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Article de méthode

Développement de thérapies combinatoires pour les lésions de la moelle épinière à l’aide de l’administration de cellules souches

851 vues

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DOI :

10.3791/66872

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7 juin 2024

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

Dans cet article

Résumé

Dans cette étude, des hydrogels composites mimétiques nerveux ont été développés et caractérisés qui peuvent être utilisés pour étudier et capitaliser sur le comportement pro-régénératif des cellules souches dérivées du tissu adipeux pour la réparation des lésions de la moelle épinière.

Résumé

Les lésions traumatiques de la moelle épinière (LME) induisent un déficit sensorimoteur permanent sous le site de la lésion. Il touche environ un quart de million de personnes aux États-Unis et représente un problème de santé publique incommensurable. Des recherches ont été menées pour fournir un traitement efficace ; cependant, la lésion médullaire est toujours considérée comme incurable en raison de la nature complexe du site de la blessure. Diverses stratégies, notamment l’administration de médicaments, la transplantation cellulaire et les biomatériaux injectables, sont étudiées, mais une seule stratégie limite leur efficacité pour la régénération. En tant que telles, les thérapies combinatoires ont récemment attiré l’attention et peuvent cibler les caractéristiques multidimensionnelles de la blessure. Il a été démontré que les matrices extracellulaires (MEC) peuvent augmenter l’efficacité de la transplantation cellulaire pour les lésions médullaires. À cette fin, des hydrogels 3D constitués de moelles épinières (dSC) et de nerfs sciatiques (dSN) décellularisés ont été développés à différents ratios et caractérisés. L’analyse histologique des dSC et des dSN a confirmé l’élimination des composants cellulaires et nucléaires, et les architectures tissulaires natives ont été conservées après la décellularisation. Par la suite, des hydrogels composites ont été créés à différents rapports volumétriques et soumis à des analyses de la turbidité, de la cinétique de gélification, des propriétés mécaniques et de la viabilité des cellules souches dérivées du tissu adipeux humain (hASC). Aucune différence significative dans les propriétés mécaniques n’a été observée entre les différents rapports d’hydrogels et de matrices de moelle épinière décellularisées. Les ASC humaines intégrées dans les gels sont restées viables tout au long de la culture de 14 jours. Cette étude fournit un moyen de générer des hydrogels combinatoires issus de l’ingénierie tissulaire qui présentent une ECM spécifique aux nerfs et des cellules souches mésenchymateuses pro-régénératives. Cette plateforme peut fournir de nouvelles informations sur les stratégies neuro-régénératives après une lésion médullaire avec des investigations futures.

Introduction

Environ 296 000 personnes souffrent d’une lésion médullaire traumatique, et chaque année, environ 18 000 nouveaux cas de lésion médullaire surviennent aux États-Unis1. La lésion médullaire traumatique est généralement causée par des chutes, des blessures par balle, des accidents de voiture et des activités sportives et entraîne souvent une perte permanente de la fonction sensorimotrice sous le site de la blessure. Les dépenses estimées au cours de la vie pour le traitement des lésions médullaires varient entre un et cinq millions de dollars par individu, avec une espérance de vie nettement inférieure1. Pourtant, la lésion médullaire est encore mal comprise et largement incurable, principalement en raison de conséquences physiopathologiques complexes après la lésion2. Diverses stratégies ont été étudiées, notamment la transplantation cellulaire et les échafaudages à base de biomatériaux. Bien que la transplantation de cellules et de biomatériaux ait démontré son potentiel, la nature multidimensionnelle des lésions médullaires suggère que les approches combinatoires pourraient être plus bénéfiques3. En conséquence, de nombreuses stratégies combinatoires ont été étudiées et ont démontré une meilleure efficacité thérapeutique que les composants individuels. Cependant, d’autres études sont nécessaires pour fournir de nouveaux biomatériaux pour l’administration de cellules et de médicaments3.

