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Électropénétrographie AC-DC pour l’étude des comportements de sonde et d’ingestion des moustiques Culex tarsalis sur les mains humaines

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DOI :

10.3791/66877

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29 novembre 2024

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1Department of Entomology, Kansas State University, 2Department of Pathobiology, Auburn University, 3National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

Dans cet article

Résumé

Des procédures sont décrites pour étudier les comportements de sondage et d’ingestion des moustiques Culex tarsalis sur des mains humaines à l’aide de l’électropénétrographie AC-DC.

Résumé

Les moustiques transmettent des agents pathogènes qui affectent négativement la santé humaine et animale. Une meilleure compréhension de la biologie de leur alimentation sanguine et de leurs interactions avec les hôtes et les agents pathogènes pourrait être exploitée pour développer de nouvelles cibles pour lutter contre les maladies transmises par les moustiques. Malheureusement, les comportements de sonde (c’est-à-dire de piquer) des moustiques sont mal compris car ils se produisent à l’intérieur des tissus de l’hôte. Ici, une procédure non invasive est décrite pour utiliser l’électropénétrographie AC-DC (EPG) pour visualiser et quantifier indirectement les comportements alimentaires des moustiques en enregistrant les changements de signaux électriques générés lors de l’exploration et de l’ingestion sur des mains humaines. De minces fils d’or sont attachés aux moustiques à l’aide d’une colle d’argent conductrice et reliés à l’instrument EPG. L’hôte humain tient une sonde de tension de substrat dans sa main. Le sondage de l’hôte par le moustique câblé complète le circuit électrique, et les signaux électriques sont enregistrés sur un ordinateur sous forme de « formes d’onde » qui peuvent ensuite être mesurées et énumérées pour analyse. Cette méthodologie a été utilisée pour caractériser les comportements de sonde et d’ingestion des moustiques Aedes aegypti et Culex tarsalis et peut être appliquée à d’autres espèces de moustiques. L’EPG peut être utilisé pour étudier les effets des agents pathogènes, des insecticides et d’autres facteurs sur les comportements alimentaires des moustiques.

Introduction

Les moustiques causent des souffrances et des pertes économiques dans le monde entier en raison de leur rôle de vecteurs de maladies et de nuisibles1. Les moustiques anophèles transmettent le paludisme, qui cause chaque année environ 219 millions de cas dans le monde, plus de 400 000 décès2, et 12 milliards de dollars américains en coûts directs3. Les moustiques Aedes sont les vecteurs les plus importants pour la santé publique car ils ont une présence presque mondiale et transmettent des agents du chikungunya, de la dengue, de la filariose lymphatique, de la fièvre de la vallée du Rift, de la fièvre jaune et du Zika, qui font des victimes, submergent les systèmes de santé et entraînent des souffrances chroniques, une morbidité à vie et une invalidité4,5. De plus, les moustiques Culex transmettent des agents de l’encéphalite équine, de l’encéphalite japonaise, de la filariose lymphatique, de l’encéphalite de Saint-Louis et de la fièvre du Nil occidental, qui ont un impact sur la santé humaine et animale3,4.

La lutte antivectorielle à l’aide d’approches basées sur des insecticides est la principale méthode de lutte contre les maladies à transmission vectorielle à l’échelle mondiale6,7. Cependant, le nombre d’insecticides disponibles pour la lutte contre les moustiques est limité. De plus, la résistance aux insecticides évolue chez de nombreuses espèces, en particulier chez les moustiques Aedes, ce qui a un impact sur notre capacité à lutter contre les maladies à transmission vectorielle et entraîne la nécessité de nouvelles stratégies de lutte 6,8. Une meilleure compréhension de la biologie des moustiques, des interactions moustique-hôte-pathogène et des processus qui régulent la transmission des agents pathogènes peut faciliter le développement de nouveaux outils de lutte antivectorielle 6.

Les comportements de sonde et d’ingestion dans les tissus de l’hôte peuvent affecter la transmission des agents pathogènes et la pathologie des maladies9,10,11,12. Par exemple, un plus grand nombre de microfilaires ont été ingérées lorsque Aedes aegypti se nourrissait directement à partir de capillaires plutôt que de stocker du sang à l’extérieur des vaisseaux rompus13. Ainsi, la recherche fondamentale et appliquée sur ce sujet peut aider à développer, affiner et évaluer les stratégies de contrôle des moustiques et d’autres contre-mesures de transmission des agents pathogènes. Cependant, il existe d'importantes lacunes dans les connaissances sur les comportements cryptiques d'alimentation par le sang qui se produisent sous la surface de la peau de l'hôte, car ces comportements nécessitent souvent des procédures invasives sur des modèles d'animaux vivants ou utilisent des substrats artificiels transparents ou des régimes liquides9,11,14,15. Les techniques d’électropénitrographie non invasive (EPG ; également appelée graphique de pénétration électrique) ont été utilisées pour étudier les comportements alimentaires des insectes herbivores liés à la transmission des agents pathogènes des plantes, à la résistance des plantes hôtes et aux modes d’action des insecticides, car elles permettent aux chercheurs d’observer, d’enregistrer et de quantifier indirectement les mouvements et les comportements des pièces buccales qui se produisent à l’intérieur des tissus de l’hôte10,12.

Depuis les années 1950, des techniques de surveillance électronique de la pénétration ont été appliquées aux arthropodes hématophages, y compris les moustiques16,17,18,19,20. Cependant, l’EPG n’a jamais été largement adopté pour les arthropodes hématophages car les activités biologiques correspondant aux formes d’onde n’ont jamais été vérifiées21. De plus, la conception et l’électronique des premiers instruments ont entraîné une suraccentuation de certains signaux électriques, des rapports bruit/signal élevés, une faible résolution et une distorsion des formes d’onde, et une irritation des hôtes vertébrés12,22. Un instrument plus récent, le moniteur EPG AC-DC<)sup class="xref">23, dispose de paramètres variables et d’un traitement du signal amélioré, ce qui le rend mieux adapté à l’enregistrement des arthropodes hématophages et au déchiffrage des origines biologiques des formes d’onde dans les études de corrélation expérimentales10,12.

Pour l’EPG, un signal électrique est appliqué à l’hôte par l’intermédiaire d’une sonde de tension de substrat (c’est-à-dire une électrode de référence). L’arthropode est attaché à une électrode enregistreuse et placé sur l’hôte. Lorsque l’arthropode insère ses pièces buccales (c’est-à-dire ses stylets) dans l’hôte, le signal électrique est transmis au moniteur EPG AC-DC pour le traitement du signal. Les signaux électriques sont ensuite affichés sur un ordinateur sous forme de « formes d’onde » correspondant à des comportements spécifiques tels que les mouvements des pièces buccales, l’ingestion, la salivation et l’acquisition/inoculation d’agents pathogènes10,12. Les variables de réponse séquentielles et non séquentielles liées à la durée et au nombre des formes d’onde24,25 à différents niveaux hiérarchiques (familles, types et sous-types) peuvent ensuite être calculées en fonction de la fréquence et de la durée des formes d’onde afin de mieux comprendre les comportements alimentaires qui se produisent au sein des espèces et entre elles, et en réponse à des facteurs biotiques et abiotiques, tels que les hôtes, les agents pathogènes, les pesticides et les conditions environnementales10,12.

Jusqu’à présent, le moniteur EPG AC-DC a été utilisé pour caractériser les comportements de sondage et d’ingestion des moustiques Ae. aegypti26 et Culex tarsalis27 se nourrissant des mains humaines, et des tiques Dermacentor variabilis et Amblyomma americanum se nourrissant des veaux bovins28. De plus, un modèle murin pour EPG29 a récemment été développé pour faciliter les études d’agents pathogènes à l’aide de cet instrument. Les mains humaines sont idéales pour la caractérisation initiale de la forme d’onde du moustique, car les hôtes humains peuvent signaler quand ils sentent le moustique sonder ainsi que d’autres comportements, ce qui facilite la corrélation des formes d’onde avec les comportements (Tableau 1). De plus, une meilleure compréhension de la plasticité des comportements alimentaires des moustiques dans différentes populations humaines pourrait contribuer au développement d’interventions de gestion plus spécialisées pour les moustiques et les agents pathogènes qu’ils transmettent.

