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Article de méthode

Essai de réassemblage de la luciférase fractionnée pour mesurer les contacts du réticulum endoplasmique et des mitochondries dans des cellules vivantes

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DOI :

10.3791/66862

⸱

11 octobre 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Science Education, College of Medicine, Charles R. Drew University of Medicine and Science

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous avons mis au point un test de réassemblage de la luciférase fractionnée pour surveiller les contacts réticulum-mitochondrie endoplasmique dans les cellules vivantes. À l’aide de ce test, nous décrivons un protocole permettant de mesurer quantitativement le niveau de ces couplages inter-organites dans HEK293T cellules, dans des conditions de traitement chimique.

Résumé

Les sites de contact du réticulum endoplasmique (RE)-mitochondries jouent un rôle essentiel dans la santé cellulaire et l’homéostasie, tels que la régulation du Ca2+ et de l’homéostasie lipidique, la dynamique mitochondriale, la biogenèse des autophagosomes et des mitophagosomes et l’apoptose. L’incapacité à maintenir un couplage ER-mitochondrial, normal, est impliquée dans de nombreuses maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique et la paraplégie spastique héréditaire. Il est d’une importance considérable d’explorer comment la dérégulation des contacts mitochondriaux RE pourrait conduire à la mort cellulaire et si la réparation de ces contacts à un niveau normal pourrait améliorer les conditions neurodégénératives. Ainsi, des tests améliorés qui mesurent le niveau de ces contacts pourraient aider à éclairer les mécanismes pathogènes de ces maladies. À terme, la mise en place de dosages simples et fiables facilitera le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous décrivons ici un test de luciférase fractionnée pour mesurer quantitativement le niveau de contacts entre les mitochondries du RE et les cellules vivantes. Ce test peut être utilisé pour étudier le rôle physiopathologique de ces contacts ainsi que pour identifier leurs modulateurs dans le criblage à haut débit.

Introduction

Les interactions entre le RE et les mitochondries sont vitales pour l’homéostasie cellulaire et la survie 1,2,3,4. Des preuves antérieures indiquent que tout type de perturbation ou de dérégulation des sites de contact entre les mitochondries du RE peut contribuer à plusieurs maladies neurodégénératives, métaboliques et cardiovasculaires, ainsi qu’au cancer 5,6,7,8,9,10. Par exemple, une augmentation anormale de l’absorption de Ca2+ dans les mitochondries peut entraîner la mort cellulaire en ouvrant les pores de transition de perméabilité des mitochondries, qui sont couramment observés dans certains modèles de la maladie d’Alzheimer 5,11. De même, la réduction des contacts entre les mitochondries du RE peut entraîner une diminution de la production d’ATP et une altération de l’apport en Ca2+, comme on l’a vu dans des modèles de sclérose latérale amyotrophique 5,11,12. Au fur et à mesure que de plus en plus d’études sont menées dans le domaine des contacts RE-mitochondries, d’autres protéines et gènes liés à la maladie qui pourraient affecter ces contacts sont découverts. Malgré les connaissances actuelles et les preuves montrant le rôle des sites de contact RE-mitochondries, beaucoup de travail reste encore à faire pour élucider comment ces contacts pourraient entraîner une perte de fonction cellulaire et, en fin de compte, la mort cellulaire.

Diverses méthodes ont été développées pour évaluer la proximité des deux membranes, la morphologie structurelle et la distance entre les deux sites de contact des organites 3,4,13. Les approches de surveillance du couplage RE-mitochondries comprennent l’imagerie basée sur des marqueurs de fluorescence14,15, l’imagerie basée sur le rapporteur FRET16 et l’imagerie basée sur une sonde de fluorescence divisée17,18, qui utilisent l’épifluorescence et la microscopie confocale. La microscopie à super-résolution et la microscopie à résolution atomique sont également des outils puissants pour visualiser avec précision les contacts entre organites, bien que leur utilisation dans l’analyse des sites de contact soit encore limitée car elles nécessitent des microscopes hautement dédiés et une expertise technique19. De plus, la microscopie électronique à transmission (MET), la microscopie électronique à balayage (MEB) et d’autres techniques EM telles que la tomographie électronique (TE) et la cryomicroscopie électronique sont couramment utilisées car elles fournissent une imagerie ultrastructurale à haute résolution des sites de contact, qui sont souvent impossibles à explorer à l’aide d’autres approches expérimentales 20,21,22. Cependant, ces méthodes basées sur les EM sont une technique à très faible débit qui peut également être affectée par les procédures de fixation chimique. Plus récemment, des méthodes basées sur le marquage de proximité ont été utilisées pour détecter les sites de contact ainsi que pour identifier de nouvelles protéines de site de contact. Par exemple, le test de ligature de proximité (PLA) a été utilisé pour quantifier la proximité des organites23,24, tandis qu’une version révisée du test de l’ascorbate peroxydase (APEX) a été utilisée pour identifier de nouvelles protéines de site de contact25,26. Il est important de reconnaître que toutes ces méthodes décrites ci-dessus ont des forces et des limites intrinsèques dans la détection des contacts entre les organites. Ainsi, l’appariement de différentes techniques est nécessaire pour obtenir une interprétation approfondie des sites de contact des organites.

