Article de méthode

Isolement des sous-populations de ribosomes subcellulaires basé sur la biotinylation enrichie par éclairage restreinte par peptide peptidique spécifique à la marque de recombinaison

DOI :

10.3791/66881

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24 juillet 2026

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1Department of Genetics, Stanford School of Medicine

Dans cet article

Résumé

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La Biotinylation par illumination restreinte par localisation spécifique à AviTag (ALIBi) est une méthode novatrice activée par l’optogénétique développée pour marquer et purifier par affinité les populations subcellulaires de ribosomes pour le séquençage en aval et l’analyse protéomique.

Résumé

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De plus en plus de preuves suggèrent que la traduction de l’ARNm est un processus hautement compartimenté au sein d’une cellule, et que le trafic subcellulaire et la localisation de certains ARNm sont essentiels pour garantir que les protéines ayant des fonctions spécifiques à un compartiment soient produites dans le milieu idéal et en quantités appropriées. Cependant, les techniques d’isolement subcellulaire et de caractérisation des ribosomes qui traduisent ces ARNm ont été limitées à ce jour, de sorte que beaucoup reste inconnu sur la manière dont la composition des mécanismes de traduction contribue à la régulation de la traduction localisée de l’ARNm.

Ici, nous démontrons la Biotinylation par éclairage restreinte spécifique à AviTag (ALIBi), une méthode combinant le marquage d’épitopes, une ligase à biotine fractionnée activée par optogène nouvellement développée, et la purification d’affinité pour marquer et isoler rapidement et spécifiquement les ribosomes localisés dans tout compartiment subcellulaire d’intérêt. Tout d’abord, l’édition CRISPR/Cas9 est utilisée pour fusionner un peptide AviTag, un site de clivage de protéase du virus de la gravure du tabac (TEV) et un tag épitope FLAG à une protéine ribosomique. La ligase de biotine scindée, fusionnée à un domaine ciblant les organites, est exprimée dans cette lignée cellulaire et est inactive sous des concentrations normales de biotine. Après activation par biotine supplémentaire et illumination en lumière bleue, la ligase biotinyle AviTagged des ribosomes à proximité immédiate, permettant la purification d’affinité des ribosomes biotinylés ainsi que des protéines et ARNm associés sur des billes recouvertes de streptavidine. L’élution non dénaturante via la clivage de la protéase TEV fournit des échantillons adaptés à la caractérisation en aval des protéines ribosomiaux centrales, des protéines associées aux ribosomes et des ARNm liés aux ribosomes via le séquençage de l’ARN ou la protéomique par spectrométrie de masse.

Dans ce protocole, nous repassons les principes de conception pour fusionner AviTag avec une protéine ribosomique et cibler l’enzyme ligase de biotine scissée vers l’organite d’intérêt. Nous démontrons l’activation du système ALIBi, la lyse cellulaire, la purification d’affinité et l’élution de l’échantillon. Enfin, nous discutons des résultats typiques et du dépannage.

Introduction

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Il est important de disposer d’outils capables d’isoler des échantillons biologiques provenant de compartiments subcellulaires spécifiques afin d’étudier mieux comment l’organisation et le trafic subcellulaires s’intègrent dans les processus cellulaires. La traduction de l’ARNm est un exemple clé de ce processus : de plus en plus de preuves suggèrent que la traduction est fortement compartimentée et, en particulier, que de nombreux ARNm sont localisés dans les organites où leurs protéines codéesrésideront 1,2. Cependant, on en sait moins sur la localisation subcellulaire des machines translationnelles. Les ribosomes commencent leur existence dans le nucléol et le noyau, où commence l’assemblage à partir de protéines ribosomiques (RP) et d’ARN ribosomiaux (ARNr). Ils sont ensuite exportés vers le cytoplasme pour les dernières étapes d’assemblage, après quoi ils commencent à traduire lesARNm 3,4. Les sites canoniques de translation incluent le cytoplasme et le réticule endoplasmique ; ce dernier est le lieu où les protéines membranaires intégrales et les protéines destinées à des organites liés à la membrane ou à la sécrétion extracellulaire sontsynthétisées 5. Les sites plus récemment identifiés de translation localisée incluent les mitochondries, les peroxysomes et les processusneuronaux 6,7,8,9,10,11,12. Fait intéressant, des preuves émergent également que des mécanismes translationnels tels que les protéines associées aux ribosomes, les modifications post-traductionnelles, les modifications d’ARNr et la stœchiométrie non canonique des protéines ribosomales centrales sont impliquées dans des mécanismes régulateurs qui régissent la traduction de certains ARNm et des paramètres tels que la fidélité et le taux de traduction 13,14,15,16,17.18, 19, 20. Par exemple, des centaines de protéines ont été identifiées qui interagissent avec le ribosome et pourraient potentiellement entraîner des différences dans la composition subcellulairedu ribosome 13. Cependant, les techniques d’isolement des populations de ribosomes subcellulaires ont été limitées à ce jour ; ainsi, beaucoup de choses restent inconnues sur la manière dont la composition des mécanismes de traduction contribue à réguler la traduction localisée de l’ARNm. L’avènement de méthodes polyvalentes pour isoler les populations de ribosomes subcellulaires, en particulier celles compatibles avec les systèmes modèles de mammifères, permettra d’explorer ces caractéristiques de la machine de traduction au niveau subcellulaire.