Tableau 1 : Description des familles de formes d’onde utilisées pour classer les signaux électriques enregistrés à partir de Culex tarsalis sur des mains humaines à l’aide d’EPG AC-DC. La phase de sondage et les activités biologiques correspondant à chaque famille de formes d’onde. Voir Cooper et al.27 pour plus d’informations. Abréviation : AC = courant alternatif, DC = courant continu, EPG = électropénétrographe. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Pour faciliter l’utilisation de l’EPG pour étudier la biologie des moustiques et les interactions hôte-vecteur, la méthodologie de quantification des comportements alimentaires des moustiques Cx. tarsalis sur les mains humaines à l’aide du moniteur EPG AC-DC est présentée ici. Ces protocoles s’appuient sur les procédures fondamentales EPG AC-DC décrites dans les ressources en ligne 30 et supposent que les utilisateurs ont une connaissance pratique de base de l’EPG AC-DC et des logiciels associés31. Les procédures décrites peuvent être modifiées pour d’autres espèces de moustiques et d’hôtes et fournissent une base pour faciliter la recherche fondée sur des hypothèses sur les comportements alimentaires des moustiques.

Tableau 2 : Définitions de la terminologie courante EPG AC-DC. Les définitions sont basées sur celles données dans les ressources en ligne 30,31 et la littérature scientifique32. Abréviation : AC = courant alternatif, DC = courant continu, EPG = électropénétrographe. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Protocole

Ce protocole (IRB-10729) a été approuvé par le comité d'évaluation institutionnel (IRB) pour la recherche sur l'être humain de la Kansas State University27 et est destiné à être utilisé uniquement avec des moustiques exempts de pathogènes. Les volontaires humains ont donné leur consentement éclairé pour participer à l'étude et publier leurs données. Avant d'entreprendre tout travail impliquant des animaux, des êtres humains ou des agents biologiques dangereux, assurez-vous que toutes les procédures ont été examinées et approuvées par les comités réglementaires institutionnels compétents ou par les personnes chargées de la surveillance. Voir le Tableau des matériaux pour obtenir des détails sur tout l'équipement et les matériaux utilisés dans ce protocole.

1. Préparation initiale et mise en place

  1. Installer le moniteur EPG CA-CC (Figure 1A), la cage de Faraday (Figure 1B,C) et le logiciel comme décrit précédemment30,31, en utilisant les modifications décrites ci-dessous (étapes 1.1.1-1.1.5). Se référer aux ressources en ligne30 pour des tutoriels étape par étape sur la configuration et l'utilisation du matériel et du logiciel. Enregistrer la configuration souhaitée comme valeur par défaut dans le logiciel de gestion du matériel et de visualisation des formes d'onde. Se référer au Tableau 2 pour une liste des termes courants en EPG CA-CC et de leurs définitions.
    1. Connecter un amplificateur de tête (tête ampli) et une sonde de tension du substrat au canal 1 de la boîte de contrôle.
      NOTE : L'enregistrement sur un seul canal est présenté, bien que le moniteur CA-CC puisse accueillir simultanément quatre insectes et leurs hôtes.
    2. S'assurer que le canal 1 de la boîte de contrôle est allumé, ainsi que les canaux Pré-1 et Post-1 correspondants sur la boîte d'interface à commutateur.
      NOTE : Les canaux non utilisés doivent rester éteints.
    3. Utiliser le logiciel de gestion du matériel pour activer les canaux 1 et 3 sur la carte d'acquisition A/N DI-710 (et aucun autre) afin d'enregistrer les signaux pré- et post-redressés.
    4. Configurer le logiciel de gestion du matériel pour afficher/chevaucher les formes d'onde pré- et post-redressées (par exemple, 1 = 1 pour le signal pré et 2 = 3 pour le signal post).
    5. Régler la fréquence d'échantillonnage du logiciel de gestion du matériel à 100 échantillons par seconde et par canal (c'est-à-dire S/s/CHAN : 100).
  2. Construire des supports pour insectes26,27,29,30 :
    1. Préchauffer le fer à souder à la température recommandée pour la soudure spécifiée à âme résineuse.
    2. Utiliser un outil coupe-câble-dénudeur pour retirer le revêtement plastique à environ 6 cm de l'extrémité d'un rouleau de fil de cuivre 20 AWG, sans toutefois sectionner ni endommager le faisceau de fils de cuivre à l'intérieur (Figure 2A). Ensuite, couper le faisceau de cuivre exposé et le défaire en brins individuels (Figure 2B).
    3. Utiliser une pince à bec effilé pour enrouler un brin de fil de cuivre autour de la tige d'une épingle à douille adaptée, sous la tête (c'est-à-dire la partie plate), de sorte que la majeure partie du fil de cuivre dépasse de la tête de l'épingle. Replier l'extrémité du fil sur la tête de l'épingle pour fixer le fil en place (Figure 2C).
      NOTE : Tester différentes épingles à douille afin d'identifier celles qui s'ajustent fermement dans le port de l'amplificateur de tête (lorsqu'il est éteint, débranché et réglé à 106 Ohms (Ω)).
    4. Fixer la tige de l'épingle à douille dans un support de soudage « mains libres » de manière à ce que le fil de cuivre pointe vers le haut. Appliquer ensuite une petite quantité (~0,2 cm de diamètre) de flux soluble dans l'eau au niveau de la jonction entre l'épingle à douille et le fil de cuivre (Figure 2D).
      ATTENTION : Le flux est toxique et doit être manipulé avec précaution.
    5. Dérouler environ 10 cm de soudure et le redresser. Maintenir le fer à souder chaud contre la tête de l'épingle pendant quelques secondes, jusqu'à ce que le flux fonde et que le métal soit chaud. Appuyer ensuite la pointe de la soudure contre la tête de l'épingle, à côté du fer à souder, jusqu'à ce que la soudure fonde et recouvre complètement la jonction, fusionnant ainsi l'épingle et le fil pour former un support pour insecte.
    6. Pendant que le support pour insecte refroidit, nettoyer la pointe du fer à souder avec de la laine d'acier et une éponge humide.
    7. Une fois refroidi, retirer le support pour insecte du support « mains libres ». Rincer le support dans de l'éthanol à 70 %, puis à l'eau, afin d'éliminer tout résidu de flux. Raccourcir le fil de cuivre à la longueur souhaitée (~3 cm, Figure 2E).
    8. Répéter les étapes 1.2.3 à 1.2.7 jusqu'à ce que 20 à 30 supports pour insectes soient fabriqués.
  3. Assembler un aspirateur pour insectes26,27 :
    1. Faire passer l'extrémité d'une pipette Pasteur en verre dans une flamme, en tournant légèrement la pipette. Répéter jusqu'à ce que l'extrémité de la pipette ait la taille appropriée pour s'ajuster fermement autour de l'abdomen de l'insecte.
    2. Couvrir l'extrémité large de la pipette Pasteur modifiée avec un tissu anti-moustiques, puis l'insérer directement dans un tube en silicone relié à un aspirateur de laboratoire, et fixer la jonction avec du ruban isolant afin de former un aspirateur pour insectes (Figure 2H).
      NOTE : La pipette Pasteur et le tissu peuvent être insérés dans un court morceau de tube en plastique équipé d'un raccord rapide, permettant un changement facile entre différentes tailles (Figure 2H).

Installation d'un laboratoire d'électrophysiologie pour l'enregistrement d'EEG ; comprend un amplificateur, un ordinateur, une cage de Faraday et des capteurs.
Figure 1 : Installation du moniteur EPG AC-DC pour l'enregistrement sur les mains humaines. (A) Composants de l'EPG, incluant (1) la boîte de commande, (2) la boîte d'interface à commutateur, (3) l'alimentation électrique, (4) la carte A/N DI-710, (5) l'ordinateur, (6) le régulateur de tension, et (B) la cage de Faraday contenant (C) un microscope numérique (7) monté sur un support flexible, (8) du papier bulle et des coussins d'air, (9) une sonde de mesure de tension du substrat et (10) un amplificateur de tête monté sur un support de laboratoire. Abréviations : AC = courant alternatif, DC = courant continu, EPG = électropénétrogramme. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Processus de montage du cathéter avec tubulure, fil et outils ; schéma du dispositif expérimental pour le transfert de liquide.
Figure 2 : Électrodes d'enregistrement pour connecter des moustiques et un aspirateur d'insectes pour manipuler les moustiques pendant le câblage. (A) Fil de cuivre 20 AWG avec 6 cm de gaine plastique retirée pour exposer le faisceau de fils de cuivre à l'intérieur. (B) Brins individuels du faisceau de fil de cuivre. (C) Un brin de fil de cuivre enroulé autour de la tête d'une épingle en laiton avec l'extrémité du fil repliée sur la tête de l'épingle. (D) Une petite quantité de flux appliquée sur la jonction entre l'épingle en laiton et le fil de cuivre, maintenue par un support de soudage « mains aidantes », en préparation de la soudure. (E) Un support d'insecte terminé, constitué d'un clou en laiton soudé à un fil de cuivre. (F) Une électrode d'enregistrement constituée d'un fil d'or enroulé autour de l'extrémité du fil de cuivre du support d'insecte et fixée en place avec de la colle argentée. (G) Vue rapprochée de la boucle en or située à l'extrémité de l'électrode d'enregistrement. (H) Un aspirateur d'insectes monté (en haut) et démonté (en bas), fabriqué à partir de pipettes Pasteur modifiées, de moustiquaire, de tubulure plastique, de ruban isolant et de connecteurs rapides mâles, placé à côté du tube d'aspiration de laboratoire équipé du connecteur rapide femelle (en haut à droite). Échelles = 1 cm (A-F), 200 µm (G). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

