Ce protocole fournit une technique pour récolter et cultiver le ganglion de la racine dorsale (DRG) explanté de rats Sprague Dawley adultes dans un dispositif à compartiments multiples (MC).
Article de méthode
Récolte, intégration et culture de ganglions de la racine dorsale dans des dispositifs à compartiments multiples pour étudier les caractéristiques neuronales périphériques
Dans cet article
Résumé
Résumé
La caractéristique neuronale périphérique la plus courante de la douleur est un seuil de stimulation abaissé ou une hypersensibilité des nerfs terminaux des ganglions de la racine dorsale (DRG). L’une des causes proposées de cette hypersensibilité est associée à l’interaction entre les cellules immunitaires du tissu périphérique et les neurones. Les modèles in vitro ont fourni des connaissances fondamentales pour comprendre comment ces mécanismes entraînent une hypersensibilité des nocicepteurs. Cependant, les modèles in vitro sont confrontés au défi de traduire l’efficacité chez l’homme. Pour relever ce défi, un modèle in vitro pertinent sur le plan physiologique et anatomique a été développé pour la culture de ganglions de la racine dorsale intacts (DRG) dans trois compartiments isolés d’une plaque de 48 puits. Les DRG primaires sont récoltés sur des rats Sprague Dawley adultes après euthanasie sans cruauté. Les racines nerveuses en excès sont coupées et le DRG est coupé à des tailles appropriées pour la culture. Les DRG sont ensuite cultivés dans des hydrogels naturels, ce qui permet une croissance robuste dans tous les compartiments. Ce système multi-compartiments offre une isolation anatomiquement pertinente des corps cellulaires DRG à partir des neurites, des types de cellules physiologiquement pertinents et des propriétés mécaniques pour étudier les interactions entre les cellules neurales et immunitaires. Ainsi, cette plateforme de culture fournit un outil précieux pour étudier les stratégies d’isolement du traitement, conduisant finalement à une meilleure approche de dépistage pour prédire la douleur.
Introduction
La douleur chronique est la principale cause d’invalidité et de perte d’emploi dans le monde1. La douleur chronique touche environ 20 % des adultes dans le monde et impose un fardeau sociétal et économique important2, avec des coûts totaux estimés entre 560 et 635 milliards de dollars chaque année aux États-Unis3.
La principale caractéristique périphérique présentée par les patients souffrant de douleurs chroniques est un seuil de stimulation abaissé des nerfs, ce qui conduit le système nerveux à être plus réactif aux stimuli 4,5. L’abaissement du seuil de stimulation peut entraîner une réponse douloureuse à un stimulus auparavant non douloureux (allodynie) ou une réponse accrue à un stimulus douloureux (hyperalgésie)6. Les traitements actuels de la douleur chronique ont une efficacité limitée, et les traitements qui réussissent sur des modèles animaux échouent souvent dans les essais humains en raison de différences mécanistes dans la manifestation de la douleur7. Les modèles in vitro qui peuvent imiter plus précisément les mécanismes de sensibilisation périphérique ont le potentiel d’augmenter la traduction de nouvelles thérapies 8,9. De plus, en modélisant les aspects clés des nerfs sensibilisés dans un système de culture, les chercheurs pourraient développer une compréhension plus profonde des mécanismes qui entraînent l’abaissement des seuils et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui les inversent10.
Les plateformes in vitro ou les systèmes microphysiologiques idéaux incorporeraient la séparation physique des neurites distaux et du corps cellulaire des ganglions de la racine dorsale (DRG), un environnement cellulaire tridimensionnel (3D) et la présence de cellules de soutien natives pour imiter étroitement les conditions in vivo . Cependant, un article récent de Caparaso et al.11 montre que les plateformes actuelles de culture de DRG manquent d’une ou plusieurs de ces caractéristiques clés, ce qui les rend insuffisantes pour reproduire des conditions in vivo . Même si ces plateformes sont faciles à mettre en place, elles n’imitent pas la base biologique de la sensibilisation périphérique et peuvent donc ne pas se traduire par une efficacité in vivo . Pour remédier à cette limitation, un modèle in vitro physiologiquement pertinent a été développé pour la culture de ganglions de la racine dorsale (DRG) dans une matrice d’hydrogel avec trois compartiments isolés pour permettre l’isolement fluidique temporel des neurites et des corps cellulaires DRG11. Ce modèle offre une pertinence à la fois physiologique et anatomique, ce qui a le potentiel d’étudier la sensibilisation périphérique des neurones in vitro.
L’intérêt croissant pour l’utilisation des explants de DRG dans une culture 3D est dû à leur capacité à faciliter la croissance robuste des neurites, qui sert d’indicateur indirect de la viabilité des DRG12. Alors que les explants primaires de DRG néonatals ou embryonnaires sont principalement utilisés dans les plateformes de culture in vitro actuelles13,14, l’utilisation d’explants de rongeurs adultes fournit un meilleur modèle de la physiologie neuronale mature, qui imite étroitement la physiologie humaine des DRG par rapport aux explants de rongeurs néonatals ou embryonnaires15. Les DRG explant font référence à la préservation du tissu cellulaire et moléculaire du tissu DRG natif, principalement en maintenant les cellules de soutien non neuronales natives. Le présent protocole décrit la méthodologie de récolte et de culture des explants de DRG de rats Sprague Dawley adultes dans un dispositif à compartiments multiples (figure 1).
