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Étude du mouvement orthodontique des dents chez la souris

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DOI :

10.3791/66884

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2 août 2024

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1Department of Oral Diagnosis and Pathology, School of Dentistry, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry, Universidade Federal de Minas Gerais, 3Department of Physiology and Biophysics, Biological Science Institute, Universidade Federal de Minas Gerais, 4Private Clinic, 5Department of Metallurgical and Materials Engineering, School of Engineering, Universidade Federal de Minas Gerais, 6Laboratory of Immunopharmacology, Department of Biochemistry and Immunology, Biological Science Institute, Universidade Federal de Minas Gerais, 7Department of Orthodontics, School of Dental Medicine, University of Pittsburgh, 8Department of Oral Surgery, Pathology and Clinical Dentistry, School of Dentistry, Universidade Federal de Minas Gerais

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour l’étude du mouvement des dents orthodontiques (OTM), servant de modèle approprié pour étudier les mécanismes d’adaptation osseuse, de résorption radiculaire et de réponse des cellules osseuses aux stimuli mécaniques. Ce guide complet fournit des informations détaillées sur le modèle OTM, l’acquisition de la micro-tomodensitométrie et l’analyse ultérieure.

Résumé

Le mouvement orthodontique des dents (OTM) représente un processus dynamique dans lequel l’os alvéolaire subit une résorption aux sites de compression et un dépôt aux sites de tension, orchestré par les ostéoclastes et les ostéoblastes, respectivement. Ce mécanisme sert de modèle précieux pour l’étude de divers aspects de l’adaptation osseuse, y compris la résorption radiculaire et la réponse cellulaire aux stimuli de force mécanique. Le protocole décrit ici offre une approche simple pour étudier l’OTM, établissant 0,35 N comme force optimale dans un modèle murin utilisant un ressort hélicoïdal nickel-titane (NiTi). À l’aide de l’analyse par micro-tomodensitométrie, nous avons quantifié l’OTM en évaluant l’écart de la distance linéaire à la jonction ciment-émail. L’évaluation comprenait également une analyse de la résorption radiculaire inflammatoire induite par l’orthodontie, évaluant des paramètres tels que la densité minérale racinaire et le pourcentage de volume radiculaire par volume total. Ce protocole complet contribue à faire progresser notre compréhension des processus de remodelage osseux et à améliorer la capacité à développer des stratégies de traitement orthodontique efficaces.

Introduction

Le remodelage osseux est un processus continu orchestré par les ostéoclastes, les ostéoblastes, les cellules de la muqueuse osseuse et les ostéocytes, essentiels au maintien de l’intégrité du squelette adulte 1,2. Principalement entraîné par la différenciation et l’activité des ostéoclastes et des ostéoblastes, ce processus dynamique implique la résorption et le dépôt de l’os, déclenchés par le stress mécanique et la mise en charge 3,4,5.

Les expériences sur les animaux jouent un rôle central dans l’élucidation des mécanismes biologiques et cellulaires complexes qui sous-tendent le mouvement orthodontique des dents (OTM)6,7. Ce processus implique un large éventail de types de cellules, tels que les ostéoblastes, les ostéoclastes, les ostéocytes, les fibroblastes et les cellules immunitaires comme les macrophages et les lymphocytes T, situés dans l’os de la mâchoire et le ligament parodontal 7,8. Ces cellules répondent dynamiquement aux stimuli mécaniques et aux changements dans le milieu local, influençant la composition et l’architecture de l’os environnant 7,8. De plus, ils déclenchent également une réponse inflammatoire au niveau cellulaire, même s’il n’y a pas d’agents pathogènes présents. Cette réponse inflammatoire joue un rôle dans l’augmentation du renouvellement du tissu osseux9.