Les premières méthodes pour isoler les fractions subcellulaires contenant des ribosomes reposaient sur les principes de la lyse séquentielle et de lacentrifugation 21,22. En général, ces méthodes sont limitées à certains organites et nécessitent souvent de longs temps de traitement. Une méthode plus récente est basée sur la ligase de biotine BirA, qui biotinylle spécifiquement un substrat peptidiqueAviTag 10,23,24. Le BirA peut être génétiquement localisé à l’organite d’intérêt dans les cellules où les ribosomes ont été marqués avec AviTag. Cependant, comme BirA est actif à des concentrations physiologiques de biotine, il est nécessaire de cultiver les cellules dans des conditions de dépuisement de biotine afin d’éviter la biotinylation constitutive et non spécifique des ribosomes porteursd’AviTags 10,24. Cela limite l’utilisation de BirA chez les types cellulaires sensibles à la déplétion de labiotine 25. Enfin, des méthodes de biotinylation promiscue ont été développées utilisant des enzymes modifiées telles que BioID, TurboID etAPEX 26,27,28. Lors de l’induction, ces enzymes produisent un intermédiaire réactif de biotine qui modifie de manière covalente tout résidu de lysine dans un rayon autour de l’enzyme. Les méthodes de biotinylation promiscues sont très utiles pour cartographier les protéomes subcellulaires, mais moins informatives pour distinguer les protéines à proximité générale des ribosomes localisés par rapport aux protéines plus proches de celles-ci.

Ici, nous démontrons notre méthode récemment développée pour marquer et isoler les populations de ribosomes subcellulaires, appelée Biotinylation Améliorée par Illumination Restreinte par Localisation spécifique à AviTag (ALIBi). Cette méthode exploite un BirA à division modifiée fusionné avec des interrupteurs magnétiques (eMag) améliorés par optogénétique (Figure 1A) qui hétérodimérisent sous éclairage à lumièrebleue 29 ; et un tag peptidique composé de l’épitope FLAG, du site de clivage de la protéase du virus de la gravure du tabac (TEV), et d’AviTag (FTA) fusionné à la protéine ribosomique Rpl31 (Figure 1B). L’enzyme divisée peut être génétiquement ciblée sur certains organites, est inactive à des concentrations physiologiques de biotine, et peut être reconstituée en quelques minutes après l’éclairage à la lumière bleue et l’ajout d’un supplément de biotine (Figure 1C-E). La lyse cellulaire ultérieure, la purification d’affinité et l’élution enzymatique non dénaturante via la clivage des protéases TEV produisent des ribosomes et des molécules co-purificatrices telles que les ARNm et les protéines associées aux ribosomes, adaptées aux méthodes analytiques en aval telles que le séquençage de l’ARN et la protéomique par spectrométrie de masse (Figure 1A). Ainsi, cette méthode révèle non seulement la composition des ribosomes, mais aussi les ARNm auxquels les ribosomes sont liés. Dans un article récent décrivant l’application fondamentale d’ALIBi pour caractériser les populations de ribosomes subcellulaires, nous avons réussi à cibler l’enzyme divisée vers le cytoplasme, le nucléole, le noyau, le réticule endoplasmique, la membrane plasmique et les mitochondries (Tableau 1)30. La comparaison résultante des mécanismes de traduction entre ces compartiments subcellulaires a conduit à des découvertes nouvelles et inattendues concernant la traduction au niveau du réticulum endoplasmique et des mitochondries, ainsi que des pistes potentielles pour de futures recherches sur les facteurs de biogenèse des ribosomes dans le noyau et le nucléole.

