Article de méthode

Développement de thérapies combinatoires pour les lésions de la moelle épinière à l’aide de l’administration de cellules souches

DOI :

10.3791/66872

⸱

7 juin 2024

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cette étude, des hydrogels composites mimétiques nerveux ont été développés et caractérisés qui peuvent être utilisés pour étudier et capitaliser sur le comportement pro-régénératif des cellules souches dérivées du tissu adipeux pour la réparation des lésions de la moelle épinière.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les lésions traumatiques de la moelle épinière (LME) induisent un déficit sensorimoteur permanent sous le site de la lésion. Il touche environ un quart de million de personnes aux États-Unis et représente un problème de santé publique incommensurable. Des recherches ont été menées pour fournir un traitement efficace ; cependant, la lésion médullaire est toujours considérée comme incurable en raison de la nature complexe du site de la blessure. Diverses stratégies, notamment l’administration de médicaments, la transplantation cellulaire et les biomatériaux injectables, sont étudiées, mais une seule stratégie limite leur efficacité pour la régénération. En tant que telles, les thérapies combinatoires ont récemment attiré l’attention et peuvent cibler les caractéristiques multidimensionnelles de la blessure. Il a été démontré que les matrices extracellulaires (MEC) peuvent augmenter l’efficacité de la transplantation cellulaire pour les lésions médullaires. À cette fin, des hydrogels 3D constitués de moelles épinières (dSC) et de nerfs sciatiques (dSN) décellularisés ont été développés à différents ratios et caractérisés. L’analyse histologique des dSC et des dSN a confirmé l’élimination des composants cellulaires et nucléaires, et les architectures tissulaires natives ont été conservées après la décellularisation. Par la suite, des hydrogels composites ont été créés à différents rapports volumétriques et soumis à des analyses de la turbidité, de la cinétique de gélification, des propriétés mécaniques et de la viabilité des cellules souches dérivées du tissu adipeux humain (hASC). Aucune différence significative dans les propriétés mécaniques n’a été observée entre les différents rapports d’hydrogels et de matrices de moelle épinière décellularisées. Les ASC humaines intégrées dans les gels sont restées viables tout au long de la culture de 14 jours. Cette étude fournit un moyen de générer des hydrogels combinatoires issus de l’ingénierie tissulaire qui présentent une ECM spécifique aux nerfs et des cellules souches mésenchymateuses pro-régénératives. Cette plateforme peut fournir de nouvelles informations sur les stratégies neuro-régénératives après une lésion médullaire avec des investigations futures.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Environ 296 000 personnes souffrent d’une lésion médullaire traumatique, et chaque année, environ 18 000 nouveaux cas de lésion médullaire surviennent aux États-Unis1. La lésion médullaire traumatique est généralement causée par des chutes, des blessures par balle, des accidents de voiture et des activités sportives et entraîne souvent une perte permanente de la fonction sensorimotrice sous le site de la blessure. Les dépenses estimées au cours de la vie pour le traitement des lésions médullaires varient entre un et cinq millions de dollars par individu, avec une espérance de vie nettement inférieure1. Pourtant, la lésion médullaire est encore mal comprise et largement incurable, principalement en raison de conséquences physiopathologiques complexes après la lésion2. Diverses stratégies ont été étudiées, notamment la transplantation cellulaire et les échafaudages à base de biomatériaux. Bien que la transplantation de cellules et de biomatériaux ait démontré son potentiel, la nature multidimensionnelle des lésions médullaires suggère que les approches combinatoires pourraient être plus bénéfiques3. En conséquence, de nombreuses stratégies combinatoires ont été étudiées et ont démontré une meilleure efficacité thérapeutique que les composants individuels. Cependant, d’autres études sont nécessaires pour fournir de nouveaux biomatériaux pour l’administration de cellules et de médicaments3.

Une approche prometteuse pour la fabrication d’hydrogels naturels est la décellularisation tissulaire. Le processus de décellularisation utilise des méthodes ioniques, non ioniques, physiques et combinatoires pour éliminer tout ou partie des matériaux cellulaires et nucléiques tout en préservant les composants ECM. En éliminant la totalité ou la plupart des composants cellulaires, les hydrogels dérivés de l’ECM sont moins immunoréactifs à l’hôte après l’implantation/l’injection4. Il y a plusieurs paramètres à mesurer afin d’évaluer la qualité des tissus décellularisés : l’élimination du contenu cellulaire/nucléique, les propriétés mécaniques et la préservation de l’ECM. Les critères suivants ont été établis pour éviter les réponses immunitaires indésirables : 1) moins de 50 ng d’ADN double brin (ADNdb) par mg de poids sec ECM, 2) moins de 200 pb de longueur de fragment d’ADN, et 3) presque ou pas de matériel nucléaire visible coloré au 4'6-diamidino-2-phénuylindole (DAPI)5. Les propriétés mécaniques peuvent être quantifiées par des essais de traction, de compression et/ou de rhéologie, et elles doivent être similaires au tissu d’origine6. De plus, la préservation des protéines peut être évaluée par protéomique ou par des tests quantitatifs axés sur les principaux composants des tissus décellularisés, par exemple, la laminine, le glycosaminoglycane (GAG) et le protéoglycane de sulfate de chondroïtine (CSPG) pour la moelleépinière7,8. Les hydrogels dérivés de l’ECM vérifiés peuvent être recellularisés avec différents types de cellules pour faciliter la thérapie cellulaire9.

