Isolement des cellules immunitaires du cerveau et du crâne de souris

Le cerveau, plaque tournante centrale du système nerveux, est protégé par le crâne. Sous le crâne se trouvent trois couches de tissu conjonctif appelées méninges : la dure-mère, l’arachnoïde et la pie-mère. Le liquide céphalo-rachidien (LCR) circule dans l’espace sous-arachnoïdien entre l’arachnoïde et la pie-mère, amortissant le cerveau et éliminant également les déchets via le système glymphatique ^1,2. Ensemble, cette architecture unique fournit un environnement sûr et favorable qui maintient la stabilité du cerveau et le protège contre les blessures potentielles.

Le cerveau a longtemps été considéré comme immuno-privilégié. Cependant, cette notion a été partiellement abandonnée car de plus en plus de preuves de plus en plus de la microglie résidente dans le parenchyme, les frontières du cerveau, y compris le plexus choroïde et les méninges, hébergent un large éventail de cellules immunitaires³. Ces cellules jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie, la surveillance de la santé du cerveau et l’initiation de la réponse immunitaire aux lésions cérébrales. Notamment, des découvertes récentes indiquent que le crâne est impliqué dans l’immunité des méninges et peut contribuer à la réponse immunitaire dans le cerveau après une blessure. En 2018, Herisson et al. ont fait une découverte fondamentale des canaux vasculaires directs qui relient la moelle osseuse du crâne aux méninges, établissant ainsi une voie anatomique pour la migration des leucocytes ^4,5. Plus tard, Cugurra et al. ont démontré que de nombreuses cellules myéloïdes (par exemple, les monocytes et les neutrophiles) et les lymphocytes B dans les méninges ne proviennent pas du sang⁶. À l’aide de techniques telles que la transplantation par lambeau osseux calvaria et les régimes d’irradiation sélective, les auteurs ont fourni des preuves convaincantes que la moelle osseuse du crâne sert de source locale de cellules myéloïdes dans les méninges ainsi que le parenchyme du SNC après une lésion du SNC⁶. De plus, une autre étude a suggéré que les lymphocytes B méningés sont constamment alimentés par la moelle osseuse du crâne⁷. Plus récemment, une nouvelle structure, appelée sortie de la coiffe arachnoïdienne (ACE), a été identifiée comme une passerelle directe entre la dure-mère et le cerveau pour le trafic des cellules immunitaires⁸.

Ces découvertes passionnantes ont des implications importantes sur l’origine de l’infiltration des cellules immunitaires dans le cerveau blessé (par exemple, après un accident vasculaire cérébral ischémique). De nombreuses preuves ont indiqué qu’après un AVC, de nombreuses cellules immunitaires s’infiltrent dans le cerveau, contribuant à la fois à des lésions cérébrales aiguës et à une récupération cérébrale chronique. L’idée conventionnelle est que ces cellules sont des leucocytes circulants dans le sang qui s’infiltrent dans le cerveau, ce qui est largement facilité par les dommages à la barrière hémato-encéphalique induits par les accidents vasculaires cérébraux. Cependant, cette notion a été remise en question. Dans une étude, les cellules immunitaires du crâne et du tibia des souris ont été étiquetées différemment, et 6 heures après l’AVC, une diminution significativement plus importante des neutrophiles et des monocytes a été observée dans le crâne par rapport à l’AVC. Le tibia et d’autres neutrophiles dérivés du crâne étaient présents dans le cerveau ischémique. Ces données suggèrent que dans la phase aiguë de l’AVC, les neutrophiles dans le cerveau ischémique proviennent principalement de la moelle osseuse du crâne⁴. Il est intéressant de noter que le LCR peut guider cette migration. En effet, deux rapports récents ont démontré que le LCR peut relayer directement les signaux de signalisation du cerveau dans la moelle osseuse du crâne via les canaux crâniens, et instruire la migration cellulaire et l’hématopoïèse dans la moelle osseuse du crâne après une lésion du SNC ^9,10.

À la lumière de ces découvertes récentes, il est devenu important d’analyser les changements dans les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle osseuse du crâne, lors de l’étude de la réponse immunitaire aux troubles cérébraux. Dans de telles études, un nombre suffisant de cellules immunitaires de haute qualité est nécessaire pour les analyses en aval telles que le tri cellulaire, l’analyse par cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN sur cellule unique (scRNA-seq). Ici, l’objectif global est de présenter deux procédures optimisées pour la préparation de suspensions unicellulaires à partir de tissu cérébral et de moelle osseuse du crâne. Il est important de noter que la calvaria (os frontal, os occipital et os pariétaux) du crâne est généralement utilisée pour extraire la moelle osseuse, et cette moelle osseuse est spécifiquement appelée moelle osseuse du crâne tout au long de cette étude.