Ce protocole contient une démonstration détaillée de la transfection et de l’activation du système ALIBi, la lyse cellulaire, la purification d’affinité et l’élution de l’échantillon. Nous discutons également des moyens de vérifier une purification d’affinité réussie via western blot et formulons des recommandations pour effectuer un séquençage d’ARN en aval ou une analyse protéomique par spectrométrie de masse (MS) (voir Fichier Supplémentaire 1). Ce protocole est écrit pour des expériences utilisant des cellules souches embryonnaires de souris (mESC) exprimant Rpl31 fusionné homozygique à la FTA (L31-FTA) à partir du locus endogène Rpl31 ; Cette lignée cellulaire est disponible auprès des auteurs sur demande. La stratégie pour générer cette lignée cellulaire est décrite dans le fichier supplémentaire 1 , ainsi que dans la figure supplémentaire S1 et la figure supplémentaire S2. Des plasmides codant pour les enzymes divisées ciblées à plusieurs organites sont disponibles sur Addgene (numéros de catalogue #235608 à 235643). Les principes de conception pour cibler les enzymes divisées vers ces organites sont décrits dans le Fichier Supplémentaire 1. Le protocole suppose que chaque échantillon provient de mESCs cultivés dans une plaque de 10 cm. Nous avons constaté que l’échelle de 10 cm fournit suffisamment de matière pour la protéomique de la spectrométrie de masse, tandis que l’échelle de 6 puits est suffisante pour les Western blots ou le séquençage d’ARN.

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Protocole

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1. culture cellulaire mESC

REMARQUE : Avant l’activation d’ALIBi et la lyse cellulaire, les mESC doivent être manipulés selon la technique stérile standard pour la culture cellulaire. La centrifugation des mESC intacts doit être effectuée à 200 × g pendant 3 minutes à température ambiante, sauf indication contraire. Préchauffez le milieu à 37 °C dans un bain-marie avant utilisation, sauf indication contraire. Les mESC doivent être transmis dans une plaque de culture tissulaire fraîche qui a été gélatinisée pendant la nuit (voir étape 1.1).

  1. La veille de la décongélation des mESC L31-FTA, recouvrir le bas d’une plaque de 10 cm avec 5 mL de gélatine à 0,1 %. Incubez à 37 °C toute la nuit.
  2. Combinez les composants du milieu mESC (Tableau 2) et passez à travers un filtre de 0,2 μm. Conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois.
  3. Le jour de la décongélation, réchauffez une aliquote de 5 mL de média pour diluer les cellules décongelées et une aliquote de 10 mL pour les emplatrer.
  4. Récupérer un cryovial contenant ~5 × 106 MESC L31-FTA dans un stockage d’azote liquide. Décongelez immédiatement en faisant tourner le fond du flacon dans un bain-marie à 37 °C.
  5. Mélangez doucement 0,5 à 1 mL de média de l’aliquote de 5 mL avec le contenu cryovial selon la capacité du flacon, puis transférez le contenu cryovial vers l’aliquote du média de 5 mL.
  6. Pelletez les cellules par centrifugation. Aspirez le surnageant.
  7. Resuspendez la granule cellulaire avec l’aliquote de 10 mL de mieux.
  8. Aspirez la gélatine de la plaque de 10 cm et transférez immédiatement la suspension cellulaire dans la plaque. Incuber à 37 °C.
  9. Toutes les 24 heures (sauf les jours de passage), aspirez les vieux substrats de la plaque et remplacez-les par 10 mL de substrat frais.
  10. Lorsque les colonies sont confluentes à 70 % à 80 % (généralement 48 h après le plaque), aspirez le vieux milieu et rincez deux fois avec 10 mL de solution physiologique tamponnée phosphate (DPBS) de Dulbecco.
  11. Après avoir aspiré le DPBS, enduire la plaque de 2 mL de trypsine à 0,05 % (Tableau 2). Incubez à 37 °C pendant 5 minutes.
  12. Neutralisez la trypsine en ajoutant 4 mL de média mESC froid à la plaque. Utilisez immédiatement une pipette sérologique de 5 ou 10 mL pour faire des pipettes 15 fois dans la plaque afin de dissocier les colonies en suspension unicellulaire.
  13. Transférez la suspension dans un tube conique. En option, retirez une aliquote pour compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
  14. Pelletez les cellules par centrifugation. Aspirez le surnageant.
  15. Resuspendez la granule cellulaire dans un milieu frais. La plaque 5 × 106cellules (généralement un ratio de passage de 1:6) dans une plaque fraîchement gélatinisée de 10 cm et incuber à 37 °C. Répétez les étapes 1.9 à 1.15 selon les besoins jusqu’à ce que la transfection soit prête à procéder.
  16. Pour fabriquer des stocks cellulaires congelés, trypsiniser une plaque de mESC (comme aux étapes 1.10–1.14). Resuspendez la pellete cellulaire dans un milieu de congélation (250–500 μL par 5 × 106 cellules), aliquote dans des cryoviaux, puis congelez lentement dans un récipient de congélation à -80 °C toute la nuit avant de transférer dans le stockage d’azote liquide.