Une variété de types de cellules, telles que les cellules de Schwann, les cellules engainantes olfactives, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) dérivées de la moelle osseuse et les cellules souches/progénitrices neurales, ont été étudiées pour la réparation des lésions médullaires 10,11,12. Cependant, l’utilisation clinique de ces cellules est limitée en raison de préoccupations éthiques, d’une intégration rare avec les cellules/tissus voisins, d’un manque de sources de tissus à haut rendement, d’une incapacité à s’auto-renouveler et/ou d’une capacité de prolifération limitée 13,14,15. Contrairement à ces types de cellules, les CSM humaines dérivées du tissu adipeux (hASC) sont un candidat intéressant car elles sont facilement isolées de manière peu invasive à l’aide de lipoaspirations, et un grand nombre de cellules peuvent être obtenues16. De plus, les hASC ont la capacité de sécréter des facteurs de croissance et des cytokines qui ont le potentiel de neuroprotecteur, d’angiogénétique, de cicatrisation des plaies, de régénération tissulaire et d’immunosuppression17,18,19,20,21.

Comme nous l’avons décrit, de nombreuses études ont été menées 22,23,24 et beaucoup d’enseignements en ont été tirés, mais des caractéristiques hétérogènes des lésions médullaires ont limité leur efficacité à promouvoir la récupération fonctionnelle. À ce titre, des approches combinatoires ont été proposées pour augmenter l’efficacité du traitement des lésions médullaires. Dans cette étude, des hydrogels composites ont été développés en combinant des moelles épinières décellularisées et des nerfs sciatiques pour une culture hASC tridimensionnelle (3D). La décellularisation réussie a été confirmée par des analyses histologiques et d’ADN, et différents ratios d’hydrogels composites nerveux ont été caractérisés par une cinétique de gélification et des tests de compression. La viabilité des hASC dans les hydrogels composites nerveux a été étudiée pour prouver que cet hydrogel peut être utilisé comme plate-forme de culture cellulaire 3D.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les tissus porcins ont été obtenus commercialement, de sorte que l’approbation n’était pas requise par le comité d’éthique animale.

1. Décellularisation de la moelle épinière porcine (Temps estimé : 5 jours)

REMARQUE : Effectuez la décellularisation en utilisant les protocoles précédemment établis avec les modifications25,26. Toutes les procédures doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité stérile à température ambiante, sauf indication contraire. Toutes les solutions doivent être filtrées stérilement à l’aide d’un filtre sur le dessus d’une bouteille (pores de 0,2 μm) dans des bouteilles autoclavées. Les procédures à effectuer à 37 °C peuvent être effectuées à l’intérieur d’un incubateur ou d’un four propre réglé à 37 °C.

  1. Préparation des solutions de décellularisation
    REMARQUE : Toutes les solutions sont calculées pour 1 L. Les utilisateurs peuvent avoir besoin d’ajuster le volume final requis en fonction de leurs besoins expérimentaux.
    1. Diluer 500 mL de trypsine/acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,05 % avec 500 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour obtenir 0,025 % de trypsine/EDTA.
    2. Diluer 300 mL de Triton X-100 à 10 % avec 700 mL de PBS pour obtenir 3 % de Triton X-100. Mélangez 0,56 g de NaCl, 1,31 g de NaH2PO4H2O et 10,85 g de HNa2O4P·7H2O dans 1 L d’eau déminéralisée pour obtenir un tampon 100 mM Na/50 mM phos.
    3. Mélangez 32,4 g de saccharose dans 1 L d’eau déminéralisée pour obtenir 1 M de saccharose. Mélangez 40 g de désoxycholate de sodium (SD) dans 1 L d’eau désionisée pour obtenir une solution à 4 % de SD. Diluer 6,7 mL d’acide peracétique à 15 % avec 993,3 mL d’éthanol à 4 %.
  2. Préparation de la moelle épinière porcine
    REMARQUE : Les moelles épinières ont été expédiées congelées sans aucune solution et maintenues à -80 °C jusqu’à leur utilisation.
    1. Décongeler la moelle épinière à 4 °C au réfrigérateur pendant 18 à 24 h avant la décellularisation. Utilisez des ciseaux stériles pour retirer soigneusement la dure-mère.
    2. Coupez la moelle épinière en petits morceaux (environ 1 cm de long). Placez un morceau dans un tube de 15 ml ou un maximum de trois morceaux dans un tube de 50 ml.
  3. Décellularisation de la moelle épinière
    REMARQUE : Après chaque étape, les solutions de décellularisation sont versées manuellement dans un grand bécher pour être jetées. Une petite crépine en acier inoxydable autoclavable peut être utilisée pour aider à éliminer les solutions de décellularisation sans perdre les tissus nécessaires à chaque étape. La moelle épinière était agitée à 83 tr/min, sauf indication contraire.
    1. Rincer la moelle épinière à l’eau déminéralisée pendant 18 à 24 h à 4 °C et 60 tr/min.
    2. Rincer la moelle épinière avec de la trypsine à 0,025 % / EDTA pendant 1 h à 37 °C et 40 tr/min. Ensuite, rincez la moelle épinière avec du PBS pendant 15 min, 2x.
    3. Rincer la moelle épinière avec 3 % de Triton X-100 pendant 2 h. Rincer la moelle épinière avec un tampon 100 mM Na/50 mM phos pendant 15 min, 2x.
    4. Rincer la moelle épinière avec 1 M de saccharose pendant 1 h. Ensuite, rincez la moelle épinière à l’eau déminéralisée pendant 1 h.
    5. Rincer la moelle épinière avec 4 % d’écart-type pendant 2 h. Ensuite, rincez la moelle épinière avec 100 mM Na/50 mM de tampon phos pendant 15 min, 2x.
    6. Rincer la moelle épinière avec de l’acide peracétique à 0,1 % dans de l’éthanol à 4 % pendant 4 h. Ensuite, rincez la moelle épinière avec du PBS pendant 1 h.
    7. Rincez la moelle épinière à l’eau déminéralisée pendant 1 h, 2x. Ensuite, rincez la moelle épinière avec du PBS pendant 1 h.
    8. Lyophiliser la moelle épinière à 0,01 mbar et -56 °C pendant 3 jours et conserver au sec jusqu’à utilisation.

