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Article de méthode

Méthode basée sur l’extraction Apoplast pour améliorer la pureté d’une protéine recombinante produite par une plante

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DOI :

10.3791/66852

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5 juillet 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Academy of Medical Sciences, Shandong First Medical University, 2State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 3College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, 4Beijing Life Science Academy

Dans cet article

Résumé

La purification des protéines recombinantes des systèmes végétaux est généralement contestée par les protéines végétales. Ce travail fournit une méthode pour extraire et purifier efficacement une protéine recombinante sécrétée à partir de l’apoplast de Nicotiana benthamiana.

Résumé

Les plantes sont un système d’expression eucaryote en cours d’exploration pour produire des protéines thérapeutiques. La purification des protéines recombinantes des plantes est l’une des étapes les plus critiques du processus de production. En règle générale, les protéines ont été purifiées à partir de protéines solubles totales (TSP), et la présence de protéines intracellulaires et de cytochromes divers pose des défis pour les étapes ultérieures de purification des protéines. De plus, la plupart des protéines thérapeutiques comme les antigènes et les anticorps sont sécrétées pour obtenir une glycosylation correcte, et la présence de protéines incomplètement modifiées conduit à des structures d’antigènes ou d’anticorps incohérentes. Ce travail introduit une méthode plus efficace pour obtenir des protéines recombinantes hautement purifiées à partir de l’espace apoplasique des plantes. La protéine fluorescente verte recombinante (GFP) est conçue pour être sécrétée dans l’apoplast de Nicotiana benthamiana et est ensuite extraite à l’aide d’une méthode d’infiltration-centrifugation. Le GFP-His de l’apoplaste extrait est ensuite purifié par chromatographie d’affinité au nickel. Contrairement aux méthodes traditionnelles de TSP, la purification à partir de l’apoplast produit des protéines recombinantes hautement purifiées. Il s’agit d’une amélioration technologique importante pour les systèmes de production végétale.

Introduction

De nos jours, diverses protéines thérapeutiques recombinantes produites par des plantes sont à l’étude, notamment des anticorps, des vaccins, des protéines bioactives, des enzymes et de petits polypeptides 1,2,3,4,5,6. Les plantes deviennent une plate-forme de plus en plus utilisée pour produire des protéines thérapeutiques en raison de leur sécurité, de leur faible coût et de leur capacité à augmenter rapidement la production 7,8. L’expression et la modification des protéines dans les systèmes végétaux, ainsi que la purification des protéines, sont des facteurs critiques déterminant la productivité des bioréacteurs végétaux 9,10. L’amélioration de la productivité des plantes et l’obtention de protéines cibles de haute pureté sont les principaux défis auxquels sont confrontés les systèmes de production à base de plantes11,12.

La localisation subcellulaire et la modification des protéines recombinantes dépendent du peptide signal spécifique codé à l’extrémité N-terminale, qui cible la protéine vers sa destination finale d’organite lors de l’expression génique. Les protéines recombinantes sont conçues pour se localiser dans l’apoplaste, le réticulum endoplasmique (RE), le chloroplaste, la vacuole ou le cytoplasme, en fonction de leurs propriétés uniques13. Pour les antigènes et les anticorps, les protéines sécrétées sont préférées. Avant la sécrétion, les protéines progressent à travers le RE et Golgi pour un repliement correct et des modifications post-traductionnelles 14,15,16.

Après la production dans les plantes, les protéines recombinantes doivent être purifiées à partir d’extraits de plantes. En règle générale, les protéines sont purifiées à partir d’extraits de plantes solubles totaux, qui contiennent d’abondantes protéines intracellulaires, des produits mal repliés et non modifiés et des cytochromes17. Pour éliminer les impuretés, les extraits de plantes subissent un fractionnement important, y compris la chromatographie d’affinité spécifique de la ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase (RuBisCO), la précipitation des phytates, la précipitation du polyéthylène glycol et l’ajustement de la température et du pH18,19. Ces étapes d’élimination des impuretés sont laborieuses et peuvent compromettre la qualité des protéines.

