Method Article

Procédures de culture in vitro de Treponema pallidum, le spirochète syphilis

DOI:

10.3791/66880

⸱

January 24th, 2025

 ,  , 
1University of Texas Health Science Center at Houston - McGovern Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit la culture in vitro de l’agent pathogène de la syphilis Treponema pallidum subsp. pallidum en co-culture avec des cellules de mammifères. La méthode est évolutive ; il peut être utilisé pour produire de grandes quantités de T. pallidum et pour générer des cultures clonales.

Abstract

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Pendant plus d’un siècle, Treponema pallidum subsp. pallidum, la bactérie en forme de spirale qui cause la syphilis, n’a pu se propager que par inoculation et récolte des organismes à partir de testicules de lapin. En 2018, nous avons décrit une méthode pour cultiver en continu T. pallidumin vitro. Ce système utilise la co-culture avec des cellules épithéliales de lapin (cellules Sf1Ep) dans un milieu de culture tissulaire contenant du sérum appelé TpCM-2. Le temps de doublement de T. pallidum en culture est similaire à celui estimé lors d’une infection naturelle (environ 33-45 h). L’organisme peut être cultivé en continu avec un temps de passage standard de 1 semaine dans un environnement à faible teneur en oxygène (1,5%) à 34 °C. Cet article contient les protocoles de culture de T. pallidum, les méthodes de croissance et de maintien des cellules de culture tissulaire requises, et la technique de génération de souches isogéniques en limitant la dilution. La possibilité de cultiver T. pallidum in vitro offre de nouvelles pistes expérimentales pour étudier et comprendre cet organisme énigmatique.

Introduction

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Treponema pallidum est une espèce de bactérie en forme de spirale (appelée spirochètes) qui cause la syphilis et des infections connexes chez les humains et d’autres primates. La syphilis est une maladie grave qui a des effets à long terme sur les personnes infectées, et on estime que plus de 8 millions de nouveaux cas de syphilis surviennent chaque année dans le monde1. T. pallidum a été subdivisé en trois sous-espèces en fonction des maladies qu’elles causent chez l’homme ainsi que de différences génétiques mineures : la sous-espèce pallidum (qui cause la syphilis, une maladie sexuellement transmissible), la sous-espèce pertenue (pian) et la sous-espèce endémique (qui cause la syphilis endémique)2,3. T. pallidum subsp. pertenue provoque également des infections chez les babouins, les chimpanzés et d’autres primates. Un organisme étroitement apparenté appelé Treponema paraluiscuniculi (également appelé Treponema paraluisleporidarum) provoque une infection chez les lapins et les lièvres 4,5. Toutes ces bactéries sont très étroitement liées, avec plus de 98% d’identité de séquence d’ADN au niveau 6,7,8 du génome. Ils ont chacun un seul petit chromosome circulaire d’environ 1,14 million de paires de bases (Mb) de taille. Les membres de ce groupe de T. pallidum ne se trouvent qu’en association avec leurs hôtes mammifères ; En tant que tels, ils sont des agents pathogènes obligatoires qui dépendent de leur espèce hôte pour leur survie et leur croissance 9,10.

Les tentatives d’élevage in vitro de T. pallidum ont commencé peu de temps après son identification par Schaudinn et Hoffman en 190511,12. Cependant, ces efforts n’ont pas permis d’obtenir une croissance cohérente et reproductible de l’organisme. En conséquence, les études de recherche sur T. pallidum ont nécessité la propagation de l’organisme par l’infection expérimentale d’animaux de laboratoire, le plus souvent le lapin13,14. En 1981, Fieldsteel et al.15 ont introduit un système de culture tissulaire qui favorisait la multiplication des souches de T. pallidum pendant une période pouvant aller jusqu’à 2 semaines. Ce système impliquait une co-culture de T. pallidum avec des cellules épithéliales de lapin à queue blanche Sf1Ep dans un milieu de culture tissulaire modifié (T. pallidum Culture Medium 1, TpCM-1) basé sur le milieu essentiel minimum (MEM) d’Eagle et 20 % de sérum de bovin fœtal (FBS). D’autres conditions de culture requises étaient l’incubation à 34 °C dans une atmosphère contenant 1,5 % d’O2 et 5 % de CO2 9,16. Dans ce système, T. pallidum se fixe aux cellules Sf1Ep et se multiplie lorsqu’il est en association étroite avec la surface cellulaire des mammifères. Malgré de nombreuses tentatives de sous-culture et d’autres modifications, le système de Fieldsteel et al. n’a pas réussi à promouvoir une croissance in vitro continue.

En 2018, notre laboratoire a signalé que l’utilisation d’un milieu modifié appelé TpCM-2 (dans lequel le MEM d’Eagle a été remplacé par un milieu de culture tissulaire plus complexe, CMRL 1066) a fourni à T. pallidum les nutriments nécessaires pour permettre une culture cohérente à long terme17. À ce jour, cette modification a conduit à une culture cohérente et continue d’au moins 5 souches de T. pallidum subsp. pallidum (Nichols, SS14, Mexico A, UW231B et UW249B) et d’une souche de T. pallidum subsp. endemicum (Bosnia A)18,19. À titre d’exemple, la souche Nichols a été cultivée en continu in vitro pendant plus de 6 ans. Jusqu’à présent, les tentatives de culture d’isolats de pian (T. pallidum subsp. pertenue) ou de T. paraluiscuniculiin vitro ont été infructueuses18. Le système TpCM-2 nécessite toujours la présence de cellules Sf1Ep, de faibles concentrations d’oxygène et une incubation à 34 °C, ce qui rend le système plus complexe que la plupart des techniques de culture bactérienne. Cependant, ce système de culture de T. pallidum modifié s’est avéré utile pour mieux définir les besoins de croissance de la bactérie18, déterminer les concentrations minimales inhibitrices (CMI) de composés antimicrobiens et de peptides 20,21,22,23,24,25, propager de nouvelles souches à partir d’échantillons de tissus de patients26, isoler les populations clonales de organisme27, caractérisant le système de variation antigénique tprK 27,28, examinant l’expression génique29 et effectuant une analyse mutationnelle 30,31,32.