2. Décellularisation du nerf sciatique porcin (Temps estimé : 5 jours)

REMARQUE : Effectuez la décellularisation en utilisant un protocole27 préalablement établi. Toutes les procédures doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité stérile à température ambiante, sauf indication contraire. Toutes les solutions doivent être filtrées stérilement à l’aide d’un filtre sur le dessus d’une bouteille (pores de 0,2 μm) dans des bouteilles autoclavées. Les procédures à effectuer à 37 °C peuvent être effectuées à l’intérieur d’un incubateur ou d’un four propre réglé à 37 °C.

  1. Préparation des solutions de décellularisation
    REMARQUE : Toutes les solutions sont calculées pour 1 L. Les utilisateurs peuvent avoir besoin d’ajuster le volume final requis en fonction de leurs besoins expérimentaux.
    1. Préparez un tampon de 50 mM Na/10 mM de phos en mélangeant 1,86 g de NaCl, 0,262 g de d NaH2PO4H2O et 2,17 g de HNa2O4P·7H2O dans 1 L d’eau déminéralisée.
    2. Préparez une solution de 125 mM de sulfobétaïne-10 (SB-10) en mélangeant 38,4 g de SB-10 dans 1 L de tampon 50 mM Na/10 mM de tampon phos.
    3. Préparer une solution de sulfobétaïne-16 à 3 % SD/0,6 mM (SB-16) en mélangeant 30 g de SD et 0,24 g de SB-16 dans 1 L de tampon 50 mM Na/10 mM phos.
  2. Préparation du nerf sciatique porcin
    REMARQUE : Les nerfs sciatiques ont été expédiés congelés avec du PBS et conservés à -80 °C jusqu’à l’utilisation.
    1. Décongeler le nerf sciatique à 4 °C au réfrigérateur 18 à 24 h avant la décellularisation.
    2. Coupez le nerf sciatique en petits morceaux (environ 1 cm de long). Placez un morceau dans un tube de 15 ml ou un maximum de trois morceaux dans un tube de 50 ml.
  3. Décellularisation du nerf sciatique
    REMARQUE : Après chaque étape, les solutions de décellularisation sont versées manuellement dans un grand bécher pour être jetées, et une petite passoire en acier inoxydable autoclavable peut être utilisée pour aider à jeter les solutions de décellularisation sans perdre les tissus nécessaires pour chaque étape. Le nerf sciatique était agité à 15 tr/min, sauf indication contraire.
    1. Rincer le nerf sciatique avec de l’eau déminéralisée pendant 7 h. Ensuite, rincez le nerf sciatique avec 125 mM de sulfobétaïne-10 (SB-10) dans un tampon 50 mM Na/10 mM phos pendant 18 h.
    2. Rincer le nerf sciatique avec 100 mM de Na/50 mM de tampon phos pendant 15 min. Ensuite, rincez le nerf sciatique avec 3 % de SD/0,6 mM de sulfobétaïne-16 (SB-16) dans un tampon 50 mM Na/10 mM de phos pendant 2 h.
    3. Rincer le nerf sciatique avec 100 mM Na/50 mM de tampon phos pendant 15 min, 3x. Ensuite, rincez le nerf sciatique avec 125 mM SB-10 dans 50 mM Na/10 mM de tampon phos pendant 7 h.
    4. Rincer le nerf sciatique avec 100 mM de Na/50 mM de tampon phos pendant 15 min. Ensuite, rincez le nerf sciatique avec 3 % SD/0,6 mM SB-16 dans 50 mM Na/10 mM phos buffer pendant 1,5 h.
    5. Rincer le nerf sciatique avec un tampon 50 mM Na/10 mM phos pendant 15 min, 3x. Ensuite, rincez le nerf sciatique avec 75 U/mL de désoxyribonucléase (DNase) pendant 3 h sans agitation.
    6. Rincer le nerf sciatique avec 50 mM de Na/10 mM de tampon phos pendant 1 h, 3x. Ensuite, rincez le nerf sciatique avec 0,2 U/mL de chondroïtinase ABC pendant 16 h sans agitation à 37 °C.
    7. Rincer le nerf sciatique avec du PBS pendant 3 h, 3x. Lyophiliser le nerf sciatique à 0,01 mbar et -56 °C pendant 3 jours et conserver au sec jusqu’à utilisation.

3. Digestion des tissus décellularisés et fabrication d’hydrogels composites (Temps estimé : 4 jours)

  1. Hachez ou broyez les tissus décellularisés en poudre à l’aide de ciseaux ou d’un homogénéisateur. Stérilisez les outils pour hacher ou broyer les tissus à l’aide d’un autoclave à 121 °C pendant 45 min. La méthode de l’oxyde d’éthylène est également applicable.
  2. Digérer les tissus séparément dans une solution d’acide chlorhydrique 0,01 N (HCl) contenant 1 mg/mL de pepsine à une concentration de 15 mg/mL. Les poids estimés de la moelle épinière décellularisée et du nerf sciatique sont de 50 à 100 mg et de 100 à 150 mg par morceau, respectivement.
  3. Placez la barre magnétique et remuez à 500 tr/min et 4 °C pendant au moins 4 jours pour générer des solutions de prégel.
  4. Mélangez le nerf sciatique et le prégel de la moelle épinière aux rapports volumétriques suivants : 2:1, 1:1 et 1:2. Ajustez le pH de 7,4 à l’aide de 1 N d’hydroxyde de sodium (NaOH) et de HCl et diluez à la concentration souhaitée à l’aide d’un milieu M199 et d’un PBS 1x. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
    REMARQUE : Ajouter NaOH 1 μL à la fois. Le média M199 peut être utilisé comme indicateur de pH car il devient rose clair lorsque le pH est de 7,4, mais des bandelettes de pH doivent être utilisées pour confirmer le niveau de pH.