Le protocole a été approuvé par le comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Institut Duke (IACUC). Des souris mâles C57Bl/6 (âgées de 3 à 4 mois ; 22 à 28 g) ont été utilisées dans la présente étude. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Suspension unicellulaire à partir du cerveau de souris

REMARQUE : La figure 1 illustre la vue d’ensemble du protocole d’isolement des cellules cérébrales.

1. Anesthésier, intuber et sécuriser la souris, comme démontré précédemment¹¹.
2. Faites une incision abdominale supérieure à travers la peau et les couches musculaires sous-jacentes, et coupez soigneusement le diaphragme et les côtes pour créer l’ouverture dans la cavité thoracique.
3. Remplissez une seringue de 30 ml de PBS froid et fixez-la à l’aiguille de perfusion émoussée à l’aide d’un tube en silicone. Insérez soigneusement l’aiguille de perfusion dans le ventricule gauche.
4. Effectuez une petite entaille à l’oreillette droite pour permettre le drainage sanguin, puis perfuser¹² la souris à un débit de ~ 10 mL/min pendant 3-4 min.
   REMARQUE : Pour améliorer la clairance sanguine dans le cerveau, l’augmentation du volume de la solution de perfusion et l’ajout d’héparine peuvent être envisagés.
5. Décapitez la souris et faites une incision médiane à travers la peau sur le dessus de la tête pour exposer le crâne.
6. Grattez soigneusement tout tissu conjonctif recouvrant le crâne à l’aide d’une pince émoussée.
7. À l’aide de ciseaux de dissection tranchants, coupez soigneusement les sutures du crâne le long de la ligne médiane et des deux côtés, créant ainsi un rabat.
8. Soulevez doucement le rabat du crâne pour exposer le cerveau et utilisez une pince émoussée pour retirer soigneusement le cerveau de la cavité crânienne.
9. Plongez le cerveau dans une boîte de Pétri contenant du PBS glacé et retirez tous les tissus méninges restants.
   REMARQUE : Pour mieux préserver la viabilité cellulaire, il est recommandé d’effectuer toutes les étapes suivantes sur de la glace ou à 4 °C.
10. Placez le cerveau dans un homogénéisateur en verre prérefroidi de 15 ml contenant 20 ml (cerveau entier) ou 12 ml (demi-cerveau) de tampon HBSS glacé.
11. Utilisez le pilon lâche Dounce pour dissocier doucement et lentement le tissu cérébral avec environ 100 à 120 coups sur de la glace.
    REMARQUE : Cette étape est essentielle pour obtenir une grande quantité de cellules cérébrales saines. Cette étape dure environ 10 min. Arrêtez l’homogénéisation lorsqu’aucun morceau substantiel de tissu cérébral n’est visible dans la suspension. À ce stade, le pilon peut facilement se déplacer vers le bas sans aucune force.
12. Filtrez la suspension de tissu cérébral résultante à travers une crépine cellulaire de 70 μm dans un tube à centrifuger de 50 mL.
13. Rincez le tube Dounce avec 5 mL de HBSS et procédez à la filtration pour maximiser la collecte des cellules.
14. Centrifuger la suspension tissulaire filtrée à 550 x g pendant 6 min à 4 °C.
15. Retirer le surnageant à l’aide d’un aspirateur et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de solution à gradient de densité isotonique à 30 %.
    REMARQUE : Pour préparer 15 mL de solution de gradient de densité isotonique à 30%, mélanger 4,5 mL de milieu à gradient de densité de 100%, 1,5 mL de PBS 10× et 9 mL de ddH₂O.
16. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml et ajoutez 9 ml (cerveau entier) ou 6 ml (demi-cerveau) de solution à gradient de densité de 30 %.
17. Retournez doucement le tube pour assurer un mélange complet.
18. Centrifuger immédiatement le tube à 845 x g avec l’accélération et le freinage réglés au niveau 3, pendant 20 min à 4 °C.
19. Retirez délicatement le tube de la centrifugeuse sans le secouer et aspirez soigneusement la couche supérieure de myéline à l’aide d’une pointe de 1 mL reliée au vide.
    REMARQUE : Il est extrêmement important de ne pas déranger cette couche. Toute myéline restante peut avoir un impact négatif sur la santé des cellules et compromettre les analyses en aval.
20. Aspirez le surnageant, en laissant 1 à 2 mL derrière, et remettez en suspension la pastille cellulaire avec un minimum de 10 mL de HBSS froid.
21. Centrifugeuse à 550 x g pendant 6 min à 4 °C.
22. Laver une fois de plus avec un minimum de 7 ml de HBSS froid.
23. Retirez la plus grande partie possible du surnageant et remettez les cellules en suspension pour l’analyse par cytométrie en flux à l’aide de 100 à 200 μL de tampon de cytométrie en flux.
    REMARQUE : Le tampon FACS de cytométrie en flux utilisé pour cette étude contient 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA dans 1× PBS. Une plaque à fond en V de 96 puits pour la coloration des cellules est recommandée pour minimiser la perte de cellules pendant les étapes de lavage.
24. Effectuer une analyse par cytométrie en flux à l’aide d’un protocole standard établi dans chaque laboratoire¹³.
    1. Mélangez brièvement 80 μL de suspension cellulaire avec 20 μL du mélange d’anticorps dans une plaque à fond en V de 96 puits et incubez pendant 25 min à 4 °C.
    2. Laver avec 200 μL de tampon FACS, puis remettre les cellules en suspension avec 100 μL de réactif de coloration HBSS plus viabilité cellulaire.
    3. Après une incubation de 15 minutes à 4 °C, laver avec un tampon FACS et remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon FACS pour l’analyse par cytométrie en flux.