2. Montage chez les moustiques

  1. Préparer les moustiques et la colle argentée (l’après-midi ou le soir précédant l’EGP) :
    1. Élever et maintenir les moustiques de la souche Cx. tarsalis KNWR comme décrit précédemment27.
    2. Jeûner les femelles adultes de 5 à 17 jours après l’éclosion pendant 8 à 12 heures afin d’augmenter les taux de sondage, tout en leur permettant l’accès à l’eau pour éviter la mortalité.
    3. Préparer une colle argentée fraîche26,27,28,29,30 :
      1. Ajouter 510 mg de paillettes d’argent de 4-8 µm dans un bécher de 20 mL. Remettre la balance à zéro et ajouter 1 100 mg de colle non toxique pour école dans le bécher par-dessus les paillettes d’argent.
      2. Remettre la balance à zéro, ajouter 510 mg de paillettes d’argent de 8-10 µm dans le bécher par-dessus la colle, puis ajouter 1 000 µL d’eau à l’aide d’une pipette.
      3. Ajouter délicatement une barrette d’agitation dans le bécher et placer celui-ci sur la plaque d’agitation. Commencer à agiter lentement, augmenter progressivement jusqu’au réglage « rapide » et agiter pendant 4 minutes. S’assurer que tous les composants sont bien incorporés.
      4. Utiliser une pipette de transfert (avec l’extrémité coupée) pour transférer la colle argentée dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
      5. Envelopper le haut des tubes de colle argentée avec du Parafilm et les conserver à température ambiante jusqu’à utilisation.
        REMARQUE : La colle argentée conserve la bonne consistance pendant jusqu’à 2 jours, mais il est recommandé de la préparer fraîche la veille de l’utilisation30.
  2. Préparer les électrodes d’enregistrement26,27,29,30 :
    1. Vortexer vigoureusement la colle argentée avant utilisation.
    2. Envelopper un bloc de mousse avec un film plastique neuf pour y fixer les supports d’insectes préparés et les moustiques câblés.
      REMARQUE : La mousse doit être suffisamment grande pour permettre aux moustiques câblés de reposer à la verticale sans se toucher, mais assez petite pour tenir dans une boîte de rangement. ATTENTION : Les gouttelettes excrétées après un repas de sang peuvent contenir des agents pathogènes. Jeter le film plastique et le bloc de mousse de manière appropriée après utilisation.
    3. Éliminer l’oxydation (et l’ancienne colle argentée si les supports d’insectes sont réutilisés) de l’extrémité du fil de cuivre en raclant environ 1 cm du fil de cuivre avec une lame de rasoir jusqu’à ce qu’il brille sur toutes ses faces. Préparer un support d’insecte par moustique, plus quelques exemplaires supplémentaires.
    4. Couper des fils d’or de 0,025 mm de diamètre en morceaux de 4 à 5 cm de long. Tenir toujours le fil avec des pinces auto-fermantes recouvertes de ruban adhésif pour éviter de l’abîmer.
      REMARQUE : Le fil d’or est beaucoup plus visible sur un fond noir.
    5. Placer l’extrémité du fil d’or le long de l’extrémité propre du fil de cuivre du support d’insecte et enrouler délicatement le fil d’or 3 fois autour du fil de cuivre.
    6. Utiliser une sonde de dissection pour appliquer de la colle argentée afin de maintenir le fil d’or en place. S’assurer qu’il n’y a ni queue ni extrémité libre. Placer le support d’insecte dans la mousse jusqu’à ce que la colle sèche.
    7. Passer délicatement le fil d’or fixé au support d’insecte pour le lisser et le façonner en un arc long et doux (Figure 2F). Couper le fil à la longueur souhaitée (~2,5-3 cm).
    8. Travailler sous un microscope de dissection, utiliser des pinces fines pour former une boucle d’or à l’extrémité du fil d’or, puis plier la boucle à un angle de 90° comme décrit ci-dessous (étapes 2.2.8.1-2.2.8.4 ; Figure 2E,F). S’assurer que la boucle d’or est complètement fermée. Replacer le support d’insecte sur le bloc de mousse.
      1. Avec la main non dominante, tenir le support d’insecte par le clou en laiton, l’extrémité du fil d’or touchant le plateau du microscope. Avec la main dominante, saisir l’extrémité du fil d’or à l’aide de pinces fines.
      2. À l’aide des pinces fines, croiser l’extrémité du fil d’or par-dessus le fil de cuivre du support d’insecte près de l’endroit où le fil d’or est collé. Appuyer l’extrémité des pinces et du fil d’or contre le plateau du microscope.
      3. Tirer doucement sur le support d’insecte jusqu’à ce que le fil d’or forme une petite boucle autour de l’extrémité des pinces fines (ne pas trop serrer). Relâcher le fil d’or et retirer soigneusement les pinces.
      4. Toujours en tenant le support d’insecte de la main non dominante, saisir la boucle d’or avec les pinces fines de manière à ce que les pinces soient perpendiculaires au col du fil et que leur extrémité traverse le milieu de la boucle d’or, saisissant ainsi les deux côtés de la boucle. Tirer doucement sur le support d’insecte tout en faisant légèrement pivoter les pinces loin du support d’insecte jusqu’à ce que la boucle soit pliée à un angle de 90° par rapport au col du fil (Figure 2G).
  3. Fixer les électrodes d’enregistrement aux moustiques26,27,29,30 (le matin de l’EGP) :
    1. Anesthésier les moustiques à jeun avec du gaz CO2 jusqu’à l’arrêt complet de tout mouvement. Placer les moustiques sur le dos sur le coussin d’anesthésie, l’abdomen tourné vers le chercheur.
    2. Placer un morceau de ruban adhésif d’environ 2 cm sous un microscope de dissection, côté collant vers le bas. Déposer une goutte de 0,5 cm (~10 µL) de colle argentée sur le ruban.
    3. Aspirer l’abdomen d’un moustique anesthésié dans une pipette de Pasteur modifiée en utilisant l’aspiration uniquement le temps nécessaire pour bien positionner l’abdomen. Tenir le moustique sous le microscope stéréoscopique au-dessus de la colle argentée à l’aide de l’aspirateur.
      REMARQUE : Les ailes peuvent être à l’intérieur ou à l’extérieur de l’embout de la pipette de Pasteur modifiée, mais les placer à l’intérieur aidera à empêcher le moustique de tomber. Éviter de plier ou d’endommager les ailes.
    4. Travailler rapidement, tremper une pointe minutieuse dans la colle argentée et appliquer une fine couche sur le pronotum du moustique (c’est-à-dire la surface dorsale du thorax). Passer immédiatement à l’étape suivante si possible (ou réanesthésier le moustique si nécessaire).
      REMARQUE : Il est recommandé d’enlever les écailles du pronotum en frottant la pointe de va-et-vient afin de favoriser la pénétration de la colle dans les pores de la cuticule. Éviter de mettre de la colle sur toute autre partie du moustique.
    5. Tremper rapidement la boucle d’or située à l’extrémité de l’électrode d’enregistrement dans la colle argentée et la placer sur la goutte de colle argentée située sur le pronotum du moustique. Balancer doucement la boucle d’avant en arrière pour s’assurer qu’elle est bien à plat contre le pronotum. Maintenir le fil en place jusqu’à ce que la colle sèche (~20-25 s).
    6. Remettre le support d’insecte dans la mousse à un angle permettant au moustique câblé de se tenir confortablement lorsqu’il se réveillera. Passer au câblage du moustique suivant.
      REMARQUE : Il est conseillé de prendre des notes sur la qualité de chaque câblage.
    7. Une fois le nombre souhaité de moustiques câblés atteint, placer le bloc de mousse dans une boîte de rangement. Maintenir les moustiques dans des conditions normales d’élevage jusqu’à utilisation.