2. Transfection

REMARQUE : Effectuer la transfection le jour où les mESC sont prêts à être laissés passer. Les plasmides peuvent commencer à s’exprimer dès 3 à 5 heures après la transfection. Une fois exprimées, nous recommandons de manipuler les cellules dans l’obscurité et de minimiser l’exposition à des températures inférieures à 37 °C afin d’éviter une activation prématurée, car des travaux antérieurs ont montré que les domaines optogénétiques magnétiques se dimérisent non seulement sous lumière bleue mais aussi lors d’une exposition au froid31. Gardez les assiettes dans un incubateur dédié ou protégez une étagère dans un incubateur partagé de la lumière avec du papier aluminium. Lorsque vous manipulez des cellules à l’extérieur de l’incubateur, éteignez ou bloquez toutes les lumières et fenêtres de la pièce à l’avance, et utilisez un phare à lumière rouge pour voir. Ne laissez pas la porte de l’incubateur ouverte plus longtemps que nécessaire. Retirez seulement de petites boîtes de plaques de l’incubateur à la fois, et reposez les plaques sur une surface isolante (c’est-à-dire un couvercle de boîte en polystyrène propre) tout en les manipulant pour minimiser le contact avec les surfaces de travail à température ambiante. Chauffez complètement le substrat avant utilisation. Ne pas inspecter les plaques sous un microscope électroluminique.

  1. La veille de la transfection, gélatinez une plaque de 10 cm.
  2. Le jour de la transfection, aspirez la gélatine de la plaque et ajoutez 7,5 mL de média pour préchauffer à 37 °C. Préchauffer un milieu sérique réduit à 37 °C pour les cellules en résuspension.
  3. Diluez 18,75 μL du réactif de transfection dans 250 μL de milieu sérique réduit. Tapotez doucement pour mélanger et couver pendant 5 minutes à température ambiante.
  4. Si vous coexprimez deux plasmides codant pour les fragments N et C, ajoutez 3,75 μg de chaque plasmide à 250 μL de milieu sérique réduit. Si un seul plasmide exprime (c’est-à-dire un contrôle négatif GFP ou un contrôle positif BirA de longueur complète), ajoutez plutôt 7,5 μg du plasmide unique.
  5. Ajoutez le mélange plasmide/médium sérique réduit au mélange réactif de transfection/médium sérique réduit, puis tapez/inversez pour mélanger. Incubez à température ambiante pendant 15 minutes.
  6. En attendant, trypsinisez et comprimez les mESC (étapes 1.10–1.14). Resuspendez la pellete dans un milieu sérique réduit chauffé à une concentration de 10 × 106 cellules/mL.
  7. Ajoutez 7,5 × 10cellules en suspension de 6 (750 μL) au mélange plasmide/réactif de transfection/milieu sérique réduit. Inversez le tube pour mélanger. Incubez pendant 10 minutes à la RT, en inversant les tubes de temps en temps pour maintenir les cellules en suspension.
  8. Inversez brièvement les tubes et ajoutez le mélange mESC/plasmide/réactif de transfection/médium sérique réduit sur la plaque contenant un milieu chaud. Balancez doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules.
  9. Incubez la plaque à 37 °C pendant 3 à 5 heures, permettant aux cellules d’adhérer pendant ce délai.
    REMARQUE : À partir de maintenant, nous recommandons de respecter les précautions ci-dessus contre l’exposition à la lumière et les températures inférieures à 37 °C.
  10. Aspirez doucement les anciens supports. Ajoutez un substrat frais et chaud, en pipettant le long du côté de la plaque pour éviter de déloger les cellules. Reprenez l’incubation à 37 °C.
  11. Si vous activez ou lisez à 24 heures après la transfection, passez à la section 3. Si vous prévoyez d’activer/lyser 48 h après la transfection, changez de milieu ~24 h après avoir placé les cellules transfectées.

3. Activation d’ALIBi et lyse cellulaire

REMARQUE : Continuez à manipuler les cellules/échantillons dans l’obscurité jusqu’au début de l’élution (étape 5.4). Une fois les cellules refroidies sur glace (étape 3.15), garder les échantillons au froid et n’utiliser que des réactifs refroidis jusqu’au début de l’élution. Assurez-vous que les surfaces de travail, les équipements, les réactifs et les plastiques sont exempts d’ARNase en utilisant des objets fraîchement ouverts et en essuyant ou rinçant les surfaces dures avec une solution décontaminante à l’ARNASE et 70 % d’éthanol. Portez des gants chaque fois que vous manipulez des échantillons ou du matériel. Pour les échantillons destinés à la protéomique de la SEP, il faut également minimiser la contamination à la kératine en maintenant l’espace de travail sans poussière ; Couvrez la peau nue et attachez les cheveux longs.