L’efficacité a été démontrée dans la culture de DRG à partir de la colonne cervicale, thoracique et lombaire, sans aucune différence observable dans la croissance des neurites. Pour cette application, l’objectif était de provoquer la croissance de neurites dans les compartiments extérieurs du dispositif ; par conséquent, cet article n’a pas fait de distinction entre les niveaux de DRG. Cependant, si nécessaire pour une expérience spécifique, le niveau DRG peut être adapté pour répondre aux besoins des expérimentateurs. Il existe actuellement d’autres modèles de culture compartimentée pour la culture 3D des DRG16, cependant, ces dispositifs ne contiennent pas de cellules de support non neuronales natives préservées, ce qui peut limiter la traduction. La préservation de la structure native des DRG récoltés est importante car elle assure la rétention des cellules de soutien non neuronales, dont les interactions avec les neurones DRG sont essentielles pour maintenir les propriétés fonctionnelles de ces neurones. Plusieurs études ont co-cultivé des DRG dissociés avec des cellules neuronales non natives telles que les cellules de Schwann pour favoriser la myélinisation des neurones 17,18,19.
Protocole
La récolte de DRG a été effectuée conformément au Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Nebraska-Lincoln. Des rats Sprague Dawley femelles âgés de 12 semaines (~250 g) ont été utilisés pour l’étude. Les détails des animaux, des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Fabrication et assemblage de dispositifs à compartiments multiples
- Conception assistée par ordinateur et impression 3D de l’appareil à compartiments multiples
REMARQUE : Le dispositif MC se compose de trois compartiments pour l’isolement des corps cellulaires DRG et des neurites (Figure 2A). Le dispositif MC n’est pas disponible dans le commerce ; cependant, le fichier STL est fourni ici (Supplementary Coding File 1) pour permettre l’impression 3D. L’impression du MC prend une (1) journée. - Téléchargez le fichier STL du MC sur une imprimante 3D résine à l’aide d’un logiciel compatible.
REMARQUE : Le matériau idéal pour l’impression est une résine haute température. L’un des principaux avantages de l’utilisation de la résine à haute température est qu’elle est biocompatible et qu’elle peut être autoclavée et réutilisée. Une imprimante 3D DLP (Digital Light Processing) ou d’autres imprimantes 3D peuvent également être utilisées pour imprimer l’appareil. - Transférez les appareils imprimés dans une solution de lavage pendant 30 minutes dans de l’isopropanol (>96 %) pour éliminer la résine résiduelle de la surface de l’appareil MC imprimé.
- Postpolymériser les appareils à 80 °C pendant 120 min à l’aide d’un agent de durcissement disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux). L’agent de durcissement améliore les propriétés mécaniques du dispositif MC imprimé en l’exposant à la température et aux UV.
- Faites durcir thermiquement les appareils MC dans un four à 160 °C pendant 180 min.
- Stérilisez les appareils à l’aide d’un autoclave pendant 45 min sur un cycle de gravité.
2. Préparation de l’hydrogel
- Synthétiser l’acide hyaluronique méthacrylé (MAHA, méthacrylation de 85 % à 115 %) et le caractériser à l’aide d’un protocole décrit par Seidlits et al.20.
REMARQUE : Pour soutenir la croissance des DRG, des hydrogels triples composés d’acide hyaluronique méthacrylé, de collagène de type I et de laminine sont couramment utilisés. Les résultats indiquent que les DRG se développent couramment dans MAHA, allant de 1,25 à 2,5 mg / ml et le collagène de 2,0 à 4,5 mg / ml. Pour la laminine, on constate que 0,75 mg/mL est suffisant pour assurer une croissance robuste des DRG. Ici, les méthodes de création d’un gel triple avec 1,25 mg/mL de MAHA, 4,5 mg/mL de collagène et 0,75 mg/mL de laminine sont détaillées. La préparation de l’hydrogel doit être effectuée dans une armoire à flux laminaire pour fournir un espace de travail aseptique.
3. Préparation de la solution de photo-initiateur
REMARQUE : Un photoinitiateur est nécessaire pour réticuler le MAHA sous la lumière UV. Il est couramment utilisé à des pourcentages de 0,3 % à 0,6 %.
- Préparez la solution photoinitiatrice 3 jours avant la récolte du DRG.
- Préchauffez le bain-marie à 37 °C avant de préparer la solution photoinitiatrice.
- En travaillant avec la technique stérile dans une hotte, préparez une solution de bicarbonate de sodium (NaHCO3) à 23,125 mg/mL en dissolvant le NaHCO3 dans une solution 5x Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-HEPES.
- Dans un flacon en verre, mélanger un photoinitiateur à 0,6 % en poids/volume (p/v) dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) 1x à 20 % vol/vol et une solution de DMEM/HEPES 5x à 80 % vol/vol.
- Pour le protéger de la lumière, enveloppez le flacon en verre dans du papier d’aluminium. Cependant, assurez-vous de retirer la feuille d’aluminium avant de transférer le flacon dans le bain-marie sonique chauffé à 37 °C avec sonication entre 30 et 40 min.
REMARQUE : La solution photo-initiatrice doit être protégée de la lumière car elle peut se décomposer en radicaux et démarrer le processus de polymérisation lorsqu’elle est exposée à la lumière21. - Filtrez stérilement la solution avec un filtre à seringue de 0,22 μm dans un nouveau flacon en verre stérile.