Le compartiment cellulaire végétal au-delà de la membrane plasmique est défini comme l’apoplaste, englobant la paroi cellulaire, les espaces intercellulaires et le xylème20. La phase aqueuse est communément appelée liquide de lavage apoplast (AWF). L’AWF contient des molécules sécrétées par les cellules pour réguler de nombreux progrès biologiques tels que le transport, le métabolisme de la paroi cellulaire et les réponses au stress21,22. Contrairement à la TSP, les constituants moléculaires de l’AWF sont moins complexes. L’extraction de protéines recombinantes de l’AWF peut éviter la contamination par des protéines intracellulaires, des produits mal repliés et des restes cytoplasmiques. En bref, le lipide d’extraction pénètre dans les feuilles par les stomates sous pression négative, et l’AWF est collecté par centrifugation douce23. Bien que l’isolement de l’AWF soit largement utilisé pour étudier les progrès biologiques à l’intérieur de l’apoplast 24,25,26,27, il n’a pas été exploité dans les systèmes de production à base de plantes.

L’amélioration de la productivité des plantes et l’obtention de protéines cibles de haute pureté sont des défis centraux pour les systèmes de production végétale28. En règle générale, les protéines sont purifiées à partir d’extraits de plantes solubles contenant de grandes quantités de protéines intracellulaires, de produits mal repliés et non modifiés, et de cytochromes29, qui nécessitent des coûts élevés pour la purification ultérieure30. L’utilisation de méthodes d’extraction de protéines AWF pour l’extraction de protéines recombinantes exogènes sécrétées dans l’apoplast peut améliorer efficacement l’homogénéité des protéines recombinantes et réduire le coût de la purification des protéines. Ici, nous utilisons un peptide signal PR1a pour permettre la sécrétion de protéines exogènes dans l’espace de l’appoplast et introduisons une méthode détaillée pour la purification des protéines recombinantes de l’AWF de N. benthamiana.

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Protocole

1. Préparation des plantes de N. benthamiana

  1. Placez les blocs de semis dans un plateau, ajoutez 1 L d’eau et laissez tremper pendant environ 2 h jusqu’à ce qu’ils soient complètement saturés.
  2. Saupoudrez uniformément les graines de N. benthamiana de type sauvage sur les blocs de semis, couvrez avec un couvercle et faites germer pendant 1 semaine. Cultivez N. benthamiana dans une serre avec une photopériode de 18 h, 24 °C, 45% d’humidité relative, et fertilisez toutes les 2 semaines.
  3. Une fois que les graines ont germé, utilisez une pince à épiler pour retirer délicatement un semis, en prenant soin de ne pas endommager ses racines. Creusez un petit noyau au centre d’un nouveau plateau, placez-y le semis et recouvrez légèrement les racines de terre. Couvrir avec un couvercle et continuer à pousser.
  4. Cultivez jusqu’à ce que les semis aient trois feuilles, avec le couvercle. Retirez le couvercle lorsque la 4ème vraie feuille émerge.
  5. Laissez les plantes continuer à pousser pendant deux semaines de plus avant l’agroinfiltration.

2. Construction de la GFP-His recombinante

  1. Effectuer l’optimisation des codons de N. benthamiana et la synthèse de la GFP et de la PR1a (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLLFLVISHSCRAG) sur la base des séquences de gènes.
  2. Effectuer une double digestion du vecteur pCAMBIA1300 à l’aide des enzymes Xba I et Sac I (voir Tableau des Matériaux).
  3. Effectuer l’amplification de PR1a à l’aide d’amorces en amont (TTGGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGATT
    TGTTCTCTTTTC) et les amorces en aval (TCCTCG
    CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA
    GTGGG), l’amplification de la GFP à l’aide d’amorces en amont (CCCACTCTTGCCGTGCGCGGGGGTCGACATGGTGAG
    CAAGGGCGAGGA) et les amorces en aval (GGGGAAATTCGAGCTCTCAGTGGTGATGGTGGTG
    GTGAGATCTTCCGGACTTGT).
  4. En utilisant la recombinaison homologue, clonez PR1a et GFP dans le vecteur d’expression végétale pCAMBIA1300. Après le transfert dans E. coli, sélectionnez des clones uniques et envoyez-les à l’entreprise pour séquençage. La comparaison des résultats de séquençage et du plasmide droit est le plasmide recombinant pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His, appelé p35s-PR1a-GFP-His.

