Method Article

Production et microscopie imageuse à vie multiparamètre en fluorescence de cellules vivantes (FLIM) de sphéroïdes multicellulaires

DOI:

10.3791/66845

⸱

August 9th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, 2Ghent Light Microscopy Core, Ghent University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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Ici, nous décrivons différentes méthodes de formation de sphéroïdes multicellulaires pour effectuer une microscopie multiparamètre de suivi sur cellules vivantes. À l’aide de la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM), de l’autofluorescence cellulaire, des colorants de coloration et des nanoparticules, l’approche d’analyse du métabolisme cellulaire, de l’hypoxie et de la mort cellulaire dans le cancer tridimensionnel vivant (3D) et les sphéroïdes dérivés de cellules souches est démontrée.

Abstract

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Les sphéroïdes tumoraux multicellulaires sont un modèle 3D populaire de microagrégats tissulaires pour reproduire le microenvironnement tumoral, tester et optimiser les thérapies médicamenteuses et utiliser des biocapteurs et des nanocapteurs dans un contexte 3D. Leur facilité de production, leur taille prévisible, leur croissance et les gradients de nutriments et de métabolites observés sont importants pour récapituler le microenvironnement cellulaire de type niche 3D. Cependant, l’hétérogénéité des sphéroïdes et la variabilité de leurs méthodes de production peuvent influencer le métabolisme cellulaire global, la viabilité et la réponse aux médicaments. Il est donc difficile de choisir la méthodologie la plus appropriée, compte tenu des exigences en termes de taille, de variabilité, de besoins de biofabrication et d’utilisation comme modèles tissulaires 3D in vitro en biologie des cellules souches et cancéreuses. En particulier, la production de sphéroïdes peut influencer leur compatibilité avec les microscopies quantitatives en direct, telles que l’imagerie métabolique optique, la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM), la surveillance de l’hypoxie sphéroïde avec des nanocapteurs ou la viabilité. Ici, un certain nombre de protocoles conventionnels de formation de sphéroïdes sont présentés, mettant en évidence leur compatibilité avec la microscopie à grand champ en direct, confocale et à deux photons. Le pipeline d’imagerie de suivi à l’analyse avec l’autofluorescence multiplexée FLIM et, en utilisant divers types de cancer et de sphéroïdes de cellules souches, est également présenté.

Introduction

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Les sphéroïdes multicellulaires représentent un groupe de modèles tissulaires 3D obtenus par l’auto-agrégation de cellules et présentant une forme sphérique. Ils sont largement utilisés pour imiter l’interaction cellule-cellule et cellule-matrice in vitro et pour reproduire un contexte 3D dans une multitude de constructions dérivées du cancer et des cellules souches. Plusieurs techniques sont employées pour réduire l’attachement cellulaire et favoriser l’agrégation. Il s’agit notamment de la méthode de la suspension et de la chute reposant sur la tension superficielle1 ; méthodes de repoussée de fixation des cellules telles que les plaques de fixation ultra-faibles, les micro-moules et les micropuits 2,3 ; approche basée sur les ondes acoustiques4 ; méthodes d’agrégation induites par l’écoulement (fioles tournantes, bioréacteur et dispositifs microfluidiques)5 ; formation assistée par particules magnétiques6 et utilisation des matrices et échafaudages synthétiques et ECM favorisant l’agrégation 7,8,9.

Dans la recherche sur le cancer, le développement et la validation de nouvelles thérapies médicamenteuses, les sphéroïdes sont un modèle attrayant en raison de leur capacité à récapituler les gradients limités par la diffusion spatiale des nutriments, des déchets et de l’O2, conduisant souvent à la formation d’un noyau nécrotique, typique des tumeurs solides10,11. Ces modèles in vitro plus fiables et plus sophistiqués remettent en question la nécessité d’une utilisation intensive de modèles animaux (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.012), conformément au principe des 3R de la recherche animale (remplacement, réduction et raffinement). En plus du cancer, les sphéroïdes trouvent leur application dans la recherche sur les cellules souches. Par exemple, les cellules souches pluripotentes ont la capacité de former des corps embryoïdes (EB), qui peuvent être utilisés pour la différenciation des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) vers des types de cellules spécialisés difficiles à obtenir directement des patients, tels que les cellules précurseurs neurales13 ou les cellules de la granulosa ovarienne 13,14. De plus, la formation d’une EB est souvent la première étape dans le développement de modèles organoïdes plus complexes, par exemple, neural15, rétinien16, cardiaque17, foie18, estomac19 et organoïdes intestinaux20. Des facteurs tels que la taille, la reproductibilité, le débit et les applications en aval doivent être pris en compte lors du choix d’une méthode de formation de sphéroïdes appropriée pour les expériences.

La complexité accrue de la culture 3D peut entraîner une plus grande variabilité par rapport à la culture 2D. Des facteurs tels que la composition nutritionnelle21, l’évaporation du milieu22, la viscosité23, le contrôle du pH24, la méthode de formation des sphéroïdes et même le temps passé dans la culture25,26 peuvent entraîner l’obtention de sphéroïdes de morphologie, de taille, de viabilité et de chimiorésistance différentes27,28. Des recherches récentes ont démontré que les gradients d’oxygène sphéroïdes ne sont pas toujours statiques et sont affectés par la méthode de formation, la taille du sphéroïde et la viscosité extracellulaire, affectant l’hétérogénéité des sphéroïdes29. Pour améliorer la reproductibilité et l’accessibilité des données sur les sphéroïdes, la base de connaissances MISpheroID a été développée26, identifiant la lignée cellulaire, le milieu de culture, la méthode de formation et la taille des sphéroïdes comme les informations minimales pour un résultat reproductible. Par conséquent, une comparaison détaillée a été effectuée de plusieurs méthodes à haut débit (SphericalPlate 5D, micromoules fabriqués en laboratoire et moules à microtissus) et à faible fixation (c’est-à-dire des plaques à 96 puits recouvertes de Biofloat et de Lipidure, à la fois sans échafaudage et à base d’échafaudage) (figure 1 et tableau 1), y compris la taille du puits (compte tenu d’une estimation de la taille maximale des sphéroïdes), les consommables utilisés, le temps de préparation et la possibilité de surveiller les sphéroïdes sans les transporter vers des boîtes de microscopie. Ce dernier permet des études à long terme, tandis que les sphéroïdes produits avec des méthodes à haut débit aboutissent souvent à des expériences finales. Toutes les méthodes, à l’exception des grilles de la 5DspheriPlate, n’apportent pas d’autofluorescence indésirable, ce qui permet leur utilisation directe en microscopie.

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Figure 1 : Explication des méthodes de formation des sphéroïdes. Des méthodes à haut débit telles que la SphericalPlate 5D, qui a intégré des micropuits brevetés dans la plaque, tandis que les micromoules produits en laboratoire et les moules MicroTissue utilisent des tampons pour fabriquer plusieurs micropuits en agarose (bleu). Les plaques à faible fixation telles que Lipidure (Amsbio) et Biofloat (Sarstedt) utilisent un revêtement non adhérent inhibant l’adhésion à la surface cellulaire et favorisant l’auto-agrégation cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5D SpheriPlateMicromoules auto-produitsMicrotissusMéthodes de fixation faibles
Nombre de sphéroïdes/puits7501589811
Diamètre puits90 μm400 μm800 μm1 millimètre
Volume de culture1 mL5 mL1 mL200 μL
Autres consommables/7 mL d’agarose à 3 %500 μL d’agarose à 2 %/ *
Temps de préparationDurée : 10 minutes2 h + 3 jours d’adaptation des médias0,5 h + 15 min d’adaptation du support10 à 30 min + 1 h de séchage
SurveillanceOuiNon**OuiOui
AutofluorescentOuiNonNonNon
RéutilisableNonOuiOuiNon**
Coût€€€€€€€€€€€ : Enrobage et Matrigel
€€ : Plaque commerciale 96 puits
*Certaines lignées cellulaires nécessitent l’ajout d’ECM (c’est-à-dire 2 à 5 % de Matrigel) pour former des sphéroïdes compacts.
**Le revêtement est réutilisable jusqu’à ce qu’il soit épuisé. Cependant, chaque plaque consommera une petite quantité de média et la poussière peut s’accumuler au fil du temps. Une stérilisation par filtre est régulièrement nécessaire.

Tableau 1 : Comparaison de plusieurs méthodes de formation de sphéroïdes29. « Monitoring » : la possibilité de surveiller les sphéroïdes sans avoir besoin de les transférer dans une boîte de microscopie. € : 0-50€, €€ : 50-150€ , €€€ : 150-500€ , €€€€ : >500€

La microscopie à fluorescence permet de surveiller directement les principaux aspects biologiques des sphéroïdes, notamment la mort cellulaire, la viabilité, la prolifération, le métabolisme, la viscosité et même les propriétés mécaniques30. La microscopie imageuse à durée de vie de fluorescence (FLIM) apporte une dimension quantitative supplémentaire pour l’étude des interactions des sondes fluorescentes au sein de leur (micro)environnement 31,32,33,34, permettant de résoudre les spectres d’émission qui se chevauchent en fonction de différentes durées d’émission 35,36 et sonder le métabolisme cellulaire basé sur l’autofluorescence cellulaire intrinsèque. Ainsi, des composés cellulaires autofluorescents aussi répandus que le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NAD(P)H), la flavine mononucléotide (FMN), la flavine adénine dinucléotide (FAD), la protoporphyrine IX et d’autres peuvent être mesurés avec un FLIM à un ou deux photons et servent de « capteurs » intrinsèques du catabolisme du glucose, de la phosphorylation oxydative (OxPhos) et fournissent un aperçu général de l’état redox cellulaire. Le NAD(P)H existe sous forme cytoplasmique libre ou sous forme mitochondriale liée aux protéines37,38. De même, l’état oxydé du FAD est fluorescent avec une durée de vie plus longue de la forme libre. Les microscopies NAD(P)H et FAD impliquent généralement une FLIM excitée par deux photons, visant à prévenir les photodommages de l’échantillon39. Souvent, l’imagerie métabolique optique FLIM peut être combinée à l’utilisation de sondes à base de colorants, de biocapteurs génétiquement codés, de microscopie d’imagerie à durée de vie de phosphorescence (PLIM) et de mesures basées sur l’intensité ratiométrique afin de fournir une image plus complète du métabolisme, de l’oxygénation, de la prolifération et de la viabilité cellulairedes sphéroïdes ou des organoïdes 29,30,31 . De plus, FLIM peut également être combiné avec la méthode de transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) pour mesurer la variation de la durée de vie du fluorophore donneur lorsqu’il est en contact étroit avec l’accepteur afin d’étudier la liaison d’un médicament avec son domaine cible 33,40,41.

Les images FLIM acquises sont généralement analysées pour calculer la durée de vie pixel par pixel. À l’heure actuelle, il existe au moins 3 stratégies courantes utilisées pour obtenir la durée de vie de la fluorescence : le « FLIM rapide » semi-quantitatif 42 (parfois appelé « sens tau »43,44), l’ajustement de la courbe de décroissance, en utilisant un ajustement à une, deux ou trois exponentielles, et l’approche « sans ajustement » avec transformation de phase et analyse du tracé de phase. Selon le fournisseur, des logiciels fournis (LAS X, Symphotime, SPCImage, etc.) ou open source (par exemple, FLIMfit45, FLIMJ46 ou autres47) peuvent être utilisés pour traiter les données FLIM mesurées. En règle générale, les logiciels fournis par le fournisseur sont utiles pour l’analyse préliminaire des données, tandis que les solutions open source peuvent fournir des études plus précises en utilisant, par exemple, des diagrammes de phaseur et la visualisation 3D.

Malgré l’utilité et l’attrait de FLIM en tant que méthode d’étude des sphéroïdes, très peu de protocoles expérimentaux sont disponibles, et il y a un manque général de connaissances dans le choix de la méthode de formation la plus appropriée pour des expériences de microscopie multiparamétrique en direct réussies impliquant FLIM. Ici, une comparaison détaillée des protocoles de formation de sphéroïdes couramment utilisés est présentée en fonction de leur morphologie, de leur viabilité et de leur oxygénation avec le nanocapteur de détection d’oxygène rouge lointain et proche infrarouge (NIR) (MMIR1) récemment validé et caractérisé. La nanoparticule cationique est imprégnée de deux colorants rapporteurs, l’aza-BODIPY de référence insensible à l’O2 (excitation 650 nm, émission 675 nm) et la métallporphyrine sensible à l’O2 NIR, PtTPTBPF (excitation 620 nm, émission 760 nm). Le MMIR1 permet l’analyse en temps réel des gradients d’oxygène sur un microscope à fluorescence conventionnel (à l’aide de l’analyse ratiométrique) ou un microscope à durée de vie de phosphorescence (PLIM) sans introduire de toxicité cellulaire et permettant des signaux stables, une surveillance à long terme et un multiplexage25,29. En fonction de la nécessité de colorer avec des colorants ou des nanocapteurs, du débit de sphéroïdes ou du type de cellule, le protocole de formation le plus approprié peut être choisi. Étant donné que les études de viabilité et d’oxygénation des sphéroïdes sont pertinentes pour les études de cancer et de sphéroïdes dérivés de cellules souches, les protocoles présentés incluent également des exemples et des résultats typiques attendus du NAD(P)H-FLIM et du FAD-FLIM avec ces modèles. Les pipelines d’imagerie et d’analyse présentés ciblent les plateformes de microscopie FLIM basées sur le comptage de photons uniques corrélées dans le temps les plus populaires.