3. Installation et préparation de la PEA (le matin précédant la PEA)

  1. Allumez le moniteur EPG AC-DC (en basculant l’interrupteur de l’alimentation) au moins 30 min avant l’enregistrement afin de permettre l’équilibration de l’appareil et d’effectuer les éventuels dépannages.
    NOTE : Les canaux utilisés sur la boîte de commande et la boîte d’interface de commutation peuvent rester allumés.
  2. Allumez l’ordinateur et ouvrez le logiciel de gestion du matériel.
    NOTE : Si les signaux n’apparaissent pas sous forme de lignes fines et plates, un dépannage est nécessaire (voir la section discussion).
  3. Effectuez le test de contact27,30 pour vérifier le bon fonctionnement du matériel :
    1. En étant mis à la terre (c’est-à-dire en touchant la cage de Faraday avec la peau nue), tournez le bouton de l’amplificateur de tête sur 106 Ω et insérez la tige d’un porte-insecte dans le port.
      ​NOTE : Effectuer le test de contact à un niveau de résistance d’entrée (Ri) plus élevé peut endommager l’amplificateur de tête.
    2. En étant mis à la terre, allumez l’amplificateur de tête et serrez fermement le fil de cuivre du porte-insecte entre le pouce et l’index trois fois. Si l’EPG fonctionne correctement, trois pics importants apparaîtront à la fois sur les signaux pré- et post-amplification à l’écran. Dans le cas contraire, un dépannage est nécessaire (voir la section discussion).
  4. Réglez les paramètres de l’appareil sur un courant alternatif (AC) de 150 mV, avec une Ri de 107 Ω, un gain matériel de 20-40x, un décalage négatif, une ligne de base native et un gain logiciel de 8-16x27,30, comme décrit ci-dessous (étapes 3.4.1-3.4.3).
    1. Réglez la tension, le type de courant, le gain matériel (plage, gain et multiplicateur), le décalage et la ligne de base (zéro) à l’aide des commutateurs et des boutons du canal 1 de la boîte de commande.
      NOTE : Le réglage approprié du gain matériel dépend de la qualité du câblage et de la colle argentée ; des variations du gain optimal d’un moustique à l’autre ou d’un jour à l’autre sont donc attendues. Le gain matériel peut devoir être ajusté pendant l’enregistrement si les pics de signal sont saturés (défini dans le Tableau 2 et illustré dans la Figure 3A,C) ou trop faibles pour être visualisés. Toute modification du gain matériel affectera de façon permanente l’enregistrement (illustré dans la Figure 3A,C).
    2. Réglez le niveau de Ri à l’aide du bouton de l’amplificateur de tête.
    3. Réglez et ajustez le gain logiciel à l’aide du logiciel de gestion du matériel (par exemple, sélectionnez le signal pré- ou post-amplification, puis cliquez avec le bouton gauche pour augmenter le gain logiciel ou avec le bouton droit pour le diminuer).
      NOTE : Les modifications du gain effectuées dans le logiciel n’affecteront PAS de façon permanente l’enregistrement.
  5. Configurez un nouvel enregistrement dans le logiciel de gestion du matériel, mais ne commencez pas l’enregistrement avant l’étape 4.3 de la section suivante.

4. PEG sur les mains humaines26,27 :

  1. Après avoir obtenu le consentement éclairé (tel que spécifié par le comité d'éthique de l'institution), demander à l'hôte de s'asseoir à côté de la cage de Faraday avec un bras à l'intérieur, tout en tenant la sonde de tension du substrat et en la maintenant sous l'amplificateur de tête.
    NOTE : Le bras doit reposer confortablement sur du papier bulle ou un substrat non conducteur similaire. La main et la sonde de tension du substrat ne doivent pas entrer en contact avec la cage de Faraday ou l'amplificateur de tête pendant l'enregistrement. Pour éviter tout dommage, il est impératif que le volontaire n'effleure pas l'amplificateur de tête une fois qu'il est allumé. Si l'amplificateur de tête est touché accidentellement, effectuer le test de contact décrit ci-dessus pour évaluer son bon fonctionnement.
  2. Une fois l'hôte en position, tourner l'amplificateur de tête sur le côté. Sortir un moustique filé de la boîte de stockage et le connecter à l'appareil en insérant la broche en laiton du support d'insecte dans le port de l'amplificateur de tête. Laisser le moustique pendre librement.
    NOTE : Garder à portée de main un flacon pulvérisateur contenant de l'éthanol à 70 % pour maîtriser tout moustique qui se détacherait du fil.
  3. Démarrer l'enregistrement à l'aide du logiciel de gestion du matériel. Positionner l'amplificateur de tête au-dessus de la main de manière à ce que le moustique puisse se tenir et piquer confortablement.
  4. Allumer l'amplificateur de tête tout en étant mis à la terre. Démarrer un minuteur de 10 minutes. Ajuster la position de la main de l'hôte au besoin pour favoriser la réussite du piquage.
    NOTE : Lorsqu'on utilise des moustiques enclins à piquer immédiatement, allumer l'amplificateur de tête avant de positionner le moustique sur la main. Une fine tige en bois ou le manche d'un pinceau non conducteur peut être utilisé pour courber le fil de cuivre du support d'insecte afin d'ajuster davantage la position du moustique. Une loupe ou un microscope numérique monté sur un bras articulé peut aider à observer le moustique pendant l'EPG, en particulier pour les études de corrélation comportementale.
  5. Utiliser le logiciel de gestion du matériel pour effectuer des observations horodatées (par exemple, marqueurs d'événements) pendant l'enregistrement concernant les réponses de l'hôte, les comportements du moustique, les changements de gain, etc. Ajuster la position des signaux à l'écran et le gain logiciel au besoin afin que les deux signaux restent clairement visibles. Ajuster le gain matériel si les signaux atteignent leur seuil maximal (Figure 3A,C et Table 2) ou si les ondes apparaissent trop petites lorsque le gain logiciel est au maximum. Ajuster le décalage si un repliement du redresseur est observé (Figure 3C,C' et Table 2). Se référer au manuel du logiciel31 et aux ressources en ligne30 pour des instructions détaillées sur la manière d'effectuer ces réglages.
    1. Pour ajuster la position des signaux à l'écran, sélectionner le signal pré ou post (par exemple, en cliquant sur
      1 = 1       ou 2 = 3), puis faire glisser le signal vers la position souhaitée à l'écran (idéalement près du centre, sans chevauchement).
    2. Pour ajuster le gain logiciel, utiliser le logiciel de gestion du matériel décrit à l'étape 3.4.3.
    3. Pour ajuster le gain matériel, commencer par tourner le bouton de gain du canal 1 vers la droite ou la gauche pour augmenter ou diminuer le gain, respectivement. Si ce réglage ne suffit pas à éliminer le dépassement (gain trop élevé ; Figure 3A,C) ou à permettre une visualisation claire des détails du signal (gain trop faible), basculer les commutateurs de plage et de multiplicateur du canal 1 pour ajuster davantage le gain.
      NOTE : Il est recommandé d'utiliser des marqueurs d'événements pour enregistrer les moments où le gain matériel a été modifié, afin de faciliter l'interprétation des données des formes d'onde.
    4. Pour ajuster le décalage, basculer le commutateur de décalage du canal 1 sur la boîte de commande sur neg, puis tourner le bouton de décalage du canal 1 jusqu'à ce que les pics des signaux pré et post apparaissent dans la même direction à l'écran de l'ordinateur. Si le bouton de décalage est tourné trop loin, le signal post se retournera à nouveau.
  6. Si le moustique ne pique pas dans les 10 minutes (ou un autre délai défini), éteindre l'amplificateur de tête. Si le moustique est en cours de piquage au moment indiqué, lui permettre de terminer avant d'éteindre l'amplificateur de tête. Demander à l'hôte de retirer soigneusement sa main, puis retirer le moustique avec le support d'insecte attaché. Remettre le moustique dans la boîte de stockage.
  7. Arrêter/fermer l'enregistrement à l'aide du logiciel de gestion du matériel. Passer à l'EPG du moustique suivant (Étape 4.2).
    NOTE : Penser à modifier le nom du fichier après chaque moustique.
  8. Éteindre l'amplificateur de tête et la source d'alimentation à la fin de la séance, puis fermer le logiciel.
  9. Passer en revue la déclaration de débriefing du participant ou un document similaire avec le volontaire, conformément aux exigences approuvées par le comité d'éthique.
  10. Éliminer les moustiques conformément aux exigences du protocole. Retirer le film plastique du bloc de mousse et le jeter de manière appropriée.
  11. Une fois la collecte de toutes les données terminée, examiner et mesurer les formes d'onde, puis analyser les données comme décrit précédemment24,25,26,27,29,30. Se référer aux ressources en ligne30 pour des tutoriels étape par étape sur l'utilisation du logiciel d'examen des formes d'onde, la création de figures illustrant les formes d'onde, la mesure des formes d'onde, l'exportation des données pour analyse, la réalisation de l'analyse statistique, ainsi qu'une explication détaillée des variables courantes de réponse des formes d'onde.