4. Vérification de la décellularisation

  1. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E ; Temps estimé : 8 jours)
    REMARQUE : Après chaque étape de rinçage, les solutions sont versées manuellement dans un grand bécher pour être jetées.
    1. Fixez la moelle épinière et le nerf sciatique frais et décellularisés dans du formaldéhyde à 3,7 % à 4 °C pendant 18 h. Placez un morceau dans un tube de 15 ml.
    2. Retirez le formaldéhyde et placez les mouchoirs dans du saccharose à 10 % pendant 1 jour. Retirez 10 % de saccharose et placez les tissus dans 30 % de saccharose pendant 6 jours.
    3. Remplissez à moitié un cryomoule de taille appropriée avec une température de coupe optimale (OCT). Placez les tissus décellularisés, couvrez-les d’OCT et laissez-les absorber l’OCT pendant 1 jour.
    4. Après 1 jour, congelez les mouchoirs pendant la nuit à -80 °C. Cryosection des tissus à 10 m d’épaisseur à l’aide d’un cryostat.
    5. Rincer avec 1x PBS pendant 5 min, 2x. Ensuite, rincez à l’eau du robinet pendant 5 min.
    6. Colorer avec une solution d’hématoxyline pendant 1 min. Rincer à l’eau du robinet pendant 1 min, 3x.
    7. Colorer avec une solution d’éosine pendant 1 min. Rincer avec de l’éthanol à 95 % pendant 1 min, 2x et avec de l’éthanol à 100 % pendant 1 min, 3x.
    8. Rincer au xylène pendant 1 min, 2 min, puis 1 min. Laissez sécher les lames pendant 5 min.
    9. À l’aide d’un coton-tige, versez 3 à 4 gouttes de solution de montage en polystyrène xylène (DPX) de dibutylphtalate sur les lames. Placez les lamelles sur les lames recouvertes de DPX. Laissez sécher les lames pendant la nuit.
  2. Analyse ADN (Temps estimé : 1 h)
    1. Peser les tissus décellularisés et lyophilisés. Isolez et quantifiez l’ADN à l’aide de trousses disponibles dans le commerce, conformément aux instructions du fabricant.

5. Caractérisation des hydrogels composites

  1. Test de turbidité de gélification (Temps estimé : 1 h)
    1. Placer 100 μL de solutions de prégel dans chaque puits d’une plaque de 96 puits sur de la glace. Lire l’absorbance à 405 nm toutes les 2 min pendant 45 min à l’aide d’un lecteur de plaques.
    2. Calculer l’absorbance normalisée à l’aide de l’équation suivante :
      (Absorbance - Absorbanceinitiale) / (Absorbancemaximale -Absorbance initiale)
    3. Calculez la pente de la courbe et le temps nécessaire pour obtenir une gélification de 50 % et 95 %, respectivement t1/2 et t95.
  2. Test de compression (Temps estimé : 1 min par hydrogel)
    1. Fabriquer des hydrogels composites à la concentration de 12 mg/mL de 8 mm de diamètre et de 2 mm de hauteur.
    2. À l’aide d’un rhéomètre, comprimer les échantillons avec une charge de 250 N entre des plaques parallèles en acier inoxydable à une vitesse de déformation de 10 % de la hauteur de l’échantillon/min. Le logiciel qui fournit les lectures du rhéomètre fournira une courbe contrainte-déformation en appliquant la force et en mesurant la déformation jusqu’à ce que les hydrogels se rompent.
    3. Calculez le module de Young à partir de la pente de la région linéaire des courbes contrainte-déformation.

6. Culture tridimensionnelle d’ASC humains dans des hydrogels de composites nerveux

  1. Préparation de la plateforme tridimensionnelle (3D) (Temps estimé : 3 h)
    1. Gravure d’une plaquette de silicium avec une résine photosensible SU-8 pour générer des motifs circulaires de 200 μm de profondeur et 4 mm de diamètre.
    2. Mélanger la base de polydiméthylsiloxane (PDMS) et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1. Versez le mélange sur la plaquette de silicone et laissez reposer pendant 20 minutes pour éliminer toutes les bulles qui résultent du mélange de la base PDMS et de l’agent de durcissement.
    3. Mettez-le au four et faites-le durcir pendant 2 h à 70 °C. Démoulez la feuille PDMS durcie et perforez-la à l’aide d’un poinçon de biopsie de 8 mm de diamètre pour créer des micropuits PDMS.
    4. Placez les micropuits dans une plaque de 96 puits et placez la plaque de puits dans un nettoyeur air-plasma pour stériliser les micropuits PDMS.
    5. Fonctionnaliser les micropuits PDMS avec 1 % de polyéthylèneimine (PEI) et 0,1 % de glutaraldéhyde (GA) pendant 10 min et 20 min, respectivement. Laver les micropuits avec de l’eau distillée, 2x.
  2. Préparation des hASCs (Temps estimé : 7 jours)
    1. Cellules de passage de culture pour 2 à 5 passages dans des milieux de croissance hASCs (milieux basaux hASCs complétés par du sérum de veau fœtal (FBS) et de la pénicilline/streptomycine (Pen-streptocoque)) jusqu’à confluent. Passage et calcul du nombre de cellules à l’aide d’un hémacytomètre ou d’un compteur de cellules.
  3. Hydrogels composites nerveux chargés d’ASC (Temps estimé : 2 h)
    1. Mélangez le prégel du nerf sciatique et de la moelle épinière dans un rapport volumétrique de 2:1, 1:1, 1:2, et préparez de l’hydrogel pour la moelle épinière uniquement sans mélanger de prégel pour le nerf sciatique.
    2. Ajouter le milieu M199 et ajuster le pH de 7,4 à l’aide de 1 N, de NaOH et de HCl. Remettre en suspension les hASC avec le milieu de croissance dans le prégel à une densité de 1 x 106 cellules/mL.
      REMARQUE : La quantité de M199 et de suspension cellulaire doit être de 10 % de prégel.
    3. Diluer le prégel à 12 mg/mL à l’aide de 1x PBS. Placez le prégel sur des micropuits et incubez pendant 30 min. Culture d’hydrogels chargés d’ASC dans des milieux de croissance hASC.
  4. Test de viabilité cellulaire (Temps estimé : 4 h par jour)
    1. Préparez des solutions d’essai de viabilité en utilisant des réactifs disponibles dans le commerce conformément aux instructions du fabricant.
    2. Aspirez le support les jours 1, 4, 7 et 14. Ajouter le réactif dans les puits et incuber à 37 °C pendant 3 h en suivant les instructions du fabricant.
    3. Lire la fluorescence à une excitation/émission de 560/590 nm à l’aide d’un lecteur de plaques. Calculez la différence en pourcentage à l’aide de l’équation suivante :
      [(Échantillon de fluorescence -Blanc de fluorescence) /Blanc de fluorescence] x 100