4. Dissolution de l’acide hyaluronique méthacrylé
- Dissoudre l’acide hyaluronique méthacrylé (préparé à l’étape 2) le jour même de la préparation de la solution photoinitiatrice (étape 3).
- Placez le MAHA lyophilisé congelé dans un dessiccateur pendant 15 min pour qu’il soit à température ambiante.
- En travaillant dans une hotte à flux laminaire et en utilisant la technique de pesage stérile, pesez le MAHA lyophilisé dans un flacon en verre.
- Ajouter le volume nécessaire de solution de photo-initiateur filtrée à MAHA pour obtenir la concentration MAHA souhaitée. La concentration finale courante sur gel est de 1,25 mg/mL de MAHA et de 4,5 mg/mL de collagène.
- Scellez le bouchon avec un film d’étanchéité de laboratoire, enveloppez le flacon en verre avec du papier d’aluminium et placez-le sur une plaque vibrante orbitale à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous (généralement 3 jours). De temps en temps, vortex la solution pour briser de gros amas de MAHA afin d’assurer une dissolution uniforme de MAHA.
5. Assemblage de l’appareil
- Placez l’appareil MC dans une plaque à 48 puits un jour avant la récolte du DRG.
- Appliquez une fine ligne de gel de silicone dans la rainure sous l’appareil MC (figure 2B) à l’aide d’une seringue de 3 ml. Cela aidera l’appareil à se fixer solidement à la plaque de puits.
- À l’aide de la pince #3, placez délicatement le dispositif MC dans le puits d’une plaque à 48 puits, comme illustré à la figure 2C.
REMARQUE : La taille de l’appareil peut être modifiée pour s’adapter à l’application prévue, et une plaque d’une taille différente peut être utilisée si vous le souhaitez. Les appareils peuvent être réutilisés. Pour être réutilisé, l’hydrogel doit être lavé doucement de tous les tunnels, et la rainure de chargement sous l’appareil doit être utilisée avec de l’éthanol à 70 % avec une agitation douce. Une fois cette opération terminée, les appareils peuvent être ré-autoclavés pour être stérilisés avant utilisation.
6. Préparation des animaux
- Autoclavez tous les outils de dissection nécessaires avant le début de la récolte.
- Obtenez un rat Sprague Dawley mâle ou femelle adulte âgé de 12 à 20 semaines. Le sexe du rat n’a pas d’impact sur la croissance des DRG.
- Euthanasier le rat selon le protocole approuvé de l’IACUC en utilisant le surdosage de CO2 comme méthode principale d’euthanasie et la ponction bilatérale du pneumothorax comme méthode secondaire d’euthanasie selon les directives22 de l’American Veterinary Medical Association.
- Placez le rat sur un sous-tapis stérile sur une table de dissection, le côté ventral vers le bas. Vaporisez la fourrure avec de l’éthanol à 70%.
7. Récolte des ganglions de la racine dorsale (DRG)
- Préparez un milieu de parage contenant 86 % de milieu neurobasal A, 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de pénicilline-streptomycine (PS), 1 % de glutamine et 2 % de B27 plus 50x et transférez-le dans une plaque à 24 puits. Ce milieu et cette plaque de puits seront utilisés pour le stockage temporaire des DRG récoltés avant de les intégrer dans l’hydrogel.
- Portez une blouse de laboratoire, un masque chirurgical, un bonnet, des lunettes de sécurité et des gants.
- À l’aide de gros ciseaux à nez émoussé, coupez la peau à la base de la colonne cervicale, puis sur toute la longueur de la colonne vertébrale.
- Pour drainer davantage le sang loin du canal rachidien, coupez sous les omoplates et à travers le muscle pour sectionner les principaux vaisseaux sanguins.
- Utilisez de gros ciseaux à nez pointu pour couper le muscle de la colonne vertébrale. Nettoyez autant de muscle que possible pour visualiser la colonne vertébrale.
- Retirez les segments dorsal et latéral des vertèbres. Utilisez un Rongeur droit et des ciseaux à bec pointu pour enlever les apophyses épineuses et transversales des vertèbres, en commençant par l’extrémité cervicale et en allant vers l’extrémité lombaire.
- Retirez la moelle épinière. Utilisez de petits ciseaux à nez pointu pour couper soigneusement les racines nerveuses reliées aux DRG des deux côtés de la moelle épinière. Coupez l’extrémité cervicale de la moelle épinière et retirez-la doucement du canal rachidien, en coupant toutes les racines nerveuses restantes connectées aux DRG.
REMARQUE : La motricité fine est essentielle pour s’assurer que le corps DRG n’est pas sectionné dans le processus. - Pour exposer les DRG, utilisez le Rongeur incurvé pour enlever davantage de parties latérales des vertèbres. Tirez vers l’extérieur à partir de la ligne médiane, en alternant les côtés. Veillez à ne pas couper le corps DRG car cela pourrait endommager les corps cellulaires et les axones.
- À l’aide de la pince #3 et des ciseaux à ressort à règle droite, retirez les DRG entre chaque niveau des vertèbres. Saisissez les racines nerveuses de la colonne vertébrale du DRG, retirez-les soigneusement de la poche et coupez l’autre extrémité du nerf rachidien. Veillez à ne pas saisir directement le corps du DRG.
- Placez les DRG dans des puits d’une plaque de 24 puits (contenant le milieu de coupe, étape 7.1) sur de la glace.
