, nous abordons à la fois les méthodes quantitatives et qualitatives de mesure de l’anatomie des feuilles et les moyens de les optimiser. De plus, la méthodologie est appliquée à des espèces cultivées représentatives afin de déterminer quels traits anatomiques sont les plus utiles pour distinguer les sections transversales en C3 et en C4 . La compréhension de ces caractéristiques est essentielle car les espèces hybrides, appelées photosynthèseC2 , deviennent une voie de recherche plus prometteuse. À l’heure actuelle, une seule espèce cultivée, Diplotaxis tenuifolia (roquette), a été identifiée comme utilisant la photosynthèse en C2 , mais il est probable qu’il y en ait plus que ce que les données actuelles indiquent25. Des niveaux élevés de diversité photosynthétique intraspécifique et de plasticité sont présents dans les lignéesC2 . Cela implique que la confirmation de l’apparition de la photosynthèse enC2 nécessite plusieurs éléments de preuve, tels que le point de compensation du CO2 , les analyses ultrastructurales et l’immunohistochimie30.

Les lames à main levée et semi-minces sont utilisées pour identifier et mesurer des tissus végétaux spécifiques depuis de nombreuses années, mais cet article vise à discuter du cas particulier d’utilisation des structures foliaires anatomiques qui affectent la différenciation photosynthétique entre les plantes cultivées en C3 et en C4 . Il y a des mises en garde à la fois à main levée et à la section semi-mince qui doivent être prises en compte. Les sections à main levée, bien que rapides à obtenir, sont susceptibles d’aboutir à des sections de feuilles d’épaisseurs inégales, ce qui entrave les analyses quantitatives. Cela peut être évité en utilisant un équipement spécialisé pour la coupe de matériel végétal frais (par exemple, vibratome ou cryostat). Les sections plus épaisses de la section à la main peuvent entraîner plusieurs couches de cellules les unes sur les autres, brouillant les cellules et, par conséquent, l’anatomie. Si le but de la coupe est purement qualitatif, les coupes à main levée offrent l’avantage du traitement chimique des tissus végétaux (c’est-à-dire l’histochimie)31. Cela permet d’indiquer qualitativement la présence de composés particuliers dans les cellules végétales. À l’inverse, les sections semi-minces donnent presque toujours des sections d’une épaisseur constante. Cependant, les processus sont plus longs, délicats et donc sujets aux erreurs. Les problèmes qui peuvent survenir, ainsi que les moyens de les éviter, sont discutés plus en détail.

Fixage
Du matériel frais doit être utilisé à la fois pour les lames à main levée et semi-minces, c’est-à-dire les feuilles de plantes suffisamment hydratées. Les sections de feuilles fanées n’ont pas d’intégrité structurelle car les cellules ont une pression de turgescence réduite. Lors de l’obtention de lames semi-minces à partir d’un matériau incrusté de résine, il est essentiel de s’assurer que les sections de feuilles sont fixées sous vide afin de remplacer l’air à l’intérieur de la feuille. Cela permet l’intégrité structurelle et l’osmose pendant le processus d’infiltration. Si cette étape n’est pas effectuée correctement, les cellules sont susceptibles de s’effondrer, ce qui entraîne des coupes transversales qui ne décrivent pas avec précision la structure réelle des feuilles et, par conséquent, des mesures anatomiques incorrectes32.

À l’inverse, une pression de vide élevée peut endommager les feuilles avec des tissus mous (comme les cotylédones), entraînant un rétrécissement des cellules ou la destruction des échantillons. Cela peut être évité en utilisant un réglage de pompe à vide approprié ou en l’ignorant complètement et en trempant simplement les échantillons dans la solution fixatrice. Si ce dernier est préféré, les échantillons peuvent être coupés de tous les côtés, afin de faciliter l’infiltration du fixateur dans le tissu.

Pré-infiltration
L’épaisseur de la paroi cellulaire et le tissu scléréide sont les traits anatomiques les plus influents pour la perméation des solutions qui permettent une fixation et une infiltration optimales de l’échantillon. Le but des scléréides dans les tissus végétaux est le soutien mécanique et la protection, ce qui peut avoir un impact sur le processus d’infiltration33. Comme ces tissus ont des parois cellulaires lignifiées très épaissies, la perméation des solutions peut être entravée. Les échantillons qui présentent des problèmes d’infiltration entraînent des sections semi-minces avec des cellules brisées et des déchirures dans la résine (figures 5C et D). La coupe longitudinale entraîne une distorsion des cellules, ce qui entraîne des biais dans les analyses anatomiques et la mesure des caractéristiques des feuilles telles que la taille et la densité cellulaires (Figure 5F-H).