Une approche prometteuse pour la fabrication d’hydrogels naturels est la décellularisation tissulaire. Le processus de décellularisation utilise des méthodes ioniques, non ioniques, physiques et combinatoires pour éliminer tout ou partie des matériaux cellulaires et nucléiques tout en préservant les composants ECM. En éliminant la totalité ou la plupart des composants cellulaires, les hydrogels dérivés de l’ECM sont moins immunoréactifs à l’hôte après l’implantation/l’injection4. Il y a plusieurs paramètres à mesurer afin d’évaluer la qualité des tissus décellularisés : l’élimination du contenu cellulaire/nucléique, les propriétés mécaniques et la préservation de l’ECM. Les critères suivants ont été établis pour éviter les réponses immunitaires indésirables : 1) moins de 50 ng d’ADN double brin (ADNdb) par mg de poids sec ECM, 2) moins de 200 pb de longueur de fragment d’ADN, et 3) presque ou pas de matériel nucléaire visible coloré au 4'6-diamidino-2-phénuylindole (DAPI)5. Les propriétés mécaniques peuvent être quantifiées par des essais de traction, de compression et/ou de rhéologie, et elles doivent être similaires au tissu d’origine6. De plus, la préservation des protéines peut être évaluée par protéomique ou par des tests quantitatifs axés sur les principaux composants des tissus décellularisés, par exemple, la laminine, le glycosaminoglycane (GAG) et le protéoglycane de sulfate de chondroïtine (CSPG) pour la moelleépinière7,8. Les hydrogels dérivés de l’ECM vérifiés peuvent être recellularisés avec différents types de cellules pour faciliter la thérapie cellulaire9.

Une variété de types de cellules, telles que les cellules de Schwann, les cellules engainantes olfactives, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) dérivées de la moelle osseuse et les cellules souches/progénitrices neurales, ont été étudiées pour la réparation des lésions médullaires 10,11,12. Cependant, l’utilisation clinique de ces cellules est limitée en raison de préoccupations éthiques, d’une intégration rare avec les cellules/tissus voisins, d’un manque de sources de tissus à haut rendement, d’une incapacité à s’auto-renouveler et/ou d’une capacité de prolifération limitée 13,14,15. Contrairement à ces types de cellules, les CSM humaines dérivées du tissu adipeux (hASC) sont un candidat intéressant car elles sont facilement isolées de manière peu invasive à l’aide de lipoaspirations, et un grand nombre de cellules peuvent être obtenues16. De plus, les hASC ont la capacité de sécréter des facteurs de croissance et des cytokines qui ont le potentiel de neuroprotecteur, d’angiogénétique, de cicatrisation des plaies, de régénération tissulaire et d’immunosuppression17,18,19,20,21.

Comme nous l’avons décrit, de nombreuses études ont été menées 22,23,24 et beaucoup d’enseignements en ont été tirés, mais des caractéristiques hétérogènes des lésions médullaires ont limité leur efficacité à promouvoir la récupération fonctionnelle. À ce titre, des approches combinatoires ont été proposées pour augmenter l’efficacité du traitement des lésions médullaires. Dans cette étude, des hydrogels composites ont été développés en combinant des moelles épinières décellularisées et des nerfs sciatiques pour une culture hASC tridimensionnelle (3D). La décellularisation réussie a été confirmée par des analyses histologiques et d’ADN, et différents ratios d’hydrogels composites nerveux ont été caractérisés par une cinétique de gélification et des tests de compression. La viabilité des hASC dans les hydrogels composites nerveux a été étudiée pour prouver que cet hydrogel peut être utilisé comme plate-forme de culture cellulaire 3D.

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Protocole

Les tissus porcins ont été obtenus commercialement, de sorte que l’approbation n’était pas requise par le comité d’éthique animale.

1. Décellularisation de la moelle épinière porcine (Temps estimé : 5 jours)

REMARQUE : Effectuez la décellularisation en utilisant les protocoles précédemment établis avec les modifications25,26. Toutes les procédures doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité stérile à température ambiante, sauf indication contraire. Toutes les solutions doivent être filtrées stérilement à l’aide d’un filtre sur le dessus d’une bouteille (pores de 0,2 μm) dans des bouteilles autoclavées. Les procédures à effectuer à 37 °C peuvent être effectuées à l’intérieur d’un incubateur ou d’un four propre réglé à 37 °C.