- Après avoir collecté tous les DRG, nettoyez l’espace de travail, placez la carcasse dans un sac d’autoclave et stockez/éliminez-la de manière appropriée conformément au protocole IACUC.
8. Rognage et coupe DRG
- Remplissez une boîte de Pétri de 60 mm sur un banc propre avec un milieu de coupe (étape 7.1). Installez la lunette de dissection et le stérilisateur de billes de verre et placez une boîte à outils autoclavée avec des outils de coupe (pince #3 et ciseaux à ressort droits) près de la lunette.
- Sous la lunette de dissection, retirez l’excès de tissu autour du DRG et coupez les racines nerveuses près du corps du DRG (généralement légèrement plus foncées que les nerfs environnants).
- Remplissez une deuxième boîte de Pétri de 60 mm avec un produit frais. Sous la lunette de dissection, coupez les DRG coupés à environ 0,5 mm (ou entre 0,5 mm et 0,8 mm). Une règle est placée sous la boîte de Pétri pendant la coupe pour avoir la bonne estimation de la taille des DRG coupés.
- Transférez les DRG coupés dans une assiette fraîche à 24 puits avec le support sur de la glace.
REMARQUE : Le rognage, la coupe et l’enrobage DRG doivent être effectués dans une armoire à flux laminaire pour fournir un espace de travail aseptique. En l’absence d’une armoire à flux laminaire, des techniques aseptiques doivent être observées, avec un équipement de protection individuelle (EPI) minimum approprié recommandé (blouse de laboratoire, masques, lunettes et gants) et tous les outils stérilisés tout au long du processus pour atténuer la contamination potentielle.
9. Neutralisation du collagène
- Neutralisez le collagène le même jour que la récolte des DRG après avoir taillé et coupé les DRG.
- Travaillant sur de la glace, pipetez ~8,16 % d’eau ultra-pure, ~1,84 % d’hydroxyde de sodium 1 M (NaOH), ~10 % 10x PBS et ~80 % de collagène du volume total de la solution dans un flacon en verre.
- Mélangez lentement à l’aide d’une pointe de pipette stérile à faible rétention pour pipeter le collagène (généralement ajouté en dernier) dans le mélange. Assurez-vous de garder la pointe de la pipette dans la solution pendant le mélange pour éviter de créer des bulles. Vérifiez le pH du collagène neutralisé à l’aide de bandelettes de pH pour vous assurer qu’il est de ~7.
REMARQUE : Le collagène neutralisé peut être conservé sur de la glace pendant 2-3 h sans gélification ; Par conséquent, la fabrication de l’hydrogel doit être effectuée rapidement une fois que le collagène est neutralisé.
10. Fabrication d’hydrogel
- En travaillant sur de la glace, pipetez de la laminine (jusqu’à une concentration finale de 0,75 mg/mL) et 1x PBS dans un flacon en verre.
- À l’aide d’embouts de pipette stériles à faible rétention, la pipette a neutralisé le collagène et la solution MAHA dans le mélange pour obtenir la concentration souhaitée.
- Mélangez lentement et vérifiez le pH de l’hydrogel obtenu (doit être de ~7).
11. Intégration DRG
- Effectuez un encastrement à plusieurs compartiments.
- Pipeter 65,1 μL et 52,8 μL de l’hydrogel prémélangé dans les compartiments du soma et du neurite, respectivement.
REMARQUE : Cela suppose l’utilisation de dispositifs MC dans une plaque à 48 puits. Ces volumes peuvent être modifiés en fonction de la taille du périphérique MC utilisé. - Enfoncez doucement les DRG coupés dans le compartiment soma (Figure 2A), en vous assurant qu’ils ne rayent pas le fond de la plaque du puits. Placez le DRG au milieu pour que les neurites puissent se développer dans les compartiments adjacents à travers les tunnels.
- Réticulation thermique de l’hydrogel dans l’incubateur à 37 °C pendant 30 min. Pendant ce temps, allumez la lampe UV pour vous réchauffer.
- Après la réticulation thermique, réticulation UV de l’hydrogel pendant 90 s.
- Ajoutez le milieu de croissance DRG à l’hydrogel et au DRG et effectuez un changement complet de milieu après une heure pour éliminer les traces de photo-initiateur qui persistent dans le milieu ou qui n’ont pas réagi ou qui restent dans le milieu.
- Effectuez un demi-changement de support tous les 3 jours et surveillez la croissance des DRG en les regardant au microscope.
- Après ~4 semaines, lorsque les neurites DRG commencent à croître (Figure 3A), capturez des images avec l’imageur à plaque fluorescente et quantifiez la longueur des neurites à l’aide de FIJI (ImageJ).
- Pipeter 65,1 μL et 52,8 μL de l’hydrogel prémélangé dans les compartiments du soma et du neurite, respectivement.
12. Intégration de contrôle DRG
- Pipette 250 μL d’hydrogel dans une plaque de 48 puits (sans MC).
- Placez délicatement le DRG coupé au milieu du puits et à mi-chemin dans l’hydrogel, en veillant à ce qu’il ne raye pas le fond de la plaque du puits.
- Réticulation thermique de l’hydrogel dans l’incubateur à 37 °C pendant 30 min.
- Réticulation UV de l’hydrogel pendant 90 s.
- Ajoutez du milieu de croissance DRG à l’hydrogel et au DRG et effectuez un changement complet de milieu après une heure.