  1. Prérefroidissez la centrifugeuse à 4 °C.
  2. Avec les lumières éteintes, déplacez les plaques transfectées dans un incubateur temporaire à 37 °C afin qu’elles ne soient pas exposées aux fluctuations de température dans l’incubateur principal après l’installation du transilluminateur.
  3. Essuie le transilluminateur à lumière bleue avec de l’éthanol à 70 % et connecte-le à l’alimentation. Placez le transilluminateur dans l’incubateur principal et laissez les conditions de l’incubateur se rééquilibrer tout en poursuivant l’installation.
  4. Réchauffer une aliquote de média à doser avec de la biotine et de la cycloheximide (CHX) (10 mL de média par plaque de 10 cm) à 37 °C. Si vous prenez des échantillons témoins sans biotine supplémentaire, réchauffez également une aliquote séparée à administrer uniquement avec CHX.
    REMARQUE : Certains composants tampons peuvent être mélangés la veille de l’utilisation et stockés toute la nuit à 4 °C (voir Tableau 2). Notez que différentes recettes de lyse et de tampon de lavage ont été utilisées pour des expériences destinées à la protéomique western blot ou MS ainsi que pour celles destinées au séquençage ARN.
  5. Refroidissez une aliquote de DPBS à administrer avec du CHX (20 mL par plaque de 10 cm).
  6. Préparez le tampon d’élimination de l’ARNase, le lavage de sel, le tampon de lyse et les tampons de lavage (voir Tableau 2). Pour les tampons contenant des composants denses/visqueux tels que le glycérol et le Triton X-100, pipoyez le tampon complet pour assurer un mélange uniforme. Refroidissez les tampons sur la glace avant utilisation.
    REMARQUE : Pour les étapes de lavage des billes, faites brièvement tourner le tube contenant les billes dans leur tampon actuel dans une centrifugeuse de poche pour recueillir le contenu au fond. Placez le tube dans un support magnétique pendant 1 minute ou jusqu’à ce que les billes soient complètement déplacées. Aspirez le surnageant sans toucher à la pellete de billes. Sans laisser sécher la granule de billes, ajoutez le tampon suivant. Pour resuspendre la pellete de billes, soit vous pipetez doucement, soit faites rouler le tube fermé entre vos doigts en le tenant contre la grille magnétique, de sorte que les billes soient rapidement tirées dans plusieurs directions par l’aimant. Enfin, inversez plusieurs fois les billes resuspendues pour vous assurer que les parois intérieures du tube sont lavées.
  7. Suspendez à nouveau la bouteille d’origine de perles de streptavidine en pipettant doucement ou en la berçant. Transférez 450 μL de billes dans un tube à faible liaison protéique pour chaque plaque de 10 cm de mESCs.
  8. Suivant la NOTE ci-dessus sur le lavage des billes, jeter le tampon de stockage des billes et laver les billes deux fois avec 900 μL de tampon d’élimination de l’ARNase.
    REMARQUE : Passez à l’étape suivante sans délai ; un temps prolongé dans le tampon d’élimination de l’ARNase peut diminuer la capacité de liaison des billes.
  9. Laver les billes 1x avec 900 μL de lavage salé.
  10. Laver les billes 2 fois avec 900 μL de tampon Wash I. Après avoir resuspendu les billes lors du second cycle de tampon Wash I, stockez les billes dans le tampon Wash I à 4 °C tout en effectuant l’activation et la lyse cellulaire.
  11. Ajouter de la biotine (concentration finale de 50 μM ; dilution 1:1 000 du stock de 50 mM) et du CHX (concentration finale de 100 μg/mL ; dilution 1:1 000 du stock de 100 mg/mL) selon le besoin aux aliquotes chauffées du milieu. Gardez à 37 °C jusqu’à utilisation.
  12. Ajouter CHX (concentration finale de 100 μg/mL ; dilution 1:1 000 de la bouillon de 100 mg/mL) à l’aliquote froide de DPBS et garder au frais jusqu’à utilisation.
    REMARQUE : Les deux étapes suivantes décrivent l’activation d’ALIBi via la biotine supplémentaire et l’éclairage à lumière bleue. Une durée idéale d’activation est suffisamment longue pour permettre une quantité suffisante de biotinylation des ribosomes pour les tests en aval, mais suffisamment courte pour préserver la résolution spatiotemporale. Le temps d’activation idéal peut varier en fonction de paramètres tels que le type cellulaire, l’échelle de l’expérience, le niveau d’expression des enzymes divisées, l’abondance de ribosomes près de l’organite d’intérêt et la sensibilité de la technique d’analyse. Nous recommandons 15 minutes comme point de départ, soit le temps d’activation utilisé dans nos résultats représentatifs (Figure 2) et dans notre travailaccompagnant 30.
  13. Aspirez les milieux à partir des plaques transfectées. Ajoutez immédiatement 10 mL de substrat tiède contenant CHX ± biotine par plaque.
  14. Pour que les plaques de contrôle négatives ne soient pas éclairées, placez-les dans un incubateur sombre. Pour que les plaques soient illuminées, placez-les directement sur le transilluminateur, allumez-le et faites couver pendant 15 minutes.
  15. Lorsque l’éclairage est terminé, lavez immédiatement les plaques deux fois avec 10 mL de DPBS froid + CHX par plaque. Placez les assiettes sur la glace entre et après les lavages. Après avoir aspiré le second lavage, inclinez la plaque et aspirez tout DPBS résiduel.
  16. En gardant chaque plaque aussi plate que possible sur la glace, procédez à la lyse en ajoutant 2 mL de tampon de lyse glacé. Incubez la plaque sur la glace pendant 5 minutes, en tapotant la plaque pour déloger les cellules 2 à 3 fois pendant ce temps.
    REMARQUE : si elles sont maintenues sombres sous du papier aluminium et sur de la glace, les plaques peuvent être déplacées hors de la zone de culture cellulaire vers un autre espace sombre pendant cette période.
  17. Délogez les cellules restantes en utilisant une micropipette pour faire apparaître le lysat sur la surface de la plaque tout en évitant la formation de bulles, puis transférez le lysat dans un tube à faible liaison protéique refroidi et marqué.
    REMARQUE : OPTIONNEL : Pour certains organites difficiles à lyser comme le noyau et le nucléole, la sonication peut aider.
  18. Dans le cas d’organites difficiles à lyser, sonicez tous les échantillons de l’expérience pendant 45 s à 4 °C (réglage de puissance de 3 watts). Si la conception du sonicateur nécessite l’insertion d’une sonde dans un tube d’échantillon ouvert, transférez initialement le lysat de la plaque vers un tube plus grand pour éviter le débordement pendant la sonation ; puis, transférez-le dans un tube de 2 mL.
  19. Incubez le lysat sur glace pendant 15 minutes.
  20. Centrifugez le lysat à 17 000 × g pendant 3 minutes à 4 °C. Transférez le surnageant (lysat clarifié) dans un tube froid à faible liaison protéique sans perturber la pellete de débris cellulaires.
    REMARQUE : Si l’analyse RNA-seq est envisagée, une aliquote du lysate clarifié peut désormais être collectée comme fraction totale d’ARN (voir Fichier Supplémentaire 1, « Recommandations pour le séquençage de l’ARN » étape 1.1) pour plus de détails.
    REMARQUE : Si les quantités cellulaires, les conditions de transfection/culture et les conditions de lyse ont été uniformes pour tous les échantillons, nous supposons généralement que les concentrations de lysat sont comparables entre les échantillons et nous poursuivons sans quantifier la concentration totale de protéines. Cela minimise le temps écoulé entre l’activation et la purification d’affinité.