Graphique de données électrophysiologiques illustrant des changements transitoires de l'amplitude du signal au fil du temps.
Figure 3 : Exemples d'enregistrements sous-optimaux dus à un dépassement de gamme, à des modifications du gain de la boîte de contrôle, à des changements de tension peu clairs causés par un câblage médiocre, au repliement du redresseur et au bruit. Formes d'onde de moustiques Culex tarsalis se nourrissant jusqu'à satiété sur des mains humaines, déformées par (A) un dépassement de gamme (flèche horizontale bleue) et des modifications subséquentes du gain de la boîte de contrôle passant de 100x à 80x, puis à 40x, 60x, 40x et enfin 20x (flèches verticales oranges), (B) des variations de tension peu distinctes, et (C) le repliement du redresseur dans le signal post- (noir) par rapport au signal pré- (rouge) (voir forme d'onde J, agrandissement présenté dans le panneau C'), le bruit de ligne (onde sinusoïdale de 11 Hz visible uniquement dans le signal pré-redressé (rouge), agrandissement montré dans le panneau C'), le dépassement de gamme (flèche horizontale bleue) et un changement de gain de la boîte de contrôle de 500x à 200x (flèche verticale orange). Les noms des formes d'onde sont indiqués en haut de chaque panneau. Les flèches violettes dans le coin inférieur droit du panneau C indiquent le moment où l'amplificateur de tête a été éteint après la fin de la sonde et fournissent un autre exemple de repliement du redresseur. Les lignes horizontales rouges associées au signal pré-redressé dans le panneau C indiquent les moments où des marqueurs d'événement ont été utilisés pour enregistrer des notes horodatées. Les niveaux Ri, les signaux appliqués, les échelles de temps et les gains logiciels sont les suivants : (A) 107 Ω, 150 mV CC, 13,2 s/div, 8x ; (B) 107 Ω, 150 mV CC, 4,4 s/div, 128x ; et (C) 107 Ω, 150 mV CA, 7,4 s/div, 2x ; (C') 0,2 s/div, 8x. Abréviations : CA = courant alternatif, CC = courant continu, Ri = résistance d'entrée, mV = millivolt, Ω = ohms, s/div = secondes par division. Cette figure a été préparée à partir de données de Cooper et al.27. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Résultats

Les enregistrements EPG à courant alternatif/continu (AC-DC) de la prise de sang par des moustiques Cx. tarsalis sur des mains humaines (Figure 4) ont produit des signaux interprétables, adaptés à l'analyse et à la publication27. Les signaux interprétables présentaient des motifs répétitifs distincts et différenciables pouvant être classés en familles (Tableau 1 et Figure 4), types et sous-types, une fois que la compression (définie dans le Tableau 2) et le gain logiciel avaient été ajustés dans le logiciel d'analyse des signaux27,31. Toutes les familles de signaux (J, K, L, M, N) et types (L1, L2, M1, M2) précédemment décrits chez Ae. aegypti se nourrissant sur des mains humaines26 ont été identifiés dans les signaux générés par Cx. tarsalis se nourrissant sur des mains humaines, confirmant ainsi la validité des méthodes décrites ici. De plus, trois nouveaux types de signaux (M3, N1, N2) ainsi que de nombreux sous-types des signaux L1, L2, M1 et M2 ont été identifiés27. En outre, la chute de tension revenant à la ligne de base lorsque les pièces buccales sont retirées de l'hôte a été désignée comme la famille de signaux W27.

La variation systématique des paramètres de l'appareil (type de courant et niveaux de Ri) tout en suivant les procédures décrites ici a permis de déterminer les réglages optimaux pour l'enregistrement de l'alimentation de Cx. tarsalis sur les mains humaines, les origines électriques de chaque forme d'onde, la durée moyenne en secondes des piqûres complètes et incomplètes par moustique, ainsi que la comparaison statistique de la durée des formes d'onde en secondes par insecte (WDI), du nombre d'événements de formes d'onde par insecte (NWEI) et de la durée des formes d'onde en secondes par événement par insecte (WDEI) entre les différents réglages27. Des moustiques ont également été interrompus pendant différentes formes d'onde puis disséqués afin de déterminer quelle forme d'onde était corrélée à l'ingestion de sang27. Une étude similaire a été réalisée pour Ae. aegypti en utilisant une méthodologie comparable26.

En raison de la nature sensible et délicate de l'EPG, tous les enregistrements n'étaient pas aussi impeccables que ceux présentés dans la Figure 4. Des pics (Figure 3A,C), des changements de gain du matériel (Figure 3A,C), des branchements médiocres (Figure 3B), un repliement du redresseur dans la forme d'onde J (Figure 3C,C') et des bruits électriques (Figure 3C,C') ont parfois déformé ou masqué les formes d'onde, les rendant inappropriées pour des figures de qualité de publication et rendant le codage et l'analyse difficiles. Par conséquent, il est recommandé de consacrer un effort initial à perfectionner les compétences en câblage, optimiser les réglages de gain et de tension, ajuster le décalage (offset) et maîtriser le bruit électrique. Curieusement, le repliement du redresseur n'a été observé que dans la famille de formes d'onde J pour Cx. tarsalis (Figure 3C,C') et n'est pas réapparu une fois le décalage initialement corrigé, même lorsqu'on a utilisé d'autres espèces de moustiques (Ae. aegypti et Culex quinquefasciatus) (données non montrées). En outre, le diagnostic a révélé que le bruit électrique non contrôlé illustré dans la Figure 3 (panneaux C et C') provenait d'une cage de Faraday défectueuse. Les enregistrements réalisés dans cette cage de Faraday défectueuse étaient encore utilisables, mais les problèmes de bruit ont été résolus lorsqu'une cage de Faraday améliorée a été construite (Figure 1B).

Même lorsque toutes les précautions et optimisations initiales ont été prises, de légères variations dans la qualité de l'attachement de l'électrode au moustique et d'autres facteurs inconnus qui déformaient le signal et modifiaient périodiquement le rapport signal sur bruit rendaient nécessaire l'ajustement du gain matériel en cours d'enregistrement, afin de s'assurer que le signal restait dans la plage visible et que la résolution des pics dans chaque onde était suffisante pour l'identification et la caractérisation des formes d'onde. Malheureusement, ajuster le gain matériel en cours d'enregistrement peut entraîner des changements brusques de tension (Figure 3A, C), ce qui rend les formes d'onde inadaptées à la publication, mais encore utilisables (en totalité ou en partie) pour les mesures et l'analyse.

Diagrammes d'équilibre statique montrant l'analyse des forces ; les graphiques mettent en évidence les équations ΣFx=0, ΣFy=0.
Figure 4 : Formes d'onde représentatives d'une sonde de Culex tarsalis sur une main humaine, enregistrées avec une Ri de 107 Ω à l'aide d'un signal appliqué de 250 mV CA. Les noms des formes d'onde au niveau familial (NP, J, K, L, M, W) sont indiqués en haut de chaque panneau. Les panneaux inférieurs montrent des agrandissements de régions sélectionnées du panneau A. Les panneaux insérés montrent des agrandissements des régions indiquées. Les échelles de temps et les gains logiciels sont : (A) 7,0 s/div, 16x ; (B) 1,0 s/div, 64x ; (B') 0,2 s/div, 64x ; (C) 1,0 s/div, 64x ; (C') 0,2 s/div, 32x ; (D) 1,0 s/div, 64x ; (D') 0,2 s/div, 64x. Abréviations : CA = courant alternatif, Ri = résistance d'entrée, mV = millivolt, Ω = ohms, s/div = secondes par division. Cette figure a été préparée à partir de données de Cooper et al.27. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Discussion

Lors de l’utilisation de l’EPG AC-DC, il est essentiel d’avoir une compréhension de base du fonctionnement matériel et logiciel30 et de suivre attentivement les protocoles décrits dans le présent document pour éviter d’endommager l’équipement. Plus particulièrement, évitez de toucher l’ampli de tête lorsqu’il est allumé, à moins qu’il ne soit mis à la terre sur la cage de Faraday. Il est recommandé d’enregistrer le plus loin possible dans la cage de Faraday30. Les portes de la cage n’ont pas nécessairement besoin d’être fermées pour obtenir des formes d’onde interprétables, sauf si elles enregistrent dans un environnement où le bruit électrique ambiant est excessif. Rien de motorisé ne peut se trouver dans la cage de Faraday. Il est important de noter que la cage de Faraday elle-même doit être mise à la terre électriquement uniquement par l’ampli de tête pour qu’elle fonctionne correctement. Ceci est accompli en connectant l’ampli de tête à un support de laboratoire en métal avec la peinture poncée d’un pied du support pour permettre un chemin conducteur pour que l’électricité capturée par la cage de Faraday s’écoule vers le support de laboratoire, dans le boîtier métallique de l’ampli de tête, le long du cordon jusqu’au boîtier de commande, par l’alimentation électrique dans une prise murale correctement mise à la terre, et dans la terre par le soldu bâtiment 30. Un multimètre peut être utilisé pour vérifier la qualité de la connexion entre les composants à l’intérieur de la cage en mesurant la résistivité (qui est l’inverse de la conductivité) entre différents points. Une radio AM sans fil peut également être placée à l’intérieur de la cage de Faraday pour vérifier que le son est considérablement réduit (ou idéalement éliminé) lorsque les portes sont fermées, confirmant ainsi que la cage de Faraday capte correctement les signaux électriques aéroportés (E. Backus per. Comm.).