Nous décrivons ici les méthodes actuelles de culture de T. pallidum in vitro. Nous espérons que ces informations faciliteront l’application plus répandue de cette technique de culture in vitro à l’amélioration du diagnostic, du traitement et de la prévention de la syphilis et des infections tréponémiques connexes.

Protocol

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REMARQUE : Toutes les étapes nécessitent l’utilisation d’une technique aseptique et de matériaux et réactifs stériles. L’utilisation d’une hotte à flux laminaire pour la culture tissulaire est recommandée pour réduire à la fois a) l’exposition du personnel aux matières infectieuses et b) la possibilité de contamination microbienne des cultures.

1. Etablissement des stocks de cellules Sf1Ep

REMARQUE : Les cellules épithéliales de lapin à queue blanche Sf1Ep peuvent être achetées sous forme de stocks congelés de la collection de cultures de type américain (voir la table des matériaux). La nature lente de la croissance et le faible taux métabolique des cellules Sf1Ep semblent être la clé de leur capacité à soutenir la survie et la croissance à long terme de T. pallidum33 ; Par conséquent, la substitution par d’autres cultures de cellules de mammifères n’est pas recommandée. Les cellules Sf1Ep ne sont pas une lignée cellulaire immortalisée et ne peuvent être conservées que pendant 25 à 30 passages en culture. Par conséquent, il est important de conserver un stock congelé de cellules Sf1Ep à faible passage pour une utilisation future. Des lignées Sf1Ep immortalisées apparaissent parfois au cours de la culture à long terme des cellules Sf1Ep. (observations non publiées). Ces lignes poussent souvent plus vite et sont plus faciles à manipuler ; cependant, parfois, ils perdent la capacité de soutenir la croissance de T. pallidum . Les lignées Sf1Ep immortalisées peuvent être utilisées, puis remplacées lorsque les spirochètes commencent à croître lentement.

  1. Préparez un milieu cellulaire Sf1Ep et préchauffez-le dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 .
    REMARQUE : Le milieu cellulaire Sf1Ep se compose de MEM d’Eagle complété par 10 % de FBS, 1 x acides aminés non essentiels MEM, 2 mM de L-glutamine et 1 mM de pyruvate de sodium. (voir Tableau des matériaux). Le milieu doit être stérilisé par filtre et peut être conservé à 4 °C jusqu’à 2 mois. Les antibiotiques (tels que la pénicilline et la streptomycine) ne doivent pas être utilisés dans le milieu cellulaire Sf1Ep, car le transfert de quantités même infimes d’antibiotiques interférera avec la croissance de T. pallidum.
  2. Décongelez rapidement le bouillon Sf1Ep congelé à 37 °C. Essuyez l’extérieur du flacon avec de l’éthanol à 70 %.
  3. Ajouter 1 mL de milieu cellulaire Sf1Ep dans le cryoflacon et mélanger délicatement. Ajouter le mélange milieu/stock cellulaire dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 mL contenant 5 mL de milieu cellulaire Sf1Ep et mélanger délicatement.
  4. Granuler les cellules par centrifugation à 100 x g pendant 7 min. Retirez et jetez le surnageant en prenant soin de ne pas déranger la pastille cellulaire.
  5. Remettez doucement en suspension les cellules Sf1Ep décongelées dans 15 mL de milieu cellulaire Sf1Ep frais et transférez-les dans une fiole de culture tissulaire T75.
    REMARQUE : La récupération des cellules Sf1Ep nouvellement décongelées est améliorée par centrifugation pour éliminer le DMSO utilisé pour congeler les cellules. Cependant, les étapes 1.4 à 1.7 peuvent être omises et les cellules décongelées de l’étape 3 peuvent être directement ensemencées dans un flacon de culture tissulaire T75 contenant 14 mL de milieu cellulaire Sf1Ep. Après une nuit d’incubation, remplacer la moitié du milieu par du milieu Sf1Ep frais pour diluer le DMSO résiduel.
  6. Incuber les cultures Sf1Ep dans un incubateur de culture tissulaire humidifié standard à 37 °C, 5% CO2. Desserrez les bouchons des flacons de culture tissulaire non ventilés pour maintenir un pH moyen approprié.

2. Passage des cellules Sf1Ep

REMARQUE : La croissance de la culture cellulaire Sf1Ep est surveillée à l’aide d’un microscope inversé à l’aide d’une optique à contraste de phase. En règle générale, les cellules mettent environ une semaine pour atteindre une confluence proche. Lorsque les cellules atteignent ~90% de confluence, elles peuvent être évacuées, utilisées pour la culture de T. pallidum ou la préparation de stocks congelés. La durée de vie de la culture peut être prolongée jusqu’à deux semaines en remplaçant la moitié du milieu de culture après une semaine de culture.