4. Purification d’affinité

  1. Pelletez les billes lavées de streptavidine à l’aide d’un support magnétique. Aspirez le buffer Wash I.
  2. Transférez 1 200 μL de lysat clarifié dans le tube contenant les billes lavées. Pipetez doucement pour remettre les perles en place. Conservez le reste du lysat clarifié à -80 °C.
  3. Incubez le lysat avec des billes à 4 °C dans l’obscurité pendant 1 heure sur le rotateur tubulaire.
  4. Pendant cette incubation, préparez le tampon d’élution TEV (Tableau 2).

5. Élution

  1. Suivant les notes sur le lavage des billes dans la section 3, placez les billes sur un support magnétique et transférez le surnageant dans un tube à faible liaison protéique refroidi. Conservez le surnageant à -80 °C.
  2. Laver les billes 2 fois avec 900 μL de buffer Wash I.
  3. Laver les billes 1x avec 900 μL de tampon Wash II.
    REMARQUE : Après avoir terminé cette étape, les échantillons n’ont plus besoin d’être manipulés dans le noir.
  4. Ajoutez 450 μL de tampon d’élution TEV aux billes.
  5. Incubez les billes dans le tampon d’élution TEV pendant 1 h à température ambiante sur le rotateur tubulaire. Pour des expériences à plus petite échelle utilisant de faibles volumes de tampon d’élution TEV, incubez les tubes sur un shaker à 1 000–2 000 tr/min à la place.
  6. Pelletez les billes sur la grille magnétique. Transférez l’éluate dans un tube à faible liaison protéique. Si une analyse protéomique ou un western blot est prévu, stockez l’éluat à -80 °C. Si l’analyse RNA-seq est prévue, voir le fichier supplémentaire 1 « Recommandations pour le séquençage de l’ARN » étape 1.2 pour les instructions de stockage des éluats.
  7. OPTIONNEL : Pour déterminer de manière préliminaire si la purification d’affinité a produit un rRNA/ARNm appréciable (indiquant que les ribosomes ont été isolés), analysez les éluats sur un spectrophotomètre de microvolume en utilisant un tampon d’élution TEV comme blanc.
    REMARQUE : Les éluates provenant de cellules contenant le système activé devraient avoir une plus grande absorbance à 260 nm que les éluats provenant de cellules dépourvues des enzymes divisées, de la lumière bleue/biotine ou de L31-FTA.