Auparavant, nous avons établi le test de réassemblage de la Renilla luciférase 8 (test Split-Rluc) pour surveiller le niveau de contacts membranaires des mitochondries du RE (Figure 1A)24,26,27. En bref, chaque moitié fendue de Renilla luciferase est conjuguée à une séquence ciblant le RE ou les mitochondries. Lorsqu’elle est transfectée ensemble, chaque moitié fendue de l’enzyme est exprimée soit dans le RE, soit dans la membrane mitochondriale. Lorsque le RE et les mitochondries sont positionnés à proximité l’une de l’autre, les moitiés fendues se rejoignent et reconstituent l’ensemble de l’enzyme avec l’activité de la luciférase. Pour la construction split-Rluc, nous avons utilisé Renilla luciferase 8 (Rluc8) dans pBAD/Myc-His27 pour le modèle initial. Le site de division (entre les acides aminés 91 et 92) a été déterminé sur la base des rapports précédents27. Pour la moitié N-terminale du Rluc8, les séquences d’ADN des acides aminés 1-91 du Rluc8 ont été fusionnées à l’extrémité 3' de l’étiquette FLAG et à la séquence de ciblage mitochondriale AKAP1 de la souris dans le vecteur TOPO pcDNA3.1 par PCR27. Pour la moitié C-terminale ciblée sur le RE, les séquences d’ADN qui codent pour les acides aminés 92-311 ont été fusionnées à l’extrémité 5' de l’étiquette myc et à la séquence de localisation du RE UBC6 de la levure. Ici, nous avons mis à niveau la construction du plasmide luc split-Rde sorte que les moitiés fendues de la Renilla luciferase sont exprimées dans un seul vecteur (pCAG) sous le même promoteur, puis clivées en deux fragments lorsque T2A, une séquence 2A du peptide 2A auto-clivant du virus Thosea asigna, est insérée entre les deux moitiés divisées (Figure 1B). La carte et les séquences de l’ADN plasmidique sont fournies dans le fichier supplémentaire 1 et la figure supplémentaire S1. À l’aide de ce système, nous avons mesuré les effets de trois substances chimiques (inhibitrices des GTPases impliquées dans la polymérisation de l’actine) sur les contacts RE-mitochondries. Ce test luc split-Rest un système de test simple mais robuste pour le criblage à haut débit de modulateurs de contact inter-organites24.

