Démonstration du transport membranaire de l’histidine à l’aide de sacs inversés intestinaux de chèvre : un outil pédagogique expérientiel pour les étudiants de premier cycle

Résumé

Ici, nous rapportons une méthode peu coûteuse et reproductible démontrant le transport membranaire de l’histidine dans un intestin de chèvre. Ce processus se produit en co-transportant les ions histidine et sodium activés par le gradient de sodium à travers la membrane entérocytaire. Cette méthode exploite la pédagogie de l’apprentissage par l’expérience pour mieux comprendre le mouvement des solutés à travers les membranes biologiques.

Résumé

L’histidine est un acide aminé essentiel qui est également un précurseur des métabolites impliqués dans le système immunitaire, la ventilation pulmonaire et la circulation vasculaire. L’absorption de l’histidine alimentaire repose en grande partie sur le transport d’acides aminés neutres couplé au sodium par le transporteur d’acides aminés neutres larges (B⁰AT) présent sur la membrane apicale de l’entérocyte. Ici, nous démontrons l’absorption de l’histidine par les entérocytes des villosités intestinales à partir de la lumière à l’aide de sacs inversés jéjunaux de chèvre. Les sacs jéjunaux exposés à des concentrations variables de sodium et d’histidine ont été dosés pour déterminer la concentration d’histidine à l’intérieur des sacs en fonction du temps. Les résultats montrent une absorption active de l’histidine. L’augmentation de la concentration de sel a entraîné une absorption plus élevée de l’histidine, ce qui suggère un symptôme de l’absorption du sodium et de l’histidine dans les sacs inversés intestinaux de chèvre. Ce protocole peut être appliqué pour visualiser la mobilité intestinale des acides aminés ou d’autres métabolites avec les modifications appropriées. Nous proposons cette expérience comme un outil pédagogique expérientiel qui peut aider les étudiants de premier cycle à comprendre le concept de transport membranaire.

Introduction

Les cellules biologiques sont entourées d’une bicouche lipidique membranaire qui sépare le cytosol intracellulaire du contenu extracellulaire. La membrane sert de barrière semi-perméable qui régule le mouvement des solutés¹. Le transport à travers les membranes biologiques est affecté par le coefficient de perméabilité d’un soluté, qui dépend de plusieurs facteurs, dont la concentration et la charge du soluté. En général, les solutés se déplacent à travers la membrane en utilisant trois mécanismes (Figure 1) : la diffusion passive, la diffusion facilitée et le transport actif². La diffusion simple est le processus par lequel les solutés solubles, non chargés et non polaires passent leur gradient de concentration à travers une membrane semi-perméable (Figure 1A). Les protéines membranaires n’aident pas à ce processus car il implique le mouvement des solutés d’une région de concentration plus élevée vers une région de concentration plus faible. Le taux de diffusion est basé sur la loi de Fick³. D’autre part, la diffusion facilitée est un transport dépendant des protéines dans lequel la membrane ne laisse passer que des solutés sélectifs le long d’un gradient de concentration sans dépense d’énergie (Figure 1B). Ce type de transport est spécifique et diffère de la simple diffusion en présentant une cinétique de saturation.

Le transport actif est un transport dépendant des protéines de molécules contre leur gradient de concentration, c’est-à-dire de la région de concentration la plus faible à une région de concentration plus élevée avec l’utilisation de gradients d’ATP ou d’ions (Figure 1C). Lorsque le transporteur hydrolyse l’ATP, le transport est appelé transport actif primaire (Figure 1C ; panneau de gauche). Une autre forme de transport actif est le transport actif secondaire (Figure 1C ; panneau de droite). Dans le transport actif secondaire, les solutés sont déplacés en fonction d’un gradient électrochimique. Elle se produit lorsqu’une protéine de transport couple le mouvement d’un ion (généralement Na⁺) le long de son gradient de concentration avec le mouvement d’une autre molécule ou d’un ion contre son gradient de concentration. Ce type de mouvement de soluté peut être un co-transport (Symport) dans lequel le soluté et l’ion se déplacent dans la même direction ou un échange (Antiport), auquel cas le soluté et l’ion se déplacent dans des directions opposées.

Les acides aminés alimentaires et les monosaccharides provenant de sources alimentaires sont absorbés dans l’intestin grêle. L’intestin grêle peut être fonctionnellement divisé en trois segments : le duodénum, le jéjunum et l’iléon (figure 2). L’absorption du soluté se produit dans tout l’intestin grêle, l’absorption maximale se produisant au niveau du jéjunum et de l’extrémité proximale de l’iléon. Les entérocytes intestinaux sont des cellules polarisées, et les jonctions serrées reliant deux cellules adjacentes créent deux sites membranaires distincts - le site de membrane basolatérale et le site de membrane apicale (Figure 2). L’absorption des solutés luminaux générés par la digestion se produit sur le site de la membrane apicale⁴.