  1. Aspirez et jetez le milieu de croissance Sf1Ep de la fiole. Rincez la couche cellulaire avec 5 ml de PBS stérile à température ambiante (RT), puis aspirez et jetez le rinçage PBS.
  2. Ajouter 2,5 mL de trypsine-EDTA dans le ballon et fermer le bouchon. Secouez le ballon d’avant en arrière pour recouvrir la couche cellulaire de trypsine-EDTA et incubez le ballon à 37 °C pendant 5 min.
  3. Tapotez doucement le ballon pour déloger les cellules. Observez au microscope inversé pour confirmer la dispersion des cellules Sf1Ep.
  4. Ajouter 5 mL de milieu de croissance Sf1Ep et secouer la fiole pour la mélanger avec la trypsine-EDTA et arrêter l’action de la trypsine. Retirez les cellules Sf1Ep en suspension dans un tube conique stérile.
  5. Quantifiez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.
  6. Pour maintenir les stocks cellulaires en état de marche, transvaser une aliquote (0,5-1,0 mL ou ~8 x 105 cellules) du mélange milieu/trypsine-EDTA/cellule dans un nouveau flacon de culture tissulaire T75 contenant 15 mL de milieu Sf1Ep frais.
  7. Pour la culture de T. pallium , diluer les cellules dans le milieu Sf1Ep à 0,25-0,5 x 105 cellules/mL et les semer dans des récipients de culture appropriés (tableau 1).
  8. Pour congeler des cellules Sf1Ep, faites-les tourner dans une centrifugeuse de table à 100 x g pendant 7 min. Retirez délicatement le surnageant sans déranger la pastille cellulaire. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu Sf1Ep complété par 10 % de DMSO de qualité culture tissulaire.
  9. Répartir 1 mL de suspension cellulaire dans chaque flacon cryogénique et congeler toute la nuit à -70 °C à -80 °C dans un contenant isolé (comme un support de tube à essai en polystyrène) pour améliorer la conservation de la viabilité avant de transférer les flacons dans un récipient cryogénique à azote liquide.

3. Culture de T. pallidum

MISE EN GARDE : Toutes les sous-espèces et souches de T. pallidum sont pathogènes pour les humains et sont classées comme agents pathogènes de niveau de biosécurité 2 (BSL-2)34. Des mesures appropriées sont nécessaires pour protéger le personnel ; il s’agit notamment de l’utilisation de gants et d’autres équipements de protection individuelle (EPI) ainsi que de la désinfection des surfaces, des matériaux et des liquides potentiellement exposés à T. pallidum. T. pallidum est facilement inactivé par l’exposition à de l’éthanol à 70 % ou à des désinfectants disponibles dans le commerce. Il est recommandé d’utiliser systématiquement des hottes à flux laminaire pour la manipulation d’échantillons contenant T. pallidum .

REMARQUE : T. pallidum est un organisme microaérophile qui peut être tué par quelques heures d’exposition aux niveaux atmosphériques d’oxygène 9,16,35. Par conséquent, il est recommandé de limiter la manipulation de T. pallidum dans l’air à moins d’une heure si possible. De plus, le milieu TpCM-2 doit être pré-équilibré en 1,5 % O2, 5 % CO2, équilibre N2, et l’agitation vigoureuse (par exemple, l’utilisation d’un vortex) doit être limitée. Étant donné que la culture de T. pallidum est généralement effectuée en l’absence d’antibiotiques, des précautions supplémentaires sont nécessaires pour éviter la contamination par des bactéries ou des champignons. La procédure Sf1Ep-TpCM-2 pour l’élevage de T. pallidum est résumée à la figure 1 et comprend plusieurs étapes, notamment l’ensemencement des récipients de culture avec des cellules Sf1Ep, la préparation du milieu TpCM-2 et l’inoculation des cultures avec T. pallidum. Le sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur est un composant moyen critique, et son efficacité varie selon les différents fournisseurs et lots19. Il est nécessaire de présélectionner l’efficacité des lots de FBS.