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Protocole

1. Entretien des cellules et ensemencement (Jour 1)

  1. Conserver HEK293T cellules dans un milieu de culture cellulaire contenant du milieu modifié Eagle de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) (dans des boîtes de culture de 100 mm) dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2.
  2. Avant de commencer, vérifiez la confluence de la plaque en l’observant au microscope. Lorsque les cellules atteignent environ 80 à 90 % de confluence, préparez-vous à ensemencer les cellules dans une plaque de culture à 6 puits en retirant le milieu et en les lavant avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS).
  3. Retirer le DPBS de la boîte de culture et traiter les cellules avec 1 mL de rouge phénolique Trypsine-EDTA à 0,05 %. Incuber pendant 3 min, puis sortir la plaque de l’incubateur et ajouter 9 mL de milieu de culture (DMEM avec 10 % de FBS) pour arrêter la réaction de la trypsine. Pipetez lentement de haut en bas pour vous assurer que toutes les cellules encore collées à la plaque sont délogées. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml.
  4. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à température ambiante. Retirer le milieu et remettre en suspension les granules de cellules avec 1 mL de milieu frais (DMEM + 10 % FBS).
  5. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    1. Assurez une distribution uniforme des cellules en faisant tourner doucement le tube. Retirer immédiatement 10 μL de la suspension cellulaire et l’introduire dans un tube de microcentrifugation de 1,7 mL. Ajoutez 90 μL de fluide dans le même tube.
    2. Après avoir mélangé doucement les cellules et les milieux, prélever la suspension cellulaire et appliquer 10 μL dans chacune des chambres de l’hémocytomètre en pipetant doucement sous la lamelle.
    3. À l’aide d’un objectif 10x, faites la mise au point au microscope sur les lignes de la grille de l’hémocytomètre. Une fois sélectionné, comptez le nombre de cellules dans un ensemble de 16 cases (4 x 4 cases) à l’aide d’un compteur de comptage de main. Répétez l’opération jusqu’à ce que les quatre séries de 16 carrés soient comptées.
    4. Calculez le nombre total de cellules/ml en prenant le nombre moyen de cellules (de chacun des 16 carrés d’angle) et en le multipliant par 105.
      REMARQUE : Au lieu d’utiliser un hémocytomètre pour compter les cellules, un compteur de cellules automatisé peut être utilisé selon les instructions du fabricant.
  6. Une fois le comptage des cellules terminé, préparez-vous à plaquer les cellules dans une plaque à 6 puits à 7,5 × 10 à une densité de5 cellules/puits avec 2 mL de milieu/puits. Dans un tube de 50 ml, ajoutez le volume nécessaire de cellules ainsi que 13 ml de milieu. Versez 2 ml de la suspension cellulaire diluée dans chacun des 6 puits.
    1. Avant le placage, calculer le nombre de cellules nécessaires pour 7,5 × 105 cellules/puits en utilisant C1V1 = C2V2 où C1 est le nombre initial de cellules (nombre de cellules/mL), V1 est le volume nécessaire à partir de la suspension cellulaire initiale, C2 est la densité cellulaire cible souhaitée (nombre de cellules/mL), et V2 est le volume final nécessaire à l’ensemencement cellulaire.
  7. Après la distribution, tapotez doucement la plaque de tous les côtés pour étaler les cellules, puis placez-la dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2 pendant la nuit.

2. Transfection cellulaire médiée par la polyéthylèneimine (PEI) et ensemencement cellulaire post-transfection (jour 2)

  1. Retirez la plaque à 6 puits de l’incubateur et aspirez le milieu de culture existant de chaque puits. Ajouter 2 ml de milieu frais par puits.
  2. Transfectez les cellules avec l’ADN plasmidique split-Rluc (pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry) dissous dans un tampon TE (pH 8,0).
    1. Pour chaque puits, mélangez l’ADN (750 ng) et le PEI (rapport ADN/PEI = 1:3) dans 200 μL de DMEM dans un tube de microcentrifugation de 1,7 mL. Vortex rapidement l’ADN/PEI au niveau 8 pendant environ 2 s pour s’assurer qu’ils se mélangent bien pour former un complexe. Après cela, faites-le tourner brièvement dans une mini-centrifugeuse (<3 s).
    2. Laissez le mélange ADN/PEI incuber à température ambiante pendant 15 min, puis ajoutez le mélange (en le laissant tomber) à la surface du milieu de culture dans la plaque à 6 puits contenant les cellules. Tapotez doucement la plaque (pour répartir uniformément le mélange) et incubez-la dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 6 h.
  3. Pendant l’incubation, préparer une plaque à 96 puits recouverte de poly-D-lysine (PDL) en ajoutant d’abord 70 μL de PDL (50 μg/mL dans le DPBS) dans chaque puits et en l’incubant dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant au moins 1 h. Retirer la solution de PDL, puis laver chaque puits 2 fois avec 100 μL de DPBS. À la fin du deuxième lavage, assurez-vous que tous les DPBS restants sont retirés.
  4. 6 h après la transfection, préparez-vous à ensemencer les cellules transfectées dans une plaque à 96 puits recouverte de PDL.
    1. Sortez de l’incubateur la plaque à 6 puits contenant les cellules transfectées, aspirez le milieu et lavez chaque puits avec 2 ml de DPBS. Après avoir retiré le DPBS, ajoutez 350 μL de rouge phénol Trypsine-EDTA à 0,05 % et incubez pendant 1 à 2 min. Pour arrêter la réaction de la trypsine, ajoutez 1,7 mL de milieu dans chaque puits.
    2. Après avoir transféré les cellules et le milieu dans un tube de 50 ml, faites tourner le tube à 300 × g pendant 5 min dans une centrifugeuse de table. Aspirez le milieu et remettez en suspension la pastille de cellule avec 1 mL de milieu frais. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre (comme décrit à l’étape 1.5).
  5. Ensemencer les cellules dans une plaque de 96 puits recouverte d’un PDL à une densité de 4 × 104 cellules/puits dans 100 μL de milieu de culture. Pour cela, dans un tube de 50 ml, ajoutez le volume nécessaire de cellules (voir ci-dessous pour le calcul) ainsi que le volume approprié de média (volume total de 12 ml). À l’aide d’une pipette multicanaux, versez 100 μL de suspension cellulaire diluée dans chacun des 96 puits. Incuber les cellules pendant 18 h dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2.
    1. Calculez le nombre de cellules nécessaires pour 4 × 104 cellules/puits à l’aide de C1V1 = C2V2 où C1 est le nombre initial de cellules (nombre de cellules/mL), V1 est le volume nécessaire à partir de la suspension cellulaire initiale, C2 est la densité cellulaire cible souhaitée (nombre de cellules/mL) et V2 est le volume final nécessaire pour l’ensemencement des cellules.