- Effectuez un demi-changement de média tous les 3 jours et surveillez la croissance du DRG en l’observant au microscope.
- Après ~4 semaines, lorsque les neurites DRG commencent à se développer (Figure 3B), capturez des images avec l’imageur à plaque fluorescente.
REMARQUE : N’importe quel microscope à fond clair fonctionnera pour l’imagerie. Un microscope automatisé à plaque accélère ce processus. L’intégration de contrôle dans des gels simples sans l’appareil est effectuée pour comparer la croissance des neurites DRG dans plusieurs compartiments. Une fois que les utilisateurs ont validé que les DRG se développent de la même manière dans les gels MC et de contrôle, ils n’ont peut-être pas besoin de répéter les gels de contrôle à chaque fois.
13. Imagerie DRG
- Capturez des images en fond clair à un grossissement de 4x à l’aide d’un imageur à plaque fluorescente à différentes distances focales pour visualiser l’ensemble du DRG et du MC.
- Ajustez la luminosité et le contraste de l’image pour faciliter la visualisation des neurites.
- Enregistrez l’image en tant que fichier .tiff.
14. Quantification du neurite DRG
- Téléchargez et installez FIJI (ImageJ).
- Ouvrez ImageJ. Ouvrez le fichier image et assurez-vous qu’il est monochrome.
- Améliorez le contraste pour que les plus petits neurites soient visibles. Pour ce faire, ouvrez l’option de luminosité et de contraste à l’aide du raccourci Ctrl+Maj+C.
- Ajustez les curseurs du contrôleur au besoin pour visualiser les neurites, et cliquez sur Appliquer pour la luminosité et le contraste souhaités.
- Ouvrez le traceur neurite en ouvrant le menu Plugins , en sélectionnant Segmentation et en cliquant sur Simple Neurite Tracer.
- Démarrez une nouvelle trace en cliquant sur une extrémité du neurite juste contre le corps du DRG.
- Cliquez sur un autre point le long du neurite pour ajouter une trace jusqu’à ce que le neurite soit tracé de bout en bout. Cliquez sur Terminer le chemin après avoir tracé le neurite.
- Convertissez la longueur tracée en unités réelles et enregistrez les résultats en les copiant et en les collant dans Excel.
- Utilisez l’outil ligne droite dans FIJI pour tracer une ligne de la même longueur que la barre d’échelle (sans lâcher la fin de la ligne) et regardez la valeur de longueur visible sous la barre d’outils. La valeur length est utilisée pour la conversion.
- Mesurez la longueur de six longs neurites s’étendant des deux côtés du DRG (Figure 3C,D) et calculez la longueur moyenne de ces neurites pour donner une longueur moyenne représentative du DRG, comme le montre la figure 4.
REMARQUE : L’immunocoloration a été testée sur des explants de DRG dans des gels simples pour montrer la présence de cellules de soutien non neuronales7. Les DRG sont fixés dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à température ambiante, lavés trois fois avec 1 PBS pendant 15 minutes et stockés dans 1 PBS à 4 °C jusqu’à l’immunomarquage. - Pour les explants dans les appareils MC, retirez le dispositif MC et suivez le même processus décrit ci-dessus7.
Résultats
Le présent protocole décrit une technique de récolte et de culture de DRG sur des rats Sprague Dawley adultes dans un dispositif à compartiments multiples (MC). Comme le montre la figure 1, le DRG récolté sur des rats adultes a été taillé et coupé en ~0,5 mm. Les DRG coupés et coupés ont ensuite été intégrés dans un hydrogel dans la région soma du dispositif MC (Figure 2) et cultivés pendant 27 jours avant la quantification des neurites. Le DRG a été cultivé dans un gel ordinaire pour servir de témoin. La concentration de la formulation d’hydrogel utilisée pour cette expérience était de 4,5/1,25 mg/mL de collagène : MAHA. Les jours 27 et 21 pour les gels à compartiments multiples et les gels simples, respectivement, il y avait une croissance robuste des neurites (Figure 3). La longueur moyenne des neurites dans la MC (894,22 μm ± 308,75 μm) était comparable à la longueur des neurites dans les gels simples témoins (864,26 μm ± 362,84 μm) (Figure 4). Cela démontre la capacité du dispositif MC à prendre en charge la culture DRG et la croissance des neurites. Les longueurs des neurites ont été quantifiées à l’aide du logiciel ImageJ.