6. Tache occidentale

REMARQUE : Jusqu’à ce que les échantillons de lysat et de flux traversant aient été dénaturés dans le tampon de Laemmli, nous recommandons de continuer à éviter l’exposition à la lumière. Nous utilisons des gels préfabriqués, un tampon de transfert et un tampon de fonctionnement disponibles dans le commerce, ainsi qu’un système de transfert semi-sec (voir le tableau des matériaux). Le SDS-PAGE et le western blot sont réalisés selon les instructions du fabricant pour ces composants, sauf indication contraire ci-dessous.

  1. Ajoutez 6x échantillons tampons de Laemmli au lysat, à travers le flux et/ou à l’éluate pour atteindre une concentration finale de 1x tampon de Laemmli. Chauffez à 95 °C dans un bloc chauffant ou un thermocycleur pendant 10 minutes. Si de la condensation se forme sur le couvercle ou les parois du tube, faites tourner brièvement les tubes.
  2. Installez un gel avec un tampon courant dans le réservoir de gel, selon les instructions du fabricant du réservoir. Chargez les échantillons et l’échelle.
  3. Faites couler le gel à 125 V pendant 45 à 75 minutes jusqu’à ce que le front de colorant approche le fond du gel. En attendant, préparez PBST et tampons de blocage (Tableau 2).
  4. Effectuez un transfert semi-sec selon les instructions du fabricant du système de transfert.
    REMARQUE : Pour toutes les étapes de lavage/incubation de membrane, assurez-vous que la membrane est complètement immergée et placez le plateau de membrane sur un bascule orbital ou basculant. Pour un plateau de 10 x 15 cm, cela nécessite 25 à 50 mL de tampon.
  5. Retirez la membrane de la pile de transfert et passez immédiatement à l’étape suivante pour vous assurer que la membrane ne sèche pas.
    REMARQUE : OPTIONNEL : Des taches sèches sur la membrane peuvent entraîner un blocage inégal ou une liaison de la sonde, notamment avec les sondes ayant des incubations courtes comme la streptavidine et la peroxydase de raifort. Pour éviter ce problème, nous réhumidifions les membranes après le transfert dans du méthanol 100 % pendant 30 secondes, puis dans de l’eau pendant 5 minutes. Cette mesure est similaire aux recommandations générales pour réhumidifier les membranes PVDF qui ont séché aprèstransfert 32,33.
  6. Lavez la membrane dans PBST pendant 3 x 10 minutes à température ambiante.
  7. En suivant les conditions spécifiées dans le tableau 3 pour chaque sonde western blot, effectuez le blocage, le lavage, l’incubation par sonde et les incubations secondaires des anticorps.
  8. Après le lavage final à l’étape 6.7, mélangez les composants du substrat ECL selon les instructions du fabricant et enrobez uniformément la membrane avec. Capturez l’image avec un système d’imagerie gel chimiluminescence.

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Résultats

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Western blot (section 6 du protocole) est la manière la plus rapide d’évaluer préliminairement le succès d’une expérience. Lorsque les membranes sont sondées avec la streptavidine-HRP, le lysat des cellules où tous les composants du système étaient présents devrait contenir une bande correspondant à la biotinylée L31-FTA (Figure 2A, voie 20). La même bande devrait être présente, généralement à une intensité plus élevée, si les cellules ont été transfectées a...