3. Traitement chimique et dosage de la luciférase dans des cellules vivantes (Jour 3)

  1. Dans un tube à microfuge de 1,7 mL, préparer les trois solutions fraîches de 50 μM de rhosine (50 mM de DMSO), de 25 μM d’Ehop-016 (25 mM de DMSO) et de 50 μM de ZCL278 (50 mM de DMSO) en diluant chaque solution mère (50 mM de rhosine, 25 mM d’Ehop-016 et 50 mL de ZCL278 ; toutes dans du DMSO) à 1:1 000 dans la quantité requise (50 μL/puits × nombre de puits) de milieu de culture. À chaque solution, ajouter un substrat de cellules vivantes (stock de 50 mM dans du DMSO) pour Renilla luciferase diluée à 1:2 000 jusqu’à une concentration finale de 25 μM. Pour fabriquer des solutions ZCL278 de 0,5, 5 et 50 μM, effectuez des dilutions en série en utilisant le ZCL278 initial de 50 μM dans un milieu de culture.
    REMARQUE : Si le temps d’incubation du produit chimique est inférieur à 1-1,5 h, les cellules peuvent être préincubées avec un substrat de cellules vivantes (pour Renilla luciferase) pendant 1-1,5 h avant d’être traitées avec chaque produit chimique. Nous ajoutons simultanément des produits chimiques et un substrat de cellules vivantes afin d’optimiser le protocole de criblage de médicaments à haut débit.
  2. Retirez le milieu de chaque puits de la plaque de 96 puits contenant les cellules transfectées et ajoutez 50 μL de mélange de produits chimiques et de substrat dans chaque puits.
  3. Après avoir incubé les cellules pendant 1 h, 2 h ou 5 h, sortez la plaque de culture de l’incubateur, chargez-la sur le lecteur de plaque de luminescence et mesurez la luminescence.
    1. Avant de commencer, assurez-vous que le lecteur de plaques est allumé. Accédez au logiciel de lecture de microplaques et créez un nouveau fichier en cliquant sur Nouvelle session. Réglez la température du lecteur de plaques sur 37 °C en cliquant sur Incubateur, en cochant l’option de température et en tapant 37 °C. Sous Disposition des plaques, choisissez l’option Inconnu et spécifiez les puits à mesurer en cliquant et en faisant glisser.
    2. Sous Protocole, cliquez sur Luminescence et conservez les paramètres par défaut. Une fois la configuration terminée, chargez la plaque avec le couvercle retiré dans le lecteur de plaques et choisissez Run Plate In. Cliquez sur Démarrer et la fenêtre d’enregistrement du fichier apparaîtra. Enregistrez le fichier sur votre bureau en le renommant et en cliquant sur Enregistrer.
      REMARQUE : La luminescence continuera à être produite pendant >24 h après l’ajout du substrat de cellule vivante.
  4. Une fois la lecture terminée, retirez la plaque du lecteur de plaques, puis cliquez sur Exécuter la plaque pour remettre le lecteur en place. Une fois terminé, replacez la plaque dans l’incubateur humidifié (37 °C, 5% CO2) jusqu’à la lecture suivante.
  5. Lorsque vous avez terminé, transférez les données de luminescence dans un programme graphique pour tracer l’unité de luminescence relative (RLU) (axe y) pour chaque variable (par exemple, produits chimiques ou concentrations) (axe x) et analysez les données.

4. Validation du dosage split-Rluc avec d’autres méthodes.

  1. Effectuer d’autres tests tels que le test de ligature de proximité (PLA), la microscopie électronique à transmission et la surveillance de l’absorption du calcium mitochondrial pour valider les résultats obtenus du test split-Rluc comme décrit précédemment24.