Figure 1 : Schéma de principe de la procédure expérimentale. (A) Récolte des ganglions de la racine dorsale (DRG) sur des rats Sprague Dawley adultes. (B) Parage et découpe des DRG récoltés. (C) Formulation d’hydrogel, enrobage de DRG et culture en hydrogel dans un MC inséré dans une plaque de 48 puits. (D) Croissance des neurites DRG après 21 à 30 jours de culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Multi-compartiments imprimés avec trois compartiments isolés et pouvant être utilisé dans une plaque à 48 puits. (A) Une image représentative montrant la vue de dessus du dispositif MC imprimé montre les compartiments DRG et Neurite (lignes rouges) et la zone d’encastrement DRG (vert). (B) Vue latérale de MC. (C) Une image de MC insérée dans une plaque de 48 puits. Barre d’échelle = 10 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Croissance des neurites dans un dispositif à compartiments multiples (MC) et des gels simples de contrôle. (A) Une image représentative montrant la croissance tracée des neurites dans un dispositif à compartiments multiples (MC) en fond clair. (Ci-dessous) Les neurites qui se sont développées à travers les tunnels de MC sont indiqués par des flèches. (B) Image de la croissance des neurites dans des gels simples témoins (sans MC). (C) Une image représentative montrant le tracé des neurites de douze longs neurites dans des gels simples de contrôle (lignes violettes). Six longs neurites des deux côtés du DRG ont été quantifiés pour donner la longueur moyenne des neurites. Les images ont été capturées à l’aide d’un imageur à plaque fluorescente à un grossissement de 4x, et les neurites ont été quantifiées à l’aide de FIJI (ImageJ). Barres d’échelle = 1000 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : Longueur des neurites dans les compartiments multiples (MC) par rapport à celle du gel ordinaire (PG). Nuage de points montrant les longueurs individuelles des neurites avec les moyennes et les écarts-types représentés par des barres d’erreur. La longueur moyenne des neurites dans la MC était de 1204,40 μm ± 690,43 μm (moyenne ± ET) contre 864,26 μm ± 362,84 μm (moyenne ± ET) dans le gel simple, indiquant que la MC soutient la croissance des neurites. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Fichier de codage supplémentaire 1 : Fichier STL d’un dispositif à compartiments multiples (MC) généré à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Ce protocole décrit une méthode pour récolter les Drg adultes de Sprague Dawley et les cultiver dans des hydrogels naturels en 3D. Contrairement à cette méthode, d’autres approches de récolte des DRG chez les souris et les rats impliquent l’isolement de la colonne vertébrale. La colonne vertébrale excisée est coupée en deux et la moelle épinière est retirée pour exposer les DRG23, 24, 25. Les lésions de la moelle épinière limitent l’apport sanguin, ce qui affecte les DRG et les neurones internes26. Cela réduit l’activité des DRG, ce qui rend les approches chirurgicales plus appropriées. De plus, une méthode d’impression 3D d’un dispositif MC robuste qui permet une culture physiologiquement pertinente des DRG a été décrite.
Ce protocole décrit une méthode de culture de DRG in vitro, en mettant l’accent sur l’étude de la sensibilisation périphérique des neurones dans un modèle anatomiquement et physiologiquement pertinent. Cette méthode de culture permet d’établir une séparation physique des neurites distaux et du corps cellulaire DRG dans un environnement 3D. Le dispositif MC imite l’environnement in vivo puisque les explants de DRG avec des cellules sont préservés et peuvent être co-cultivés avec des cellules gliales natives. DRG explant contient des cellules neuronales non natives, qui pourraient être co-cultivées avec d’autres cellules pour imiter les conditions physiologiques. Cette pertinence physiologique favorise l’étude de la façon dont les cellules non neuronales régulent l’activité des neurites et aide à comprendre les mécanismes de base impliqués dans la nociception. L’intégration de ces interactions non neuronales devrait permettre d’obtenir des prédictions plus précises des résultats de la signalisation cellulaire par rapport aux modèles de culture simplifiés avec des DRG dissociés. La présence de deux compartiments de neurites maximise la pertinence physiologique car des DRG uniques innervent différents tissus in vivo. Cette conception permet de traiter un compartiment de neurites tandis que l’autre sert de contrôle. Les compartiments de contrôle et de traitement connectés à un seul soma pourraient être utilisés pour étudier les effets intercompartiments, imitant les conditions in vivo où les neurites s’étendent à partir d’un seul soma et subissent différents stimuli lorsqu’ils innervent différents tissus, donnant ainsi un aperçu de la diaphonie entre les neurites. Si une diaphonie se produit entre les neurites dans les compartiments adjacents, les DRG non traités peuvent servir de véritable contrôle.
Ce dispositif pourrait être utilisé pour l’isolement des traitements ou pour étudier l’interaction entre les neurones et les DRG dans le contexte de la douleur. Étant donné que les neurites distaux peuvent être traités sélectivement séparément du soma DRG et des neurites proximaux, ce système pourrait être utilisé pour des traitements périphériques tels que des thérapies articulaires ciblées, où l’extrémité terminale des neurones sensoriels périphériques est directement traitée.
L’un des principaux avantages du dispositif MC est la possibilité d’expériences à haut débit sur plusieurs puits de la même plaque, car le dispositif MC est conçu pour s’adapter à une plaque de 48 puits. Un avantage supplémentaire de la plateforme in vitro est la capacité de modifier la rigidité de l’hydrogel dans le MC en ajustant les concentrations de collagène et de MAHA pour imiter les propriétés de divers microenvironnements tissulaires. Une limitation potentielle de ce protocole est que l’isolement fluidique entre les compartiments du neurite et du soma DRG n’est pas idéal pour les cultures au-delà de 72 h sans changement de milieu. Une étude antérieure a confirmé que l’isolement fluidique est maintenu dans les compartiments jusqu’à 72 h sans changement de milieu11. Des études antérieures ont montré que l’augmentation de la concentration d’acide hyaluronique améliore considérablement la densité de réticulation du collagène, limitant ainsi la diffusivité des macromolécules à travers la matrice d’hydrogel27. Par conséquent, pour améliorer l’isolement fluidique des cultures au-delà de 72 h, la concentration de MAHA peut être augmentée, comme l’a démontré une étude de Caparaso et al.7, où une augmentation de MAHA a entraîné une meilleure isolation fluidique. L’intégration de contrôle est effectuée pour assurer une croissance comparable des neurites DRG dans le MC et le gel ordinaire. Il s’agit de s’assurer que MC n’a aucun impact sur la croissance de DRG. Il n’est pas recommandé de répéter l’intégration du contrôle avec chaque expérience une fois que la croissance de DRG dans MC est validée.