  1. Sélectionnez la taille de culture appropriée.
    REMARQUE : La culture de T. pallidum peut aller de grands formats (tels que2 flacons de 75 cm donnant ~1 x 109T. pallidum par culture) à des plaques de 96 puits (adaptées aux expériences de clonage)17,18,19,27. 
    1. Lors de l’ajustement de la taille de la culture, tenez compte du nombre de cellules Sf1Ep et de T. pallidum inoculées par culture, ainsi que de la quantité de milieu nécessaire, comme indiqué dans le tableau 1. Utilisez des flacons avec des bouchons ventilés car ils permettent la libre circulation des gaz avec une perte de volume réduite due à l’évaporation.
    2. Utilisez le format de plaque à 6 puits pour les cultures initiales, car il est pratique d’inclure des répétitions en trois exemplaires et des puits supplémentaires en cas de contamination microbienne.
  2. Semez les cellules Sf1Ep 1 à 2 jours avant l’expérience.
    1. Préparer une suspension de cellules Sf1Ep par trypsinisation de cultures mères, comme décrit à l’étape 2.7.
    2. Déterminez la concentration de cellules Sf1Ep dans la suspension à l’aide d’un hémacytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.
    3. Ajouter le nombre approprié de cellules Sf1Ep et de milieu Sf1Ep (tableau 1) à chaque culture. Incuber les cultures à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire standard avec 5% de CO2 jusqu’à utilisation.
  3. Préparez TpCM-2 1 jour avant l’expérience.
    REMARQUE : TpCM-2 peut être préparé et stocké à -20 °C pendant plusieurs mois. Le milieu doit être décongelé et équilibré dans l’incubateur à faible teneur en oxygène la veille de l’expérience.
    1. Obtenir des solutions stériles pour les composants du TpCM-2 (tableau 2) dans le commerce ou les préparer à partir de réactifs secs et les stériliser par filtration. Conservez les solutions à 4 °C jusqu’à 2 mois. Ajuster le pH du tampon MOPS à 7,5 avant la stérilisation du filtre ; sinon, il n’est pas nécessaire d’ajuster le pH des composants ou du TpCM-2 final.
      REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser de l’eau distillée stérile de qualité culture tissulaire pour la préparation des composants du milieu.
    2. Combinez les réactifs énumérés dans le tableau 2 dans un récipient stérile, en ajoutant du dithiothréitol (DTT) sous forme de poudre sèche (pour minimiser son oxydation). Augmentez (ou diminuez) les quantités de chaque composant pour préparer la quantité nécessaire de TpCM-2. Mélangez délicatement et filtrez-stérilisez le milieu à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 μm.
    3. Desserrez le couvercle de la fiole contenant le TpCM-2. Pré-équilibrez le fluide en le plaçant dans un bocal anaérobie (Brewer), en l’évacuant et en le remplissant trois fois avec un mélange gazeux à 95% de N2, 5 % de CO2 , puis en le remplissant avec un mélange de gaz à 1,5% O2, 5 % CO2 et en le remplissant à nouveau avec un mélange de gaz à 95 % de N2 après l’évacuation finale. La figure 2 illustre un exemple de système permettant d’effectuer ce processus d’échange gazeux.
    4. Transférez rapidement le fluide dans un incubateur trigaz configuré pour fournir une atmosphère de 1,5 % d’O2, 5 % de CO2 et d’équilibre de l’atmosphère N2 à 34 °C. Alternativement, le bocal anaérobie contenant le milieu peut être scellé après l’échange gazeux décrit au point 3.3.3 et transféré dans un incubateur standard.
  4. Le matin de l’expérience, vérifiez les cultures Sf1Ep à l’aide d’un microscope inversé. Assurez-vous que les cellules sont attachées et que 5 à 10 % sont confluentes. Retirer le fluide de manière aseptique.
  5. Rincez brièvement les puits à l’aide d’un petit volume (0,2 mL à 2 mL, selon la taille du récipient) de TpCM-2 pré-équilibré, retirez le rinçage et ajoutez la quantité appropriée de TpCM-2 (tableau 1). Équilibrer les plaques dans une atmosphère à 1,5 % d’O2, 5 % de CO2 et équilibrer l’atmosphère N2 à 34 °C pendant 3 à 4 h comme décrit précédemment.
  6. Transvasez les plaques dans une hotte à flux laminaire et inoculez avec le nombre approprié (tableau 1) de T. pallidum à partir de stocks congelés ou de préparations trypsinisées à partir de cultures fraîchement récoltées (comme décrit ci-dessous). Des bouillons fraîchement préparés ou congelés prélevés de manière aseptique sur des lapins infectés13 peuvent également être utilisés. Rééquilibrer les plaques comme décrit à la section 3.3.3 et incuber les cultures dans une atmosphère à 1,5 % d’O2, 5 % de CO2 et d’équilibre N2 à 34 °C.

4. Récolte et passage des cultures de T. pallidum

REMARQUE : Étant donné que la majorité de T. pallidum en culture est fixée à la surface des cellules Sf1Ep, il est nécessaire de dissocier les tréponèmes des cellules de mammifères afin de les récupérer et d’obtenir un dénombrement précis des organismes. Cette « récolte » et le passage vers de nouvelles cultures se font généralement au 7e jour de la culture. La procédure décrite ici concerne les plaques à 6 puits ; la quantité de solution trypsine-EDTA utilisée est ajustée à la hausse ou à la baisse en fonction de la taille du format de culture 17,19,27.