Une préparation correcte et normalisée de la colle à l’argent et la fixation des électrodes d’enregistrement aux insectes sont essentielles pour obtenir des enregistrements utilisables. La cuticule de l’insecte est un isolant et agit comme un condensateur si la colle d’argent ne pénètre pas adéquatement dans les pores de la cuticule pour créer une voie permettant à l’électricité de voyager de l’intérieur de l’insecte vers le fil d’or à la surface du pronotum30. Préparez la colle à argent en même temps avant chaque séance d’EPG, travaillez avec de la colle à argent fraîche du tube et remplacez-la fréquemment par de la colle à argent vigoureusement vortexée pendant la procédure de câblage. Assurez-vous que la boucle dorée est positionnée contre le thorax de sorte que toute la boucle soit en contact avec la cuticule et non inclinée d’un côté ou séparée par une épaisse couche de colle argentée et des écailles pour aider à former une connexion électrique solide et empêcher le moustique de se détacher et de s’échapper du fil.

Les protocoles décrits ici doivent être optimisés lorsque l’on travaille avec différentes espèces de moustiques. Les paramètres EPG optimaux (niveau Ri, tension, type de courant et gain matériel) pour l’enregistrement sur un arthropode donné doivent être déterminés expérimentalement12,30. Cependant, une fois le décalage ajusté, il n’aura pas besoin d’être réajusté lorsque vous travaillez avec des moustiques similaires. Des réglages optimaux ont été déterminés pour l’EPG AC-DC avec Ae. aegypti26 et Cx. tarsalis27. Les bibliothèques de formes d’onde (définies dans le tableau 2) pour d’autres espèces faciliteront l’adoption de l’EPG pour les moustiques. Il est également nécessaire d’optimiser l’anesthésie du moustique d’intérêt, car le comportement d’alimentation sanguine peut être affecté différemment en fonction de l’espèce de moustique et du choix de l’anesthésie. Par exemple, Cx. tarsalis nécessite une période de récupération de 4 h après 15 min d’anesthésie avec du CO2, tandis que pour Ae. aegypti, une période de récupération de 15 min est suffisante après une période d’anesthésie de 15 min avec de la glace. Les Culex tarsalis, cependant, sont difficiles à éliminer avec une exposition au froid, de sorte que le CO2 est principalement utilisé malgré la longue période de récupération.

Bien que le moniteur EPG AC-DC soit simple à utiliser après avoir examiné les ressources en ligne30,31 ou suivi d’une formation avec un utilisateur expérimenté, un certain dépannage est nécessaire. Initialement, les enregistrements EPG de l'auteur des sondes de moustiques présentaient une onde de signe inattendue de 11 Hz dans le pré-signal qui n'avait pas été observée ou signalée par Wayadande et ses collègues26. Des consultations avec E. Backus ont révélé que la cage de Faraday était probablement le problème en raison de l’interférence des boucles de terre. Une nouvelle cage de Faraday construite à partir d'un écran en cuivre hautement conducteur relié à un cadre en aluminium boulonné à une grande plaque de sol en aluminium soutenue par des pieds en caoutchouc pour l'isoler de la table ci-dessous (Figure 1B), a résolu le signal de bruit de 11 Hz (Figure 3C,C'). De plus, parfois, lorsque l’alimentation EPG était allumée pour la première fois, les signaux de pré et post-rectification apparaissaient sous la forme de lignes épaisses et floues au lieu de lignes droites, lisses et minces. Ce problème était généralement résolu en éteignant l’instrument et en vérifiant toutes les connexions du cordon. En cas d’échec, débrancher l’instrument pendant 1 à 3 minutes aidait généralement. Très rarement, les pré et post-signaux deviennent épais et flous pendant le fonctionnement, ce qui a été résolu en éteignant l’instrument et en le branchant sur une autre prise ou en utilisant un régulateur de tension et un conditionneur de puissance pour brancher l’EPG avant de le connecter au mur. Idéalement, une ligne dédiée pour le moniteur EPG permettrait d’éliminer le bruit de ligne provenant des réfrigérateurs et autres équipements branchés sur le même circuit électrique que l’EPG30.

Actuellement, il y a deux limites principales à l’utilisation de l’EPG pour étudier les moustiques. Tout d’abord, peu d’études de corrélation ont été réalisées pour vérifier quels comportements de sondage correspondent aux formes d’onde. Bien qu’il existe de fortes hypothèses sur ce qui se passe au cours de chaque famille de formes d’onde (tableau 1) et de certains types de formes d’onde (M1 et M2), peu de ces hypothèses ont été confirmées expérimentalement, sauf que l’ingestion de sang est corrélée à la famille de formes d’onde M26,27. Plus important encore, les formes d’onde correspondant aux événements de salivation doivent être identifiées, car de nombreux agents pathogènes sont transmis dans la salive. La corrélation des formes d’onde EPG avec les activités biologiques chez les moustiques sera nécessaire pour interpréter de manière significative les différences significatives dans la durée et le nombre de formes d’onde entre les groupes de traitement. Deuxièmement, les taux de sonde et d’ingestion pendant l’EPG peuvent être beaucoup plus faibles que prévu27. Attacher individuellement les moustiques à des fils courts et les placer directement sur l’hôte pourrait empêcher les comportements de recherche d’hôte et d’alimentation sociale à longue distance, qui peuvent affecter les comportements de sondage et d’ingestion. Les insectes correctement câblés peuvent marcher et voler normalement. Pourtant, les moustiques tirent souvent contre les fils et s’emmêlent parfois ou se tiennent à des angles anormaux, ce qui indique que le fait d’être câblé affecte leur comportement dans une certaine mesure. Les auteurs ont testé de nombreuses stratégies pour améliorer les taux de sondage pendant l’EPG, et le jeûne des moustiques pendant la nuit, en utilisant des individus plus âgés, en les exposant à l’haleine humaine immédiatement avant de les placer sur la main et en appliquant de la salive humaine sur la main étaient les plus efficaces, ainsi que l’utilisation d’hôtes qui ajustaient constamment à petite échelle la position de leur main pour s’assurer que le moustique était dans la position idéale pour sonder27.

Malgré ces limitations, l’EPG AC-DC présente de nombreux avantages par rapport aux autres approches pour étudier les comportements de sondage et d’ingestion. Des systèmes tels que le BiteOScope11, le flyPAD15 et la plate-forme automatisée de biomatériaux14 qui ont été conçus pour quantifier les comportements de sonde et d’ingestion et les sécrétions salivaires pendant l’alimentation sanguine utilisent des substrats artificiels transparents et des régimes liquides qui n’ont pas de systèmes tissulaires hôtes normaux et de signaux de l’hôte. Bien que ces plates-formes synthétiques soient utiles à de nombreuses fins expérimentales, un avantage évident de l’EPG AC-DC est la capacité d’étudier les comportements de ces arthropodes et les variables d’intérêt au sein des systèmes hôtes naturels. De plus, l’adaptabilité définie par l’utilisateur du système EPG AC-DC offre un avantage supplémentaire par rapport aux autres instruments EPG22,33 et aux dispositifs de surveillance électronique de type EPG16,21, qui n’ont pas de niveaux Ri réglables, de types de courant et de niveaux de tension nécessaires pour obtenir des formes d’onde avec le maximum d’informations et minimiser les effets indésirables sur un large éventail d’hôtes et d’arthropodes22, 23. Épisode 23 Les techniques d’électromyographie (EMG) sont également utilisées pour étudier l’alimentation sanguine. Cependant, le circuit électrique n’inclut généralement que l’arthropode et seuls les potentiels musculaires les plus proches de l’électrode d’enregistrement sont enregistrés, de sorte que les formes d’onde ne fournissent pas d’informations sur les activités détaillées se produisant à l’interface hôte-insecte comme les ruptures cellulaires, les emplacements et les activités du stylet, et les potentiels de diffusion à travers les pièces buccales28,34. Les techniques de microscopie intravitale peuvent être utilisées pour visualiser directement les mouvements et les activités des pièces buccales dans les tissus de l’hôte vivant, mais ces techniques impliquent des procédures invasives sur des modèles d’animaux vivants9. Seul le moniteur EPG AC-DC peut fournir des informations très détaillées en temps réel sur les comportements de sondage, d’ingestion et de salivation qui se produisent dans les tissus vivants opaques de l’hôte sans avoir besoin de procédures invasives et est adaptable pour une utilisation dans une grande variété d’arthropodes10,12.