Les auteurs reconnaissent que les DRG humains sont plus grands, contiennent plus de cellules et ont des proportions variables de sous-type de neurone par rapport aux DRG28 de rat. L’utilisation de DRG pour rongeurs est une limite de cette étude en termes de traduction en clinique ; Cependant, ce système pourrait être précieux en tant que plate-forme de criblage pour identifier les composés qui ont un impact sur l’excitabilité neuronale. Bien qu’il existe des différences de composition entre les DRG de rongeurs et les humains, il existe également un fort chevauchement au sein du protéome entre les DRG de rat et d’homme29. Ce chevauchement dans le protéome - et la présence des mêmes sous-types neuronaux - suggère que le DRG du rat peut être utilisé pour cribler des traitements à un niveau élevé, et que d’autres tests peuvent être effectués pour déterminer si les changements dans le DRG du rat se traduisent mécaniquement par le DRG humain.
Cette plateforme permet une stimulation pharmacologique ciblée et l’étude des neurones ou des corps cellulaires avec un contrôle temporel. Les changements dans l’excitabilité neuronale et la transmission du signal peuvent être facilement mesurés en manipulant les neurites ou le DRG. La capacité d’évaluer l’excitabilité neuronale à l’aide de l’imagerie calcique dans des hydrogels de contrôle simples avec des DRG d’explant a été démontrée7. Des méthodes similaires peuvent être utilisées dans le dispositif MC pour évaluer l’excitabilité neuronale.
Cette méthode peut être utilisée pour étudier diverses affections douloureuses où la stimulation des neurones sensoriels primaires périphériques est un facteur déterminant, comme la lombalgie associée au disque. Le dépistage de l’hypersensibilité des nocicepteurs peut être un outil prometteur pour découvrir de nouveaux médicaments permettant de réduire l’hyperexcitabilité. La réduction de l’hyperexcitabilité a le potentiel de se traduire cliniquement par une réduction de la douleur. Cette plateforme permet de cribler des médicaments à haut débit afin d’identifier les candidats les plus efficaces pour la validation in vivo à l’aide de tests de comportement similaires à ceux de la douleur.
Déclarations de divulgation
Les auteurs de cette étude déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la NSF (2152065) et une bourse NSF CAREER (1846857). Les auteurs tiennent à remercier tous les membres actuels et passés du Wachs Lab pour leur contribution à ce protocole. Les diagrammes de la figure 1 ont été réalisés dans Biorender.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| #5 pince | Outils de science fine | 11252-00 | Pour tailler et couper DRG |
| 10x DMEM | MilliporeSigma | D2429 | |
| 1x PBS (autoclavé) | Préparé en laboratoire | 7,3 - 7,5 pH | |
| 24 plaques de puits | VWR | 82050-892 | Pour stocker temporairement les DRG récoltés et coupés |
| Seringue stérile, à usage unique | BD | 309657 | |
| 48 plaques de puits | Greiner Bio-One | 677180 | |
| 60 mm Boîte de Pétri | Fisher Scientific | FB0875713A | Pour maintenir les supports pour le rognage et la coupe |
| Feuille d’aluminium | Fisherbrand | 01-213-104 | |
| B27 Plus 50x | ThermoFisher | 17504044 | Pour supports DRG |
| Collagène type I | Ibidi | 50205 | |
| Courbé tasse Friedman Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16221-14 | Pour la dissection |
| Pince Dumont #3 | Outils de science fine | 11293-00 | Pour la dissection |
| Sérum de veau fœtal (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | Pour le média DRG |
| Form cure | Form Labs | Agent de durcissement | |
| Pour laver l’excès de résines | |||
| Stérilisateur à billes de verre | Fisher Scientific | NC9531961 | |
| Flacons en verre (8 mL) | DWK Life Sciences (Wheaton) | 224724 | |
| GlutaMax | ThermoFisher | 35050-061 | Pour média DRG |
| HEPES (1M) | Millipore Sigma | H0887 | |
| Haute température V2 Résine | FormLabs | FLHTAM02 | |
| Acide hyaluronique Sel de sodium | MilliporeSigma | 53747 | Utilisé pour fabriquer MAHA |
| Irgacure | MilliporeSigma | 410896 | |
| Laminin | R& D Systems | 344600501 | |
| Grands ciseaux à bec émoussé | Militex | EG5-26 | Pour la dissection |
| Grandes pinces (pointes dentelées) | Militex | 9538797 | Pour la dissection |
| Grands ciseaux à bec pointu | Outils de science fine | 14010-15 | Pour la dissection |
| Pointes de pipette à faible rétention | Fisher Scientific | 02-707-017 | Pour le pipetage du collagène et MAHA |
| Acide hyaluronique méthacrylé (MAHA) | Préparé en laboratoire | N/A | 85 - 115 % méthacrylation |
| Facteur de croissance nerveuse (NGF) | R& D Systems | 556-NG-100 | Pour les médias DRG |
| Neurobasal A Media | ThermoFisher | 10888022 | Pour les médias DRG |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Pénicilline/Streptomycine (PS) | EMD Millipore | 516106 | Pour les médias DRG |
| Bandelettes de test de pH | VWR International | BDH35309.606 | |
| Pointes de pipette (1000 & micro ; L) | USA Scientific | 1111-2021 | |
| Preform 3.23.1 software | Formslab | Pour télécharger le fichier STL | |
| Rat | Charles River | ||
| Résine Imprimante 3D | Form | Labs Form 3L | Impression 3D MC Dispositif |
| Petits ciseaux à bec pointu | Outils de sciences fines | 14094-11 | Pour la dissection |
| Bicarbonate | de sodiumMilliporeSigma | S6014 | |
| Rongeur à coupelle droite | Fine Science Tools | 16004-16 | Pour la dissection |
| Ciseaux à ressort à bord droit | Outils pour les sciences fines | 15024-10 | Pour la dissection |
| Lame chirurgicale Scaplel (N° 10) | Fisher Scientific | 22-079-690 | |
| Filtres à seringue, PES (0.22 µ ; m) | Celltreat | 229747 | |
| Ciseaux à ressort minuscules | World Precision Instruments | 14003 | Pour la coupe et la coupe |
| Lampe UV | Analytik Jena US | Pour photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2) |
Références
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the global burden of disease study 2015. Lancet. 388 (10053), 1545-1602 (2016).