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des tissus décellularisés ont été préparés selon des protocoles préalablement établis avec de légères modifications26,27. Après la décellularisation, la lyophilisation et la digestion, des hydrogels composés pour les nerfs à des rapports de SN :SC = 2:1, 1:1, 1:2 et des hydrogels de moelle épinière seulement ont été fabriqués (Figure 1). L’élimination des composants nucléaires a été confirmée par coloration H&E (figure 2A). Pour évaluer quantitativement la décellularisation, l’ADN résiduel a été mesuré dans l’ECM. La teneur en ADNdb de la dure-mère fraîche était de 132,6 ± 21,3 ng d’ADNdb/mg de tissu sec, tandis que le parenchyme de la moelle épinière frais et décellularisé contenait respectivement 22,6 ± 8,3 ng d’ADNdb/mg de tissu sec et de 23,74 ± 6,69 ng d’ADNdb/mg de tissu sec (Figure 2B). Il indiquait que la dure-mère devait être retirée avant la décellularisation. La quantité d’ADNdb du nerf sciatique frais et décellularisé était de 222,5 ± 42,65 et 0,63 ng d’ADNdb/mg de tissu sec, respectivement (Figure 2C).

La cinétique de gélification des hydrogels composés nerveux a été évaluée pour déterminer la vitesse de gélification (S) et les temps nécessaires pour atteindre 50 % et 95 % de la turbidité finale (t1/2 et t95). La cinétique de gélification a montré une forme sigmoïdale pour tous les groupes d’hydrogel (Figure 3A). La vitesse de gélification (S) dans tous les groupes d’hydrogels n’était pas significativement différente les unes des autres. Le temps nécessaire pour atteindre la moitié de la turbidité finale, t1/2, était de 11,32 ± 0,57 min, 13,33 ± 0,6 min, 15,7 ± 0,92 min, et de 17,23 ± 1,13 min pour SN :SC = 2:1, 1:1, 1:2 et les hydrogels de la moelle épinière uniquement, respectivement. Le temps nécessaire pour atteindre 95 % de la turbidité finale, t95, était de 13,8 ± 0,83 min, 15,53 ± 0,83 min, 18,38 ± 0,79 min et 19,62 ± 1,27 pour SN :SC = 2:1, 1:1, 1:2 et les hydrogels de la moelle épinière uniquement, respectivement. Ces résultats indiquent que les hydrogels avec plus de contenu en nerf sciatique atteignent l’état d’équilibre plus rapidement, et la MEC du nerf sciatique peut favoriser l’assemblage d’hydrogels. Le résultat du test de compression a montré une tendance selon laquelle les hydrogels avec plus de contenu en moelle épinière offrent une rigidité accrue ; néanmoins, elle n’était pas significativement différente entre tous les différents rapports d’hydrogels composites (figure 3B).

Enfin, pour déterminer la viabilité cellulaire des hASCs dans tous les groupes d’hydrogels, des cultures 3D ont été mises en place à l’aide de micropuits PDMS microfabriqués, comme le montre la figure 4. Tout au long de la culture de 14 jours, la viabilité de l’ASC a été mesurée à l’aide d’un test colorimétrique et métabolique de fluorescence basé sur des milieux de culture cellulaire disponibles dans le commerce, où les différences en pourcentage par rapport aux lectures ont été calculées à quatre moments différents : jour 1, jour 4, jour 7 et jour 14 (figure 5). La valeur de la différence en pourcentage augmentait à mesure que les points temporels augmentaient, et celle de l’hydrogel de la moelle épinière seulement était inférieure à celle du reste des groupes les jours 1, 4 et 14. Prises ensemble, ces données suggèrent que la viabilité des hASC a augmenté tout au long de la période de culture en raison de la prolifération cellulaire et de l’augmentation de l’activité métabolique cellulaire.