Protocol

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1. Génération de sphéroïdes multicellulaires

  1. Culture cellulaire
    REMARQUE : Les cultures cellulaires peuvent être collectées auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC), de Lonza, de Sigma-Aldrich ou d’autres fournisseurs. L’ATCC fournit tous les renseignements nécessaires à la manipulation, y compris les milieux de croissance préférés, les procédures de sous-culture, le niveau de biosécurité, le taux de croissance et les profils STR. Ici, 500 cellules/sphéroïde de la lignée cellulaire HCT116 du cancer du côlon humain sont utilisés dans le milieu 5A de McCoy (VWR, 392-0420) complété par 10 % de FBS et 1 mM de pyruvate de sodium. Pour les expériences à long terme qui sont surveillées quotidiennement, 10 mM d’HEPES, pH 7,2 peuvent être ajoutés au milieu.
    1. Cultivez des cellules pour atteindre une confluence de 70 à 90 %.
    2. Rincer les cellules avec du PBS stérile préchauffé (37 °C) (5 mL pour 25 cm2 ou 10 mL par ballon de 75 cm2 ).
    3. Ajouter 0,05 % de trypsine - 1 mM de solution EDTA (0,5 mL pour 25 cm² ou 1 mL par flacon de 75 cm2 ) et incuber pendant 5 à 10 min à 37 °C dans 5 % de CO2, 95 % d’humidité pour atteindre le détachement cellulaire.
      REMARQUE : Contrôlez le détachement de la cellule sous le microscope à lumière de transmission (fond clair). La surexposition des cellules à la solution enzymatique dissociante peut affecter leur viabilité.
    4. Neutralisez la trypsine en ajoutant un excès de milieu de culture cellulaire contenant 10 % de FBS (au moins 5 ml de milieu pour 1 ml de solution de dissociation).
      REMARQUE : Pour les cellules cultivées sur des milieux de culture à faible teneur en FBS ou sans FBS, la neutralisation de la trypsine peut être effectuée avec l’ajout de 0,5 mL de FBS à 100 % à la culture cellulaire traitée à la trypsine, suivie d’une centrifugation pour transférer les cellules dans leur milieu de culture d’origine.
    5. Dissocier les agrégats cellulaires par pipetage pour obtenir une suspension unicellulaire en milieu.
      REMARQUE : Le pipetage à l’aide d’une pipette sérologique avec une pointe de pipette de 1000 μL sur le dessus améliore considérablement la génération de suspension unicellulaire dans un grand volume de culture cellulaire en suspension.
    6. À l’aide d’une chambre de comptage (hémocytomètre réglé de Neubauer ou alternatives) pour compter le nombre de cellules par 1 mL de suspension cellulaire.
    7. Diluez la suspension cellulaire pour obtenir le nombre souhaité de cellules par millilitre.
    8. Ajouter une solution concentrée de sonde d’O2 (nanoparticules) à la suspension cellulaire à une concentration finale de 10 μg/mL pour l’analyse ratiométrique de l’O2.
      REMARQUE : Pour assurer une suspension cellulaire homogène (avec la sonde), remettre en suspension plusieurs fois avant la formation de sphéroïdes. Si la sonde O2 n’est pas nécessaire, sautez cette étape et procédez à la formation des sphéroïdes. Un protocole modifié doit être appliqué lors de la manipulation des iPSC. En bref, les iPSC sont cultivées en colonies sur des plaques revêtues de Geltrex et passées à l’aide de ReLeSR comme décrit dans le protocole48 fourni par le fournisseur. Le jour de la formation des sphéroïdes, les colonies doivent être grandes, compactes et présenter des centres multicouches avec des bordures distinctes. Rincez les cellules avec du PBS stérile préchauffé. Ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire douce (GCDR) et incuber à 37 °C pendant 8 à 10 min. À l’aide d’une pointe de 1000 μL, détacher doucement les cellules du puits et obtenir une suspension unicellulaire. Transférez la suspension unicellulaire dans un tube conique stérile de 50 mL et ajoutez 4 mL de milieu DMEM-F12 préchauffé pour neutraliser le GCDR. Lavez le puits avec 1 mL de DMEM-F12 et transférez-le dans le reste de la suspension cellulaire. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min. Remettre en suspension dans 1 mL de milieu approprié pour d’autres expériences. Pour les expériences décrites dans ce manuscrit, mTeSR + 10 μM Rock Inhibitor a été utilisé. Comptez et diluez la suspension cellulaire pour obtenir le nombre souhaité de cellules par millilitre.
  2. Méthodes de formation de sphéroïdes
    1. Micro-moules en boîte de Pétri 3D
      REMARQUE : Cette méthode à haut débit est utilisée pour générer simultanément un grand nombre de sphéroïdes (81 sphéroïdes) dans un réseau de micromoules de 9 x 9 d’un diamètre de 800 m et d’une profondeur de 800 m.
      1. Rincer les micro-moules pour la coulée de boîtes de Pétri 3D en dH2O et les mettre dans un récipient autoclave.
      2. Mesurez 2 g de poudre d’agarose de qualité électrophorèse et placez-la dans une bouteille en verre sèche de 200 ml sans danger pour l’autoclave.
        REMARQUE : Assurez-vous que le flacon et la poudre d’agarose sont secs, sans liquide ni humidité.
      3. Micro-moules autoclaves pour la coulée de boîtes de Pétri 3D et flacons avec de la poudre d’agarose pendant 30 min sur un cycle de séchage.
      4. Préparez une solution saline à 0,9 p/v en ajoutant 0,9 g de NaCl dans 100 ml d’eau ultrapure et stérilisez à l’autoclave.
        REMARQUE : Le NaCl est recommandé par le fabricant. Il augmente la stabilité de l’agarose.
      5. Préparez la solution d’agarose en ajoutant la solution saline stérile à la poudre d’agarose stérilisée. Vissez le couvercle de manière lâche pour éviter l’accumulation de pression. Agitez la bouteille pour mélanger la poudre d’agarose.
      6. Faites bouillir et dissoudre la poudre d’agarose à l’aide d’un four à micro-ondes. Arrêtez fréquemment le micro-ondes (~toutes les 10 s). Agitez la bouteille et répétez jusqu’à ce que l’agarose soit dissous.
        ATTENTION : La solution d’agarose est chaude et nécessite une manipulation soigneuse. L’agitation immédiatement après la procédure de fusion peut faire jaillir la solution de la cuve. Pour éviter les accidents, utilisez des récipients suffisamment grands remplis à 50 % de leur capacité et utilisez une protection individuelle appropriée (gants, gant de cuisine, lunettes de protection et blouse de laboratoire).
      7. Laissez refroidir la solution d’agarose dissoute à 60-70 °C. À l’aide de techniques et de conditions aseptiques, pipeter l’agarose fondu dans le micro-moule (500 μL pour la série 12 ou 330 μL pour la série 24).
        REMARQUE : Évitez la formation de bulles lors du mélange ou du pipetage de l’agarose. Éliminez toutes les petites bulles piégées dans les petites caractéristiques du micro-moule par pipetage ou grattage doux avant que l’agarose ne se solidifie.
      8. Laissez l’agarose se solidifier pendant environ 2-3 min. Ensuite, fléchissez soigneusement le micro-moule pour retirer la boîte de Pétri 3D et transférez-la sur une plaque de culture tissulaire à 12 puits.
        REMARQUE : Une flexion excessive du micro-moule peut entraîner la formation de fissures dans le moule d’agarose.
      9. Pour équilibrer la boîte de Pétri 3D, ajoutez 2,5 mL/puits de milieu de culture cellulaire. Incuber pendant 15 minutes ou plus. Retirez le milieu de culture et remplacez-le par un milieu frais. Répétez l’opération une fois de plus pour équilibrer la boîte de Pétri 3D avec un milieu de culture.
        REMARQUE : Le protocole peut être interrompu ici jusqu’à l’ensemencement des cellules. Pour un stockage à long terme (jusqu’à 2 semaines à 4 °C), utilisez une solution PBS au lieu d’une solution moyenne.
      10. Retirez complètement la boîte de Pétri 3D entourant le milieu de culture (ou PBS) et retirez avec précision le milieu à l’intérieur de la boîte de Pétri 3D en inclinant la plaque de culture tissulaire.
      11. Ensemencez avec précaution 190 μL de suspension cellulaire contenant 40 500 cellules goutte à goutte dans la chambre d’ensemencement cellulaire (voir étape 1.1).
        REMARQUE : Le nombre de micro-puits dans les timbres d’agarose détermine le nombre de sphéroïdes produits par timbre. Dans ce cas, ce moule d’agarose contient 81 micropuits (81 x 500 cellules/sphéroïde). La variation de la concentration cellulaire en suspension ajoutée à un macropuits permet de modifier le nombre de cellules par sphéroïde, contrôlant ainsi la taille du sphéroïde.
      12. Attendez ~10 min pour que les cellules s’installent dans les caractéristiques du dsh de Petri 3D. Ensuite, ajoutez 2 ml de milieu à l’extérieur de la boîte de Pétri 3D.
      13. Placez la plaque de culture tissulaire dans l’incubateur de culture cellulaire et remplacez le milieu entourant la boîte de Pétri 3D si nécessaire.
    2. Plaque de fixation basse
      REMARQUE : Cette méthode est utilisée pour générer un seul sphéroïde par puits. Des plaques revêtues (Lipidure ou Biofloat) sont disponibles dans le commerce (sautez les étapes 1.2.2.1-1.2.2.4). Alternativement, le revêtement peut être acheté séparément et utilisé pour revêtir des plaques multipuits non traitées. Il est recommandé de remplir les puits situés sur les bords des plaques de 96 puits avec de l’eau stérile ou du PBS en raison de l’évaporation plus rapide dans ces puits, limitant ainsi le nombre de puits pour les sphéroïdes à 60. Au cas où moins de sphéroïdes seraient nécessaires, remplissez les puits vides environnants avec de l’eau ou du PBS. Utilisez des embouts sans poussière pour la manipulation des liquides afin d’éviter d’apporter de petites particules dans les puits, car elles interfèrent avec la formation de sphéroïdes.
      1. Préparez une solution d’enrobage à 0,5 % p/v en dissolvant 0,25 g de poudre de polymère dans 50 ml d’éthanol dans un récipient en verre. Filtrez-stérilisez le revêtement.
        REMARQUE : La stérilisation par filtre et toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles sous flux laminaire.
      2. Ajouter 200 μL de la solution d’enrobage dans chaque puits d’une plaque de culture à fond en U de 96.
      3. Incuber pendant 1 min et enlever l’excédent de revêtement.
        REMARQUE : La solution de revêtement peut être utilisée plusieurs fois. Conserver dans un récipient en verre à température ambiante (RT). Les récipients en plastique ne sont pas conseillés, car le plastique peut se dissoudre partiellement et faire partie de la solution. S’il y a de la poussière, stérilisez le filtre avec un polyéthersulfone (PES) de 0,22 μm ou des filtres à seringue en nylon.
      4. Laissez sécher la plaque à 96 puits à l’air libre pendant environ 1 h.
        REMARQUE : Si les cellules ont besoin d’une matrice extracellulaire, passez à l’étape 1.2.3. Les plaques revêtues peuvent être stockées chez RT lorsqu’elles sont enveloppées dans de l’aluminium jusqu’à 1 mois. Lors de l’ensemencement d’une plus petite quantité de cellules/puits, la centrifugation de la plaque pendant 5 minutes à 300 g peut aider à abattre les cellules.
    3. Protocole de formation assistée par matrice extracellulaire
      REMARQUE : Certaines lignées cellulaires ne produisent pas suffisamment de matrice extracellulaire (ECM) elles-mêmes et ont besoin de l’ajout d’ECM telles que Matrigel, Cultrex ou Geltrex afin de former des sphéroïdes compacts 49,50,51. Pour des types de cellules tels que le cancer du sein MDA-MB-231, la papille dermique humaine, les cellules cancéreuses de la prostate et autres, il est possible d’utiliser l’étape 1.2.2 avec les modifications suivantes52, nécessitant l’ajout de l’ECM. Utilisez de préférence des embouts sans poussière pour la manipulation des liquides afin d’éviter que la poussière n’interfère avec la formation de sphéroïdes. Les étapes 1 et 4 à 7 doivent être effectuées sous une enceinte de sécurité biologique (classe II).
      1. Passez aux étapes 1.2.2.1-1.2.2.4 (plaques de fixation basses) pour le traitement de surface.
      2. Pré-refroidissez la plaque à 96 puits à 4 °C au réfrigérateur.
      3. Préparez la centrifugeuse avec l’adaptateur approprié pour la plaque à 96 puits et prérefroidissez-la à 4 °C.
      4. Préparez une solution à 5 % de matrice de membrane basale (BMM) dans un milieu de culture cellulaire pré-refroidi (4 °C).
        REMARQUE : BMM se croise rapidement à RT. Lors de la manipulation, gardez les stocks et les solutions sur la glace.
      5. Préparez la suspension cellulaire (voir étape 1.1).
      6. Ajouter 50 μL de la solution BMM dans chaque puits.
      7. Ajouter délicatement 50 μL de suspension cellulaire dans chaque puits au-dessus de la solution BMM (25 000 cellules/puits).
        REMARQUE : Ne projetez pas ce volume dans le puits, sinon les cellules se répandront sur les côtés des puits et ne s’accumuleront pas au fond. Un nombre inférieur de cellules par puits peut être obtenu en ajustant la densité cellulaire en conséquence. Toutes les cellules ne formeront pas de sphéroïdes à toutes les densités d’ensemencement ; L’optimisation doit être effectuée en termes de type de cellule et de dimension. Avec les volumes fournis, la concentration finale de BMM est de 2,5 %. Si une concentration différente est nécessaire, la solution mère doit être préparée à une concentration plus faible/plus élevée.
      8. Centrifuger la plaque à 96 puits pendant 5 min à 300 x g et 4 °C.
        REMARQUE : Sans cette étape, les cellules ne s’agrègent pas correctement au fond du puits, ce qui provoque la formation de plusieurs agrégats plus petits. La centrifugeuse doit être refroidie pour éviter la réticulation à ce stade.
      9. Placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Les agrégats sont considérés comme matures le jour 4 après l’ensemencement.
        REMARQUE : Pour des protocoles supplémentaires sur la formation des sphéroïdes, reportez-vous au Fichier supplémentaire 1.