3. Production de GFP-His chez N. benthamiana

  1. Ajouter 1 μL de plasmide GFP dans 50 μL de cellules réceptrices Agrobacterium GV3101, mélanger doucement et ajouter dans la coupelle de l’électrode, retirer après électrocution sur l’électrochoceur.
  2. Étaler Agrobacterium tumefaciens transformé sur une plaque de milieu solide LB contenant 50 μg/mL de kanamycine (Kan) et 50 μg/mL de rifampicine (Rif). Incuber à l’envers à 28 °C pendant 48 h. Le vecteur pCAMBIA1300 est résistant au kan et Agrobacterium est résistant au rif ; seul l’Agrobacterium correct peut se développer sur des plaques avec kan et rif. Les clones monoclonaux étaient les transformants positifs, nommés A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG).
  3. Utilisez un cure-dent stérilisé pour prélever une quantité appropriée d’AtGPG et l’inoculer dans 4 mL de LB liquide avec du Kan et du Rif. Culture à 28 °C, 220-300 tr/min pendant 24 h.
  4. Sous-culture de bactéries dans des LB fraîches (50 μg/mL de Kan, 10 mM d’acide éthanesulfonique (NE-Morpholino), 20 μM d’acétosyringone (AS)) et incuber à 28 °C, 220-300 tr/min pendant 10-12 h.
  5. Récolter les bactéries par centrifugation à 1500 x g pendant 10 min et remettre en suspension la pastille avec 1 mL de MMA (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 100 μM AS).
  6. Mesurez et ajustez la densité optique (DO) d’AtGPG àOD 600 = 0,8 à l’aide de MMA. Incuber les bactéries pendant encore 2 à 4 h à température ambiante. Prélevez la solution bactérienne à l’aide d’une seringue sans aiguille, pressez-la légèrement contre l’arrière des feuilles et exercez une pression pour faire pénétrer la solution dans les feuilles. Injectez uniquement les 3-4 feuilles du milieu par plante.
  7. Continuez à cultiver N. benthamiana dans la serre pendant 3-4 jours avant de récolter les feuilles pour l’extraction des protéines.

4. Observation de la localisation subcellulaire de la GFP

  1. Après 48 h d’agroinfiltration, sélectionnez une feuille plate et utilisez une perforatrice de 6 mm pour serrer la lame pour le poinçonnage.
  2. Versez une solution de saccharose à 30 % sur une lame de verre, placez l’échantillon de feuille avec le dos vers le haut et couvrez-le d’un verre de protection.
  3. Réglez la longueur d’onde d’excitation sur 488 nm et détectez la fluorescence verte à 490-550 nm après un grossissement de 400x. Prenez la première photo une fois la diapositive préparée et une autre 10 min plus tard.