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Figure 1 : Fabrication d’hydrogels composites nerveux. La moelle épinière porcine et les nerfs sciatiques ont été décellularisés, lyophilisés et digérés pour obtenir des solutions de prégel. Des solutions de prégel pour le nerf sciatique et la moelle épinière ont été mélangées dans un rapport de 2:1, 1:1 et 1:2, et du prégel pour la moelle épinière seulement a également été préparé. Toutes les solutions de prégel ont été incubées à 37 °C pour générer des hydrogels composites nerveux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Vérification de la décellularisation. (A) Coloration H&E de la moelle épinière porcine fraîche et décellularisée et des nerfs sciatiques. Les flèches indiquent la présence de cellules dans les tissus. Barres d’échelle = 1 mm pour les images grand angle et 500 μm pour les images zoomées (200 μm uniquement pour les images décellularisées du nerf sciatique zoomées). (B) Analyse de l’ADN de dure-mère fraîche, de parenchyme et de moelles épinières décellularisées (n = 10, 16 et 6, respectivement). (C) Analyse de l’ADN des nerfs sciatiques frais et décellularisés (n = 8 et 3, respectivement). Les barres d’erreur représentent les écarts-types. L’analyse statistique a été effectuée par ANOVA à un facteur avec un test post-hoc de Tukey pour (B) et un test t pour (C). Abréviations : ns = non significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Caractérisation des hydrogels composés pour nerfs. (A) Absorbance normalisée des hydrogels composites pour nerfs (n = 5). (B) Module de Young des hydrogels composites décellularisés de la moelle épinière et des nerfs (n = 4 pour la moelle épinière décellularisée et 3 pour chaque groupe d’hydrogels composites, respectivement). Les barres d’erreur représentent les écarts-types. L’analyse statistique a été effectuée via l’ANOVA à un facteur avec le test post-hoc de Tukey. Abréviations : ns = non significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Image schématique d’une culture 3D. (A) Les micropuits PDMS ont été fabriqués sur une plaquette de silicium recouverte d’un SU-8. Chaque micropuits a été percé à l’aide d’un poinçon de biopsie de 8 mm. (B) Décellulariser la moelle épinière et le nerf sciatique à différents ratios, ajuster le pH à 7,4, remettre en suspension avec des hASC, placer le prégel sur le micropuits et incuber pendant 30 minutes à 37 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5 : Essai de viabilité cellulaire. La différence en pourcentage de hASCs cultivées dans des hydrogels composites nerveux aux jours 1, 4, 7 et 14 (n = 3). Les barres d’erreur représentent les écarts-types. L’analyse statistique a été effectuée via l’ANOVA à un facteur avec le test post-hoc de Tukey. * P<0,05 ; ** P<0.01 ; p<0.005 ; p<0.001 ; NS : Non significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

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Il est largement admis que la physiopathologie des lésions médullaires est complexe et multidimensionnelle. Même si des thérapies uniques telles que la transplantation cellulaire, l’administration de médicaments et les biomatériaux ont chacune fourni des informations précieuses sur les lésions médullaires, la nature complexe des lésions médullaires peut limiter leur efficacité individuelle 28,29,30,31. Par conséquent, les efforts pour développer des thérapies combinatoires efficaces ont augmenté. Les hydrogels composites nerveux décrits dans cette étude peuvent servir de véhicule d’administration efficace pour les cellules ou les médicaments. En ce qui concerne les cellules, les ASC sont l’un des candidats prometteurs pour la transplantation cellulaire. Les ASC sécrètent des facteurs immunomodulateurs tels que l’interleukine-10 (IL-10) et le facteur de croissance transformant bêta (TGF-β) ainsi que des facteurs neurotrophiques tels que le facteur de croissance nerveuse (NGF), le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), le facteur neurotrophique dérivé de la glie (GDNF) et la neurotrophine-3 (NT-3) qui entraînent une augmentation de la croissance des neurites des ganglions de la racine dorsale in vitro et une récupération de la fonction in vivo 17,19,32,33, 34. Les ASC administrés dans des solutions aqueuses ont favorisé la récupération fonctionnelle après une lésion médullaire chez le rat et l’homme ; cependant, des défis liés à la médiation de la migration, de la différenciation, de la survie et de la différenciation des ASC ont été notés 35,36,37. En outre, il existe des rapports contradictoires sur le potentiel tumorigène des ASC transplantés ; Alors que certaines études ont indiqué que les ASC peuvent contribuer à la prolifération et aux métastases de différents types de cancer, d’autres études ont également montré des potentiels antitumorigènes 38,39,40,41 Par conséquent, un profil d’innocuité à long terme des ASC dans les hydrogels composites nerveux doit être étudié à l’avenir. Ici, les moelles épinières décellularisées et les nerfs sciatiques ont été étudiés séparément pour la réparation des lésions médullaires.

Des moelles épinières décellularisées ont été injectées dans un modèle de rat de LME et ont stimulé la croissance axonale dans la lésion et amélioré la récupération fonctionnelle ; Cependant, en raison de la dégradation rapide, un kyste s’est formé et la récupération a diminué après 4 à 8 semaines de traitement4, 42. De l’hydrogel acellulaire décellularisé du nerf sciatique a été injecté chez des rats LME et a favorisé la régénération neurale, mais l’efficacité de l’hydrogel a été limitée en raison de sa dégradation rapide24. Par conséquent, les approches combinatoires utilisant des tissus décellularisés ont récemment attiré l’attention. Il a été rapporté que les hydrogels décellularisés de la moelle épinière favorisaient la prolifération, la migration et la différenciation des cellules souches neurales/cellules progénitrices en neurones4. Il a également facilité la croissance de neurites 3D à partir des cellules de neuroblastome N1E-115, indiquant que les hydrogels décellularisés de la moelle épinière pourraient être un échafaudage attrayant pour favoriser la régénérationaxonale 26. Des nerfs sciatiques décellularisés ont été étudiés avec l’encapsulation de Schwann et ont montré un potentiel en tant que greffe nerveuse après LME43. Dans l’ensemble, une combinaison de moelles épinières décellularisées et de nerfs sciatiques devrait favoriser à la fois la régénération axonale et la restauration des tissus. L’étude actuelle n’inclut pas non plus l’évaluation des effets thérapeutiques des hydrogels nerveux chargés d’ASC. Par conséquent, il est essentiel d’évaluer les potentiels régénératifs, tels que les effets pro-angiogéniques et neurotrophiques, de la plateforme via des études in vitro et in vivo . De plus, les hydrogels composites nerveux peuvent être facilement appliqués pour encapsuler d’autres types de cellules, telles que les cellules de Schwann, les cellules souches olfactives et les cellules souches neurales, afin d’améliorer l’efficacité thérapeutique de la transplantation cellulaire. Il serait intéressant d’étudier l’innocuité et l’efficacité de divers types de cellules dans l’hydrogel composite nerveux à différents stades de la LME.