Il s’agit de la première procédure détaillée étape par étape pour câbler les moustiques, construire un aspirateur d’insectes et effectuer l’EPG sur des hôtes humains. Ces protocoles devraient faciliter l’adoption de l’EPG AC-DC sur les moustiques se nourrissant d’hôtes humains. Des exemples d’efforts de recherche futurs utilisant l’EPG AC-DC pourraient inclure des études sur les mécanismes fondamentaux de l’alimentation sanguine et des lésions tissulaires de l’hôte10, y compris l’identification de séquences stéréotypées de comportements de sondage précédant l’ingestion de sang, l’étude du flux sanguin à travers les pièces buccales et la comparaison de la plasticité alimentaire au sein et entre les espèces d’arthropodes/stadesde développement 26. L’EPG peut également être utilisée pour quantifier les effets des insecticides, des antidigents et des répulsifs12. Les procédures présentées ici pour l’utilisation de l’EPG AC-DC pour étudier les moustiques sur les mains humaines accéléreront ces études et permettront de nouvelles perspectives sur la biologie des mangeurs de sang des moustiques.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer. La mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux dans cette publication est uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et n’implique pas une recommandation ou une approbation par le ministère américain de l’Agriculture. Les conclusions de ce rapport sont celles des auteurs et ne représentent pas nécessairement les points de vue de l’USDA.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants au professeur Astri Wayadande de l’Université d’État de l’Oklahoma d’avoir été le pionnier de la procédure de câblage pour les moustiques, ainsi qu’au Dr Elaine Backus de l’USDA-ARS à Parlier, en Californie, et à M. Andrew Dowell d’EPG Technologies Inc. à Gainesville, en Floride, pour leur aide au dépannage de l’équipement EPG. Nous remercions également le Dr Dustin Swanson et M. William Yarnell de l’USDA-ARS Insectary à Manhattan, KS, pour avoir fourni des moustiques, et Mlle Miriam Ruhinda de l’Université d’État du Kansas à Manhattan, KS pour son aide dans le tournage des vidéos procédurales. Ce travail a été rendu possible grâce à l’accès à l’Integrated Molecular Entomology Core (IEMC) de l’Université d’État du Kansas. Cette recherche a été financée par l’USDA Research, Education, and Economics Workforce Development Agreement (#58-3022-0-002) et le Hatch Multistate Project (NE1943). Ce manuscrit est la contribution n° 24-194-J de la Kansas Agricultural Experiment Station, Kansas State University, Manhattan, KS, États-Unis.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Instrumentation
Électropénétrographe 4 canaux AC-DCEPG Technologies, Inc.Pour EPG, comprend l’alimentation, le boîtier de commande, le boîtier d’interface de commutation, quatre amplificateurs d’étage principal, quatre sondes de tension de substrat et les cordons associés
Coussins d’airAmazon.compour que l’hôte humain puisse reposer sa main/son bras pendant l’EPG
DI-710 Matériel d’acquisition de données (carte AD)DATAQ Instruments Inc.pour numériser les signaux EPG analogiques afin qu’ils puissent être visualisés sur un ordinateur
Lampe loupe LED à intensité variable, grande loupe mains libres 5X avec lumière et support pour la lecture Loisirs Artisanat Atelier de coutureAmazon.compour l’observation comportementale pendant EPG ; utiliser uniquement débranché pendant EPG ou du bruit peut résulter
Microscope numérique Dino-Lite Edge (grossissement 250x)Dino-LiteAF4915ZTpour l’observation comportementale pendant l’EPG
Dino-Lite Flex-arm Desktop StandDino-LiteMS22Bpour tenir et manipuler la caméra
Eisco Steel Rekh Base Stand and RodFisher ScientificS41740pour tenir l’amplificateur de l’étage supérieur et mettre à la terre la cage de Faraday (doit être en métal)
Atelier en ligne EPGUF IFAS Extensionhttps://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022AKA, « ressources en ligne » pour l’apprentissage de l’EPG (mise en place d’instruments, collecte et analyse de données, construction de Faraday, préparation de colle d’argent, construction de talons d’insectes, etc.)
Furman P-1800 AR Régulateur de puissance/Conditionneur de puissanceAmazon.compour réduire le bruit
de ligne Enveloppe d’amortissement à petites bullesAmazon.compour une utilisation comme barrière entre l’hôte et la cage de Faraday
Troemner Talboys Labjaws Regular Clamp HolderFisher Scientific02-217-121pour maintenir l’amplificateur de tête et mettre à la terre la cage de Faraday (doit être en métal et non recouverte de plastique)
Ordinateur WindowsBest Buypour l’EPG et l’analyse statistique
Software
Backus 2.0 Data Analysis SAS program  ;UF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/pour l’analyse statistique des données de forme d’onde
Ebert 1.0 File Manipulator and Error Checker Programmes SASIFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/pour la préparation de fichiers pour l’analyse statistique des données de forme d’onde
SAS version 9.4SAS Institute Inc.pour l’analyse statistique des données de forme d’onde
WinDaq Lite  ;DATAQ Instruments Inc.pour l’enregistrement et la révision des données EPG.  ; Comprend le logiciel WinDaq Hardware Manager (AKA, « logiciel de gestion matérielle ») et le logiciel WinDaq Waveform Browser (AKA, « logiciel de révision de forme d’onde »). Pour une utilisation sur les ordinateurs Windows uniquement.  ;
Cage de Faraday
Screen frameHome DepotMSCF5167pour les parois de la cage de Faraday Tôle d’aluminium
, 0,125 (1/8) d’épaisseur 3003-H14Metals DepotS318pour la base de la cage de Faraday
Bretelles d’angle, 1"  ;Home Depot339547pour les parois de la cage de Faraday
Vis à métaux Phillips à tête plate, #6-32 x 1Depot459999pour la construction de la cage de Faraday
Rondelles plates, #6 ;Home Depot638977pour la construction de la cage de Faraday
multimètre numérique Fluke 15B+, pour applications électriques, mesure les mesures de tension et de courant AC/DC jusqu’à 1000 V et 10 A, ainsi que les capacités de résistance, de continuité, de diode et de capacitéAmazon.compour tester la cage de
FaradayRadio portable AM FM, radio à transistors Goodes avec haut-parleur, prise casque, radio à piles 2AA pour une réception longue portée, radio de poche pour l’intérieur, l’extérieur etles Amazon.compour tester la cage de Faraday
Écran en cuivre pur, maille 16 x 16 avec un diamètre de fil de 0,11, écran Metropour les parois de la cage de Faraday
Vis à métaux combinées à tête ronde, #6-32 x 3/4Home Depot528466pour la construction de la cage de Faraday
Papier de verre, 1/2 » par 1 », 150 GrainHome Depot19036-20-CCpour enlever la peinture du bas du support de laboratoire Coins du cadre de l’écran
, 5/16"  ;Home DepotWCORN516pour les parois de la cage de Faraday
Screen spline, 0,14"  ;Home Depot3034719pour les parois de la cage de Faraday
Insect Stubs
Brass Escutcheon PinsHome Depot801294pour la construction de stubs d’insectes  ;   ;
Fil de cuivre, 20 AWGAmazon.compour la construction de talons d’insectes  ;   ;
Grippe hydrosoluble Harris  ;Home Depot355398pour aider à souder le fil de l’embout d’insecte et former une connexion solide
Pince à bec effiléHome Depotpour plier le fil lors de la construction d’embouts
d’insectes Pro’s Kit 900-015 Helping Hands Aide au soudage Amazon.compour tenir les broches de l’écusson pendant le soudage
Soudure (avec noyau en colophane)Home Depot296497pour la construction de souches d’insectes  ;   ;
Outil de dénudageHome Depotpour dénuder et couper le fil de cuivre lors de la construction de souches d’insectes