2. Microscopie en direct des sphéroïdes

  1. Préparation des sphéroïdes pour l’analyse d’imagerie en direct
    REMARQUE : Selon le plan d’expérience (par exemple, surveillance à long terme ou analyse finale, configuration du microscope ou propriétés spectrales de la fluorescence mesurée) ou en raison de l’incompatibilité de la méthode de production des sphéroïdes avec la microscopie (par exemple, épaisseur de l’échantillon, autofluorescence du matériau, flottement des sphéroïdes pendant l’imagerie), surveillance directe des sphéroïdes dans la plaque, où ils ont été produits, peut ne pas être possible. Le protocole explique la préparation des sphéroïdes pour l’imagerie, qui conviennent à la plupart des microscopes à champ large inversé et des microscopes confocaux.
    1. Préparez et préchauffez (37 °C) le support d’imagerie : DMEM complété par HEPES-Na, pH 7,2 (10 mM), pyruvate de sodium (1 mM), L-glutamine (2 mM) et glucose (5 mM), sans rouge de phénol.
      REMARQUE : Le bicarbonate de sodium seul ou en combinaison avec HEPES-Na peut être utilisé, si le contrôle du CO2 est fourni pendant l’imagerie24. Certains types de cultures cellulaires ne peuvent pas tolérer la présence d’HEPES. Selon la conception expérimentale, les teneurs en pyruvate, en glutamine et en glucose peuvent être modifiées.
    2. Préparez des boîtes de microscopie stériles (disponibles dans le commerce ou fabriquées en laboratoire) avec des surfaces en verre de couverture recouvertes (pour une forte adhérence sphéroïde) ou non revêtues (faible adhérence sphéroïde) (épaisseur #1,5).
      REMARQUE : Le besoin et le type d’enrobage dépendent du type de cellule, des propriétés d’adhésion des sphéroïdes et de la vitesse de leur migration cellulaire de l’interface de culture 3D à l’interface de culture 2D. Il est important d’en tenir compte, car le revêtement peut faciliter la perte d’organisation 3D, en modifiant la forme des micro-gradients chez les sphéroïdes et, par conséquent, le comportement cellulaire. Pour certaines expériences (par exemple, l’imagerie a analysé la réponse à la stimulation médicamenteuse), une forte adhérence des sphéroïdes à la surface est requise, et un revêtement avec de la gélatine, du BMM, du collagène, du collagène / poly-D-lysine ou de la poly-D-lysine est préféré.
    3. Lavez délicatement les sphéroïdes colorés par la sonde O2 des micropuits de l’agarose à micromotifs ou de la plaque à 96 puits et transférez les sphéroïdes encore flottants dans un flacon de 2 ml.
      REMARQUE : Pour assurer la collecte de tous les sphéroïdes à partir de la méthode à haut débit, rincez le moule 1 à 3 fois avec le volume supplémentaire de milieu de culture, en combinant toutes les suspensions de sphéroïdes dans un seul flacon. Pour les sphéroïdes dans une plaque de fixation basse, prélever les sphéroïdes un par un dans des puits individuels dans un flacon ou directement dans une boîte de microscopie si un petit nombre de sphéroïdes est suffisant pour l’expérience. Lors du transfert de gros sphéroïdes, coupez l’extrémité de la pointe de la pipette pour éviter tout dommage lors du pipetage.
    4. Laissez le flacon en position verticale jusqu’à 5 min pour laisser les sphéroïdes se déposer au fond du flacon, formant une pastille visible.
    5. Retirez le milieu du tube, en laissant les sphéroïdes intacts, et remettez-les doucement en suspension dans une quantité suffisante de culture fraîche.
      REMARQUE : Pour faciliter la manipulation des sphéroïdes, le transfert des sphéroïdes sur le support d’imagerie peut également être effectué à ce stade en petits lots ; Voir les étapes 2.1.7 et 2.1.8. Les sphéroïdes des différents groupes expérimentaux doivent être traités de la même manière, car la composition du milieu et le temps de préconditionnement du milieu peuvent affecter leur métabolisme.
    6. Pendant que les sphéroïdes flottent, transférez un volume égal de suspension de sphéroïdes par puits de la boîte de microscopie.
    7. Incuber les sphéroïdes pendant 1 à 2 h à 37 °C dans un incubateur de CO2 pour assurer leur fixation à la surface de la parabole/puits de microscopie. Pour l’imagerie, passez à l’étape 2.1.9. Pour la coloration des sphéroïdes avec des sondes supplémentaires, passez à l’étape 2.1.8.
      REMARQUE : Le taux de migration cellulaire du sphéroïde 3D à l’interface de surface 2D est fonction du temps. Pour éviter une perte d’organisation 3D, le temps d’incubation doit être optimisé en fonction du type de cellule, du type de revêtement de surface et de la conception de l’expérience. Par exemple, HCT116, selon la taille du sphéroïde, a besoin d’au moins 2 h pour une bonne fixation du sphéroïde à la surface recouverte de collagène IV/poly-D-lysine, tandis que la fixation et la migration du hDPSC vers l’interface 2D sont extrêmement rapides, entraînant une perte d’organisation 3D en 1 à 2 h. Pour éviter l’imagerie de « sphéroïdes 2D » dues à une étalement excessif, des surfaces en verre non revêtues sont utilisées avec un temps d’incubation réduit.
    8. Ajouter une ou plusieurs sondes de fluorescence à des concentrations recommandées ou optimisées empiriquement à un volume connu de suspension sphéroïde. Incuber pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur de CO2 avant l’imagerie.
      REMARQUE : Pour les essais vivants/morts, utiliser l’iodure de propidium et le Calcein Green-AM à une concentration finale standard de 1 μg/mL. Pour éviter l’effet toxique de la coloration à l’iodure de propidium sur les corps embryoïdes d’iPSC, la concentration finale d’iodure de propidium était de 0,5 μg/mL. Le temps de chargement de la sonde peut être prolongé si la diffusion de la sonde n’est pas efficace en raison de la grande taille du sphéroïde. Le temps de chargement doit toujours être considéré comme faisant partie du temps d’incubation total nécessaire à la fixation du sphéroïde à la surface. Si une période plus longue est nécessaire pour la fixation des sphéroïdes, la procédure de coloration doit être organisée à la fin de cette période. Sachez qu’un temps d’incubation plus long peut entraîner une perte d’organisation 3D.
    9. Retirez les milieux de culture cellulaire ou les milieux contenant des sondes fluorescentes et remplacez-les par un volume nécessaire de supports d’imagerie. Pour vous assurer qu’aucun fond de fluorescence de média n’est sur le chemin de l’imagerie sphéroïde, répétez l’étape d’échange de média (lavage) jusqu’à 5 fois.
      REMARQUE : Pour éviter l’élimination des sphéroïdes lors du changement de support, il est recommandé d’aspirer soigneusement le support avec une pipette de 200 μL à partir des bords des boîtes de microscopie et d’effectuer l’ajout de support par la paroi ou latéralement dans la boîte de microscopie.
    10. Passez immédiatement à l’étape 2.2.1 du protocole d’imagerie.
      REMARQUE : Une pause trop longue entre la préparation à l’imagerie et l’acquisition réelle de l’imagerie peut influencer le métabolisme cellulaire (par exemple, via une modification de la composition du milieu), la viabilité (certaines sondes fluorescentes utilisées pour l’analyse des paramètres ont des effets toxiques, qui peuvent stimuler la mort cellulaire après une longue période d’incubation) ainsi qu’entraîner une perte d’organisation 3D. Si plusieurs groupes de sphéroïdes ou conditions expérimentales doivent être comparés, le plan expérimental doit être élaboré en conséquence pour que le moment du traitement, du préconditionnement et des procédures d’imagerie soit aussi égal que possible entre les groupes analysés.
  2. Acquisition d’images
    REMARQUE : Le protocole décrit l’imagerie multiparamétrique de sphéroïdes vivants à l’aide du microscope confocal Stellaris 8 Falcon (Leica) et du logiciel Leica Application Suite X (LAS X) version 4.7. Cependant, seules des modifications mineures seront nécessaires pour effectuer une telle analyse sur d’autres plateformes de microscopie.
    1. Allumez l’unité de contrôle de la température 30 à 60 minutes avant l’imagerie. Réglez la vitesse de ventilation et la température nécessaires (35-37 °C).
      REMARQUE : Si, en plus du contrôle de la température, la concentration de gaz (par exemple, CO2 ou O2) doit être contrôlée pendant l’imagerie, les appareils correspondants doivent également être démarrés à l’avance pour atteindre les conditions nécessaires avant l’imagerie.
    2. Allumez le microscope et les appareils connectés (c’est-à-dire le laser WLL, l’ordinateur, la pompe à eau pour l’objectif d’immersion dans l’eau et d’autres blocs électroniques en fonctionnement). Démarrez le logiciel de contrôle du microscope (par exemple, LAS X Machine Mode ou Mode Machine avec contrôle de l’environnement) fourni avec la configuration exacte du microscope et initialisez l’étalonnage de la platine.
    3. Choisissez l’objectif requis dans le logiciel et appliquez le liquide d’immersion si nécessaire.
      REMARQUE : Pour la microscopie en direct, il est recommandé d’utiliser des objectifs à immersion dans l’eau ou le glycérol ayant une distance de travail suffisante (« longue »), par exemple HC Fluotar L 25x/0,95 W VIS IR (distance de travail de 2,4 mm), HC PL Apo 40x/1,25 GLYC (distance de travail de 0,35 mm) ou au moins NA = 0,4 ou plus pour les objectifs à air. Le choix du grossissement et de la distance de travail dépend de la nature et de la taille de l’échantillon imagé et des signaux de fluorescence mesurés (luminosité, rendement quantique, efficacité de coloration, voir par exemple, discussion sur les colorants et les nanoparticules53). Les grands objets (sphéroïdes ou organoïdes, d’une taille de >500 μm), les « bioréacteurs » ou les puces microfluidiques nécessitent des objectifs à longue distance de travail et un grossissement plus faible, tandis que l’analyse de cellules individuelles ou d’organites cellulaires nécessite un grossissement élevé, souvent obtenu par imagerie « mosaïque ».
    4. Installez la parabole de microscopie avec des sphéroïdes sur la scène. Ajustez la mise au point et trouvez un objet/une région d’intérêt (ROI).
      REMARQUE : Si des objets petits, faiblement fluorescents, à faible contraste ou rares doivent être trouvés et qu’il est difficile de trouver la mise au point, il est recommandé de pré-focaliser sur les parois de la parabole de microscopie et de « masquer » la surface de l’objet d’intérêt par serpentine, en commençant par l’un des coins du puits.
    5. Choisissez la fenêtre Ouvrir le projet et cliquez sur l’icône correspondante, Créer un nouveau projet. Donnez un nom standard (par exemple, commençant par « description AA-MM-JJ+ ») au dossier du projet de recherche. Pendant l’imagerie, toutes les images produites seront automatiquement enregistrées dans le fichier .lif du projet créé.
    6. Ouvrez la fenêtre Acquisition . Réglez la longueur d’onde d’excitation du laser à lumière blanche (WLL) et la plage requise des détecteurs à balayage hybrides ou par résonance (type HyD S, HyD X ou HyD R) en fonction des propriétés spectrales connues de la fluorescence mesurée (spectres d’excitation/d’absorbance et d’émission). Choisissez les types de balayage Ligne ou Image .
      REMARQUE : Pour la plupart des colorants fluorescents disponibles dans le commerce, les propriétés spectrales peuvent être trouvées (ou ajoutées) dans le package LAS X Dye Assistant. Choisissez le détecteur avec la plage de sensibilité spectrale appropriée compatible avec les propriétés spectrales de la sonde et, dans le cas de FLIM, compatible avec le comptage de photons (c’est-à-dire HyD X ou HyD R). Pour l’imagerie multiparamétrique, régler la WLL dans plusieurs positions d’excitation (par exemple, pour l’imagerie simultanée de FAD/Flavins et de deux canaux de fluorescence de la sonde ratiométrique MMIR1 O2 - de référence et sensible, les paramètres d’excitation/d’émission peuvent être de 460 nm/510-590 nm HyD X1 et 614 nm/631-690 HyD X3 et 724-800 nm HyD R en conséquence dans une ou deux séquences de balayage séquentiel). Il est important d’attribuer le détecteur approprié pour collecter l’émission, car les détecteurs peuvent avoir différentes sensibilités spectrales54.
    7. (Facultatif pour FLIM) Dans la fenêtre Acquisition , choisissez le mode FLIM pour effectuer une imagerie combinée au comptage de photons (collecte de désintégration). Immédiatement, un « module FLIM supplémentaire dans le logiciel LAS X » sera ouvert pour naviguer et analyser les données FLIM.
    8. (Facultatif pour FLIM) Choisissez le taux de répétition des impulsions WLL en fonction de la durée de vie moyenne attendue du fluorophore.
      REMARQUE : La fréquence de l’impulsion laser doit être ajustée pour collecter la décroissance complète de la fluorescence. Cela peut être fait à l’aide d’une fonction Pulse Picker installée sur le microscope. Le chevauchement de la décroissance de la fluorescence avec l’impulsion laser entraînera un raccourcissement de la durée de vie estimée de la fluorescence. Il est recommandé d’avoir des intervalles d’impulsion de 4 à 5 fois plus longs que la durée de vie moyenne prévue de la fluorescence (par exemple, 25 ns/40 MHz pour des durées de vie allant jusqu’à 5 ns). De nombreux lasers pulsés ont un taux de répétition fixe de 80 MHz (idéal uniquement pour une plage allant jusqu’à 2-3 ns). Ceci est important pour choisir les fluorophores appropriés pour l’expérience.
    9. Démarrez l’aperçu de l’imagerie à l’aide du mode FAST LIVE et ajustez la mise au point fine de l’objet d’imagerie sur une section d’intérêt.
      ATTENTION : Respectez strictement les règles de sécurité laser. Tenez toujours compte des règles de sécurité laser et attendez que l’imagerie s’arrête avant d’allumer la lumière de transmission, de regarder dans l’oculaire ou sur l’échantillon.
      REMARQUE : En mode FAST LIVE , un balayage haute vitesse de 600 Hz (correspond à une fréquence d’images maximale de 4,43/s si le mode de balayage X bidirectionnel est utilisé), une résolution de 256 x 256 pixels sont appliquées automatiquement à l’image pour protéger la fluorescence du photoblanchiment. Ouvrez le sténopé (par exemple, à 3-4 UA) et/ou augmentez l’intensité du laser si le signal de fluorescence est trop faible pour faire la mise au point sur l’objet. Évitez la collecte incomplète de pourritures.
    10. (Facultatif pour FLIM) En regardant un histogramme d’intensité de pixel apparaissant pendant l’imagerie dans la fenêtre d’un module FLIM (mode en direct ), ajustez l’intensité laser/la taille et la résolution appropriées pour atteindre le taux de comptage ~1 photon/limite d’impulsion laser (ligne rouge). Évitez d’aller nettement au-dessus de 1 pour exclure un risque d’effet d’carambolage. Si nécessaire, ajustez le taux de répétition des impulsions WLL pour avoir une collection complète de désintégrations dans une fenêtre de décroissance (pour éviter une collecte incomplète, voir l’étape 2.2.8).
      REMARQUE : Si le nombre de photons (intensité) n’est pas suffisant pour reconstruire une décroissance fiable pour l’analyse d’ajustement ou le nuage de tracé de phaseur, appliquez plusieurs répétitions de balayage (images ou lignes, ou configurez le temps de balayage), augmentez l’intensité du laser et/ou sacrifiez la résolution (taille de la zone d’intérêt numérisée). Sachez que la diminution du taux de répétition du laser nécessite la collecte d’un plus grand nombre de photons pour une reconstruction fiable de la désintégration, et qu’une correction supplémentaire des paramètres d’imagerie peut être nécessaire. Soyez conscient de l’impact potentiel d’une lumière intense et d’un éclairage continu long sur la viabilité cellulaire et le métabolisme55. L’impact négatif sur la viabilité et le métabolisme peut être différent dans chaque cas individuel, en fonction de l’intensité, de la durée et de la longueur d’onde de la lumière d’excitation, ainsi que de la modalité d’imagerie (par exemple, imagerie confocale à un photon ou imagerie multiphotonique). Ajuster les paramètres d’imagerie en conséquence et, si nécessaire, contrôler la vivie/mort cellulaire par Calcein Green-AM ou l’intensité de l’iodure de propidium dans les expériences pilotes56. Dans la mesure du possible, d’autres optimisations du protocole de coloration de la sonde de fluorescence doivent être envisagées pour atteindre un signal de fluorescence adéquat pendant la microscopie en direct.
    11. (Facultatif pour 3D z-stack) Dans Fast Live , définissez les coordonnées, la direction du balayage et attribuez-les au début et à la fin dans la fenêtre Z-stack (mode de balayage XYZ). Choisissez la taille du pas Z ou le nombre de pas.