L’une des étapes critiques dans la création d’hydrogels composites est de préparer une quantité adéquate de tissus, en particulier de la moelle épinière. Le rendement des moelles épinières décellularisées est significativement faible, comme indiqué dans le protocole (50-100 mg de morceau de moelle épinière et 100-150 mg de morceau de nerf sciatique) ; Par conséquent, il n’est pas recommandé de récolter ou d’obtenir des moelles épinières à partir de petits animaux tels que les souris et les rats. Au moins les animaux de taille moyenne, tels que les lapins, sont suggérés pour obtenir une quantité substantielle de matrices de la moelle épinière. En outre, il est important de vérifier le pH lors de la digestion des tissus décellularisés, car l’ajout de tissu peut déplacer le pH au-delà de la plage d’activation requise de la pepsine, qui est d’environ 1,5-2. Les temps d’agitation pour la décellularisation de la moelle épinière sont plus longs que la méthode précédemment établie26 car la vitesse d’agitation est plus lente dans le protocole actuel. Le rotateur utilisé dans ce protocole offre jusqu’à 83 tr/min, alors qu’un maximum de 200 tr/min était utilisé dans les méthodes précédemment établies. Par conséquent, les temps d’agitation ont été augmentés deux fois pour bien laver tous les débris cellulaires. Pour s’assurer que toutes les solutions de décellularisation peuvent pénétrer dans les tissus et laver tout le contenu cellulaire et nucléaire, les temps et la vitesse d’agitation doivent être optimisés à l’aide de l’histologie ou de l’analyse de l’ADN du côté de l’utilisateur. Il est suggéré que le rapport entre les tissus et la solution de décellularisation soit d’au moins 1:15 [p/v]. Les tissus décellularisés dans le protocole26 précédemment établi ont été digérés/agités à température ambiante ; cependant, dans ce protocole, ils ont été digérés avec une barre magnétique sur une plaque d’agitation à 4 °C et 500 tr/min pendant 4 jours. Le moteur de la plaque d’agitation pourrait générer de la chaleur et l’introduire dans la solution de prégel. Par conséquent, il est recommandé de digérer à basse température ou d’utiliser une plaque d’agitation à température contrôlée.

Comme indiqué dans l’analyse de l’ADN (Figure 2B), il est essentiel d’enlever la dure-mère de la moelle épinière car une quantité importante d’ADN peut être trouvée dans la dure-mère. La dure-mère, contrairement au parenchyme de la moelle épinière, est constituée de tissu fibreux ; Par conséquent, différentes méthodes de décellularisation doivent être utilisées, comme nous l’avons déjà documenté44,45. La coloration H&E et l’analyse de l’ADN des tissus décellularisés ont été utilisées pour vérifier l’efficacité du processus de décellularisation. Les critères suivants doivent être satisfaits pour atteindre les objectifs d’une décellularisation réussie : 1. Moins de 50 ng d’ADNdb/mg de poids sec ECM, 2. Moins de 200 pb de longueur de fragment d’ADN, 3. Manque de matériel nucléaire dans les coupes de tissus ou H&E5. L’analyse qualitative de la coloration H&E après décellularisation a montré une absence de coloration des noyaux, suggérant une élimination réussie des cellules. De plus, les composants de l’ECM, tels que le collagène et d’autres protéines matricielles, ont été conservés, et l’intensité de la coloration a été réduite après la décellularisation, reflétant l’élimination du matériel cellulaire. Après la décellularisation, la teneur en ADN était de 0,63 ng dans le nerf sciatique et de 23,74 ± 6,69 ng dans la moelle épinière par mg de poids sec ECM, ce qui est inférieur au seuil acceptable pour une application in vivo.

Les mesures rhéologiques des hydrogels composites doivent être conçues avec soin, car les rhéomètres à force de compression élevée ou les testeurs de traction ne peuvent pas être utilisés pour analyser les propriétés mécaniques des matériaux mous tels que les hydrogels composites nerveux créés dans cette étude. Les échantillons seront déchirés/déchirés lorsqu’ils seront saisis sur l’appareil d’essai de traction, et la compression avec une force élevée ne fournira pas de données suffisamment sensibles pour être analysées. Dans cette étude, un rhéomètre avec une force de compression de 250 N a été utilisé, et il est conseillé de trouver un appareil avec une force similaire ou appropriée pour les besoins des utilisateurs. Alternativement, différentes mesures rhéologiques, telles que la mesure de cisaillement oscillatoire, peuvent aider à déterminer les modules de stockage et de perte. La réduction des propriétés mécaniques après décellularisation est une limitation dans cette étude. Même si le module de Young de tous les groupes d’hydrogels est similaire à celui de la moelle épinière décellularisée, il est significativement différent de celui de la moelle épinière fraîche (données non présentées). Les cellules souches neurales et les CSM cultivées sur des matériaux relativement mous ont montré une augmentation de la différenciation neuronale et de l’expression de la tubuline β-III, respectivement46,47. Cependant, il est possible de renforcer ou de réticuler les matériaux décellularisés avec d’autres matériaux tels que l’alginate, le poly(éthylène glycol), la génipine et le glutaraldéhyde 48,49,50,51. Une optimisation sera nécessaire pour s’assurer que ces stratégies visant à améliorer les propriétés mécaniques des hydrogels n’influencent pas le comportement ou la viabilité cellulaire.