Divers modèles animaux, y compris des souris, des rats, des lapins, des chiens et des singes, ont été utilisés dans des études expérimentales d’OTM 7,8,10. Parmi ceux-ci, les rongeurs, en particulier les souris, sont privilégiés pour étudier les phases initiales du mouvement des dents et du remodelage osseux6. Des recherches antérieures ont souligné les avantages de l’utilisation de modèles murins par rapport aux modèles de rats, principalement en raison de la disponibilité généralisée de souches génétiquement modifiées, permettant une exploration détaillée des influences génétiques dans OTM 7,11. Actuellement, deux modèles principaux sont utilisés pour induire le mouvement des dents chez la souris. La première méthode consiste à insérer un ressort hélicoïdal en nickel-titane (NiTi) entre la première molaire supérieure et les incisives supérieures 4,12. La deuxième approche consiste à placer un élastique dans l’espace interdentaire entre la première et la deuxième molaire supérieure13. Les principaux critères de jugement analysés comprennent généralement l’amplitude du mouvement de la dent et la microarchitecture osseuse, de préférence évaluée à l’aide de la micro-tomodensitométrie (micro-CT)14. Idéalement, l’évaluation de l’intégrité des racines dentaires est importante pour s’assurer que des forces appropriées sont employées pour produire de l’OTM4.

Bien que la micro-TDM soit largement reconnue comme la référence pour l’évaluation de la microarchitecture des tissus minéralisés14, l’absence de méthodologies et de protocoles standardisés pour le balayage, l’analyse et la communication des données présente souvent des défis pour discerner les procédures précises utilisées, interpréter les résultats et faciliter les comparaisons entre différents modèles OTM 14,15.

Nous présentons ici un guide étape par étape du modèle murin OTM, y compris l’acquisition et l’analyse de l’OTM, de la microstructure osseuse et des racines dentaires. Cette méthode consiste à appliquer une force mécanique contrôlée à la première molaire pour induire un mouvement à l’intérieur de l’os de la mâchoire. Le choix de cette méthode découle de plusieurs facteurs, notamment la faisabilité, la pertinence et la précision. Une telle approche permet une analyse quantitative détaillée, fournissant des informations précieuses sur les processus biologiques sous-jacents au mouvement des dents orthodontiques et facilitant le développement de stratégies de traitement orthodontique améliorées à l’avenir.

Protocole

Toutes les procédures ont été strictement respectées dans le respect des normes éthiques établies par le Comité d’éthique de l’Universidade Federal de Minas Gerais (n° 166/2022). Avant chaque expérience, un calcul de la taille de l’échantillon est obligatoire. Utilisez des souris mâles de type sauvage C57BL6/J âgées de 8 à 10 semaines pesant environ 20 à 30 g. Les souris doivent être logées dans une cage à l’intérieur d’une pièce maintenue à 25 °C, en respectant un cycle de 12 h de lumière et 12 h d’obscurité. Après la fixation de la bobine, l’animal doit être nourri avec un régime doux. La surveillance quotidienne doit inclure des évaluations du poids corporel et de la santé globale.