YIHUA 928D-III, 110W haute puissance, entièrement numérique Fer à souderAmazon.compour la construction de souches d’insectes ; livré avec un support, une éponge et de la laine d’acier pour le nettoyage
Insect Aspirator
Accuris ASPIRE Laboratory AspiratorInstruments AccurisV0020pour l’application d’une aspiration sur l’aspirateur d’insectes ; comprend le contrôleur de vide portable, l’adaptateur en acier inoxydable à pointe fine (40 mm) et l’adaptateur de pointe de pipette
Pipettes Pasteur Chemglass Life Sciences, 5 3/4" de longFisher Scientific NC0230004pour une utilisation comme aspirateur d’insectes lors du câblage des
moustiquesRuban électrique commercial en vinyle coloréHome Depotpour fixer la pipette Pasteur modifiée à la conduite de vide
Tissu utilitaire de moustiquaire, 10 x 10 cm carrésJoann Fabrics16651622pour empêcher les moustiques d’être aspirés dans la pompe à vide
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16Fisher Scientific50-206-8914pour une commutation rapide et facile entre différentes pipettes Pasteur modifiées
Thermo Scientific Nalgene HDPE Quick Disconnects (3/8 à 7/16 po. D.I.)Fisher Scientific15-315Bpour une commutation rapide et facile entre différentes pipettes Pasteur modifiées
Silver Glue  ;
Elmer’s Glue-All Colle blanche polyvalenteAmazon.compour la préparation de la colle à l’argent
Silver Flake pur à 99,9 %, 4-8   ; 4-8   ; mThermoFisher786.09pour la préparation de la colle à l’argent
Silver Flake pur à 99,95 %, 8-10 & micro ; mInframat Advanced Materials47MR-12Fpour la préparation de la colle à l’argent
Insect Anesthesia
CO2 bubbler kit, 1000 mL, #9 RubberStopper FlyStuff59-181pour prévenir la dessiccation des insectes lors de l’utilisation du
flypad Flypad  ; cadre, taille standardFlyStuff59-118pour empêcher les moustiques de tomber du tapis anti-mouches
Flystation BrushFlyStuff59-205pour réduire l’électricité statique lors du travail sur un coussin anti-mouches
Flystuff  ; Coussin anti-mouches  ; taille standardFlyStuff59-114AKA « tampon d’anesthésie » pour anesthésier les moustiques
Entonnoir (4 pouces de diamètre)Amazon.compour gazer des tasses de moustiques avant de les transférer sur le coussin anti-mouches
Verre plexi ou un couvercle plat en plastique (coupé à la bonne taille)Home DepotMC-27pour couvrir le coussin anti-mouches si les moustiques commencent à se réveiller
Colliers de serrage de tuyau en plastique à position unique et ouverts (variété 1/8 » à 1/2 »)Amazon.compour dévier le gaz entre le coussin de vol et l’entonnoir
Régulateur de CO2 à un étageFlyStuff59-142pour réguler le débit de gaz du réservoir de CO2
T” Raccord pour tube 1/8 po IDFlyStuff59-123pour connecter à la fois le coussin de protection et l’entonnoir au réservoir de CO2
Tubing, transparent.FlyStuff59-124Cpour connecter l’entonnoir et le coussin anti-mouches au régulateur du réservoir 2
Insect Wiring
Black, (65Lb, 176 g/m2) 8,5 » x 11"Michael’s Stores Inc.327826pour rendre le fil d’or plus facile à visualiser
Papier de construction noir carré 3,5 « x 4,0 » Agrafes956221pour rendre le fil d’or plus facile à visualiser
Boules de cotonAmazon.compour les moustiques à jeun
Bloc de mousse d’artisanat #12 (3,1 cm x 17,2 cm x 30,2 cm)Joann Tissu et artisanat Store1941079pour tenir les moustiques filaires
Ruban Deflecto Distributeur,Amazon.compour ranger le fil d’or
Pince d’entomologie poids plumeFisher ScientificS72110pour la manipulation des insectes
Pince fine (FST de Dumont : #5 91150-20, Inox-Electronic)Outils de sciences fines91150-20pour faire une boucle dorée lors du câblage des moustiques
Pinceau à pointe fineAmazon.compour manipuler les moustiques pendant le câblage et l’EPG ; doit avoir un manche en plastique ou en bois s’il est utilisé pour EPG
Pipettes de transfert standard à pointe fine, étroites, 5,8 mLThomas Scientific7761D21pour la préparation de la colle à l’argent Fil
d’or, pur à 99,99 %, 0,025 mm d’épaisseurGoodfellowAU005121pour le câblage des moustiques
Broches Minutien, pointe 0,2 mm, 1 cmScientificNC9681411pour appliquer de la colle sur les moustiques
Gobelets en papier  ;en papier rigidepour les moustiques à jeun  ;   ;   ;
Étau à goupilleFisher Scientific50-996-811pour maintenir la goupille minutien pendant le câblage des insectes
Boîte de rangement en plastique avec couvercle (7 pouces x 9 pouces x 14 pouces)Amazon.compour le transport des moustiques grillagés
Verre plexi ou couvercle plat en plastique (coupé à la bonne taille)Home DepotMC-27pour couvrir le coussin anti-mouches si les moustiques commencent à se réveiller
Pince à fermeture automatiqueFisher Scientific08-906pour tenir et manipuler le fil d’or
Compressed Gas
CO2 Réservoir gasMatheson Gaspour anesthésier les moustiques avec un coussin anti-mouches
Common Lab Items
Sacs d’autoclave jetables pour risques biologiques, 8 1/2 » x 11Fisher Scientific03-410-591pour l’élimination des moustiques nourris au sang
Bec Bunsen ou torche au propaneAmazon.compour la modification des pipettes Pasteur
Ruban de laboratoire coloréDaigger FournituresEF9763Rpour l’étiquetage, la préparation de la colle argentique et les pinces de masquage
Pointes de pipette jetables, 1000 & micro ; LFisher Scientific  ;pour l’aliquotage de l’eau lors de la fabrication de la colle d’argent Microscope
dissectionLeica Microsystemspour le câblage des moustiques
Sonde de dissectionFisher ScientificNC9109673pour l’agitation et l’application de colle d’argent
Fiole Erlenmeyer, 1000 mLFisher Scientific  ;pour prévenir la dessiccation des insectes lors de l’utilisation du tapis anti-mouches
Éthanol, 70 %  ;Fisher Scientific04-355-122pour la récupération des moustiques échappés Boîtes
Pétri en verreFisher Scientific08-747Bpour l’anesthésie des moustiques avec de la glace
GantsFisher Scientificpour la protection individuelle
Kimwipes Essuie-glaces de la marque KimTech Science  ;Fisher Scientific06-666pour écraser les moustiques Blouses
de laboratoireFisher Scientificpour la protection personnelle
Flacons pulvérisateurs LiBa, flacons pulvérisateurs vides rechargeables (sans danger pour l’alcool à frictionAmazon.compour récupérer les moustiques échappés Barre d’agitation
magnétique, 2 cm de longFisher Scientific  ;pour mélanger la colle argentée
Pipette mécanique monocanal, 1000 & micro ; LFisher Scientific  ;13-690-032pour l’aliquotage de l’eau lors de la fabrication de colle à argent
Tubes de microcentrifugation, 1,5 mLFisher Scientific  ;780420pour le stockage de la colle argentée
Parafilm M  ;Fisher Scientific50-998-944pour sceller les tubes de colle à l’argent
Pellicule plastiqueAmazon.compour recouvrir le bloc de mousse
Bécher en Pyrex 20 mLFisher Scientific  ;07-250-051pour mélanger la colle d’argent
Semi-Micro BalanceFisher Scientific  ;10-919-370pour peser la colle et les flocons d’argent
Stylo Sharpie, pointe fineAmazon.compour l’étiquetage
Lame de rasoir à un seul tranchantMicroscopie électronique Sciences71980pour le nettoyage des souches d’insectes
Pipettes de transfert jetables standardFisher Scientific  ;133-711-7mLpour transférer la colle d’argent dans un tube de stockage  ;
Plaque à mélangerFisher Scientific  ;pour mélanger de la colle argentée
Minuterie/chronomètreFisher Scientificpour chronométrer la durée d’exposition de l’hôte à chaque insecte
Eau ultrapure (18 M&Omega ;)Fisher Scientific  ;pour la préparation de la colle à l’argent
Ciseaux utilitairesFisher Scientific08-945pour couper le fil d’or
Mélangeur vortexFisher Scientific  ;pour mélanger de la colle argentée
< strong>Study Organisms
Culex tarsalis moustiquesUSDA ARS Center for Grain and Animal Health Research à Manhattan KSpour utilisation comme sujets d’étude
Set UF "Home Le d’urgence de 36 "x 12 '" transparent Fisher Tube "de de

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