Infiltration de résine
Un sectionnement de qualité est essentiel pour l’observation des tissus anatomiques, qui sont directement affectés par le milieu dans lequel l’échantillon est intégré. Les supports d’enrobage les plus couramment utilisés en histologie végétale sont la cire de paraffine, l’époxy et les résines acryliques34,35. L’enrobage à la cire nécessite la préparation des échantillons par fixateur chimique, et l’infiltration avec de la cire liquide, qui est durcie à température ambiante. Ces coupes donnent généralement des sections d’une épaisseur de 5 à 10 m, ce qui, comme démontré ici, peut être réalisé tout aussi bien à la main (figure 2) et ne nécessite que du tissu frais non fixé. Dans ce cas, la disposition des cellules autour de la gaine du faisceau est essentielle pour distinguer les plantes C3 et C4, ce qui nécessite l’utilisation d’un média d’enrobage plus robuste et plus rigide. La résine époxy (résineSpurr 36) et la résine acrylique (LR White) ont été testées à la fois pour la dureté, la longévité, l’infiltration d’échantillons, ainsi que la durabilité des sections dans cette étude. La résine époxy est utilisée dans l’incorporation de matériel biologique depuis des décennies37. Les résines acryliques sont relativement nouvelles et ont d’abord été envisagées pour l’enrobage de spécimens végétaux en raison de leur résilience dans le temps car, contrairement aux résines époxy, elles ne se décolorent pas à la suite de l’exposition aux UV et sont moins sujettes au rétrécissement38. La résine acrylique LR White (grade dur) a été sélectionnée pour sa formule non toxique et stable aux UV. Les résines acryliques ont tendance à être considérablement moins visqueuses que les résines époxy, ce qui permet une infiltration plus rapide de l’échantillon, et la dureté du matériau permet une coupe plus nette avec un microtome39. La figure 5C,D montre les résultats de la résine époxy dans des spécimens de feuilles avec une grande quantité de tissu structurel, où les déchirures sont inévitables en raison de la douceur de la résine époxy, par rapport à la résine acrylique (Figure 3).

Ultramicrotomie
L’élimination de l’excès de résine peut créer des fissures dans la résine qui pénètrent dans l’échantillon. Pour éviter cela, il est essentiel de tenir compte de la densité et de la fragilité de la résine choisie pour l’enrobage. En coupant plus profondément dans la section, vous éviterez tout artefact causé par une coupe à la main ou un couteau grossier. L’échantillon doit être aligné perpendiculairement au porte-échantillon et validé en augmentant le grossissement à travers l’oculaire, ainsi qu’en visualisant une section fixe et colorée. Les cellules végétales qui ne sont pas coupées à angle droit apparaissent comme des cellules effilées dont une extrémité est plus grande que les40 autres.

Post-coloration
Le bleu de toluidine (1 % en solution aqueuse) a été utilisé pour colorer les lames semi-minces découpées sur l’ultramicrotome. Si la teinture est laissée sécher trop longtemps sur la section, elle entraîne une coloration excessive, provoquant une sursaturation de la section lors de l’imagerie (Figure 5A). Lorsque la coloration n’est pas bien filtrée, elle entraîne le séchage de particules non dissoutes sur la section, ce qui entrave la visualisation des structures anatomiques (Figure 5B). Ce problème peut être évité en utilisant un filtre fin lors de la préparation d’une solution de bleu de toluidine ainsi qu’en limitant l’exposition de la section à la tache. Les échantillons sont séchés sur une plaque chauffante à 60 °C avant la coloration afin de s’assurer que la section adhère à la lame de microscope en verre, mais ne doivent pas être exposés pendant plus de 10 s au bleu de toluidine avant d’être rincés et séchés à nouveau41.