      REMARQUE : Bien que le logiciel calcule automatiquement le nombre « optimal » d’étapes, en fonction de la résolution utilisée et des paramètres de numérisation, la reconstruction 3D en direct peut normalement nécessiter un plus petit nombre d’étapes pour obtenir une acquisition rapide, par exemple, une taille de pas de 1 à 2 μm, une taille de pile de 50 à 100 μm, une numérisation bidirectionnelle, nécessitant 2 à 3 minutes du temps de numérisation total. Sachez que les organites subcellulaires, les cellules et le modèle cellulaire 3D peuvent également se déplacer pendant les mesures. De plus, en raison de la profondeur de pénétration de la lumière et des limites de diffusion, il n’est généralement possible d’atteindre qu’une profondeur de balayage de 50 à 100 μm sur le FLIM confocal.
    12. Lorsque tous les paramètres nécessaires sont appliqués, démarrez l’imagerie.
    13. Donnez à l’image un nom approprié.
    14. Recherchez l’objet d’imagerie suivant en mode lumière de transmission et répétez la procédure d’imagerie avec les paramètres d’imagerie précédemment optimisés (étapes 2.2.8 à 2.2.12).
      REMARQUE : Pour la comparaison basée sur l’intensité ou l’analyse du rapport d’intensité (par exemple, l’analyse de l’oxygénation basée sur la sonde MMIR O2), conservez toujours les mêmes paramètres d’imagerie pour tous les objets analysés (grossissement et type de lentille d’objectif, intensité laser, puissance et fréquence d’impulsion, longueur d’onde d’excitation, portée des détecteurs, sténopé, vitesse de balayage, temps de séjour des pixels et résolution). Cependant, comme la durée de vie de la fluorescence ne dépend pas de l’intensité de la fluorescence et nécessite la collecte d’un nombre approprié de photons pour un calcul fiable, les paramètres d’imagerie FLIM peuvent être réajustés au cours de l’expérience pour maintenir le nombre de photons collectés comparables entre différents traitements ou conditions expérimentales. Par conséquent, pour l’analyse multiparamétrique où l’analyse basée sur l’intensité et l’analyse basée sur la durée de vie de la fluorescence sont toutes deux nécessaires, des paramètres d’imagerie universels optimisés doivent être appliqués pour tous les objets des groupes expérimentaux comparés. Pour la comparaison « FLIM uniquement », il est possible de comparer les images acquises avec des paramètres d’imagerie légèrement différents, car le logiciel LAS X fournit le calcul de l’IRF pour la mesure d’image individuelle42. Cependant, pour l’analyse d’ajustement FLIM en dehors de LAS X (par exemple, FLIMfit45), la fonction de réponse de l’instrument (IRF) doit être mesurée pour chaque condition d’imagerie différente, car elle ne peut pas être exportée à partir du logiciel d’imagerie. Par conséquent, pour la simplicité de la conception expérimentale et de la charge de travail, il est recommandé d’appliquer les mêmes paramètres d’imagerie à toutes les images de l’ensemble de données. Ensuite, les mesures IRF correspondantes peuvent être effectuées à l’aide de fluorophores à durée de vie éteints ou à fluorescence rapide (dans la gamme ps) avec les propriétés d’émission du canal spectral mesuré 57,58,59, par luminescence de nanoparticules d’or 60 ou par signal de génération de seconde harmonique pour le multiphoton FLIM61. Dans le logiciel LAS X, les paramètres d’imagerie précédemment optimisés peuvent être chargés pour un nouveau projet en faisant un clic droit sur le fichier qui vous intéresse et en choisissant Appliquer les paramètres d’image.
    15. Une fois la session d’imagerie terminée, enregistrez le projet d’imagerie. Pour finaliser la séance d’imagerie, retirez l’échantillon de la platine de microscopie et nettoyez l’objectif du liquide d’immersion (le cas échéant) selon la procédure standard mise en œuvre dans l’installation d’imagerie. Fermez le projet et le logiciel. Éteignez le microscope, les lasers et tous les appareils connectés.
    16. Procédez à l’analyse des données d’imagerie (étape 2.3).
  3. Traitement d’images de phaseur NAD(P)H/FAD-FLIM avec le module LAS X FLIM et FIJI
    REMARQUE : Le protocole décrit une analyse de la durée de vie en fluorescence de sphéroïdes imagés pour les données dans le domaine fréquentiel sur des exemples de NAD(P)H et de FLIM d’autofluorescence FAD/Flavines. La mesure de l’autofluorescence NAD(P)H est devenue un étalon-or pour l’analyse métabolique, où les composants courts et plus longs de la durée de vie de l’autofluorescence NAD(P)H sont associés à la glycolyse ou à la phosphorylation oxydative (OxPhos), respectivement. Cela peut être analysé par le décalage sur un diagramme de phaseur le long de la trajectoire métabolique vers les étalons mesurés de NAD(P)H libre ou de NAD(P)H lié aux protéines31,62. Pour analyser la trajectoire du décalage métabolique, ainsi que pour comparer la position des nuages de phaseurs (voir la NOTE ci-dessous l’étape 2.3.6) sur un graphique entre groupes expérimentaux, une analyse simplifiée des coordonnées de phaseur, basée sur le calcul du centre géométrique (centroïde) du nuage de phases, a été mise en œuvre29. Le protocole décrit illustre le calcul des coordonnées du centroïde en FIDJI et la mesure de la distance entre deux points sur un tracé de phaseur à l’aide de coordonnées (par exemple, la distance entre un centroïde du nuage de phaseur d’autofluorescence SPHÉROÏDE NAD(P)H et un point théorique « NAD(P)H libre »). De même, les signaux FAD et autres signaux d’autofluorescence peuvent être analysés. Un ensemble de données 1 avec .lif (logiciel LAS X requis) ou .ptu formats de fichiers pour l’apprentissage de cette procédure sont fournis (Dossier supplémentaire 2, Fichier supplémentaire 3, Fichier supplémentaire 4, Fichier supplémentaire 5, Fichier supplémentaire 6, Fichier supplémentaire 7, Fichier supplémentaire 8, Fichier supplémentaire 9, et Dossier supplémentaire 10).
    1. Ouvrez le module FLIM dans LAS X, sélectionnez Ouvrir le projet et chargez le fichier d’image du sphéroïde (.lif) pour l’analyse NAD(P)H/FAD d’autofluorescence.
      REMARQUE : En raison de bogues potentiels et de pertes de données intermédiaires dans le module FLIM, utilisez une copie du fichier image sphéroïde d’origine (.lif) pour l’analyse NAD(P)H/FAD, en gardant le fichier brut inchangé.
    2. Sélectionnez une seule image et accédez à l’interface d’analyse FLIM. Cliquez sur Phaseur pour accéder au tracé du phaseur et activer le mode d’analyse du phaseur. Appliquez le filtre (Médiane ou Ondelettes) et définissez le Seuil pour minimiser le bruit et améliorer la visibilité des données pour toutes les analyses de phaseur. Choisissez les harmoniques. Pour l’analyse du changement métabolique basée sur les données NAD(P)H, passez aux étapes 2.3.3 à 2.3.5. Pour la comparaison générale des diagrammes de phaseur, passez à l’étape 2.3.6.
      REMARQUE : Appliquez les paramètres d’analyse (type de filtre, harmoniques, seuil, binning et ROI de phaseur) de la même manière à toutes les images d’un ensemble de données comparées.
    3. (Facultatif pour l’analyse du NAD(P)H) Choisissez n’importe quelle image liée à un jeu de données et utilisez l’option Dessiner le curseur de rapport pour deux composants pour localiser avec précision la position de 0,45 ns sur un cercle universel d’un espace de tracé de phaseur standard. Cette position sera attribuée à une durée de vie moyenne de fluorescence d’une solution homogène pure de NAD(P)H libre, qui est normalement proche de la désintégration mono-exponentielle62.
      REMARQUE : Le NADH libre et le NAD(P)H libre ont des propriétés spectrales similaires et des valeurs similaires de durée de vie de fluorescence dans une solution aqueuse, avec deux composants à courte durée de vie, 0,3 ns et 0,7 ns63. Ainsi, pour la simplicité de l’analyse basée sur le phaseur et en raison d’une petite différence entre les composantes de la durée de vie, leur décroissance de fluorescence est acceptée comme étant mono-exponentielle, ce qui permet d’attribuer le nuage de phaseur sur un cercle universel. La durée de vie moyenne de référence d’une forme de NAD(P)H libre peut également être mesurée et tracée dans un espace de phaseur pour une analyse similaire. La durée de vie de référence a été choisie sur la base de la littérature62 ; notez que dans d’autres sources, on peut trouver une valeur légèrement différente d’un NAD(P)H libre en solution (0,4 ns64).
    4. (Facultatif pour l’analyse du NAD(P)H) Exportez le tracé de phaseur avec la durée de vie libre NAD(P)H allouée (voir étape 2.3.3) en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le graphique et en sélectionnant Exporter les données. Exportez le tracé du phaseur sous forme de fichier au format .tiff vers un dossier de stockage désigné.
      REMARQUE : La taille en pixels d’origine de l’image du tracé de phaseur exportée à partir du module LAS X FLIM est toujours de 1024 x 600 pixels. Si un autre logiciel est utilisé pour l’exportation et la pré-analyse des données, assurez-vous que toutes les images du tracé du phaseur sont exportées avec la même taille et la même résolution.
    5. Pour exporter un nuage de phaseurs lié à un sphéroïde, utilisez l’outil Dessiner le curseur du module LAS X FLIM pour choisir la ROI du sphéroïde sur l’image. Exportez le tracé de phaseur généré comme indiqué à l’étape 2.3.4.
      REMARQUE : Les coordonnées g et s correspondantes (similaires à x et y) de l’espace de phaseur seront attribuées à chaque pixel du ROI choisi, en fonction de leur durée de vie, transformé en un ensemble de données de domaine fréquentiel64,65. Le groupe de pixels avec des valeurs similaires de tf (durée de vie de la phase) et tm (durée de vie de la modulation) formera un motif de nuage (nuage de phase) sur un graphique, où le codage couleur (avec une plage allant du bleu profond au rouge) reflétera l’abondance des valeurs de durée de vie. Par la position du nuage sur un cercle universel ou à l’intérieur, les décroissances mono- ou multi-exponentielles peuvent être distinguées. Certains milieux de mesure présentent une forte (auto)fluorescence, conduisant à l’apparition d’un nuage correspondant sur un tracé de phaseur, qui ne peut pas être simplement éliminé avec le seuil de moyen d’intensité. Ce motif influencera le calcul des coordonnées du centroïde et doit être exclu du tracé de phaseur exporté. L’utilisation du retour sur investissement du sphéroïde permet d’exclure les pixels non liés de l’analyse ultérieure du phaseur.
    6. Répétez la procédure d’exportation du tracé de phaseur pour tous les ROI de sphéroïdes dans un ensemble de données (voir les étapes 2.3.4 et 2.3.6). De plus, vérifiez l’ensemble des images .tiff exportées pour garantir l’ensemble des données pour une analyse comparative plus approfondie et assurez-vous que toutes les images exportées ont la même taille de pixel (voir REMARQUE à l’étape 2.3.4).
      REMARQUE : À ce stade du protocole, l’ensemble d’images doit inclure le phaseur avec l’emplacement du NAD(P)H libre (basé sur la littérature ou les données obtenues empiriquement) et tous les tracés de phaseur de ROI sphéroïdes (ou d’autres modèles de ROI si nécessaire pour l’analyse spécifique). À partir de cette étape, une analyse plus approfondie sera effectuée aux FIDJI et par la suite dans une feuille de calcul. À l’aide de la fenêtre d’outils Analyser , définissez l’option Échelle dans FIJI et assurez-vous que toutes les images du tracé de phaseur sont calibrées avec le même type d’unité, par exemple, uniquement en pixels. Si ce n’est pas le cas, définissez l’unité de longueur dans la fenêtre Définir l’échelle pour l’unité choisie (par exemple, pour une échelle basée sur les pixels, mettez 1 dans le champ Distance en pixels et définissez l’unité de longueur sur Pixel). Pour une comparaison plus approfondie, mesurez toutes les données exportées à l’aide du même type d’unité.
    7. (Facultatif pour l’analyse du NAD(P)H) Déterminer la position du point de pixel d’une durée de vie moyenne de fluorescence en NAD(P)H libre sur l’image correspondante du tracé de phaseur exporté (voir étape 2.3.3) : Ouvrez l’image du phaseur avec FIJI, agrandissez l’image pour visualiser clairement, avec une résolution de pixel, l’intersection entre le demi-cercle universel et la ligne du curseur de rapport pour deux composants ; utilisez l’outil ROI Rectangle pour sélectionner l’intersection.
      REMARQUE : Assurez-vous que la sélection rectangulaire se trouve dans une petite zone autour du point d’intersection pour déterminer avec précision ses coordonnées à l’étape suivante (étape 2.3.9).
    8. (Facultatif pour l’analyse du NAD(P)H) Ouvrez l’outil Analyser , choisissez la fenêtre Définir les mesures , puis sélectionnez Centroid comme paramètre de mesure. Cliquez sur Mesurer dans la fenêtre de l’outil Analyser pour déterminer les coordonnées du centroïde du point de référence NAD(P)H libre. Exportez ces coordonnées vers une feuille de calcul.
      REMARQUE : Les coordonnées NAD(P)H libres seront utilisées comme point de référence pour comparer les distances entre ce point et la position du nuage de phasor sphéroïde dans un ensemble de données (la façon de caractériser le décalage métabolique entre la glycolyse et l’OxPhos dans l’analyse d’autofluorescence NAD(P)H FLIM)
    9. À l’aide de FIJI, ouvrez l’image du nuage de phaseurs sphéroïdes. Ouvrez l’outil Fenêtre d’image , choisissez Ajuster, puis sélectionnez Seuil de couleur dans la barre d’outils. Sélectionnez la méthode de seuillage de votre choix (par exemple, Otsu) et définissez la valeur de teinte et la valeur de luminosité pour affiner les paramètres de sélection d’une pièce de nuage de phaseur avec les coordonnées de pixels les plus abondantes. Cliquez sur Sélectionner pour définir la zone du cluster.
      REMARQUE : Conservez les mêmes paramètres de seuil pour toutes les images de tracé de phaseur, qui doivent être analysées. Pour les données NAD(P)H-FLIM présentées, la méthode de seuillage Otsu avec une valeur de teinte de 9 et une valeur de luminosité de 160 a été choisie et appliquée à toutes les images de phaseur. Alternativement, la zone sélectionnée peut être copiée dans le gestionnaire de retour sur investissement (suivez le chemin Modifier > Sélection > Ajouter au gestionnaire) pour créer une bibliothèque de retours sur investissement de phaseur pour une analyse plus approfondie.
    10. Tout en conservant la sélection, calculez les coordonnées du centroïde de la zone sélectionnée en suivant la procédure décrite à l’étape 2.3.9. Exportez ces coordonnées dans le fichier de tableur.
    11. Répétez les étapes 2.3.9 et 2.3.10 pour déterminer les coordonnées du centroïde de toutes les images de phaseur de retour sur investissement afin de créer un ensemble de données dans la feuille de calcul.
      REMARQUE : L’utilisation de la bibliothèque ROI Manager permet de simplifier et d’organiser l’analyse du ROI (voir étape 2.3.10)
    12. (Facultatif pour l’analyse du NAD(P)H) Ouvrez la feuille de calcul avec les coordonnées de référence de NAD(P)H et les ROI sphéroïdes exportés de différents groupes de comparaison. Calculer la distance entre chaque centroïde de phaseur de sphéroïde et la position de référence du NAD(P)H libre à l’aide des coordonnées déterminées et de l’équation suivante :
      figure-protocol-1
      Où Xc et Yc sont les coordonnées du centroïde, Xf et Yf sont les coordonnées de référence.
      REMARQUE : L’application du paramètre centroïde pour déterminer le décalage vers la durée de vie de référence n’est appropriée que si tous les centroïdes d’un ensemble de données se trouvent sur la même trajectoire linéaire vers le point de référence. Pour vérifier cela, tous les points de centroïde de l’ensemble de données doivent être tracés avec le point de référence dans le même espace de coordonnées, et l’alignement de tendance linéaire doit être effectué. Si le coefficient R2 de la droite de tendance linéaire tracée par tous les points est proche de 1 (par exemple, R2 est compris entre 0,8 et 0,99), l’analyse de distance est considérée comme appropriée.
    13. Organisez toutes les données en conséquence pour la comparaison et effectuez des analyses statistiques à l’aide de tout logiciel correspondant (par exemple, Origin, MatLab). Choisissez le test statistique approprié en fonction des caractéristiques de l’ensemble de données (normalité de distribution, nombre d’unités statistiques, etc.).
      REMARQUE : Pour l’analyse NAD(P)H, comparer les valeurs de distance afin de caractériser le décalage métabolique en fonction des conditions expérimentales. Pour comparer les tracés de phaseur entre les groupes expérimentaux, effectuez la comparaison des coordonnées des centroïdes du nuage de phaseur ROI.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choisir la méthode de formation de sphéroïde appropriée
La méthode de formation des sphéroïdes choisie peut grandement influencer la taille, la forme, la densité cellulaire, la viabilité et la sensibilité aux médicaments des sphéroïdes (Figure 2). Auparavant, les effets de plusieurs méthodes à haut débit (SphericalPlate 5D, micromoules fabriqués en laboratoire et moules MicroTissue) et à faible fixation à « débit moyen » (plaques à 96 puits revêtues de Biofloat et Lipidure) ont été comparés sur la viabilité et l’oxygénation des sphéroïdes29.