  1. Préparation des solutions de décellularisation
    REMARQUE : Toutes les solutions sont calculées pour 1 L. Les utilisateurs peuvent avoir besoin d’ajuster le volume final requis en fonction de leurs besoins expérimentaux.
    1. Diluer 500 mL de trypsine/acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,05 % avec 500 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour obtenir 0,025 % de trypsine/EDTA.
    2. Diluer 300 mL de Triton X-100 à 10 % avec 700 mL de PBS pour obtenir 3 % de Triton X-100. Mélangez 0,56 g de NaCl, 1,31 g de NaH2PO4H2O et 10,85 g de HNa2O4P·7H2O dans 1 L d’eau déminéralisée pour obtenir un tampon 100 mM Na/50 mM phos.
    3. Mélangez 32,4 g de saccharose dans 1 L d’eau déminéralisée pour obtenir 1 M de saccharose. Mélangez 40 g de désoxycholate de sodium (SD) dans 1 L d’eau désionisée pour obtenir une solution à 4 % de SD. Diluer 6,7 mL d’acide peracétique à 15 % avec 993,3 mL d’éthanol à 4 %.
  2. Préparation de la moelle épinière porcine
    REMARQUE : Les moelles épinières ont été expédiées congelées sans aucune solution et maintenues à -80 °C jusqu’à leur utilisation.
    1. Décongeler la moelle épinière à 4 °C au réfrigérateur pendant 18 à 24 h avant la décellularisation. Utilisez des ciseaux stériles pour retirer soigneusement la dure-mère.
    2. Coupez la moelle épinière en petits morceaux (environ 1 cm de long). Placez un morceau dans un tube de 15 ml ou un maximum de trois morceaux dans un tube de 50 ml.
  3. Décellularisation de la moelle épinière
    REMARQUE : Après chaque étape, les solutions de décellularisation sont versées manuellement dans un grand bécher pour être jetées. Une petite crépine en acier inoxydable autoclavable peut être utilisée pour aider à éliminer les solutions de décellularisation sans perdre les tissus nécessaires à chaque étape. La moelle épinière était agitée à 83 tr/min, sauf indication contraire.
    1. Rincer la moelle épinière à l’eau déminéralisée pendant 18 à 24 h à 4 °C et 60 tr/min.
    2. Rincer la moelle épinière avec de la trypsine à 0,025 % / EDTA pendant 1 h à 37 °C et 40 tr/min. Ensuite, rincez la moelle épinière avec du PBS pendant 15 min, 2x.
    3. Rincer la moelle épinière avec 3 % de Triton X-100 pendant 2 h. Rincer la moelle épinière avec un tampon 100 mM Na/50 mM phos pendant 15 min, 2x.
    4. Rincer la moelle épinière avec 1 M de saccharose pendant 1 h. Ensuite, rincez la moelle épinière à l’eau déminéralisée pendant 1 h.
    5. Rincer la moelle épinière avec 4 % d’écart-type pendant 2 h. Ensuite, rincez la moelle épinière avec 100 mM Na/50 mM de tampon phos pendant 15 min, 2x.
    6. Rincer la moelle épinière avec de l’acide peracétique à 0,1 % dans de l’éthanol à 4 % pendant 4 h. Ensuite, rincez la moelle épinière avec du PBS pendant 1 h.
    7. Rincez la moelle épinière à l’eau déminéralisée pendant 1 h, 2x. Ensuite, rincez la moelle épinière avec du PBS pendant 1 h.
    8. Lyophiliser la moelle épinière à 0,01 mbar et -56 °C pendant 3 jours et conserver au sec jusqu’à utilisation.

2. Décellularisation du nerf sciatique porcin (Temps estimé : 5 jours)

REMARQUE : Effectuez la décellularisation en utilisant un protocole27 préalablement établi. Toutes les procédures doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité stérile à température ambiante, sauf indication contraire. Toutes les solutions doivent être filtrées stérilement à l’aide d’un filtre sur le dessus d’une bouteille (pores de 0,2 μm) dans des bouteilles autoclavées. Les procédures à effectuer à 37 °C peuvent être effectuées à l’intérieur d’un incubateur ou d’un four propre réglé à 37 °C.