Le transport de l’histidine dans les entérocytes intestinaux au niveau de la membrane apicale est un exemple de symport actif secondaire dépendant du sodium. À l’extrémité basolatérale, l’histidine entrant dans l’entérocyte descend le gradient de concentration dans la circulation porte hépatique. Les concentrations intracellulaires de sodium dans l’entérocyte sont maintenues à 12 mmoles/L¹, ce qui est inférieur aux concentrations extracellulaires/luminales, en raison du pompage actif du sodium hors de la cellule par la Na⁺ K⁺ATPase située sur la membrane basolatérale (Figure 3). Au niveau de la membrane apicale des entérocytes, le B⁰AT et le transporteur d’acides aminés neutres en sodium (SNAT) 5 sont les principaux transporteurs qui transportent non seulement l’histidine, mais aussi des acides aminés tels que l’asparagine et la glutamine dans un cotransport dépendant du sodium ^5,6. Une autre protéine de transport appelée Large Amino Acid Transporter (LAT)1 présente au niveau de la membrane basolatérale des entérocytes transporte de grands acides aminés neutres tels que la leucine, le tryptophane, la tyrosine et la phénylalanine à travers la membrane⁷.

Dans le but d’enseigner le concept de transport membranaire intégré à des techniques telles que la spectrophotométrie et les tests biochimiques de routine par le biais de la pédagogie de l’apprentissage par l’expérience, il est impératif de développer des méthodologies qui peuvent non seulement démontrer le concept en termes faciles à comprendre, mais aussi permettre un apprentissage participatif pour les étudiants de premier cycle. À l’heure actuelle, les ressources disponibles pour les étudiants sont limitées pour s’engager dans l’apprentissage de ces concepts de biochimie. Ici, nous rapportons un protocole simple pour démontrer le transport de l’histidine à travers la membrane intestinale de la chèvre qui est facile à reproduire dans les laboratoires de premier cycle et peut être adapté pour évaluer le transport d’autres métabolites également. Plus important encore, la méthode utilise des matériaux peu coûteux dans un laboratoire de premier cycle, permettant ainsi un apprentissage par l’expérience, même dans les contextes de laboratoire les plus simples.

Protocole

L’ensemble du protocole avec toutes les étapes est représenté par un schéma de principe à la figure 4. La méthode est adaptée d’une étude précédente utilisant des intestins de rat⁸. L’expérience a été réalisée dans le respect des directives institutionnelles. Les échantillons utilisés dans cette étude ont été obtenus auprès d’un vendeur commercial.

ATTENTION : Portez des gants pendant cette expérience.

1. Préparation des sacs de jéjunum inversés

1. Prétraiter et nettoyer le jéjunum de chèvre.
   1. Procurez-vous les entrailles d’une chèvre en bonne santé fraîchement sacrifiée auprès d’un vendeur agréé.
   2. Placez les entrailles dans suffisamment de solution saline tampon phosphate (PBS) pour qu’elles soient complètement immergées pour le nettoyage.
   3. Séparez l’intestin grêle du gros intestin et assurez-vous que le tissu conjonctif externe est retiré à l’aide de ciseaux.
   4. Rincer doucement l’intestin grêle avec 1x PBS à l’aide d’une seringue de 10 ml, en assurant l’élimination des matières alimentaires non digérées pour obtenir un sac creux d’intestin grêle. Répétez ce processus au moins trois fois pour un nettoyage efficace.
      REMARQUE : Évitez d’utiliser une force excessive ou des aiguilles pendant le rinçage. L’utilisation de la force peut entraîner la perforation des parois intestinales et ainsi endommager les entérocytes intestinaux.
   5. Mesurez toute la longueur de l’intestin grêle à l’aide d’une règle pour obtenir les trois parties : le duodénum (1/^{4 de} l’intestin grêle) et le reste divisé uniformément en jéjunum et en iléon.
   6. Poursuivez l’expérience en utilisant la partie Jéjunum.
2. Préparez le jéjunum inversé.
   1. Nettoyez la partie du jéjunum en enlevant tout le tissu conjonctif à l’aide d’une lame.
   2. Coupez le jéjunum en portions de 12 à 15 cm de long, lavez-le avec 1x PBS et placez-le dans une boîte de Pétri contenant du PBS.
   3. Inversez les parties du jéjunum à l’aide d’une tige de verre pour permettre aux villosités d’être exposées à l’extérieur.
      ATTENTION : Évitez d’utiliser une tige de verre avec des arêtes vives. De plus, le diamètre de la tige de verre ne doit pas être supérieur au diamètre du sac.
      REMARQUE : À ce stade, on peut visualiser les villosités au microscope optique (Figure 4).
   4. Rincez doucement les parties inversées du jéjunum avec 1x PBS.
   5. Vérifiez qu’il n’y a pas de fuites sur les côtés du jéjunum inversé.
   6. Coupez les parties de jéjunum inversées en sacs de 5 cm de long.
   7. Attachez une extrémité avec de la ficelle et vérifiez à nouveau qu’il n’y a pas de fuites visuelles à l’extrémité attachée en remplissant les sacs de PBS.
   8. Attachez l’autre extrémité pour créer un sac inversé vide avec des villosités sur la surface externe.
   9. Vérifiez à nouveau s’il y a des fuites externes en tapotant le sac inversé sur du papier filtre.
3. Équilibrez les sacs inversés en 1x PBS.
   1. Poursuivez l’expérience le même jour ou conservez les sacs pendant la nuit dans 1x PBS à 4 °C.