Ici, différentes méthodes de formation permettent d’obtenir des sphéroïdes de tailles différentes, même avec la même concentration initiale de 500 cellules/sphéroïde. Les sphéroïdes HCT116 formés dans des plaques de 96 puits à faible fixation étaient significativement plus grands par rapport aux méthodes à haut débit après 5 jours de formation (figure 2 et tableau 2). De plus, les méthodes à faible attachement ont conduit au développement évident d’un noyau nécrotique détecté par la coloration à l’iodure de propidium (rouge), tandis que les sphéroïdes générés avec d’autres méthodes (MicroTissue, moules fabriqués en laboratoire et Sphericalplate 5D) ont démontré la distribution diffuse des cellules mortes à travers le corps sphéroïde (Figure 2A). Cette différence de viabilité cellulaire dans le volume du sphéroïde peut également affecter la diffusion de l’oxygène à travers le milieu, qui à son tour peut être affecté par la pression partielle d’O2 , le taux de consommation, la température et la solubilité de l’O2 . De plus, dans les méthodes à haut débit, les nutriments s’épuisent et les déchets s’accumulent plus rapidement, car un plus grand nombre de sphéroïdes se trouvent dans le même volume et nécessitent donc un échange de milieu plus fréquent (Figure 2A).

L’oxygénation globale des sphéroïdes a été mesurée à l’aide de la sonde MMIR129 récemment caractérisée et validée, avec un protocole détaillé précédemment rapporté25. L’oxygénation n’a pu être comparée séparément entre les méthodes à haut débit et la méthode à faible fixation (Figure 2B), car le rapport signal/bruit est différent dans toutes les méthodes de formation de sphéroïdes comparées. Les sphéroïdes 5D à plaque sphérique ont montré une oxygénation globale plus faible par rapport au MicroTissue (valeur P = 0,0697) et aux micromoules fabriqués en laboratoire (valeur P = 0,0005) (Figure 2C). Les sphéroïdes produits avec la plaque sphérique 5D sont cultivés à une plus grande distance de la surface de l’interface air-média par rapport aux méthodes de moule à agarose, ce qui ralentit la livraison d’O2 dans la culture statique. Cette hypothèse est valable car les valeurs d’oxygénation entre les deux plaques de fixation faibles et, en outre, entre les deux méthodes de moulage de l’agarose sont statistiquement similaires (Figure 2D).

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Figure 2 : Les méthodes de formation des sphéroïdes affectent la morphologie, la taille, la viabilité et l’oxygénation. (A) Les sphéroïdes HCT116 (densité d’ensemencement initiale de 500 cellules) ont été cultivés pendant 5 jours avant une coloration de 1 h avec de l’iodure de propidium (nécrose cellulaire, rouge, 1 μg/mL) et du Calcein Green-AM (cellules viables, vertes, 1 μg/mL). Les méthodes de formation à faible attachement produisent des sphéroïdes plus gros contenant un noyau nécrotique (rouge). La barre d’échelle est de 100 μm. (B) L’oxygénation dans les sphéroïdes HCT116 (ensemencement initial de 500 cellules avec ajout de 20 μg/mL de MMIR1 pendant la formation des sphéroïdes, 6 jours) produite par différentes méthodes a montré plus de sphéroïdes oxygénés avec le MicroTissue et les micromoules fabriqués en laboratoire que le SphericalPlate 5D. (C) Oxygénation globale des sphéroïdes calculée par les mesures de rapport. (D) La taille des sphéroïdes est carrée après 5 jours. Les résultats montrent la ± moyenne SEM de 6 à 16 sphéroïdes. 5D = Plaque sphérique 5D, MM = Méthode Micromold, MT = Méthode MicroTissu. La valeur P < 0,001 et la valeur P <0,0001 Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Méthode de formationQuantité de sphéroïdes par puitsQuantité totale de cellules ensemencées par puitsSuperficie carrée (μm²)
Microtissus8140 500 cellules/190 μl112 558 ± 15 702
Micropuits fabriqués en laboratoire1859794 500 cellules / mL53 460 ± 8 332
à plaque sphérique 5D750375 000 cellules / mL44 048 ± 7 259
Lipidure1500 / 200 μL257 148 ± 28 132
Bioflotteur1500 / 200 μL254 475 ± 21365

Tableau 2 : Différentes méthodes de formation des sphéroïdes entraînent des différences dans la taille des sphéroïdes, mesurée par carré d’aire.

Lors de la sélection d’une méthode de formation de sphéroïde spécifique pour les expériences, il faut garder à l’esprit que l’ajout de nanoparticules peut influencer la forme du sphéroïde. Lors de l’utilisation d’un revêtement à base de lipides avec des micropuits à fond rond, des précipitations de sonde peuvent se produire, entraînant la formation de « sphéroïdes satellites » ou de sphéroïdes non circulaires (figure 3). L’ajout de la sonde O2 à la plaque commerciale Biofloat entraîne une périphérie sphéroïde non compacte, suggérant l’interférence potentielle des nanoparticules avec le revêtement de la microplaque. La morphologie des sphéroïdes peut également être affectée par la poussière attachée aux pointes des pipettes. Les cellules en suspension peuvent coller à la poussière, affectant ainsi la forme. Par conséquent, il est recommandé d’utiliser des pointes de pipette rechargeables déjà fournies dans un rack.