  1. Préparation des solutions de décellularisation
    REMARQUE : Toutes les solutions sont calculées pour 1 L. Les utilisateurs peuvent avoir besoin d’ajuster le volume final requis en fonction de leurs besoins expérimentaux.
    1. Préparez un tampon de 50 mM Na/10 mM de phos en mélangeant 1,86 g de NaCl, 0,262 g de d NaH2PO4H2O et 2,17 g de HNa2O4P·7H2O dans 1 L d’eau déminéralisée.
    2. Préparez une solution de 125 mM de sulfobétaïne-10 (SB-10) en mélangeant 38,4 g de SB-10 dans 1 L de tampon 50 mM Na/10 mM de tampon phos.
    3. Préparer une solution de sulfobétaïne-16 à 3 % SD/0,6 mM (SB-16) en mélangeant 30 g de SD et 0,24 g de SB-16 dans 1 L de tampon 50 mM Na/10 mM phos.
  2. Préparation du nerf sciatique porcin
    REMARQUE : Les nerfs sciatiques ont été expédiés congelés avec du PBS et conservés à -80 °C jusqu’à l’utilisation.
    1. Décongeler le nerf sciatique à 4 °C au réfrigérateur 18 à 24 h avant la décellularisation.
    2. Coupez le nerf sciatique en petits morceaux (environ 1 cm de long). Placez un morceau dans un tube de 15 ml ou un maximum de trois morceaux dans un tube de 50 ml.
  3. Décellularisation du nerf sciatique
    REMARQUE : Après chaque étape, les solutions de décellularisation sont versées manuellement dans un grand bécher pour être jetées, et une petite passoire en acier inoxydable autoclavable peut être utilisée pour aider à jeter les solutions de décellularisation sans perdre les tissus nécessaires pour chaque étape. Le nerf sciatique était agité à 15 tr/min, sauf indication contraire.
    1. Rincer le nerf sciatique avec de l’eau déminéralisée pendant 7 h. Ensuite, rincez le nerf sciatique avec 125 mM de sulfobétaïne-10 (SB-10) dans un tampon 50 mM Na/10 mM phos pendant 18 h.
    2. Rincer le nerf sciatique avec 100 mM de Na/50 mM de tampon phos pendant 15 min. Ensuite, rincez le nerf sciatique avec 3 % de SD/0,6 mM de sulfobétaïne-16 (SB-16) dans un tampon 50 mM Na/10 mM de phos pendant 2 h.
    3. Rincer le nerf sciatique avec 100 mM Na/50 mM de tampon phos pendant 15 min, 3x. Ensuite, rincez le nerf sciatique avec 125 mM SB-10 dans 50 mM Na/10 mM de tampon phos pendant 7 h.
    4. Rincer le nerf sciatique avec 100 mM de Na/50 mM de tampon phos pendant 15 min. Ensuite, rincez le nerf sciatique avec 3 % SD/0,6 mM SB-16 dans 50 mM Na/10 mM phos buffer pendant 1,5 h.
    5. Rincer le nerf sciatique avec un tampon 50 mM Na/10 mM phos pendant 15 min, 3x. Ensuite, rincez le nerf sciatique avec 75 U/mL de désoxyribonucléase (DNase) pendant 3 h sans agitation.
    6. Rincer le nerf sciatique avec 50 mM de Na/10 mM de tampon phos pendant 1 h, 3x. Ensuite, rincez le nerf sciatique avec 0,2 U/mL de chondroïtinase ABC pendant 16 h sans agitation à 37 °C.
    7. Rincer le nerf sciatique avec du PBS pendant 3 h, 3x. Lyophiliser le nerf sciatique à 0,01 mbar et -56 °C pendant 3 jours et conserver au sec jusqu’à utilisation.

3. Digestion des tissus décellularisés et fabrication d’hydrogels composites (Temps estimé : 4 jours)

  1. Hachez ou broyez les tissus décellularisés en poudre à l’aide de ciseaux ou d’un homogénéisateur. Stérilisez les outils pour hacher ou broyer les tissus à l’aide d’un autoclave à 121 °C pendant 45 min. La méthode de l’oxyde d’éthylène est également applicable.
  2. Digérer les tissus séparément dans une solution d’acide chlorhydrique 0,01 N (HCl) contenant 1 mg/mL de pepsine à une concentration de 15 mg/mL. Les poids estimés de la moelle épinière décellularisée et du nerf sciatique sont de 50 à 100 mg et de 100 à 150 mg par morceau, respectivement.
  3. Placez la barre magnétique et remuez à 500 tr/min et 4 °C pendant au moins 4 jours pour générer des solutions de prégel.
  4. Mélangez le nerf sciatique et le prégel de la moelle épinière aux rapports volumétriques suivants : 2:1, 1:1 et 1:2. Ajustez le pH de 7,4 à l’aide de 1 N d’hydroxyde de sodium (NaOH) et de HCl et diluez à la concentration souhaitée à l’aide d’un milieu M199 et d’un PBS 1x. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
    REMARQUE : Ajouter NaOH 1 μL à la fois. Le média M199 peut être utilisé comme indicateur de pH car il devient rose clair lorsque le pH est de 7,4, mais des bandelettes de pH doivent être utilisées pour confirmer le niveau de pH.