Considérations sur les mesures anatomiques
Les mesures présentées dans cet article ne sont qu’un exemple des nombreux traits anatomiques qui peuvent être évalués quantitativement à l’aide de coupes semi-minces, y compris une fraction de l’espace aérien intercellulaire, l’épaisseur moyenne du mésophylle (sans tissu vasculaire) et la surface du mésophylle exposée aux espaces aériens intercellulaires par unité de surface foliaire42. Cependant, alors que la taille des cellules de la gaine du faisceau est un indicateur important pour différencier le métabolisme du C3 et du C4, l’épaisseur de la paroi cellulaire du faisceau est un autre trait important qui ne peut pas être observé sur la base de la seule microscopie optique, car elle détermine le degré de fuite des cellules de la gaine du faisceau, c’est-à-dire la quantité de CO2 qui se diffuse dans les cellules du mésophylle42, N° 43. Une fuite élevée réduit l’efficacité photosynthétique, car une grande partie de l’énergie utilisée pour la fixation du CO2 par la PEP carboxylase est perdue 44,45,46. Pour de telles analyses ultrastructurales, la microscopie électronique à transmission et les analyses d’images sont nécessaires. Bien que seule la microscopie optique ait été prise en compte pour la présente étude, le protocole comprend un traitement au tétroxyde d’osmium, un agent de contraste et de fixation qui est la pierre angulaire de la microscopie TEM. Les échantillons polymérisés peuvent donc toujours être utilisés pour l’analyse TEM chaque fois que le besoin s’en fait sentir, même s’ils n’en tiennent pas compte au moment de la préparation.

Bien que le diagnostic anatomique puisse facilement détecter des structures de type Kranz, la présence deC4 peut être diagnostiquée par des mesures d’échange gazeux qui peuvent montrer une physiologie typique duC4, c’est-à-dire un faible point de compensation du CO2, une inhibition limitée de l’O2 de la photosynthèse et une composition isotopique du carbonedifférente 2,4,47.

Il convient également de noter que l’anatomie de Kranz n’est pas nécessaire au développement de la photosynthèse en C4, comme le montre la découverte de plantesC4 unicellulaires 48,49,50. L’analyse anatomique seule peut donc ne pas être suffisante pour détecter la physiologie duC4 chez les taxons moins étudiés. Le couplage de la caractérisation anatomique et de l’analyse physiologique offre des outils puissants pour étudier les traits foliaires et leur relation structure-fonction chez les cultures et les plantes sauvages.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs saluent le programme H2020 de l’Union européenne (projet GAIN4CROPS, GA n° 862087). Le Centre d’excellence AgroCropFuture Agroecology and new crops in future climates est financé par le ministère de l’Éducation et de la Recherche de l’Estonie. Nous tenons à remercier le professeur Evelin Loit-Harro pour avoir fourni des graines de T. aestivum et Z . mays, Paula Palmet et Vaiko Vainola pour leur aide dans la préparation des coupes transversales de feuilles, et João Paulo de Silva Souza pour son aide dans l’analyse. Toutes les images ont été obtenues à partir de l’unité de microscopie de l’Université estonienne des sciences de la vie dans le cadre de divers projets.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Hydrogénophosphate disodique dihydraté (Na2HPO42H2O) purPENTA, CZ10028-24-7
Film d’enrobage, 7,8 mil d’épaisseur, 8 x 12,5, (203 x 318 mm)ACLAR, US10501-10
Éthanol, abs. 100 % a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000Danger : Liquide et vapeur hautement inflammables.
Système d’imagerie EVOS Invitrogen FL Auto 2Thermo Fisher Scientific, US
Moule en PTFE à intégration plate avec cadre métallique, 16 cavitésPELCO, US10501
Flacon en verre 2 mlVWR Life Science, US548-0045
Glutaraldéhyde 50 % solutionVWR Life Science, US23H2856331Danger : Mortel en cas d’inhalation. Toxique en cas d’ingestion. Provoque de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires. Peut provoquer une irritation respiratoire. Portez des gants de protection, des vêtements de protection, une protection oculaire et faciale.
Couteau diamant HistoDiatome, US
LEICA EM UC7Leica Vienne, AT
LR Résine blanche de qualitéMicroscopie électronique Sciences, US14383Danger : Provoque une irritation de la peau. Provoque une irritation oculaire sévère Peut provoquer une irritation respiratoire. Peut provoquer de la somnolence ou des étourdissements Portez des gants de protection, des vêtements de protection, une protection oculaire et faciale.
Lames de microscopeNormax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 et Nikon DS0Fi1 5 MPNikon Corporation, JP
Tétroxyde d’osmium (OsO4)Agar Scientific Ltd, GBR1019Danger : Mortel en cas d’ingestion, de contact avec la peau ou d’inhalation. Provoque de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires Portez des gants de protection doubles, des vêtements de protection, une protection des yeux et du visage.
Pipette et pointes de pipetteThermo Scientific, FIKJ16047
Dihydrogénophosphate de sodium dihydraté (NaH2PO4 . 2H2O) purPENTA, CZ13472-35-0
Seringue 10 mlEcoject, DE20010
Bleu de toluidine, à usage généralFisher Scientific, GB2045836
dure

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