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Résultats

Nous avons utilisé le protocole décrit ci-dessus pour mesurer le niveau de contacts RE-mitochondries lors de l’ajout de trois composés connus pour inhiber des GTPases spécifiques. CDC42, RHO et RAC sont des GTPases qui favorisent la polymérisation de l’actine28 lorsqu’elles sont activées et sont inhibées par ZCL278, Rhosine et Ehop-016, respectivement24. HEK293T cellules transfectées avec split-Rluc ont été traitées avec du DMSO (témoin), du ZCL278 (50 μM), de la R...

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Discussion

Nous avons utilisé un test de réassemblage de la luciférase 8 de Renilla fendue (test R luc split-R) pour quantifier le niveau de couplages RE-mitochondries. Dans cette étude, nous avons modifié la construction originale de Split-Rluc24 en générant un seul vecteur, pCAG-MitoRluc N-T2A-R luc CER-IRES-mCherry, codant chaque composant de Split-Rluc (MitoRlucN et RlucC

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs remercient le Dr Jeffrey Golden (Cedars-Sinai Medical Center) pour l’examen critique du manuscrit. Ces travaux ont été financés en partie par le National Institute of Neurological Disease and Stroke (NINDS, R01NS113516).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,7 mL SafeSeal Microcentrifugeuse TubeSorenson16070
Plaque 6 puits TC TreatedUSA ScientificCC7682-7506
10 mL Pointes de pipette OneTipUSA Scientific1110-3700
10 &mu ; L pointes de pipette OneTipUSA Scientific1110-3700
20-200 &mu ; L Embouts biseautés OneTipUSA Scientific1111-1210
50 mL Tube conique en polypropylèneFalcon352070
96-Well Flipper Microtube Racks ThermoFisherScientific8770-11
Plaque 96 puits TC Treated  ;USA ScientificCC7682-7596
100 mm x 20 mm TC Antenne paraboliquetraitée USA ScientificCC7682-3394
1250 &mu ; L Tips OneTipUSA Scientific1112-1720
Centrifugeuse 5910  ; Ri - Centrifugeuse réfrigéréeEppendorf5943000131
Diméthylsulfoxyde, anhydre, &ge ; 99.9 %Sigma-Aldrich276855-100ML
DMEM, haute teneur en glucoseThermoFisher Scientific11965092
DPBS, sans calcium, sans magnésiumThermoFisher Scientific14190144
EHop 016Bio-Techne Tocris6248Dissoudre dans le DMSO ; stocker à -70 ° ; C
EnduRen Live Cell SubstratPromegaE6481Stocker les aliquotes à -70 ° ; C
Eppendorf 2-20 &mu ; Pipette LEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 &mu ; Pipette LEppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 & micro ; Pipette LEppendorf3123000020
Eppendorf Research plus 12 canauxEppendorf3125000028
Eppendorf Research plus 200 &mu ; Pipette LEppendorf  ;
Sérum fœtal bovin, régions qualifiées, approuvées par l’USDAThermoFisher Scientific10437028
Forma Steri-Cycle CO2  ; Incubateur, 184 L, acier inoxydable poliThermoFisher Scientific381
Compteur de pointage manuelSigma-AldrichHS6594
HEK 293T CellulesATCCCRL-3216
Hémacytomètre - Neubauer Bright Line, chambre de comptage doubleLW ScientificCTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE BufferThermoFisher Scientific8019005
MicroscopeZeissAxiovert 25 CFL
Mini centrifugeuseBenchmark ScientificC1012
Rack multitubes pour tubes coniques de 50 ml, coniques de 15 ml et microcentrifugeusesBoekel Scientific120008
PEI MAX - Chlorhydrate de polyéthylénimine linéaire de qualité transfection (MW 40 000)Polysciences24765-100MG
Pipet-Aid XPUSA Scientific4440-0101
Bromhydrate de poly-D-lysineSigma-AldrichP6407-5MG
Chlorhydrate de rhosineBio-Techne Tocris5003Dissoudre dans le DMSO ; stocker à -70 ° ; C
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénolThermoFisher Scientific25300054
Varioskan LUX lecteur de microplaques multimodeThermoFisher ScientificVL0000D0
VortexThermoFisher Scientific2215365niveau 8
VWR Système d’aspiration sous videVWR75870-734
ZCL 278Bio-Techne Tocris4794Dissoudre dans le DMSO ; stocker à -70 ° ; L
3123000055

Références

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