2. Préparation d’une suspension unicellulaire de moelle osseuse à partir de calvaria de souris

REMARQUE : La figure 2 présente un aperçu de la procédure d’isolement de la moelle osseuse du crâne.

1. Perfusez la souris comme décrit à l’étape 1.4.
2. Décapitez la souris et faites une incision cutanée médiane sur le cuir chevelu pour exposer le crâne.
3. Coupez à travers le crâne, en commençant par le foramen magnum et en avançant le long des côtés latéraux du calvaria à l’aide de ciseaux tranchants. Ensuite, soulevez et retirez la calvaria.
   REMARQUE : Le cerveau peut être prélevé sur la même souris et traité à l’aide de l’étape 1, ce qui permet d’analyser les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle osseuse du crâne.
4. Décollez soigneusement la dure-mère du crâne à l’aide d’un microscope à disséquer à l’aide d’une pince émoussée.
   REMARQUE : Il est plus facile de commencer par les bords de l’os occipital, de se détacher lentement et de progresser progressivement vers la zone frontale, en travaillant vers l’intérieur.
5. Placez le calvaria dans le plat sur de la glace et utilisez une pipette de 1 mL pour rincer le calvaria, en veillant à ce que les résidus sanguins de sa surface soient éliminés.
6. Transférez la calvaria dans un nouveau plat avec du PBS frais et froid suffisant pour immerger la calvaria.
7. À l’aide de ciseaux stériles, coupez la calvaria en fragments d’environ 3 mm x 3 mm dans du PBS froid.
   REMARQUE : Les méthodes de culture peuvent affecter l’efficacité de l’extraction de la moelle osseuse de la calvaria. Il est recommandé d’utiliser la même méthode de culture pour minimiser la variabilité. Il est également important de couper les sutures. La figure 2B illustre une approche.
8. Percez un trou dans le fond d’un tube de microcentrifugation de 500 μL à l’aide d’une aiguille de 18 G.
9. Insérez ce tube dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 20 μL de PBS froid.
10. Transférez les fragments de calvaria dans le tube de 500 μL.
    REMARQUE : Les fragments d’os doivent être compactés sans serrer pour augmenter l’efficacité de l’extraction.
11. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 30 s à 4 °C.
    REMARQUE : Pour maximiser la récupération cellulaire, utilisez une aiguille de 18 G pour remuer doucement les fragments de calvaria, et répétez cette étape 1 à 2 fois de plus.
12. Remettre en suspension les cellules de moelle osseuse de calvaria collectées dans 500 μL de tampon de lyse des globules rouges et incuber à température ambiante pendant 30 s.
13. Transférez la suspension dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 4 mL de PBS froid.
14. Centrifuger à 400 x g pendant 6 min à 4 °C.
15. Laver une fois de plus avec 5 ml de PBS froid.
16. Remettez en suspension la pastille de cellule dans un tampon approprié. Pour la cytométrie en flux, nous utilisons généralement 500 μL de tampon FACS.
17. Pour l’analyse par cytométrie en flux, effectuez le comptage des cellules et utilisez environ 1 x 10⁶ cellules pour la coloration des anticorps.
    REMARQUE : Assurez-vous d’inclure l’étape de blocage Fc avant la coloration des anticorps¹³.