2. Dispositif expérimental pour le transport d’histidine

1. Assemblez deux ensembles de trois tubes de 50 mL selon les différentes concentrations de chlorure de sodium indiquées dans le tableau 1.
2. Trempez les sacs intestinaux préparés dans les tubes spécifiés pendant 30 min et 60 min pour chacun des ensembles.
3. Après le temps imparti, videz la solution à l’intérieur du sac dans un tube de microcentrifugation séparé de 1,5 mL et déterminez le volume.
4. Aspirez le liquide à l’intérieur du sac à l’aide d’une seringue de 2 ml. Vous pouvez également détacher une extrémité du sac et recueillir le contenu dans un tube frais de 1,5 ml.
5. Doser 0,1 mL des échantillons prélevés pour l’estimation de l’histidine et calculer la concentration à l’aide du graphique standard.

3. Estimation de l’histidine à l’aide de la réaction de Pauly

1. Préparez une courbe standard pour l’histidine.
   1. Préparer des solutions avec des concentrations variables d’histidine comme indiqué dans le tableau 2 en utilisant des solutions mères d’histidine (5 mM) et de l’eau.
   2. Ajouter de l’acide sulfanilique (0,5 ml) et du nitrate de sodium (0,5 ml) dans chaque tube.
   3. Incuber les tubes pendant 5 minutes à température ambiante, puis ajouter 1 ml de carbonate de sodium et 1 ml d’éthanol dans chaque tube.
   4. Incuber les tubes pendant 20 min à température ambiante (~20 °C) et noter l’absorbance à la longueur d’onde 490 nm.
   5. Tracez une courbe standard de l’absorbance en fonction de la concentration d’histidine.
      REMARQUE : Ce test pour l’histidine est basé sur la propriété de l’histidine à former un composé diazoïque (Figure 5).

Résultats

Le flux de travail expérimental pour démontrer la mobilité intestinale de l’histidine par l’absorption de l’histidine par les villosités intestinales dans la lumière des sacs inversés est illustré à la figure 4, au tableau 1 et au tableau 2. Trois montages expérimentaux indépendants ont été réalisés, et des données représentatives sont présentées à la figure 6.

Dans les conditions expérimentales donné...

Discussion

Le transport membranaire est l’un des concepts les plus fondamentaux enseignés aux étudiants de premier cycle de toutes les principales disciplines des sciences biologiques, fondamentales ou appliquées. Traditionnellement, le mouvement à travers les membranes a été visualisé à l’aide de métabolites marqués avec des isotopes radioactifs. Cependant, ces méthodes sont extrêmement dangereuses et ne sont pas réalisables pour l’enseignement ou l’apprentissage. Bien que l’apprentissage par l’ex...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL	TARSONS	500020
Tubes à essai de 10 mL	BOROSIL	9800U04
Tubes Falcon stériles de 50 mL	TARSONS	546041
de 500 mL Bécher	BOROSIL	10044977
Fiole conique de 500 mL	BOROSIL	691467
D-Glucose	SRL	42738
Spectrophotomètre numérique	SYSTRONICS	2710
Ethanol	EMSURE	1009831000
Finpipettes	THERMOFISHER	4642090
Tige d’agitation en verre	BOROSIL	9850107
L-Histidine  ;	SRL	17849
NaCl	SRL	41721
Gants en nitrile	KIMTECH	112-4847
Boîte de Pétri  ;	TARSONS	460090
Saline tamponnée au phosphate (ph 7,4)	SRL	95131
Pointes de pipette	ABDOS	P10102
Carbonate de sodium	SRL	89382
Nitrate de sodium  ;	SRL	44618
Phosphate de sodium dibasique (anhydre)	SRL	53046
Phosphate de sodium monobasique (anhydre)	SRL	22249
Acide sulfanilique  ;	SRL	15354