1. Remodelage osseux alvéolaire induit mécaniquement

  1. À l’aide d’une pince à coupe distale, coupez le ressort hélicoïdal ouvert NiTi de 0,25 x 0,76 pouce aux dimensions suivantes de six boucles et deux extrémités en forme de boucle positionnées perpendiculairement au ressort à l’aide d’une pince orthodontique Weingart.
  2. Façonnez le fil rond en chrome-nickel (CrNi) de 0,20 mm de diamètre dans la configuration souhaitée avec des extrémités en forme de boucle à l’aide d’une pince à épiler Mathieu et d’un instrument de forme ronde comme référence de taille.
  3. Assemblez les extrémités en forme de boucle de la bobine et le fil CrNi rond de 0,20 mm.
  4. Anesthésier l’animal par une injection intrapéritonéale de 0,2 mL de solution contenant de la xylazine (10 mg/Kg) et de la kétamine (100 mg/Kg). Avant de commencer la procédure, évaluez la profondeur de l’anesthésie à l’aide du réflexe de la pédale. Pincez soigneusement l’un des orteils de l’animal à l’aide d’une pince à épiler. L’absence de réflexe indique un plan adéquat d’anesthésie générale. Pour éviter les blessures à la cornée et les douleurs postopératoires, appliquez un lubrifiant oculaire après l’anesthésie de l’animal.
  5. Placez l’animal en décubitus dorsal sur une table chirurgicale, en immobilisant ses membres pour restreindre les mouvements et permettre l’accès intra-oral.
  6. Utilisez un ouvre-bouche, fabriqué à partir d’un fil de 0,50 mm de diamètre et fixé avec un fil de 0,08 mm, pour faciliter une visualisation complète tout en empêchant le mouvement de la tête. Utilisez le côté droit comme côté expérimental (côté OTM) et le côté gauche comme témoin sans bobine orthodontique (côté contrôle).
    REMARQUE : Une meilleure visualisation des structures intrabuccales doit être obtenue à l’aide d’un stéréomicroscope et d’un système de lumière optique.
  7. Nettoyez et mordancez les premières molaires et incisives droites à l’aide d’acétone et d’un apprêt automordançant, respectivement. Le système est auto-mordançant, ce qui signifie qu’il ne nécessite pas de conditionnement acide préalable.
    1. Appliquez l’apprêt en une seule étape, qui fonctionne également à la fois comme un acide et un adhésif. À l’aide d’un micropinceau, prélevez une petite quantité d’apprêt automordançant et appliquez-la sur la surface occlusale de la première molaire supérieure et des incisives. Il faut veiller à ce que l’apprêt automordançant n’atteigne pas la surface proximale entre la première et la deuxième molaire, car cela pourrait entraîner le collage des éléments dentaires, empêchant ainsi le mouvement des dents. Photopolymériser l’apprêt à la surface occlusale des molaires et des incisives pendant 30 s.
  8. Collez l’extrémité distale d’un ressort hélicoïdal ouvert NiTi à six boucles sur la surface occlusale de la première molaire maxillaire droite avec de la résine photopolymérisable et photopolymérisez pendant 30 s. Ajoutez un incrément de résine supplémentaire sur le bord du fil pour éviter d’endommager les souris et photopolymérisez pendant 30 s.
  9. Activez l’antenne à l’aide d’un appareil spécialement conçu composé d’un rail et d’un mécanisme à manivelle fixés à la table chirurgicale. Cela permet au mouvement longitudinal de glisser d’avant en arrière.
  10. Connectez l’extrémité libre en forme de boucle du fil rond de 0,20 mm au crochet du tensiomètre.
  11. Lors de l’activation de la manivelle, déplacez la table chirurgicale le long du rail jusqu’à ce que le dynamomètre enregistre une force de 0,35 N.
  12. Collez le fil rond de 0,20 mm aux deux incisives supérieures pour ancrer la bobine. Aucune autre réactivation n’est effectuée pendant la période d’expérimentation. Coupez le fil pour détacher l’animal du dynamomètre.  Ajoutez un autre incrément de résine pour que le bord métallique de l’appareil ne soit pas exposé et ne blesse pas l’animal. Photopolymérisation pendant 30 s. Démontez l’animal de la table.
  13. La première molaire supérieure droite avec un dispositif imposant une force de 0,35 N dans la direction mésiale est constituée du côté expérimental. Utilisez le côté gauche du maxillaire (sans appareil orthodontique) comme commande 4,16.
  14. Maintenez cet appareil pendant une période de 12 jours sans qu’aucune activation ne soit nécessaire. N’utilisez aucun médicament antidouleur. Le mouvement orthodontique se produit par le biais d’un processus inflammatoire, et les médicaments analgésiques peuvent affecter négativement la cascade d’acide arachidonique, ce qui a un impact sur le taux de remodelage osseux et peut invalider les résultats.
  15. Après la fin de la chirurgie, traitez les animaux avec une injection sous-cutanée de solution saline pour éviter la déshydratation pendant la période d’adaptation avec l’appareil. Gardez l’animal dans une cage individuelle chauffée jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli et ce n’est qu’après cette période qu’il place l’animal dans des cages collectives.
  16. Euthanasier la souris le 12ème jour par sédation avec injection intrapéritonéale d’une solution de 0,2 mL contenant de la xylazine (10 mg/Kg) et de la kétamine (100 mg/Kg) suivie d’une décapitation avec des ciseaux tranchants.