- Goldberg, D. S., Mcgee, S. J. Pain as a global public health priority. BMC Public Health. 11 (1), 770(2011).
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
- Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Im, H. J., et al. Alteration of sensory neurons and spinal response to an experimental osteoarthritis pain model. Arthritis Rheum. 62 (10), 2995-3005 (2010).
- Jensen, T. S., Finnerup, N. B. Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: Clinical manifestations and mechanisms. Lancet Neurol. 13 (9), 924-935 (2014).
- Berge, O. G. Predictive validity of behavioral animal models for chronic pain. Br J Pharmacol. 164 (4), 1195-1206 (2011).
- Anderson, W. A., Willenberg, A. R., Bosak, A. J., Willenberg, B. J., Lambert, S. Use of a capillary alginate gel (capgel™) to study the three-dimensional development of sensory nerves reveals the formation of a rudimentary perineurium. J Neurosci Methods. 305, 46-53 (2018).
- Mohammed Izham, N. A., et al. Exploring the possibilities of using in vitro model for neuropathic pain studies. Neurosci Res Notes. 5, 144(2022).
- Park, S. E., et al. A three-dimensional in vitro model of the peripheral nervous system. NPG Asia Mater. 13 (1), 2(2021).
- Caparaso, S. M., Redwine, A. L., Wachs, R. A. Engineering a multi-compartment in vitro model for dorsal root ganglia phenotypic assessment. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 111 (11), 1903-1920 (2023).
- Krug, A. K., et al. Evaluation of a human neurite growth assay as specific screen for developmental neurotoxicants. Arch Toxicol. 87 (12), 2215-2231 (2013).
- F, M., et al. Extracellular matrix stiffness negatively affects axon elongation, growth cone area and F-actin levels in a collagen type I 3D culture. J Tissue Eng Regen Med. 16 (2), 151-162 (2021).
- Spearman, B. S., et al. Tunable methacrylated hyaluronic acid-based hydrogels as scaffolds for soft tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. 108 (2), 279-291 (2020).
- Zhu, W., Oxford, G. S. Differential gene expression of neonatal and adult DRG neurons correlates with the differential sensitization of TRPV1 responses to nerve growth factor. Neurosci Lett. 500 (3), 192-196 (2011).
- Van De Wijdeven, R., et al. Structuring a multi-nodal neural network in vitro within a novel design microfluidic chip. Biomed Microdevices. 20, 1-8 (2018).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Ng, B. K., Chen, L., Mandemakers, W., Cosgaya, J. M., Chan, J. R. Anterograde transport and secretion of brain-derived neurotrophic factor along sensory axons promote Schwann cell myelination. J Neurosci. 27 (28), 7597-7603 (2007).
- Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent drg neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
- Seidlits, S. K., et al. The effects of hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties on neural progenitor cell differentiation. Biomaterials. 31 (14), 3930-3940 (2010).
- Tomal, W., Ortyl, J. Water-soluble photoinitiators in biomedical applications. Polymers. 12 (5), 1073(2020).
- Leary, S., et al. Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. Veterinary Medical Association. , Schaumburg, Illinois. (2013).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Res Notes. 9 (1), 82(2016).
- Naveed, M., et al. Simple methods of dissection protocols for the rapid isolation of rat dorsal root ganglia under the non-microscopic condition. Neuroscience Research Notes. 6 (2), 212(2023).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).
- Bai, X., et al. A high-resolution anatomical rat atlas. J Anatomy. 209 (5), 707-708 (2006).
- Bian, L., et al. The influence of hyaluronic acid hydrogel crosslinking density and macromolecular diffusivity on human MSC chondrogenesis and hypertrophy. Biomaterials. 34 (2), 413-421 (2013).
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. Human dorsal root ganglia. Front Cell Neurosci. 13, 271(2019).
- Schwaid, A. G., Krasowka-Zoladek, A., Chi, A., Cornella-Taracido, I. Comparison of the rat and human dorsal root ganglion proteome. Scientific Rep. 8 (1), 13469(2018).
Réimpressions et autorisations