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Discussion

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ALIBi offre plusieurs avantages par rapport aux techniques existantes d’étude de la traduction subcellulaire et a des applications potentielles futures en biologie des ribosomes et au-delà. Ce protocole nécessite un temps similaire ou inférieur à celui de la lyse séquentielle et de lacentrifugation 21,22 et est potentiellement applicable à tout compartiment subcellulaire pouvant être génétiquement ciblé par une séquence peptidiqu...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient les membres du Barna Lab pour leurs discussions utiles.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
-80 °C stockagePour culture cellulaire
0,1 % de gélatine dans l'eauMilliporeSigmaES-006-BPour culture cellulaire
Unités de filtre 0,2 µmFisher04-977-158Pour culture cellulaire
0,5 % de trypsine-EDTA (10X)ThermoFisher15400-054Pour culture cellulaire
1 M de MgCl2ThermoFisherAM9010Pour la lyse & la purification par affinité
1 M de Tris pH 7,5ThermoFisher15567027Pour la lyse & la purification par affinité
1 M de Tris pH 8ThermoFisherAM9855GFacultatif: pour insérer FTA dans un locus protéique ribosomal endogène
Tubes microcentrifugeuse de 1,5 et 2 mL, autoclavésPour la transfection
Tubes microcentrifugeuse de 1,5, 2 et 5 mL à liaison protéique basseEppendorf022431081, 022431102,
0030108302		Pour la lyse & la purification par affinité
Plaques de culture de tissus de 10 cmPour culture cellulaire
10 M de NaOHMilliporeSigma72068-100MLPour la lyse & la purification par affinité
Concentré de tampon de course Tris/glycine/SDS 10xBio-Rad1610772Pour le Western blot
Incubateur de culture de tissus à 37 °C x 2Pour culture cellulaire. L'un d'entre eux sert d'incubateur principal pour la culture cellulaire et l'illumination des cellules transfectées. Un espace temporaire est nécessaire dans un deuxième incubateur le jour de l'activation d'ALIBi pour accueillir les cellules transfectées tout en installant le transilluminateur dans l'incubateur principal.
Bain d'eau à 37 °CPour culture cellulaire
5 M de NaClThermoFisherAM9010Pour la lyse & la purification par affinité
50 mM de biotinThermoFisherB20656Pour la lyse & la purification par affinité
Tampon Laemmli 6xFIsher50-196-784Pour le Western blot
70 % d'éthanolPour la désinfection
AcétonitrileFisherA955Facultatif: pour la préparation d'échantillons de spectrométrie de masse
Kit de protéase AcTEVThermoFisher12575015Pour la lyse & la purification par affinité
Plasmid ALIBi C-fragmentAddgene#235615, 235636 – 235641L'échelle midi-prep est requise pour la transfection
Plasmid ALIBi N-fragmentAddgene#235614, 235635, 235642, 235643L'échelle midi-prep est requise pour la transfection
Papier aluminiumPour la lyse & la purification par affinité
Bicarbonate d'ammoniumMilliporeSigma5.3305Facultatif: pour la préparation d'échantillons de spectrométrie de masse
Anticorps anti-FLAGMilliporeSigmaF3165Pour le Western blot
Anticorps anti-GAPDHCell Signaling5174Pour le Western blot
Anticorps anti-souris secondaireGE HealthcareNA931VPour le Western blot
Anticorps anti-lapin secondaireGE HealthcareNA934VPour le Western blot
Anticorps anti-Rpl12Abcamab175219Pour le Western blot
Anticorps anti-Rpl31Abcamab103991Pour le Western blot
Anticorps anti-Rpl5ProteinTech15430-1-APPour le Western blot
Anticorps anti-V5ThermoFisherR960-25Pour le Western blot
ApyraseNEBM0398LPour la lyse & la purification par affinité
Bêta-mercaptoéthanol (55 mM)ThermoFisher21985-023Pour culture cellulaire
Transilluminateur à lumière bleueClare Research ChemicalDR46B (petit) ou DR196 (grand)Pour la lyse & la purification par affinité
Albumine sérique bovine (BSA)FisherBP1600-100Pour le Western blot
Pointes C18 (pointes OMIX C18)AgilentA57003100Facultatif: pour la préparation d'échantillons de spectrométrie de masse
Conteneur de congélation cellulairePour culture cellulaire
Centrifugeuse adaptée pour les tubes coniques de 15 mL et/ou 50 mLPour culture cellulaire
Centrifugeuse pour tubes microcentrifugeuse de 1,5-2 mLPour la lyse & la purification par affinité. Doit être capable de réfrigération jusqu'à 4 C et de vitesses allant jusqu'à 17 000 g. Idéalement, il est situé dans une pièce qui peut être temporairement obscurcie lors du transfert des tubes à l'intérieur et à l'extérieur.
Kit ECL ClarityBio-Rad170-5061Pour le Western blot
Réservoir de gel CriterionBio-Rad1656001Pour le Western blot
Gele TGX pré-moulées Criterion, 4-20%Bio-Rad5671095Pour le Western blot. Tailles et dispositions de puits supplémentaires disponibles
CycloheximideMilliporeSigmaC7698-5GPour la lyse & la purification par affinité
DéoxycholateMilliporeSigmaS1827Pour la lyse & la purification par affinité
DithiothréitolThermoFisherPIA39255Facultatif: pour la préparation d'échantillons de spectrométrie de masse
DPBS, sans calcium, sans magnésiumThermoFisher14190-250P

Références

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