4. Vérification de la décellularisation

  1. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E ; Temps estimé : 8 jours)
    REMARQUE : Après chaque étape de rinçage, les solutions sont versées manuellement dans un grand bécher pour être jetées.
    1. Fixez la moelle épinière et le nerf sciatique frais et décellularisés dans du formaldéhyde à 3,7 % à 4 °C pendant 18 h. Placez un morceau dans un tube de 15 ml.
    2. Retirez le formaldéhyde et placez les mouchoirs dans du saccharose à 10 % pendant 1 jour. Retirez 10 % de saccharose et placez les tissus dans 30 % de saccharose pendant 6 jours.
    3. Remplissez à moitié un cryomoule de taille appropriée avec une température de coupe optimale (OCT). Placez les tissus décellularisés, couvrez-les d’OCT et laissez-les absorber l’OCT pendant 1 jour.
    4. Après 1 jour, congelez les mouchoirs pendant la nuit à -80 °C. Cryosection des tissus à 10 m d’épaisseur à l’aide d’un cryostat.
    5. Rincer avec 1x PBS pendant 5 min, 2x. Ensuite, rincez à l’eau du robinet pendant 5 min.
    6. Colorer avec une solution d’hématoxyline pendant 1 min. Rincer à l’eau du robinet pendant 1 min, 3x.
    7. Colorer avec une solution d’éosine pendant 1 min. Rincer avec de l’éthanol à 95 % pendant 1 min, 2x et avec de l’éthanol à 100 % pendant 1 min, 3x.
    8. Rincer au xylène pendant 1 min, 2 min, puis 1 min. Laissez sécher les lames pendant 5 min.
    9. À l’aide d’un coton-tige, versez 3 à 4 gouttes de solution de montage en polystyrène xylène (DPX) de dibutylphtalate sur les lames. Placez les lamelles sur les lames recouvertes de DPX. Laissez sécher les lames pendant la nuit.
  2. Analyse ADN (Temps estimé : 1 h)
    1. Peser les tissus décellularisés et lyophilisés. Isolez et quantifiez l’ADN à l’aide de trousses disponibles dans le commerce, conformément aux instructions du fabricant.

5. Caractérisation des hydrogels composites

  1. Test de turbidité de gélification (Temps estimé : 1 h)
    1. Placer 100 μL de solutions de prégel dans chaque puits d’une plaque de 96 puits sur de la glace. Lire l’absorbance à 405 nm toutes les 2 min pendant 45 min à l’aide d’un lecteur de plaques.
    2. Calculer l’absorbance normalisée à l’aide de l’équation suivante :
      (Absorbance - Absorbanceinitiale) / (Absorbancemaximale -Absorbance initiale)
    3. Calculez la pente de la courbe et le temps nécessaire pour obtenir une gélification de 50 % et 95 %, respectivement t1/2 et t95.
  2. Test de compression (Temps estimé : 1 min par hydrogel)
    1. Fabriquer des hydrogels composites à la concentration de 12 mg/mL de 8 mm de diamètre et de 2 mm de hauteur.
    2. À l’aide d’un rhéomètre, comprimer les échantillons avec une charge de 250 N entre des plaques parallèles en acier inoxydable à une vitesse de déformation de 10 % de la hauteur de l’échantillon/min. Le logiciel qui fournit les lectures du rhéomètre fournira une courbe contrainte-déformation en appliquant la force et en mesurant la déformation jusqu’à ce que les hydrogels se rompent.
    3. Calculez le module de Young à partir de la pente de la région linéaire des courbes contrainte-déformation.