  1. Au moment de la récolte, retirez les cultures de l’incubateur. Examinez la couche cellulaire Sf1Ep dans chaque puits à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé et notez la densité cellulaire (p. ex., 80 % de confluent) et l’apparence. Notez également la couleur du TpCM-2 ; l’indicateur de résazurine passe souvent du rose au jaune en raison d’un pH plus bas.
  2. Pipeter le milieu de chaque puits dans un tube conique stérile de 15 ml, en utilisant des pipettes distinctes pour chaque puits afin d’éviter la contamination croisée. Rincez bien chaque pièce avec 0,35 mL de solution préchauffée de trypsine-EDTA et ajoutez le rinçage au milieu.
  3. Ajouter 0,35 mL d’une autre solution de trypsine-EDTA dans chaque puits et incuber la plaque pendant 5 minutes dans un incubateur standard à 37 °C ; une faible atmosphère d’O2 n’est pas nécessaire pendant cette courte période.
  4. Vérifiez l’arrondi et le détachement des cellules Sf1Ep, ce qui est également corrélé avec la dissociation de T. pallidum des cellules de mammifères. Surveillez ce processus à l’aide du microscope inversé et fournissez du temps supplémentaire ou une solution de trypsine-EDTA si nécessaire. Le processus de dissociation est facilité par un coup doux sur le côté de la plaque immobilisée avec un support de tube à essai en plastique ou un objet similaire.
  5. Pipeter le milieu réservé et rincer dans le puits pour récupérer le T. pallidum et les cellules dissociés. Enregistrer le volume total récupéré pour le calcul du rendement par culture.
  6. Dans la plupart des expériences, transférez un volume déterminé de T. pallidum récolté dans des plaques de culture contenant des cellules Sf1Ep fraîches et du TpCM-2. Dans de tels cas, transférez environ 1/20e du volume de culture (par exemple 200 μl pour une culture sur plaque de 4 ml à 6 puits) ; ajustez ce volume à la hausse ou à la baisse selon que la souche T . pallidum a une croissance rapide ou lente. Retirer les cellules Sf1Ep dans l’inoculum par centrifugation à 100 x g pendant 5 min, mais cette étape n’est pas nécessaire pour les transferts de routine.
  7. Immédiatement après l’inoculation des plaques d’une expérience, échangez l’atmosphère dans les plaques en utilisant le procédé d’évacuation et de remplissage (étape 3.3.3). Incuber les plaques à 34 °C dans le bocal Brewer ou les transférer dans un incubateur trigaz.
  8. Dénombrer T. pallidum par microscopie à fond noir à l’aide d’une chambre de comptage Helber ou d’un appareil similaire, en suivant les instructions du fabricant.
    REMARQUE : La chambre Helber est une lame de verre calibrée et une lamelle de recouvrement qui améliore considérablement la précision et la reproductibilité du comptage des bactéries ; La chambre est facilement désinfectée, nettoyée et séchée à l’aide d’éthanol à 70 % et de mouchoirs en papier et peut être réutilisée indéfiniment. Idéalement, le microscope à fond noir devrait avoir un objectif 40x et des oculaires 15x. Effectuez des dénombrements en double pour chaque culture, et notez le nombre de T. pallidum mobiles et non mobiles et tout changement morphologique. La PCR quantitative (qPCR) peut également être utilisée dans les cas où une quantification précise et la détermination de la motilité ne sont pas nécessaires17,24.
  9. Dans les expériences où un traitement à la trypsine peut ne pas être souhaitable (comme celles examinant la teneur en protéines de T. pallidum), utilisez un milieu de dissociation EDTA pour dissocier T. pallidum et la monocouche cellulaire17,19.
    REMARQUE : Le milieu de dissociation est constitué d’un FBS qui a été dialysé contre une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou une solution saline basique d’Earle (EBSS) sans chlorure de calcium ni chlorure de magnésium pour éliminer les cations divalents dans un milieu de culture simplifié de T. pallidum (tableau 2). Cette procédure peut prendre plus de temps (jusqu’à 30 min) ou un traitement répété pour une dissociation complète.

5. Congeler et conserver les cultures de T. pallidum

REMARQUE : T. pallidum peut être stocké indéfiniment à -70 °C ou moins, la viabilité à la décongélation étant généralement de 50 % à 90 %.

  1. Congeler les cultures de T. pallidum au moment de la récolte avec l’ajout de 10 % (v/v) de glycérol. Dispersez le glycérol dans toute la préparation par pipetage doux ou inversion. Ensuite, répartissez la préparation dans des aliquotes de 1 à 2 mL dans des flacons de congélation à bouchon vissé et placez immédiatement les flacons dans un congélateur à -80 °C ou un congélateur liquideN2 .
  2. Pour commencer une culture de T. pallidum à partir d’un stock congelé, préparez d’abord le(s) récipient(s) de culture approprié(s) contenant des cellules Sf1Ep et TpCM-2 comme décrit à la section 3. Décongeler rapidement le flacon contenant le bouillon congelé de T. pallidum  ; à cet égard, l’utilisation prudente d’un bain-marie ou d’un bloc chauffant à 37 °C est utile.
  3. Ensuite, transférez la préparation décongelée dans le(s) récipient(s) de culture. S’assurer que le rapport entre le volume de la pellicule congelée et le milieu Tp-CM2 est de 1:5 ou plus pour assurer une dilution suffisante du glycérol pour favoriser la survie et la croissance de T. pallidum.
  4. Incuber la culture dans des conditions microaérobies pendant 7 jours et transférer dans des cultures fraîches comme décrit dans la section 4.

6. Génération de clones isogéniques de T. pallidum

REMARQUE : Cette procédure est décrite en détail dans une étude antérieure27.