2. Mesures micro-CT

  1. Prélevez l’os maxillaire avec des ciseaux tranchants coupant tous les tissus mous, l’os zygomatique dans le plan sagittal, et la suture fronto-nasale et la synchondrose sphéno-occipitale dans le plan coronal. Immerger l’os maxillaire dans du formol tamponné neutre à 10 % (pH = 7,4) pendant une période de fixation de 48 h. Après cette période, changez la solution de formaldéhyde en alcool à 70%.
  2. Effectuez une micro-tomodensitométrie de l’os maxillaire avec les paramètres suivants pour les balayages haute résolution : taille de voxel isotrope de 9 à 18 μm, réglages de rayons X de 50 kV, filtre en aluminium de 0,5 mm et angle de rotation de 0,5°. Plus d’une mâchoire peut être ajustée pendant la scintigraphie microCT.
  3. Reconstruire les images acquises à l’aide du programme de reconstruction par microtomographie indiqué par le fabricant de la microtomodensitométrie (microTDM) utilisée17.
  4. Positionnez les images reconstruites à l’aide du programme d’inspection 3D indiqué par le fabricant de la microtomographie utilisée.
  5. Quantifier l’OTM en mesurant la différence de distance linéaire entre la jonction ciment-émail (CEJ) de la première et de la deuxième molaire de l’hémi-maxillaire droit (côté OTM) par rapport à l’hémi-maxillaire gauche (côté contrôle). Utilisez le logiciel d’analyse microCT approprié avec l’outil de ligne pour cette mesure 17,18,19,20.
  6. Vérifiez que les échantillons ne présentent pas de résorption radiculaire inflammatoire induite par l’orthodontie (OIIRR). Sélectionnez la région d’intérêt (ROI) de la racine disto-vestibulaire de la première molaire maxillaire à l’aide d’une méthode de contournage manuelle de la région d’intérêt anatomique irrégulière. Mesurez les paramètres suivants : densité minérale racinaire (RMD ; g/cm3) et pourcentage du volume racinaire par volume total (RV/TV ; %). Utilisez le logiciel d’analyse microCT approprié avec l’outil volumétrique 3D pour cette mesure 16,21.
  7. Effectuer la reconstruction de la première molaire maxillaire à l’aide du logiciel Mimics et analyser les données obtenues pour tirer des conclusions concernant l’OTM et l’OIIRR dans le modèle expérimental16,21.

Résultats

Ce protocole permet d’étudier un modèle de souris OTM à l’aide d’un ressort hélicoïdal NiTi. Avec une force de 0,35 N appliquée, la distance CEJ moyenne du côté du contrôle entre la première et la deuxième molaire était de 243,69 μm (figure 1A, ligne A), tandis que du côté OTM était mesurée à 284,66 μm (figure 1A, ligne B). La différence entre l’OTM et le côté témoin était de 40,97 μm (figure 1B). La distance linéaire entre le CEJ entre la première et la deuxième molaire de l’hémi-maxillaire droit (côté OTM) et de l’hémi-maxillaire gauche (côté contrôle) a été mesurée dans au moins six sections différentes avec l’outil de ligne à l’aide du logiciel d’analyse microCT approprié. La valeur moyenne des six mesures du côté OTM a été soustraite de la valeur moyenne du côté contrôle pour générer le résultat OTM (Figure 1).

En ce qui concerne l’OIIRR, des valeurs de RV/TV dentaire et de RMD ont été démontrées à la fois du côté témoin (71,02 ± 10,11 % et 1,071 ± 0,1536 g/cm2, respectivement) et du côté OTM (73,38 ± 6,162 % et 1,048 ± 0,2119 g/cm2 μm, respectivement ; Figure 2).