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Figure 3 : Images de microscopie à lumière de transmission avec des exemples de formation de sphéroïdes non idéale. Un stockage incorrect des nanoparticules peut provoquer une précipitation de la sonde, interférant avec la formation de sphéroïdes. Exemples d’interférence de la sonde et de la poussière. La barre d’échelle est de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

De toute évidence, les méthodes de formation des sphéroïdes affectent la taille, la morphologie et la viabilité du sphéroïde, et entraînent des différences dans leur oxygénation. La méthode à haut débit avec des moules à agarose (par exemple, disponibles dans le commerce, tels que les moules MicroTissue) est compatible avec la plupart des expériences. Il en résulte une forme plus reproductible, n’induit pas de précipitation de nanoparticules, est réutilisable et peut être compatible avec la microscopie de suivi directe. Cependant, pour les grands sphéroïdes (>800 μm) et la culture à long terme, la méthode à faible fixation est recommandée car les méthodes à haut débit nécessiteraient un échange fréquent de milieux. Dans un tel cas, le problème de la précipitation des nanoparticules et son influence sur la formation des sphéroïdes peuvent être évités par la pré-coloration pendant la nuit de la culture monocouche 2D avant la formation des sphéroïdes (Figure 4).

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Figure 4 : Algorithme suggéré pour sélectionner la méthode de formation de sphéroïdes pour la microscopie à fluorescence en direct. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  

L’imagerie FLIM multiparamétrique des sphéroïdes NAD(P)H par microscopie FLIM à deux photons révèle une hétérogénéité métabolique chez les sphéroïdes HCT116
Marqueur d’autofluorescence important dans l’imagerie métabolique sans marquage, le NAD(P)H montre une durée de vie plus courte pour la glycolyse et une durée de vie plus longue pour OxPhos, ce qui permet de déchiffrer la distribution spatiale de l’activité métabolique dans des modèles 3D tels que les sphéroïdes et les organoïdes31. Pour analyser facilement la distribution du NAD(P)H dans les sphéroïdes HCT116, une méthode quantitative basée sur le phaseur pour l’analyse du NAD(P)H par autofluorescence a été utilisée, révélant les états liés à la glycolyse et à la phosphorylation oxydative (OxPhos). Alors que les images de l’intensité de fluorescence des sphéroïdes HCT116 n’ont pas révélé de différences significatives entre les sphéroïdes, l’imagerie FLIM rapide du NAD(P)H a révélé une nette différence dans les sections optiques des sphéroïdes. Dans les images FLIM rapides, les sphéroïdes dont la zone interne présente une durée de vie de fluorescence plus courte ont été marqués d’un cercle blanc, identifiant cela comme un noyau glycolytique (Figure 5A). Par conséquent, les sphéroïdes ont été divisés en deux groupes, le groupe glycolytique et le groupe non glycolytique, en fonction de la présence ou de l’absence d’un noyau glycolytique. Une analyse de phaseur basée sur les centroïdes a été utilisée pour analyser statistiquement les différences entre deux groupes distincts et mesurer la distance entre le centroïde de l’amas de pixels et le point NAD(P)H libre. Comme l’illustre la figure 5B, il y avait une différence évidente entre le groupe glycolytique et le groupe non glycolytique sur le graphique des phaseurs. Pour mesurer avec précision la distance, le point NAD(P)H libre sur le diagramme de phaseur a été marqué avec précision à l’aide du module FLIM du logiciel LAS X, puis exporté dans le logiciel FIJI pour la détermination des coordonnées exactes. Par la suite, conformément au protocole 2.3, les coordonnées du centroïde ont été mesurées dans le diagramme de phaseur de chaque groupe à l’aide du logiciel FIJI. La distance (D) entre le centroïde et le point NAD(P)H libre, à l’aide du théorème de Pythagore, a été calculée en facilitant l’analyse des profils NAD(P)H pour distinguer les sphéroïdes d’OxPhos et les sphéroïdes à noyau glycolytique. Les résultats, tels qu’ils sont présentés dans la boîte à moustaches, montrent les différences de distance significatives entre les sphéroïdes du noyau glycolytique et le groupe du noyau non glycolytique (valeur P < 0,001) (figure 5C). Ce résultat était cohérent avec l’imagerie FLIM rapide, démontrant que cette méthode d’analyse de phaseur est adaptée à l’analyse quantitative de la divergence NAD(P)H des populations de sphéroïdes. De plus, pour valider si cette approche était applicable pour comparer la distance entre les deux groupes de sphéroïdes, une analyse de régression linéaire pour les centroïdes des deux groupes et le point NAD(P)H libre a été effectuée (Figure 5D). Le résultat a montré que les centroïdes sont alignés avec le NAD(P)H libre, avec un coefficient de corrélation élevé (R2 = 0,997), validant la faisabilité de la comparaison de la distance pour déduire la différence NAD(P)H entre les groupes de sphéroïdes.

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Figure 5 : Analyse par phaseur de sphéroïdes HCT116 réalisée à l’aide de plaques à faible fixation : comparaison des noyaux glycolytiques et non glycolytiques de la distribution du NAD(P)H via FLIM à deux photons. Paramètres d’acquisition : intensité laser : 15%, résolution : 512 x 512 pixels, ex. 741 nm/em. 411 à 491 milles marins. (A) L’intensité de fluorescence et les images FLIM rapides montrent la distribution du NAD(P)H dans les sphéroïdes HCT116, distinguant les sphéroïdes avec noyau glycolytique (à gauche) de ceux sans (à droite). Le cercle blanc dans l’image rapide FLIM présentait une zone de vie plus courte, définissant un noyau glycolytique. Densité d’ensemencement initiale : 50 cellules (à gauche) et 500 (à droite), temps d’incubation : 6 jours, barre d’échelle : 50 μm. (B) Méthodologie de mesure de la distance entre le centroïde des sphéroïdes HCT116 et le point NAD(P)H libre sur les parcelles de phaseur, à l’aide du module LAS X FLIM et du logiciel FIJI sur deux groupes de sphéroïdes distincts (D : distance). Pour les sphéroïdes HCT116, un filtre à ondelettes et une valeur seuil de 10 ont été utilisés pour le diagramme de phaseur. (C) Boîte à moustaches montrant la différence de distance entre le centroïde et le point NAD(P)H libre, comparant les groupes de noyaux glycolytiques et non glycolytiques (***P < 0,001). (D) L’ajustement linéaire des centroïdes du diagramme de phaseur à partir du noyau glycolytique, des groupes de noyaux non glycolytiques et des coordonnées théoriques NAD(P)H libres a démontré un alignement linéaire précis avec R2 = 0,997, permettant une comparaison directe de la différence de distance entre les sphéroïdes du noyau glycolytique et des sphéroïdes non glycolytiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Analyse multiplexée de l’autofluorescence et de l’hypoxie de la FAD dans les sphéroïdes de cellules souches de la pulpe dentaire humaine (DPSC)
Les sphéroïdes de cellules souches de la pulpe dentaire sont un outil expérimental attrayant pour la biofabrication de différents tissus, y compris les ostéoblastes 25,66,67. Cependant, leur viabilité et leur métabolisme sont rarement étudiés. Ces sphéroïdes dérivés de cellules souches présentent des tailles plutôt petites (<200 μm), une autofluorescence vert vif à partir de FAD/Flavines (plus tard appelées FAD) (ex. 460 nm, em. 550 nm) et la présence de gradients hypoxiques « directs » et « inversés »29. La figure 6 montre les résultats de l’imagerie ratiométrique confocale combinée de l’oxygénation des sphéroïdes (à l’aide de nanoparticules sensibles O2 MMIR) et de l’autofluorescence FLIM de FAD. Le gradient d’oxygénation directe « classique » a été observé chez les sphéroïdes de 69 mm de diamètre, tandis que les sphéroïdes plus grands (141 μm) présentaient un gradient « inversé ». L’ajout de FAD-FLIM à ces mesures permet de valider les différences dans le métabolisme oxydatif, comme le démontrent les graphiques rapides FLIM et Phasor : les petits sphéroïdes présentaient une fraction plus importante de durées de vie plus longues des FAD, indiquant potentiellement une activité glycolytique plus élevée chez les sphéroïdes de plus petite taille.

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Figure 6 : Exemple d’imagerie multiparamétrique de l’autofluorescence de la flavine (ex. 460 nm/em. 510-590 nm) et de l’oxygénation (analyse du rapport d’intensité avec des nanoparticules sensibles au MMIR O2 : ex. 614 nm/référence em. 631-690 nm / em. sensible 724-800 nm) dans des sphéroïdes hDPSC de différentes tailles (petits : 188 cellules/sphéroïde, grands : 820 cellules/sphéroïde), produits par la méthode des micromoules d’agarose autoproduits à haut débit (FLIM confocal). B) Exemple représentatif du rapport d’intensité d’oxygénation et de l’imagerie de la durée de vie de la flavine-autofluorescence dans les sphéroïdes hDPSC grands (A, « B Sphs ») et petits (B, « S Sphs »). (C, D) Analyse comparative de la durée de vie de l’autofluorescence de la flavine à l’aide de l’analyse des nuages de tracé de phaseur, basée sur la comparaison des centres géométriques des nuages de phases. (E) Les coordonnées des centroïdes de pixels (centres géométriques) de l’autofluorescence de la flavine à partir du grand sphéroïde hDPSC (B Sphs) et du petit sphéroïde hDPSC (S Sphs) sur le graphique du phaseur. Deux codes de couleur différents appliqués pour différentes approches d’analyse FLIM, où le codage couleur avec τ montre la distribution du temps moyen d’arrivée des photons (images FAST-FLIM), tandis que le codage couleur avec la phase τ φ - tau correspond à l’analyse phaseur-FLIM de la durée de vie de la fluorescence dans les mêmes sphéroïdes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Analyse multiplexée de l’autofluorescence de la FAD et de la mort cellulaire chez les sphéroïdes iPSC humains
Les sphéroïdes de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) sont souvent utilisés comme première étape lors de l’induction de la différenciation tissulaire spécifique et de la production d’organoïdes, par exemple dans le cas de la culture d’organoïdes neuraux. En fonction de leur manipulation et du protocole de génération spécifique, la viabilité et la reproductibilité ultérieure des organoïdes peuvent être gravement affectées. L’étude non destructive des organoïdes et des sphéroïdes contenant des cellules progénitrices neurales est cruciale pour l’évaluation structurelle, la surveillance et la prédiction de la qualité des tissus neuronaux en croissance et assemblés au cours de leur développement68,69. La figure 7A montre que la FLIM non destructive des molécules autofluorescentes de Flavine/FAD peut nous donner des informations sur la viabilité des sphéroïdes iPSC. L’imagerie a été réalisée 4 jours après l’ensemencement de 9 000 iPSC dans des puits commerciaux à plaques de fixation ultra-basse (Corning). Avant l’imagerie, les sphéroïdes ont été colorés pendant 1 h avec 0,5 μg/mL d’iodure de propidium (PI) pour visualiser les cellules mortes. Aucun noyau nécrotique n’a été observé chez ces sphéroïdes iPSC avec une densité d’ensemencement de 9 000 cellules après 4 jours. Trois motifs principaux peuvent être distingués sur le graphique de phaseur correspondant de l’autofluorescence flavine/FAD (figure 7B panneau de gauche) : motif d’autofluorescence média (couleur magenta), motif (avec une moyenne τ φ - phase tau, ~2,6 ns) correspondant à l’absence de régions PI (ROI1) et motif (avec une moyenne τ φ ~3,1 ns) de régions corrélées avec le marqueur de mort cellulaire - coloration (ROI2). Une comparaison supplémentaire de cultures 2D de cellules IP traitées et non traitées par IP n’a montré aucun impact de la PI sur l’apparition de motifs de phaseurs flavine / FAD à longue durée de vie (Figure 7C), indiquant que cette augmentation de la durée de vie des flavines / FAD peut être un marqueur indépendant de la viabilité compromise des cellules iPSC et de leurs cellules dérivées. Bien que cette observation soit conforme au récent rapport sur l’imagerie basée sur l’intensité70, nous ne pouvons pas totalement exclure la présence d’une intensité d’iodure de propidium avec canal d’émission de FAD (506-582 nm). Une enquête plus approfondie est nécessaire pour prouver le lien entre les changements de durée de vie des flavines / FAD et les événements potentiels de mort cellulaire. L’analyse multiparamétrique simple basée sur le phaseur des régions de retour sur investissement démontre une méthode élégante pour un criblage et une analyse de données rapides.