  1. Dans une expérience typique, préparez et pré-équilibrez deux plaques de 96 puits avec 1000 cellules Sf1Ep et 200 μL de TpCM-2 par puits, comme décrit dans la section 3.
    REMARQUE : Une pipette multicanaux de 200 μL et des réservoirs de réactifs jetables stériles compatibles simplifient considérablement les étapes d’inoculation des cellules Sf1Ep, d’échange de milieu et d’inoculation.
  2. Quantifier la concentration de T. pallidum dans une préparation fraîchement récoltée à l’aide d’un microscope à fond noir et d’une chambre Helber (étape 4.8). Diluer la suspension de T. pallidum dans TpCM-2 pour obtenir deux préparations avec des concentrations de 10 tréponèmes/mL et 40 tréponèmes/mL ; 10 mL de chaque préparation sont plus que suffisants pour inoculer une plaque de 96 puits à chaque dilution. Comme témoin, préparer 1 mL d’une autre dilution contenant 2 x 103 T. pallidum/mL.
  3. À l’aide d’une pipette monocanal standard ou d’une pipette multicanaux, inoculer 50 μL par puits de la préparation de 10 T. pallidum/mL dans l’une des plaques préparées à 96 puits, en omettant deux puits témoins. Répétez l’opération avec la préparation 40 T. pallidum/mL et l’autre plaque. Dans les deux puits témoins de chaque plaque, inoculer la dilution 2 x 103 T. pallidum/mL. Ce processus produira des plaques contenant (en moyenne) 0,5 ou 2 T. pallidum par puits, ainsi que des puits de contrôle positif contenant 100 T. pallidum.
    REMARQUE : L’efficacité de placage de T. pallidum est faible dans ces conditions, de sorte que même les puits ensemencés avec ~2 organismes sont susceptibles de produire des populations clonales.
  4. Équilibrez les plaques avec le mélange gazeux à faible teneur en O2 (étape 3.3.3) et incubez-les dans un bocal Brewer ou un incubateur trigaz à 34 °C.
  5. À 7 jours, retirer 100 μL de milieu de chaque puits de culture et le remplacer par 100 μL de TpCM-2 frais et équilibré. Vérifier la viabilité et la croissance de T. pallidum dans les puits témoins par microscopie à fond noir et dénombrement pour s’assurer que les conditions de culture favorisent la multiplication de T. pallidum .
    REMARQUE : Assurez-vous d’utiliser une nouvelle pointe de pipette pour chaque puits afin d’éviter la contamination croisée des cultures clonales.
  6. À 14 jours, transférez 50 μL du surnageant de culture de chaque puits dans des assiettes fraîches préparées comme à l’étape 6.1.
  7. Répétez l’alternance de l’alimentation et du passage au besoin les jours 21 et 28.
  8. Surveiller la présence de T. pallidum dans chaque puits à l’aide de la microscopie à fond noir ou de la qPCR26.
    REMARQUE : Compte tenu de la lenteur de la croissance de T. pallidum et de la perte nécessaire d’organismes pendant l’alimentation et le transfert, les puits ensemencés avec 0,5 ou 2 T. pallidum ne sont généralement pas positifs par l’une ou l’autre méthode jusqu’au jour 28 ou après.
  9. Une fois les puits positifs identifiés, trypsiniser et transférer ces puits sur des plaques de 24 puits pour une expansion supplémentaire. Déterminer la clonalité par la prédominance d’une seule séquence tprK et la présence de séquences uniques sur des sites hétérogènes dans la souche parentale27.

Results

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Dans les conditions décrites, T. pallidum conserve généralement une motilité de >90 % et se multiplie logarithmiquement avec un temps de doublement de 33 h à 45 h pendant environ 7 jours avant d’entrer dans la phase stationnaire (figure 3). Au cours d’une semaine, les spirochètes subissent environ 4 à 5 doublements (Figure 4). ). De plus, différentes souches de T. pallidum peuvent se développer à des rythmes différents. Les souches du groupe SS14 de T. pallidum ont tendance à avoir des temps de doublement plus lents que celles du groupe Nichols17.

L’alimentation des cultures peut prolonger le temps de culture de plusieurs jours, mais la couche cellulaire Sf1Ep échoue souvent après une semaine de culture. De plus, les tréponèmes atteignent une limite supérieure d’organismes d’environ 5 x 107/mL. Les cultures transférées à 7 jours d’intervalle se poursuivent généralement avec une phase de latence faible ou nulle. Les organismes en phase stationnaire deviennent souvent difficiles à passer.

La plupart des T. pallidum sont attachés aux cellules Sf1Ep. Cependant, il reste suffisamment de T. pallidum dans le surnageant pour que des échantillons de milieu puissent être prélevés périodiquement afin de vérifier la viabilité et la multiplication. S’il est nécessaire de procéder à une quantification soigneuse, il faut mesurer le volume du milieu prélevé, quantifier le nombre de T. pallidum et ajouter le nombre total d’organismes retirés aux dénombrements finaux au moment de la récolte.

Dans les études précédentes, l’efficacité du clonage (nombre de cultures positives par organisme inoculé) était de 12,5 % pour 2 T. pallidum inoculés par puits et de 6,7 % pour 0,5 T. pallidum inoculés par puits27. Ainsi, il est probable que tout puits positif représente l’excroissance d’un seul organisme au niveau de l’un ou l’autre de ces inocules. Cependant, la clonalité des populations résultantes doit être vérifiée en examinant l’homogénéité de la culture sur des sites hétérogènes dans la culture d’origine. La façon la plus définitive de démontrer que la culture est isogénique est le séquençage du génomeentier 27.