6. Culture tridimensionnelle d’ASC humains dans des hydrogels de composites nerveux

  1. Préparation de la plateforme tridimensionnelle (3D) (Temps estimé : 3 h)
    1. Gravure d’une plaquette de silicium avec une résine photosensible SU-8 pour générer des motifs circulaires de 200 μm de profondeur et 4 mm de diamètre.
    2. Mélanger la base de polydiméthylsiloxane (PDMS) et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1. Versez le mélange sur la plaquette de silicone et laissez reposer pendant 20 minutes pour éliminer toutes les bulles qui résultent du mélange de la base PDMS et de l’agent de durcissement.
    3. Mettez-le au four et faites-le durcir pendant 2 h à 70 °C. Démoulez la feuille PDMS durcie et perforez-la à l’aide d’un poinçon de biopsie de 8 mm de diamètre pour créer des micropuits PDMS.
    4. Placez les micropuits dans une plaque de 96 puits et placez la plaque de puits dans un nettoyeur air-plasma pour stériliser les micropuits PDMS.
    5. Fonctionnaliser les micropuits PDMS avec 1 % de polyéthylèneimine (PEI) et 0,1 % de glutaraldéhyde (GA) pendant 10 min et 20 min, respectivement. Laver les micropuits avec de l’eau distillée, 2x.
  2. Préparation des hASCs (Temps estimé : 7 jours)
    1. Cellules de passage de culture pour 2 à 5 passages dans des milieux de croissance hASCs (milieux basaux hASCs complétés par du sérum de veau fœtal (FBS) et de la pénicilline/streptomycine (Pen-streptocoque)) jusqu’à confluent. Passage et calcul du nombre de cellules à l’aide d’un hémacytomètre ou d’un compteur de cellules.
  3. Hydrogels composites nerveux chargés d’ASC (Temps estimé : 2 h)
    1. Mélangez le prégel du nerf sciatique et de la moelle épinière dans un rapport volumétrique de 2:1, 1:1, 1:2, et préparez de l’hydrogel pour la moelle épinière uniquement sans mélanger de prégel pour le nerf sciatique.
    2. Ajouter le milieu M199 et ajuster le pH de 7,4 à l’aide de 1 N, de NaOH et de HCl. Remettre en suspension les hASC avec le milieu de croissance dans le prégel à une densité de 1 x 106 cellules/mL.
      REMARQUE : La quantité de M199 et de suspension cellulaire doit être de 10 % de prégel.
    3. Diluer le prégel à 12 mg/mL à l’aide de 1x PBS. Placez le prégel sur des micropuits et incubez pendant 30 min. Culture d’hydrogels chargés d’ASC dans des milieux de croissance hASC.
  4. Test de viabilité cellulaire (Temps estimé : 4 h par jour)
    1. Préparez des solutions d’essai de viabilité en utilisant des réactifs disponibles dans le commerce conformément aux instructions du fabricant.
    2. Aspirez le support les jours 1, 4, 7 et 14. Ajouter le réactif dans les puits et incuber à 37 °C pendant 3 h en suivant les instructions du fabricant.
    3. Lire la fluorescence à une excitation/émission de 560/590 nm à l’aide d’un lecteur de plaques. Calculez la différence en pourcentage à l’aide de l’équation suivante :
      [(Échantillon de fluorescence -Blanc de fluorescence) /Blanc de fluorescence] x 100

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Résultats

Des tissus décellularisés ont été préparés selon des protocoles préalablement établis avec de légères modifications26,27. Après la décellularisation, la lyophilisation et la digestion, des hydrogels composés pour les nerfs à des rapports de SN :SC = 2:1, 1:1, 1:2 et des hydrogels de moelle épinière seulement ont été fabriqués (Figure 1). L’élimination des composants nucléaires a été confirmée par col...