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Figure 7 : Coloration FLIM confocale par autofluorescence de flavine et à l’iodure de propidium dans des sphéroïdes d’iPSC pour évaluer la viabilité cellulaire. (A) Autofluorescence de flavine (à gauche) et iodure de propidium - PI (à droite) FLIM d’un sphéroïde d’iPSC 4 jours après l’ensemencement de 9 000 cellules dans une plaque d’attache ultra-faible (Corning) et coloration IP (0,5 μg/mL, 1 h) avant l’imagerie. (B) Analyse en diagramme de phase des images globales de l’autofluorescence de la flavine (à gauche) et de l’iodure de propidium (à droite) et des zones d’intérêt correspondantes (ROI1 - vert et ROI2 - rouge, autofluorescence du milieu - magenta). Les zones d’intérêt ont été sélectionnées en fonction de la présence d’un marquage à l’iodure de propidium. (C) analyse FLIM rapide et en diagramme de phaseur de l’autofluorescence des flavines en culture 2D d’iPSC traitées et non traitées avec IP (0,5 μg/mL, 1 h). Aucun impact de la coloration PI sur l’apparence de la longue durée de vie en fluorescence des flavines (correspond à un motif de phaseur dans un cercle rose) n’a été détecté lors de la collecte de l’excitation des flavines dans une plage de 469 à 542 nm. Cette gamme de détecteurs ne chevauche pas le spectre d’excitation de PI (550-720 nm). Lorsqu’une plage d’excitation plus large pour la DCP est collectée (469-590 nm), un impact de PI peut être remarqué. Le codage couleur de l’image correspond aux valeurs moyennes du temps d’arrivée des photons (fast-FLIM). Les paramètres d’imagerie étaient T = 35 °C, objectif d’immersion dans l’eau 25X/0,95 (A-B), objectif glycérol 40X/1,25 (C). Flavines : ex. 460 nm, em. 506-582nm (A-B), sténopé 4 AU. PI : ex. 535 nm, em. 584-667 nm, sténopé 1 UA. Canaux : Intensity et Tau. Le taux de répétition de 40 MHz pour collecter la désintégration complète de l’autofluorescence de Flavin. Paramètres d’analyse du phaseur ; Harmonique 1, seuil 1 (A-B), 47 (C), filtre médian 17 (A-B), 11 (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Protocoles supplémentaires sur la formation des sphéroïdes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Données FLIM du noyau glycolytique et du noyau non glycolytique.lif. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Données FLIM du noyau glycolytique.ptu. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4 : Données FLIM du core.ptu non glycolytique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 5 : Noyau glycolytique rapide FLIM.tif Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 6 : Noyau non glycolytique FLIM.tif Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 7 : Noyau glycolytique libre NAD(P)H point.tif Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 8 : Phasor du noyau glycolytique plot.tif Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 9 : Noyau non glycolytique libre NAD(P)H point.tif Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 10 : Phaseur de noyau non glycolytique plot.tif Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les sphéroïdes multicellulaires deviennent une méthode de choix dans l’étude des microenvironnements de niche des tumeurs et des cellules souches, la découverte de médicaments et le développement des « éléments constitutifs tissulaires » pour la biofabrication. L’architecture interne hétérogène des sphéroïdes, les gradients de nutriments et l’oxygénation peuvent imiter ceux des tissus et des tumeurs in vivo dans un cadre relativement simplifié et accessible. Avec la nécessité d’une plus grande transparence méthodologique26,28 et d’une normalisation71, ces protocoles devraient aider les chercheurs à choisir la meilleure méthode de formation de sphéroïdes pour les expériences de microscopie d’imagerie quantitative à durée de vie de fluorescence en direct. Les méthodes présentées tirent parti des capteurs de nanoparticules de coloration cellulaire et de l’autofluorescence cellulaire intrinsèque, qui peuvent être facilement combinées avec la coloration de la mort cellulaire.

Les étapes les plus critiques sont le protocole de formation des sphéroïdes ; Ainsi, pour la méthode à haut débit à base d’agarose, il est essentiel d’équilibrer suffisamment les moules d’agarose pour le milieu de culture. Un temps d’équilibre insuffisant entraînera la dilution des nutriments dans le PBS restant et apportera des facteurs supplémentaires d’hétérogénéité sphéroïde 21,26,72,73. Le moule à agarose fraîchement fabriqué doit également être vérifié visuellement pour la présence de bulles d’air, de micro-fissures et d’autres défauts.

Bien qu’efficace pour l’imagerie, la suspension de nanoparticules peut présenter une auto-agrégation et provoquer la formation de sphéroïdes de forme irrégulière dans les méthodes de formation à faible attachement. Cela peut souvent être atténué par l’ajout de sérum au milieu de culture ou par une pré-coloration de la culture cellulaire monocouche avant la formation de sphéroïdes. Fréquemment, lors de la compactisation des sphéroïdes, l’ajout d’une petite quantité de nanoparticules (par exemple, 10 % de la concentration initiale de coloration) peut également aider à colorer la zone de prolifération des sphéroïdes. Enfin, il est important d’utiliser des pointes de pipette stériles « sans poussière » pour toutes les méthodes de formation.

L’impact potentiel de l’éclairage sur la viabilité cellulaire doit toujours être pris en compte lors des expériences d’imagerie. Ainsi, il est important de connaître les facteurs de risque affectant négativement chaque expérience d’imagerie en direct. En général, les photodommages impliquent plusieurs mécanismes : (1) une forte élévation locale de la température, (2) un stress mécanique et (3) un stress photochimique (réaction oxydative et des radicaux libres)74. En fonction de la modalité d’imagerie (par exemple, imagerie confocale à un photon ou multiphotonique, modes d’éclairage continu ou pulsé, sensibilité des détecteurs et puissance de la source lumineuse à différentes longueurs d’onde si l’accord d’excitation est possible), de la cellule et du type de tissu (par exemple, accumulation de pigments absorbant efficacement la lumière ou d’autres molécules d’autofluorescence en fonction du type de tissu, organisation 3D ou 2D, la croissance et la composition du milieu d’imagerie), l’origine de la sonde fluorescente (par exemple, les propriétés photosensibilisantes) Différentes combinaisons de facteurs de risque peuvent provoquer une phototoxicité pendant l’imagerie. De plus, même si aucune augmentation de la mort cellulaire n’est observée après l’éclairage, les effets antérieurs à la mort dépendants de la puissance lumineuse sur les mitochondries et le métabolisme peuvent potentiellement interférer avec l’analyse et l’interprétation de l’expérience.

Pour exclure l’impact phototoxique sur les résultats expérimentaux, le chercheur doit effectuer une surveillance générale de la viabilité cellulaire et des changements dans la morphologie cellulaire par rapport au contrôle intact ou à l’aide de sondes de mort cellulaire pour estimer l’augmentation du taux de mort cellulaire après éclairage. Si les expériences métaboliques sont réalisées, l’optimisation des paramètres d’imagerie doit être effectuée en conséquence dans les expériences pilotes afin d’estimer et de minimiser l’impact de l’imagerie sur les paramètres métaboliques mesurés. Dans le cas des sondes sensibles à l’oxygène, le surdosage de lumière peut être facilement suivi par une augmentation soudaine de la durée de vie et de l’intensité de la phosphorescence du colorant sensible à l’O2 (modifications correspondantes du rapport d’intensité par rapport au colorant sensible à l’O2) en raison de l’effet dit de « consommation d’O2 photoinduite »53,75. Cela peut être facilement fait par l’analyse de la courbe cinétique d’expériences en accéléré avec différents paramètres de puissance lumineuse en utilisant, par exemple, le protocolepublié suivant 25. En « défense » de l’éclairage pulsé (par exemple, utilisé en microscopie TCSPC-F(P)LIM), les études récentes ont démontré son impact minime sur la production de ROS et le photoblanchiment de la sonde par rapport aux mesures d’éclairage en régime permanent 76,77, soulignant l’avantage supplémentaire de TCSPC-FLIM par rapport à l’approche conventionnelle d’imagerie basée sur l’intensité.

La principale limitation des méthodes de formation de sphéroïdes présentées réside dans les applications de surveillance directe et à long terme. Les moules à agarose nécessitent un objectif à longue distance de travail (ou un microscope vertical supplémentaire ou un stéréomicroscope à fluorescence) en raison de l’épaisse couche d’agarose et le matériau de la Spheriplate 5D peut interférer avec les mesures dans les canaux fluorescents rouges (sonde O2 ). La taille des sphéroïdes produits par les méthodes à haut débit est limitée par le diamètre des micropuits et nécessite un échange fréquent de milieux pour éviter l’épuisement et l’acidification des milieux. Avec toutes ces limitations, nous recommandons les boîtes de Pétri 3D (MicroTissue) pour les expériences nécessitant un débit élevé (par exemple, pour les applications de bio-impression 3D) et les méthodes à faible attachement pour les études de base à « débit moyen », nécessitant également un nombre de cellules plus faible.

La surveillance ratiométrique de l’oxygénation et les expériences conventionnelles de microscopie à fluorescence de cellules vivantes sont abordables sur les microscopes inversés largement disponibles s’ils sont équipés d’une caméra sensible au proche infrarouge (NIR), d’une excitation basée sur des diodes électroluminescentes (LED) et d’un objectif25 approprié. Pour un sectionnement optique et un FLIM plus appropriés, il est recommandé d’utiliser des systèmes de microscope confocal commerciaux disponibles dans le commerce (tels que décrits ici). Bien que nous décrivions également une méthode de détection de l’autofluorescence NAD(P)H, nécessitant un microscope FLIM à deux photons plus coûteux, il existe de nombreuses approches différentes, compatibles et utiles pour les systèmes FLIM confocaux, équipés idéalement d’un laser à lumière blanche et de détecteurs hybrides ou SPAD. Il s’agit notamment de l’évaluation du métabolisme cellulaire, des protéines des biocapteurs FRET-FLIM, de l’imagerie de la mécanique cellulaire et tissulaire, de l’autofluorescence de types de cellules et de tissus spécifiques et des interactions récepteur-médicament visualisées via FLIM-FRET31.

Le logiciel d’acquisition et d’analyse FLIM fourni par le fournisseur peut nuire au succès de l’expérience, car il n’est pas toujours possible d’exporter l’IRF ou les images dans un format compatible avec l’analyse open source en aval. Le post-traitement est une partie importante du flux de travail de l’analyse FLIM, et il n’est pas encore universellement normalisé ou accepté. L’ajustement de la courbe nécessite un nombre plus élevé de photons et une puissance de calcul plus importante par rapport à l’approche du phaseur. FLIMfit45 (ajustement global et pixel par pixel) et Flimview78 font partie des logiciels ouverts utilisés pour l’analyse de l’ajustement des courbes, tandis que PAM79, FLUTE64 et AlliGator80 sont utilisés pour l’analyse des phaseurs. FLIMJ46 est un plugin ImageJ utile qui fonctionne avec les deux approches. Dans l’ensemble, ces options contribuent à améliorer la routine de post-traitement et à la rendre plus rapide, plus polyvalente et plus conviviale.

Disclosures

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Rien à divulguer.

Acknowledgements

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Ce travail a été soutenu par les subventions du Fonds spécial de recherche (BOF) de l’Université de Gand (BOF/STA/202009/003 ; BOF/IOP/2022/058), la Fondation Flandre pour la Recherche (FWO, I001922N) et l’Union européenne, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN n° 101073507.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,05 % Trypsine-EDTAGibco25300-054Également disponible chez Sigma
Pipettes sérologiques de 10 mlVWR612-3700Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés
Plaques de culture cellulaire à 12 puits, stérilesGreiner bio-one665-180Des produits similaires sont également disponibles auprès de Sarstedt, Corning et d’autres sociétés.
Lame de chambre 12 puits, amovibleIbidi81201Également disponible chez Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific et autres
Tubes à centrifuger de 15 mLNerbe plus 02-502-3001Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés
Micromoules de boîte de Pétri 3D MicrotissueZ764000-6EA
Plaques de culture cellulaire 6 puits,Greiner stérile bio-one657160Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés
70 %éthanol ChemLabCL02.0537.5000
BiofloatSarstedt83.3925.400Plaque revêtue à 96 puits disponible dans le commerce pour la formation de sphéroïdes
Calcein Green-AMTebubioAS-89201Appliquer en dilution 1:1000
Logiciel CellSens DimensionOlympusversion 3
Collagène du placenta humain, type IVSigmaC5533Pour la préparation de boîtes de microscopie à 0,07 mg/mL de collagène et de 0,03 mg/mL de poly-D-lysine
Microscope confocal FLIM LeicaMicrosystemsN/AStellaris 8 Microscope inversé avec laser à lumière blanche, détecteurs HyD X, chambre de contrôle du climat / T (OkoLab), objectif 25x/0,95 W
D(+)-GlucoseMerck8342Préparer une solution mère de 1 M, 1:100 pour la préparation du milieu d’imagerie (concentration finale 10 mM)
Milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), sans rouge de phénol, sans glucose, sans pyruvate et sans glutamineSigma-AldrichD5030-10X1LPour la préparation du milieu d’imagerie
Sérum de veau fœtal  ;( FBS)Gibco10270-098Également disponible chez Sigma. Doit être inactivé par la chaleur avant utilisation.
HEPES (1M)Gibco15630-080Dilution 1/100 pour la préparation du milieu d’imagerie (concentration finale 10 mM)
Cellules cancéreuses du côlon humain HCT116ATCC
ImageJNIHversion 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)Leica Microsystemsversion 4.6.1.27508
L-glutamineGibco25030Également disponible chez Sigma. Appliquer en dilution 1:100.
Lipidure-CM5206AmsbioAMS.52000034GB1G
McCoy’s 5A, besoin d’ajouter 1 mM de pyruvate de sodium et 10 mM HEPESVWR392-0420Milieu de croissance standard pour cellules HCT116
tampons PDMS imprimés en 3D à micro-motifsN/A/AFourni par le Centre de technologie des microsystèmes, Professeur Dr. Jan Vanfleteren, Université de Gand
NaClChemlabCL00.1429.100
Chambre de distribution NeubauerFisher Scientific15980396
Sondes O2 : MMIR1N/AN/A N/Acaractérisation complète, la validation et certaines applications peuvent être trouvées à l’adresse suivante : https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110
v1
PBSFisher scientificGibco18912014Dissoudre le comprimé de PBS dans 500 mL d’eau distillée.
Streptocoque du stylo :P énicilline (10 000 U/mL) / streptomycine (10 000 &mu ; g/mL) 100x solutionGibco15140-122Également disponible chez Sigma. Appliquer en dilution 1:100.
Poly-D-lysineSigmaP6407-5mgPour la préparation de 0,07 mg/mL de collagène et de 0,03 mg/mL de boîtes de microscopie enrobées de poly-D-lysine
Propidium IodideSigma-Aldrich25535-16-4Coloration de la mort cellulaire, utiliser 1 µ ; g/mL à 1h d’incubation
PVDF filtre seringue 0,22 & micro ; mNovolabA35149Des produits similaires sont également disponibles auprès de Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés
Pyruvate de sodium (100 mM)Gibco11360-070Dilution 1/100 pour la préparation du milieu d’imagerie (concentration finale 1mM)
SphériquePlaque 5D 24 puitsKugelmeiersSP5D-24W
pétridure stérileGreiner bio-one633181Des produits similaires sont également disponibles auprès de Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés
Flacon de culture tissulaire (25 cm² ; )VWR734-2311Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés
Flacon de culture tissulaire (75 cm² ;)VWR734-2313Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés
Plaque à fond en U à 96 puitsVWR10062-900Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one et d’autres sociétés
Ultrapure AgaroseInvitrogen (Life Technologies)16500-500D’autres types d’agarose tels que l’agarose à bas point de fusion (A-9414, Sigma), l’agarose à usage courant (A-9539, Sigma)
Le microscope inversé à fluorescence à grand champOlympusN/AMicroscope à fluorescence inversée IX81, avec contrôle motorisé de l’axe Z, CoolLED pE4000 (16 canaux, 365-770 nm), la caméra cMOS ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu), la plaque chauffante en verre Okolab, le logiciel CellSens Dimension v.3 et les objectifs aériens 4x/0.13 UPlanFLN et 40x/0.6 LUCPlanFLN. (En option, pour l’imagerie haute résolution) 60x/1.0 LUMPLFLN eau
N La .