figure-results-1
Figure 1 : Organigramme de la procédure de culture in vitro de T. pallidum. Cette figure a été reproduite avec la permission d’Edmondson et Norris (2021)19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Schéma du système d’équilibrage des réactifs de culture de T. pallidum dans un environnement à faible teneur en oxygène. Un évent de bocal d’infusion est connecté via un joint en T à une source de vide (comme un aspirateur domestique) et à des bouteilles de gaz contenant des mélanges de gaz personnalisés (5 % de CO2, azote d’équilibre et 1,5 % d’O2, 5 % de CO2, azote d’équilibre). Un vacuomètre en ligne mesure le vide aspiré dans le bocal. Le vide est aspiré dans le bocal à environ -58 kPa. Le bocal sous vide est ensuite lentement rempli avec les mélanges de gaz. Le bocal Brewer est rempli trois fois avec 5% de CO2, équilibre l’azote avant une évacuation finale, et rempli à 95% de N2, 5% de CO2, 1,5% O2. Les cultures ou les milieux sont ensuite retirés du bocal et rapidement transférés dans l’incubateur à faible teneur en oxygène. Alternativement, le tube entre le pot Brewer et le premier joint en T peut être serré fermement, le tube déconnecté du joint en T et l’ensemble du pot Brewer peut être transféré dans un incubateur à 34 °C. Cette figure a été reproduite avec la permission d’Edmondson et Norris (2021)19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Courbes de croissance de T. pallidum cultivé avec des cellules Sf1Ep avec un milieu TpCM-2. Des cultures parallèles en trois exemplaires ont été ensemencées avec T. pallidum. Des répétitions ont été récoltées à chaque point temporel ; les résultats représentent la moyenne + SEM pour ces cultures. (A) Les changements de T. pallidum par culture et (B) le pourcentage de motilité sont indiqués. Cette figure a été adaptée avec la permission d’Edmondson et al.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Exemple de passage de culture in vitro de T. pallidum, souche Nichols. Des cultures triples parallèles ont été ensemencées avec T. pallidum et passées chaque semaine à l’aide d’une dilution de 1:20. Le graphique en dents de scie montre le nombre de T. pallidum par culture et le nombre de personnes transférées à de nouvelles cultures à chaque point temporel. Les résultats représentent la moyenne ± MEB pour trois réplicats biologiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Volume moyen et taux de semis pour les récipients de culture. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Milieux de culture de T. pallium . Tous les médias doivent être stérilisés par filtre après la préparation. Le milieu Sf1Ep peut être conservé à 4 °C pendant une période pouvant aller jusqu’à deux mois. TpCM-2 est généralement fabriqué un jour avant l’utilisation. Le milieu de dissociation doit être aliquote et congelé. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

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Le système Sf1Ep-TpCM-2 est la première procédure disponible qui favorise la culture in vitro continue de T. pallidum. Le système est complexe en raison des exigences de croissance extrêmes de cet organisme : 1) besoins nutritionnels complexes en raison des capacités de biosynthèse limitées ; 2) un besoin mal compris de petites quantités d’oxygène, malgré une sensibilité élevée aux espèces réactives de l’oxygène 9,10,16,36 ; et 3) le besoin actuel de la présence de cellules Sf1Ep. Bien qu’il soit tentant de « couper les coins ronds » sur la procédure, il est recommandé de suivre attentivement les étapes jusqu’à ce qu’une culture à long terme réussie soit obtenue avant d’essayer des modifications. Au fur et à mesure que des informations supplémentaires sur les besoins métaboliques de T. pallidum s’accumulent, il peut être possible de développer des conditions axéniques qui ne nécessitent pas la présence de cellules Sf1Ep. Cependant, le taux de croissance in vitro restera probablement lent (avec un temps de doublement minimum de 33 h à 46 h, selon la souche)17,18, étant donné que T. pallidum se multiplie à un temps de doublement estimé de 30 h à 33 h, même pendant l’infection des mammifères37,38. Comme pour toute culture bactérienne, il est recommandé de maintenir les stocks à faible passage et de réaliser des expériences avec des cultures de T. pallidum situées à moins de 10 passages de ces souches afin d’éviter la « dérive génétique » et les modifications phénotypiques associées dues aux mutations.

Les cellules Sf1Ep fournissent apparemment des nutriments essentiels ou des activités enzymatiques aux tréponèmes. Cependant, ils consomment également des nutriments (tels que le glucose et l’oxygène) et peuvent produire des conditions toxiques telles qu’un faible pH 9,16,39. Par conséquent, il y a un équilibre à trouver entre le fait d’avoir suffisamment de cellules Sf1Ep pour soutenir la multiplication de T. pallidum et la prévention de la prolifération et de la toxicité des cellules de mammifères. Un nombre élevé de passages de cellules Sf1Ep a tendance à se développer plus rapidement et parfois à perdre la capacité de supporter la multiplication de T. pallidum. Par conséquent, le nombre de passages Sf1Ep doit être surveillé et les stocks de cellules doivent être remplacés périodiquement par des préparations congelées à faible passage. La présence de cellules Sf1Ep complique également l’étude des propriétés de T. pallidum telles que la teneur en ADN, en ARN et en protéines, ainsi que les activités enzymatiques. L’élimination des cellules de lapin est possible dans une certaine mesure à l’aide d’une centrifugation répétée à basse vitesse (100 x g pendant 5 min) ou plus efficacement à l’aide de gradients de Percoll ou d’Hypaque40,41. Cependant, les méthodes de centrifugation par gradient ne sont généralement efficaces qu’avec un grand nombre de T. pallidum. Les méthodes alternatives de propagation de T. pallidum sont limitées à l’infection d’animaux de laboratoire tels que les lapins13,14. Cette approche comporte des considérations éthiques et est devenue de plus en plus coûteuse ; cependant, le modèle de lapin est très utile pour étudier la pathogenèse de T. pallidum et les réponses immunitaires de l’hôte. De plus, il existe probablement des différences dans l’expression des gènes, la croissance ou le comportement de T. pallidum lors de la culture in vitro et de l’infection chez le lapin27.