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Discussion

Il est largement admis que la physiopathologie des lésions médullaires est complexe et multidimensionnelle. Même si des thérapies uniques telles que la transplantation cellulaire, l’administration de médicaments et les biomatériaux ont chacune fourni des informations précieuses sur les lésions médullaires, la nature complexe des lésions médullaires peut limiter leur efficacité individuelle 28,29,30,31.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation PhRMA et les National Institutes of Health par le biais du numéro de prix P20GM139768 et R15NS121884 attribué à YS. Nous tenons à remercier le Dr Kartik Balachandran et le Dr Raj Rao du Département de génie biomédical de l’Université de l’Arkansas de nous avoir permis d’utiliser leur équipement. Nous tenons également à remercier le Dr Jin-Woo Kim et M. Patrick Kuczwara du Département de génie biologique et agricole de l’Université de l’Arkansas pour leur formation sur le rhéomètre.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
3-(décyldiméthylammonio)sulfonate de propane sel interneSigma-AldrichD4266Utilisé lors de la décellularisation du nerf sciatique, SB-10
3-(N,N-Diméthylpalmitylammonio)sulfonate de propaneSigma-AldrichH6883Utilisé lors de la décellularisation du nerf sciatique, SB-16
Réactif AlamarBlueFisher ScientificDAL1100Utilisé lors du test de viabilité des cellules AlamaBlue
Chondroitinase ABCSigma-AldrichC3667Utilisé lors de la décellularisation du nerf sciatique
CryostatLeicaCM1860
DésoxyribonuclaseSigma-AldrichD4263Utilisé lors de la décellularisation du nerf sciatique
Phosphate d’hydrogène disodique heptahydrateVWRBDH9296Produit chimique pour 100 mM Na/50 mM phos et 50 mM Na/10 mM phos tampon
DNeasy Blood & Blood Kit de mouchoirsQiagen69506Utilisé lors de l’analyse ADN
Dpx Mountant pour l’histologie, support de montage sur culasseSigma-Aldrich6522Utilisé pendant H& Coloration E
ÉosineSigma-AldrichHT110216Utilisé pendant H& Coloration E
ÉthanolVWR89125-172
FormaldéhydeSigma-Aldrich252549Utilisé pendant H& Coloration E
Glutaraldéhyde (GA)Sigma-AldrichG6257Utilisé lors de la fonctionnalisation de la surface PDMS
Médias de croissance hASCLonzaPT-4505Utilisé pour cultiver des hASC, contenant du sérum bovin fœtal et de la péniciline/streptomycine
HématoxylineVWR26041-06Utilisé pendant H& Coloration E
Cellules souches humaines dérivées de l’adipLonzaPT-5006
Acide chlorhydrique (HCl)Sigma-Aldrich320331Utilisé pour digérer les tissus décellularisés et ajuster les solutions de Pregel
Médias M199Sigma-AldrichM0650Utilisé pour diluer les pregels à la concentration désirée
Composé de températ de coupe optimalTissue-Tek4583
PepsineSigma-AldrichP7000Utilisé pour digérer les tissus décellularisés
Acide peracétiqueAllée des labosPAA1001Utilisé lors de la décellularisation de la moelle épinière
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)VWR97062-948
Lecteur de plaquesBioTek InstrumentsSynergy Mx
Polyéthyléneimine (PEI)Sigma-Aldrich181978Utilisé lors de la fonctionnalisation de la surface PDMS
Nerf sciatique porcinTissue Source LLCDes cochons vivants, sans aucune information identifiable et sans détails de traçabilité
Moelle épinière porcineTissue Source LLCDes cochons vivants, sans aucune information identifiable et sans détails de traçabilité
Système dsDNA QuantiFluorPromegaE2670Utilisé pour analyser le contenu de l’ADN
RhéomètreTA InstrumentsDHR 2
Rotateur robusteGlas-co099A RD4512Utilisé lors de la décellularisation de la moelle épinière
Chlorure de sodium (NaCl)VWRBDH9286Produit chimique pour 100 mM Na/50 mM phos et 50 mM Na/10 mM phos tampon
Désoxycholate de sodiumSigma-AldrichD6750
Monohydrate de phosphate de dihydrogène de sodiumVWRBDH9298Produit chimique pour 100 mM Na/50 mM phos et 50 mM Na/10 mM phos tampon
Solution d’hydroxyde de sodium (NaOH)Sigma-Aldrich415443Utilisé pour ajuster les solutions de Pregel
SU-8Matériaux améliorés par KayakuSU8-100Utilisé pour recouvrir une plaquette de silicium
SaccharoseSigma-AldrichS8501Utilisé lors de la décellularisation de la moelle épinière
Kit en élastomère en silicone Sylgard 184DOW1317318Base et agent de polydiméthylxiloxane (PDMS)
Triton X-100Sigma-AldrichX100Utilisé lors de la décellularisation de la moelle épinière
Trypsine-EDTA (0,05 %), phénol rougeThermo Fisher25300062Utilisé lors des travaux sur le hASC et lors de la décellularisation de la moelle épinière
Rotateur de revolver à tubeThermo Fisher88881001Utilisé lors de la décellularisation du nerf sciatique
XylèneVWRMK866816Utilisé pendant H& Coloration E

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