Pour préparer des cellules immunitaires à partir du tissu cérébral de la souris, le protocole produit généralement des cellules à haute viabilité (84,1 % ± 2,3 % [moyenne ± écart-type]). Environ 70 à 80 % de ces cellules sont CD45 positives. Dans le cerveau normal d’une souris, presque toutes les cellules CD45+ sont microgliales (CD45LowCD11b+), comme prévu. Ce protocole a été utilisé en laboratoire pour diverses applications, notamment l’analyse par cytométrie en flux, le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et l’analyse scRNA-seq. À titre d’exemple, une analyse par cytométrie en flux a été effectuée dans un modèle d’AVC (figure 3). Les souris ont été soumises à un modèle d’AVC transitoire, une occlusion de l’artère cérébrale moyenne filamentaire (MCAO) de 30 minutes14. Le 3e jour après l’AVC, les cellules ont été préparées à partir de cerveaux de souris et colorées avec des marqueurs de surface communs aux cellules immunitaires. La stratégie de contrôle est illustrée à la figure 3A. Conformément à des recherches antérieures13,15, une augmentation marquée des cellules CD45 High dans l’hémisphère ipsilatéral a été observée (Figure 3B,C), indiquant une infiltration de la cellule immunitaire dans le cerveau.

Pour le protocole de moelle osseuse du crâne, un rendement substantiel de cellules de moelle osseuse du crâne (environ 2 x 106 cellules) a été systématiquement obtenu avec une excellente viabilité (93,8 % ± 1,8 % [± écart-type moyen]). Comme prévu, la plupart de ces cellules sont CD45 positives. Pour illustrer l’utilité de ce protocole, une étude comparative a été réalisée pour caractériser la composition des cellules immunitaires dans le fémur et la moelle osseuse du crâne de souris naïves (Figure 4). Comme le montrent les graphiques représentatifs, la composition des cellules immunitaires était similaire entre le fémur et la moelle osseuse du crâne (figures 4A, B). Il est intéressant de noter que la fréquence des neutrophiles semble être plus élevée dans le fémur que dans l’os du crâne (Figure 4C). Cependant, cette constatation doit être validée davantage, car la taille de l’échantillon était petite pour cette étude pilote.

Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole d’isolement des cellules cérébrales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Protocole d’isolement des cellules de la moelle osseuse du crâne. (A) Aperçu de la procédure. (B) Le modèle recommandé pour la coupe du crâne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Analyse par cytométrie en flux représentative des cellules immunitaires dans le cerveau de l’AVC. (A) Un exemple de stratégie de gating. Les graphiques illustrent les populations de cellules immunitaires suivantes : microglie (CD45faibleCD11b+), cellules NK (CD45élevéeNK1.1+), neutrophiles (CD45élevéLy6G+), cellules T (CD45élevéeCD11b-CD3+) et cellules B (CD45élevéeCD11b-CD19+). Cet exemple représente une analyse des cellules immunitaires cérébrales de l’hémisphère ipsilatéral au jour 3 après un AVC. (B, C) Infiltrer les cellules immunitaires dans le cerveau de l’AVC. De jeunes souris mâles ont été soumises à une occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne (MCAO). Le jour 3, les cerveaux ont été collectés et divisés en hémisphères gauche (controlatéral) et droit (ipsilatéral). Les cellules cérébrales ont été préparées selon le protocole décrit, puis soumises à une analyse par cytométrie en flux. Les graphiques représentatifs illustrent une augmentation des cellules immunitaires infiltrantes dans l’hémisphère ipsilatéral (cellulesCD45 High ; B). Les données quantitatives sont présentées dans les graphiques à barres (C). Le nombre de cellules a été calculé sur la base du nombre de cellules et du volume enregistrés dans les données de cytométrie en flux. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± MEB. *p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse cytométrie en flux représentative des cellules de la moelle osseuse du crâne. À titre de comparaison, l’analyse des cellules de la moelle osseuse du fémur a été incluse. Les graphiques représentent les populations de cellules immunitaires suivantes : cellules NK (CD45+NK1.1+), neutrophiles (CD45+CD11b+Ly6G+), cellules T (CD45+CD11b-CD3+) et cellules B (CD45+CD11b-CD19+). (A) Parcelles représentatives pour la moelle osseuse du fémur. (B) Tracés représentatifs pour la moelle osseuse du crâne. (C) Comparaison de la composition des cellules immunitaires entre le fémur et la moelle osseuse du crâne. Les données sont présentées sous forme de ± moyenne SEM. *p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Aucun.