5. Extraction de la GFP de la plante

  1. Extraction AWF
    1. Prélever les feuilles fraîches intactes de N. benthamiana exprimant la GFP recombinante 3 jours après l’agroinfiltration. Traitez la feuille avec douceur et maintenez l’intégrité de la feuille pour éviter l’efflux de protéines intracellulaires. Utilisez immédiatement les feuilles collectées pour l’étape suivante afin d’éviter la dégradation des protéines.
    2. Rincer la lame des feuilles avec du ddH2O stérilisé pré-refroidi pour éliminer les débris.
    3. Peser les feuilles fraîches et les immerger (côté abaxial vers le bas) dans 100 mL de tampon phosphate pré-refroidi de 100 mM (PB 100 mM Na2, HPO4 et 100 mM NaH2PO4 ont été configurés séparément et mélangés à un rapport de 2,2:1 pH 7,0) dans un bécher à large ouverture de 200 mL. Couvrez les feuilles avec du fil de nylon à mailles fines de 100 mailles (voir tableau des matériaux) et une assiette en plastique.
      REMARQUE : Le pré-refroidissement empêche la dégradation des protéines. Les volumes de tampon peuvent être ajustés en fonction de l’échelle expérimentale. Assurez-vous que toutes les feuilles sont immergées.
    4. Placez le bécher dans une pompe à vide. Appliquez un vide de 0,8 MPa pendant 1 min, puis rétablissez rapidement la pression atmosphérique.
    5. Retirez les feuilles du tampon et séchez-les doucement avec du papier absorbant. Enroulez les feuilles, enveloppez-les de fil à maille et placez 5 g de feuilles dans chaque tube à centrifuger de 50 ml. Pour recueillir l’AWF, placez les feuilles roulées côté tête vers le haut dans des tubes avec du fil de maille fixé par les capuchons des tubes.
    6. Centrifugeuse à 4 °C, 500 x g pendant 5 min. Retirez les feuilles et récupérez l’AWF au fond du tube à l’aide d’une pipette. Environ 5 mL d’AWF peuvent être obtenus à partir de chaque tube.
      REMARQUE : Afin de minimiser les interférences des protéines intracellulaires et d’extraire le maximum de protéines AWF, l’extraction peut être répétée 2x-3x, mais pas plus de 3x.
  2. Extraction totale des protéines solubles
    1. Broyer 20 g de feuilles en poudre fine dans de l’azote liquide. Ajouter le tampon d’extraction (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 % de glycérol, 1 % de Triton X-100, 0,034 % de β-mercaptoéthanol (voir le tableau des matériaux)) dans un rapport de 1:2.
    2. Agiter l’homogénat dans un mélangeur vertical pendant 30 min à 4 °C. Centrifugeuse homogéner à 13 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
    3. Transférez le surnageant dans un nouveau tube et répétez la centrifugation pendant 15 min. Transférez le surnageant éliminé dans un autre tube.
    4. Filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,22 μm (voir tableau des matériaux) pour obtenir un extrait total de protéines solubles.

  

6. Purification de GFP-His par chromatographie d’affinité nickel (Ni)

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes à 4 °C.

  1. Ajouter la résine Ni sepharose excel (voir le tableau des matières) dans un tube dans un rapport de 1:1000 par rapport au volume de l’extrait protéique de l’étape 5.1.6. Le volume de résine équivaut à 1/1000e du volume de l’extrait de protéines.
  2. Laver la résine Ni 3x avec 10x le volume de résine ddH, 2O et PB (pH 7,0) séparément et retirer le surnageant.
  3. Incuber l’extrait protéique avec de la résine Ni pendant 2 h pour permettre une liaison complète. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min pour éliminer les protéines non liées dans le surnageant. Laver 3x avec 20x le volume de résine de PB. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.
  4. Éluer GFP-His en ajoutant 10 fois le volume de résine de 250 mM d’imidazole (50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 150 mM de NaCl, 10 % de glycérol, 250 mM d’imidazole) et recueillir le surnageant.

7. Coloration au bleu de Coomassie des protéines

  1. Ajouter 10 μL de tampon de chargement 5x SDS à 40 μL d’échantillons de protéines, faire bouillir pendant 10 min, puis fonctionner avec 15% SDS-PAGE à 110 V pendant 60 min.
  2. Colorer les gels protéiques avec la solution de bleu de Coomassie (0,1% R-250, 25% d’isopropanol, 10% d’acide acétique glacial) pendant 2 h.
  3. Videz la solution et lavez avec une solution décolorante pendant 2 h. Observez le gel ; Les protéines sur le gel seront colorées en bleu.