Au moment de la rédaction de ce rapport, le système Sf1Ep-TpCM-2 a été établi dans au moins 6 groupes de recherche aux États-Unis et en Europe et a donné lieu à 16 publications sur des sujets allant de la biologie fondamentale et de la génétique de T. pallidum à la sensibilité aux antimicrobiens. La valeur de la culture in vitro dans l’étude de cet agent pathogène énigmatique augmentera probablement avec l’expansion de l’utilisation et les améliorations futures.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la subvention R01 AI141958 des National Institutes of Health des États-Unis/NIAID. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,5 M EDTA, pH 8,0sigma  ;E8008
10x Earle' sels équilibrés, sans Mg2+, Ca2+Gibco14155063
tubes à centrifuger coniques stériles jetables de 15 et 50 mL.S.OS.O
flacons cryogéniques de 2 mLPlaquesCorning 430659
6 puits pour la culture T. pallidumFalcon353046Les plaques doivent avoir des couvercles à faible évaporation.
70 % éthanolN/AN/A
75 cm2 flacons de culture tissulaire avec bouchons ventilésCorning43061U
93,5 % d’azote, 5 % de CO2 et 1,5 % d’oxygène pour le milieu de prééquilibrage et les culturesN/AN/A
95 % d’azote et 5 % de CO2 pour le milieu de prééquilibrage et les culturesN/AN/A
Microplaques transparentes à fond plat traitées pour culture tissulaire à 96 puits, à faible évaporation,Corning Falcon353072
Pipette multicanaux réglable d’une capacité de 200 ul.N/AN/AFacultatif, mais très utile pour le clonage
Eau de qualité culture cellulaireSigmaW3500
CMRL 1066 sans L-glutamine ni rouge de phénolUS BiologicalC5900-03A
CO2 pour les incubateurs trigaz et de culture tissulaire  ;N/AN/A N/A
Réservoir de stockage de culture cellulaire d’azote liquide cryogéniqueN/AN/
D-glucoseSigma-AldrichG6152
Unités de filtration jetables, 0,2 & micro ; m , > capacité de 100 mLN/AN/A
Pipettes jetables : 25 mL, 10 mL, 5 mL, aspirationN/AN/A
DL-DithiothreitolSigma-AldrichD9779
D-Mannitol  ;Sigma-AldrichM1902
DMSO (qualité de culture cellulaire stérileSigma-AldrichD2650
Eagle' sMEM Sigma-AldrichM4655
Sérum fœtal de bovin, inactivé par la chaleur  ;Sigma-AldrichF4135Nous recommandons vivement ce produit. Doit être présélectionné pour la compatibilité avec les cultures T. pallidum si l’on utilise une marque ou un numéro de catalogue différent.
Congélateur avec capacité de maintien de -70 ° ; C ou -80 ° ; CN/AN/APour l’entreposage de T. pallidum ; l’entreposage à l’azote liquide peut être utilisé à la place
Milieu de congélation (milieu Sf1Ep + 10 % [v/v] DMSO)N/AN/A
gaz avec raccords appropriésN/A/A
GasPak 150 Bocal anaérobie ventilé (bocal Brewer)Fisher Scientific11-816
GlycérolN/AN/A
Chambres de comptage Helber avec décisions ThomaHawksley Medical and LaboratoryPour la quantification de T. pallidum
HemocytometerN/A N/A&NBSP ; Pour la quantification de cellules Sf1Ep
Interrupteur de réservoir d’incubateurNuAire  ;NU-1550 TankGuard Interrupteur automatique du réservoir de l’incubateur de CO2En option, mais très utile pour maintenir des conditions d’O2 appropriées.
Microscope inversé avec optique à contraste de phaseN/AN/APour l’observation des cultures cellulaires Sf1Ep
L-GlutamineSigma-AldrichG7513
L-Histidine  ;Sigma-AldrichH6034
MEM Acides aminés non essentielsGibco11140-050
Microscope avec condenseur à fond noirN/A N/A N/ALe microscope doit être équipé d’un objectif 40x et d’oculaires 15x.
MOPSSigma-AldrichM3183
Adaptateur multicanal pour aspirateur  ;Integra155520Facultatif, mais utile pour le clonage de
NaHCO3 (7,5 %)Sigma-AldrichS8761
Azote pour incubateur trigazN/AN/A
ResazurinSigma-AldrichR7017
Sf1Ep (NBL-11) cellulesAmerican Type Culture CollectionCCL-68
Sodium pyruvateSigma-AldrichS8636
PBS stérile (sans chlorure de calcium ni chlorure de magnésium)  ;Sigma-AldrichD8537
Réservoirs de réactifs stériles, format 50 ou 100 mLN/AN/A
<>EMT. pallidum échantillon, congelé ou frais  ;à partir d’une infection de lapin ou d’une culture in vitro
Incubateur de culture tissulaire maintenu à 37 ° ; C, 5 % CO2N/AN/A
Incubateur de culture tissulaire trigazeuse maintenu à 34 ° ; C, 5 % CO2, 1,5 % O2ThermofisherHeracell&trade ; Incubateur à CO2 trigazeux VIOS 160iEn option, des bocaux anaérobies peuvent être utilisés à la place (voir Réf. 17)
Solution trypsine-EDTA  ;Sigma-AldrichT4049
Source de vide (par ex. aspirateur domestique), tube à vide, vacuomètre et connecteursN/A/A
Eau, convient pour la culture cellulaire, stérilisée par filtre, purifiéeSigma-AldrichW3500Recommandé pour la préparation de milieux ; réduit la variabilité de la culture
. . de culture cellulaire A ) Bouteilles de N Equipment N

References

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Treponema PallidumIn Vitro CultivationSyphilis SpirocheteTissue CultureSf1Ep CellsLow Oxygen IncubationLimiting DilutionGenetic ManipulationDark Field MicroscopyAntibiotic Screening

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