La variabilité d’un lot à l’autre des hydrogels composites nerveux peut être observée en partie en raison des différences d’âge, de sexe, de poids et d’espèce des animaux. L’utilisation contrôlée et cohérente du même type d’animaux peut aider à atténuer la variabilité. Le regroupement des échantillons de tissus de différents animaux peut également aider à réduire la variabilité entre les lots52. L’un des défis potentiels pour traduire cette étude en applications cliniques est l’évolutivité. Le faible rendement de la décellularisation de la moelle épinière entraverait la production d’une grande quantité de tissus décellularisés. De nouvelles méthodes devraient être développées/optimisées pour générer plus de tissus, ou la dure-mère pourrait être décellularisée ensemble pour augmenter le rendement après décellularisation. Un autre défi potentiel est l’autorisation réglementaire. Aux États-Unis, la FDA est responsable de l’approbation réglementaire des thérapies cellulaires53. L’autorité réglementaire de la République de Corée a approuvé l’entrée sur le marché de CARTISTEM, un produit à base de CSM composé de CSM allogéniques dérivées du sang du cordon ombilical et de 4 % d’hydrogel d’hyaluronate pour le traitement des anomalies du cartilage du genou54. Des cas précédents comme ceux-ci peuvent aider à simplifier le processus d’examen réglementaire en fournissant des données sur la sécurité et l’efficacité.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la Fondation PhRMA et les National Institutes of Health par le biais du numéro de prix P20GM139768 et R15NS121884 attribué à YS. Nous tenons à remercier le Dr Kartik Balachandran et le Dr Raj Rao du Département de génie biomédical de l’Université de l’Arkansas de nous avoir permis d’utiliser leur équipement. Nous tenons également à remercier le Dr Jin-Woo Kim et M. Patrick Kuczwara du Département de génie biologique et agricole de l’Université de l’Arkansas pour leur formation sur le rhéomètre.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
3-(décyldiméthylammonio)sulfonate de propane sel interneSigma-AldrichD4266Utilisé lors de la décellularisation du nerf sciatique, SB-10
3-(N,N-Diméthylpalmitylammonio)sulfonate de propaneSigma-AldrichH6883Utilisé lors de la décellularisation du nerf sciatique, SB-16
Réactif AlamarBlueFisher ScientificDAL1100Utilisé lors du test de viabilité des cellules AlamaBlue
Chondroitinase ABCSigma-AldrichC3667Utilisé lors de la décellularisation du nerf sciatique
CryostatLeicaCM1860
DésoxyribonuclaseSigma-AldrichD4263Utilisé lors de la décellularisation du nerf sciatique
Phosphate d’hydrogène disodique heptahydrateVWRBDH9296Produit chimique pour 100 mM Na/50 mM phos et 50 mM Na/10 mM phos tampon
DNeasy Blood & Blood Kit de mouchoirsQiagen69506Utilisé lors de l’analyse ADN
Dpx Mountant pour l’histologie, support de montage sur culasseSigma-Aldrich6522Utilisé pendant H& Coloration E
ÉosineSigma-AldrichHT110216Utilisé pendant H& Coloration E
ÉthanolVWR89125-172
FormaldéhydeSigma-Aldrich252549Utilisé pendant H& Coloration E
Glutaraldéhyde (GA)Sigma-AldrichG6257Utilisé lors de la fonctionnalisation de la surface PDMS
Médias de croissance hASCLonzaPT-4505Utilisé pour cultiver des hASC, contenant du sérum bovin fœtal et de la péniciline/streptomycine
HématoxylineVWR26041-06Utilisé pendant H& Coloration E
Cellules souches humaines dérivées de l’adipLonzaPT-5006
Acide chlorhydrique (HCl)Sigma-Aldrich320331Utilisé pour digérer les tissus décellularisés et ajuster les solutions de Pregel
Médias M199Sigma-AldrichM0650Utilisé pour diluer les pregels à la concentration désirée
Composé de températ de coupe optimalTissue-Tek4583
PepsineSigma-AldrichP7000Utilisé pour digérer les tissus décellularisés
Acide peracétiqueAllée des labosPAA1001Utilisé lors de la décellularisation de la moelle épinière
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)VWR97062-948
Lecteur de plaquesBioTek InstrumentsSynergy Mx
Polyéthyléneimine (PEI)Sigma-Aldrich181978Utilisé lors de la fonctionnalisation de la surface PDMS
Nerf sciatique porcinTissue Source LLCDes cochons vivants, sans aucune information identifiable et sans détails de traçabilité
Moelle épinière porcineTissue Source LLCDes cochons vivants, sans aucune information identifiable et sans détails de traçabilité
Système dsDNA QuantiFluorPromegaE2670Utilisé pour analyser le contenu de l’ADN
RhéomètreTA InstrumentsDHR 2
Rotateur robusteGlas-co099A RD4512Utilisé lors de la décellularisation de la moelle épinière
Chlorure de sodium (NaCl)VWRBDH9286Produit chimique pour 100 mM Na/50 mM phos et 50 mM Na/10 mM phos tampon
Désoxycholate de sodiumSigma-AldrichD6750
Monohydrate de phosphate de dihydrogène de sodiumVWRBDH9298Produit chimique pour 100 mM Na/50 mM phos et 50 mM Na/10 mM phos tampon
Solution d’hydroxyde de sodium (NaOH)Sigma-Aldrich415443Utilisé pour ajuster les solutions de Pregel
SU-8Matériaux améliorés par KayakuSU8-100Utilisé pour recouvrir une plaquette de silicium
SaccharoseSigma-AldrichS8501Utilisé lors de la décellularisation de la moelle épinière
Kit en élastomère en silicone Sylgard 184DOW1317318Base et agent de polydiméthylxiloxane (PDMS)
Triton X-100Sigma-AldrichX100Utilisé lors de la décellularisation de la moelle épinière
Trypsine-EDTA (0,05 %), phénol rougeThermo Fisher25300062Utilisé lors des travaux sur le hASC et lors de la décellularisation de la moelle épinière
Rotateur de revolver à tubeThermo Fisher88881001Utilisé lors de la décellularisation du nerf sciatique
XylèneVWRMK866816Utilisé pendant H& Coloration E

Références

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Mots-clés

Hydrogels d cellularis smatrice extracellulairetransplantation cellulairecellules souches adipeuses humainesing nierie tissulaireneuror g n rationcaract risation des hydrogels

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