8. Transfert Western des protéines

  1. Ajouter 10 μL de tampon de chargement 5x SDS à 40 μL d’échantillons de protéines, faire bouillir pendant 10 min, puis fonctionner avec 15% SDS-PAGE à 110 V pendant 60 min.
  2. Transférez les protéines dans une membrane de nitrocellulose de 0,45 μm à 280 mA. Bloquer la membrane avec du lait écrémé à 5 % pendant 1 h.
  3. Diluez les anticorps anti-His-tag à 1:5000 et incubez la membrane avec les anticorps pendant 1 h. À l’aide de la solution saline et tween 20 (TBST) tris-buffered, laver la membrane 4x pendant 5 min.
  4. Diluez les anticorps anti-souris à 1:10000 et incubez la membrane avec les anticorps pendant 1 h. Utilisez TBST pour laver la membrane 4x pendant 5 min.
  5. Mélangez le révélateur (voir tableau des matériaux) dans un rapport de 1:1. Ajouter 400 μL à la membrane et laisser réagir pendant 1 min. Prenez des photos après 1 min d’exposition avec un visualiseur.

9. Dosage de la concentration en protéines

  1. Ajouter 5 μL de protéines à 1 mL de réactif de colorant Bradford 1x et réagir pendant 5 min.
  2. Déterminez la valeur OD595 après la mise à zéro et calculez la concentration en protéines à partir de la courbe standard.

10. Quantification des protéines 31

  1. Effectuer le Western blot d’échantillons de protéines avec des étalons.
  2. Effectuez la quantification de la GFP par rapport aux normes à l’aide de l’analyse en niveaux de gris ImageJ 1.5.0.

  

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Résultats

GFP-His est ciblé pour sa sécrétion dans l’espace apoplasique de N. benthamiana
La GFP a été clonée dans le plasmide pCAMBIA1300 avec un peptide signal N-terminal PR1a pour la sécrétion et un marqueur C-terminal His-tag pour la purification, générant p35s-PR1a-GFP-His (Figure 1A). La protéine recombinante a été exprimée transitoirement chez N. benthamiana, et une bande de 30 kDa a été détectée par transfert Western à l’aide d’anticorps a...

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Discussion

L’utilisation de plantes pour produire des protéines thérapeutiques s’est rapidement développée ces dernières années 1,2,3,4,5,6. Les gènes codant pour des protéines sont clonés en vecteurs d’expression et délivrés dans les tissus végétaux par agroinfiltration. Après leur production par les cellules végétales, les protéines s...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail est soutenu par l’Association pour la promotion de l’innovation des jeunes CAS (2021084) et le Fonds de soutien aux projets de déploiement clé du Plan d’action triennal de l’Institut de microbiologie de l’Académie chinoise des sciences.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100 maille nylon fil à mailles finesGuangzhou Huayu Trading limited companyhy-230724-2Pour l’extraction de protéines AWF
50 ml tubes à centrifugerVazymeTCF00150Pour centrifugeuse
ClonExpress II kit de clonage en une étapeVazymeC112-02Pour clone
FastDigest Sac1NEBR3156SPour clone
FastDigest XbaINEBFD0685Pour clone
ImageJ 1.5.0//Pourl’analyse en niveaux de gris
Grand filtreThermo FisherNESTPour le filtrage
Microscopie confocale à balayage laserLeica SP8Pour la localisation subcellulaire
Ni sepharose excelCytiva10339806Pour la purification des protéines
Protéine prémoulée plus gelYEASEN36246ES10Pour SDS-PAGE
Petit filtreNalgene1660045Pour filtrer
SuperSignal West Femto Substrate Trial KitThermo Fisher34076Pour western blot
Triton X-100SCR30188928Pour configurer le tampon d’extraction
Type Pompe à vide rotaryvangZhejiang taizhouqiujing pompe à vide sociétélimitée2XZ-2Pour l’infiltration
sous vide Mélangeur verticalHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing société anonymeBE-1200Pour le mélange
&beta ;-mercaptoéthanolSIGMABCBK8223VPour configurer le tampon d’extraction

Références

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