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3d spheroids. J Vis Exp. (51), e2720(2011).
  2. Moskovits, N., et al. Establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs. J Vis Exp. (190), e64564(2022).
  3. Griner, L. M., et al. Generation of high-throughput three-dimensional tumor spheroids for drug screening. J Vis Exp. (139), e57476(2018).
  4. Qian, Y., Wei, X., Chen, K., Xu, M. Three-dimensional acoustic assembly device for mass manufacturing of cell spheroids. J Vis Exp. (200), e66078(2023).
  5. He, H., et al. Dynamic formation of cellular aggregates of chondrocytes and mesenchymal stem cells in spinner flask. Cell Prolif. 52 (4), e12587(2019).
  6. Perez, J. E., Nagle, I., Wilhelm, C. Magnetic molding of tumor spheroids: Emerging model for cancer screening. Biofabrication. 13 (1), 015018(2020).
  7. Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3d bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomater. 95, 357-370 (2019).
  8. Guillaume, O., et al. Hybrid spheroid microscaffolds as modular tissue units to build macro-tissue assemblies for tissue engineering. Acta Biomater. 165, 72-85 (2023).
  9. Danilevicius, P., et al. laser-made 3D microscaffolds for tissue spheroid encagement. Biointerphases. 10 (2), 021011(2015).
  10. Jamieson, L. E., Harrison, D. J., Campbell, C. Chemical analysis of multicellular tumour spheroids. Analyst. 140 (12), 3910-3920 (2015).
  11. Dmitriev, R., Borisov, S., Jenkins, J., Papkovsky, D. Multiparametric imaging of tumor spheroids with ultra-bright and tunable nanoparticle O2 probes. SPIE BiOS. 9328, (2015).
  12. Zushin, P. -J. H., Mukherjee, S., Wu, J. C. FDA Modernization Act 2.0: transitioning beyond animal models with human cells, organoids, and AI/ML-based approaches. J Clin Invest. 133 (21), e175824(2023).
  13. Kim, D. -S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human es and ips cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev Rep. 6 (2), 270-281 (2010).
  14. Hart, D., Gutiérrez, D. R., Biason-Lauber, A. Generation of a human ovarian granulosa cell model from induced pluripotent stem cells. bioRxiv. , 2022(2022).
  15. Chiaradia, I., et al. Tissue morphology influences the temporal program of human brain organoid development. Cell Stem Cell. 30 (10), 1351-1367 (2023).
  16. Wagstaff, E. L., Ten Asbroek, A. L., Ten Brink, J. B., Jansonius, N. M., Bergen, A. A. An alternative approach to produce versatile retinal organoids with accelerated ganglion cell development. Sci Rep. 11 (1), 1101(2021).
  17. Thavandiran, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (49), E4698-E4707 (2013).
  18. Harrison, S. P., et al. Scalable production of tissue-like vascularized liver organoids from human pscs. Exp Mol Med. 55 (9), 2005-2024 (2023).
  19. Noguchi, T. -A. K., Kurisaki, A. Formation of stomach tissue by organoid culture using mouse embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 2017, 217-228 (2017).
  20. Takahashi, J., et al. Suspension culture in a rotating bioreactor for efficient generation of human intestinal organoids. Cell Reports Methods. 2 (11), 100337(2022).
  21. Lagziel, S., Gottlieb, E., Shlomi, T. Mind your media. Nat Metab. 2 (12), 1369-1372 (2020).
  22. Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of uniform spheroid formation in 384-well plates: The effect of medium evaporation. J Biomol Screen. 21 (9), 923-930 (2016).
  23. Bera, K., et al. Extracellular fluid viscosity enhances cell migration and cancer dissemination. Nature. 611 (7935), 365-373 (2022).
  24. Michl, J., Park, K. C., Swietach, P. Evidence-based guidelines for controlling ph in mammalian live-cell culture systems. Commun Biol. 2, 144(2019).
  25. Okkelman, I. A., Vercruysse, C., Kondrashina, A. V., Borisov, S. M., Dmitriev, R. I. Affordable oxygen microscopy-assisted biofabrication of multicellular spheroids. J Vis Exp. (182), e63403(2022).
  26. Peirsman, A., et al. Mispheroid: A knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity. Nat Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).
  27. Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7 (13), 16948(2016).
  28. Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: Comparison of different protocols. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
  29. Debruyne, A. C., et al. Live microscopy of multicellular spheroids with the multimodal near-infrared nanoparticles reveals differences in oxygenation gradients. ACS Nano. 18 (19), 12168-12186 (2024).
  30. Debruyne, A. C., Okkelman, I. A., Dmitriev, R. I. Balance between the cell viability and death in 3D. Semin Cell Dev Biol. 144, 55-66 (2023).
  31. Barroso, M., Monaghan, M. G., Niesner, R., Dmitriev, R. I. Probing organoid metabolism using fluorescence lifetime imaging microscopy (flim): The next frontier of drug discovery and disease understanding. Adv Drug Deliv Rev. 201, 115081(2023).
  32. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging-techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).
  33. Dmitriev, R. I., Intes, X., Barroso, M. M. Luminescence lifetime imaging of three-dimensional biological objects. J Cell Sci. 134 (9), 1-17 (2021).
  34. Sarder, P., Maji, D., Achilefu, S. Molecular probes for fluorescence lifetime imaging. Bioconjug Chem. 26 (6), 963-974 (2015).
  35. Alfonso-Garcia, A., et al. Mesoscopic fluorescence lifetime imaging: Fundamental principles, clinical applications and future directions. J Biophotonics. 14 (6), e202000472(2021).
  36. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: Fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. J Biomed Opt. 25 (7), 1-43 (2020).
  37. Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. J Cell Biol. 217 (7), 2235-2246 (2018).
  38. Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomark Med. 4 (2), 241-263 (2010).
  39. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of nad (p) h and fad. Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).
  40. Verma, A., et al. Fluorescence lifetime imaging for quantification of targeted drug delivery in varying tumor microenvironments. bioRxiv. , 2024(2024).
  41. Smith, J. T., et al. In vivo quantitative fret small animal imaging: Intensity versus lifetime-based fret. Biophys Rep. 3 (2), 100110(2023).
  42. Alvarez, L. A., et al. Application Note: SP8 Falcon: A novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal flim. Nat Methods. , (2019).
  43. Roberti, M. J., et al. TauSense: A fluorescence lifetime-based tool set for everyday imaging. Nat. Methods. , https://www.nature.com/articles/d42473-020-00364-w.pdf (2020).
  44. Auer, J. M. T., Murphy, L. C., Xiao, D., Li, D. U., Wheeler, A. P. Non-fitting flim-fret facilitates analysis of protein interactions in live zebrafish embryos. J Microsc. 291 (1), 43-56 (2023).
  45. Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PLoS One. 8 (8), e70687(2013).
  46. Gao, D., et al. Flimj: An open-source imagej toolkit for fluorescence lifetime image data analysis. PloS One. 15 (12), e0238327(2020).
  47. Tullis, I. D. C., Ameer-Beg, S. M., Barber, P. R., Rankov, V., Vojnovic, B. Mapping femtosecond pulse front distortion and group velocity dispersion in multiphoton microscopy. Proc. SPIE 6089, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences VI. , 60890(2006).
  48. Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio Protoc. 8 (22), e3080(2018).
  49. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: From discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  50. Badea, M. A., et al. Influence of matrigel on single-and multiple-spheroid cultures in breast cancer research. SLAS Discov. 24 (5), 563-578 (2019).
  51. Lang, S., Sharrard, R., Stark, M., Villette, J., Maitland, N. Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional matrigel cultures. Br J Cancer. 85 (4), 590-599 (2001).
  52. Barra, J., et al. DMT1-dependent endosome-mitochondria interactions regulate mitochondrial iron translocation and metastatic outgrowth. Oncogene. 43 (9), 650-667 (2024).
  53. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Intracellular probes for imaging oxygen concentration: How good are they. Methods Appl Fluoresc. 3 (3), 034001(2015).
  54. Schweikhard, V., et al. Application Note: The power HyD family of detectors for confocal microscopy. Nat Methods. , https://www.nature.com/articles/d42473-020-00398-0 (2020).
  55. Alam, S. R., Wallrabe, H., Christopher, K. G., Siller, K. H., Periasamy, A. Characterization of mitochondrial dysfunction due to laser damage by 2-photon flim microscopy. Sci Rep. 12 (1), 11938(2022).
  56. Bush, P. G., Wokosin, D. L., Hall, A. C. Two-versus one photon excitation laser scanning microscopy: Critical importance of excitation wavelength. Front Biosci. 12, 2646-2657 (2007).
  57. Liu, M., et al. Instrument response standard in time-resolved fluorescence spectroscopy at visible wavelength: Quenched fluorescein sodium. Appl Spectrosc. 68 (5), 577-583 (2014).
  58. Szabelski, M., et al. Collisional quenching of erythrosine b as a potential reference dye for impulse response function evaluation. Appl Spectrosc. 63 (3), 363-368 (2009).
  59. Chib, R., et al. Standard reference for instrument response function in fluorescence lifetime measurements in visible and near infrared. Meas Sci Technol. 27 (2), 027001(2015).
  60. Talbot, C. B., et al. Application of ultrafast gold luminescence to measuring the instrument response function for multispectral multiphoton fluorescence lifetime imaging. Opt Express. 19 (15), 13848-13861 (2011).
  61. Becker, W. Recording the instrument response function of a multiphoton flim system. Becker & Hickl. , Available from: https://www.becker-hickl.com/literature/application-notes/recording-the-instrument-response-function-of-a-multiphoton-flim-system/ (2007).
  62. Leben, R., Köhler, M., Radbruch, H., Hauser, A. E., Niesner, R. A. Systematic enzyme mapping of cellular metabolism by phasor-analyzed label-free nad (p) h fluorescence lifetime imaging. Int J Mol Sci. 20 (22), 5565(2019).
  63. Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using nadh and nadph autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).
  64. Gottlieb, D., Asadipour, B., Kostina, P., Ung, T. P. L., Stringari, C. FLUTE: A python gui for interactive phasor analysis of flim data. Biol Imaging. 3, e21(2023).
  65. Malacrida, L., Ranjit, S., Jameson, D. M., Gratton, E. The phasor plot: A universal circle to advance fluorescence lifetime analysis and interpretation. Annu Rev Biophys. 50, 575-593 (2021).
  66. Okkelman, I., Vandenberghe, W., Dmitriev, R. Role of preconditioning with oxygen and glucose deprivation in promoting differentiation of dental pulp stem cells in 3D culture. Mol Biol Cell. 34 (2), 1212(2022).
  67. Park, J. H., et al. The effect of bmp-mimetic peptide tethering bioinks on the differentiation of dental pulp stem cells (DPSCs) in 3D bioprinted dental constructs. Biofabrication. 12 (3), 035029(2020).
  68. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  69. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  70. Bryanskaya, E. O., et al. High levels of FAD autofluorescence indicate pathology preceding cell death. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1868 (1), 130520(2024).
  71. Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell Int. 21 (1), 152(2021).
  72. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses. Redox Biol. 30, 101420(2020).
  73. Gstraunthaler, G., Seppi, T., Pfaller, W. Impact of culture conditions, culture media volumes, and glucose content on metabolic properties of renal epithelial cell cultures: Are renal cells in tissue culture hypoxic. Cell Physiol Biochem. 9 (3), 150-172 (1999).
  74. Glickman, R. D. Phototoxicity to the retina: Mechanisms of damage. Int J Toxicol. 21 (6), 473-490 (2002).
  75. Golub, A. S., Pittman, R. N. Monitoring Parameters of Oxygen Transport to Cells in the Microcirculation. Quenched-Phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. , The Royal Society of Chemistry. (2018).
  76. Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging. Biotechniques. 41 (2), 191-197 (2006).
  77. Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of pvp-hypericin: A new strategy using ms pulses of led and the fluorescent dye cfse. J Microsc. 245 (1), 100-108 (2012).
  78. Carrasco Kind, M., et al. flimview: A software framework to handle, visualize and analyze flim data. F1000Research. 9, 574(2020).
  79. Schrimpf, W., Barth, A., Hendrix, J., Lamb, D. C. Pam: A framework for integrated analysis of imaging, single-molecule, and ensemble fluorescence data. Biophys J. 114 (7), 1518-1528 (2018).
  80. Chen, S. -J., Sinsuebphon, N., Barroso, M., Intes, X., Michalet, X. Optical Molecular Probes, Imaging and Drug Delivery. , Optica Publishing Group. (2021).

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