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Figure 1 : Mouvement orthodontique des dents (OTM). (A) Image représentative des côtés commande et OTM. (B) Résultats de la distance CEJ des côtés commande et OTM et de la différence entre la distance résultant de la distance OTM. Une force de 0,35 N a été appliquée dans la direction mésiale de la première molaire supérieure droite à l’aide d’un ressort hélicoïdal NiTi, et le point final de l’étude était le 12e jour. Moyenne ±écart-type des résultats OTM générés à partir de 10 souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Image représentative de la région d’intérêt (ROI) sélectionnée. Le ROI de la racine disto-vestibulaire de la première molaire maxillaire est indiqué, qui a été sélectionnée à l’aide d’une région d’intérêt anatomique irrégulière dessinée à l’aide de la méthode de contournage manuel pour analyser la densité minérale racinaire (RMD ; g/cm3) et le pourcentage de volume radiculaire par volume total (RV/TV ; %). Des résultats moyens ± d’écart-type ont été générés à partir de 10 souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ici, nous décrivons un protocole standardisé conçu pour élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents au remodelage osseux au cours de l’OTM. Une compréhension approfondie de ces mécanismes chez la souris nécessite un protocole méticuleusement planifié pour garantir l’exactitude et la fiabilité 7,11. Des études menées par notre groupe de recherche ont montré que ce protocole réduit efficacement la variabilité de l’opérateur en incorporant un jauge de tension et un appareil spécialement conçu, établissant 0,35 N comme la force optimale pour l’OTM dans un modèle murin 4,16,17,18,19,20 . Afin d’améliorer l’efficacité des procédures expérimentales et de maximiser l’utilisation d’échantillons d’animaux, les échantillons utilisés pour l’analyse par micro-tomodensitométrie peuvent également être traités pour l’histologie de routine. Par la suite, l’OTM peut être évalué en sections de 5 μm, en utilisant le CEJ comme point de référence pour les mesures16,19. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, ainsi que des techniques spécialisées telles que la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP) et le trichrome de Masson, constituent également des méthodes efficaces pour évaluer l’intégrité des racines et quantifier les ostéocytes, les ostéoclastes et les ostéoblastes dans les régions d’intérêt 4,5,16.

Les altérations dynamiques de la microstructure de l’os alvéolaire au cours de l’OTM chez les rongeurs ont été étudiées à l’aide de systèmes de micro-CT. Ces évaluations visent à offrir des informations précieuses pour le traitement orthodontique clinique14,15. La micro-tomodensitométrie est une technique analytique capable de capturer des structures internes avec une haute résolution et une précision au micron. Cette méthode permet de reconstituer des échantillons à petite échelle en images 3D détaillées, ce qui permet une analyse qualitative et quantitative précise des échantillons22. Conformément aux études précédentes, l’OTM a été évaluée en quantifiant l’écart linéaire entre l’ECJ de la première et de la deuxième molaire de l’hémi-maxillaire droit par rapport à l’hémi-maxillaire gauche 17,18,19,20. Dans le cadre de l’imagerie dentaire, la micro-TDM présente plusieurs avantages. Il peut identifier les petits défauts sur les surfaces radiculaires, mesurer avec précision les changements dentaires linéaires et évaluer la morphologie osseuse trabéculaire et corticale22,23. Il convient de noter que les lignes directrices actuelles pour l’évaluation de la microstructure osseuse chez les rongeurs à l’aide de la micro-TDM mettent l’accent sur l’ensemble minimal de variables recommandées pour décrire la morphométrie osseuse trabéculaire et corticale23. De plus, il est crucial d’analyser la survenue d’OIIRR, une complication grave lors d’un traitement orthodontique16,21. Les chercheurs doivent évaluer l’intensité de la résorption radiculaire, car la présence d’OIIRR indique que la force appliquée peut être excessive, nécessitant des ajustements16,21.

Le respect des étapes critiques de la recherche OTM sur des modèles animaux est essentiel pour obtenir des résultats fiables. Cela comprend une sélection minutieuse des animaux, en tenant compte de facteurs tels que la tension, l’âge, le métabolisme osseux, le taux de croissance et le patrimoine génétique. Le choix de modèles animaux influence considérablement les résultats de l’étude, car les variations de ces facteurs affectent la physiologie osseuse et la réponse aux forces orthodontiques6. Le moment de l’euthanasie des animaux est également essentiel, car il permet de saisir des étapes spécifiques du remodelage osseux en réponse aux forces orthodontiques. Par exemple, Taddei et al.4 ont effectué une analyse moléculaire à 0, 12 et 72 heures, avec une analyse histopathologique à 6 jours, permettant d’évaluer les changements temporels des marqueurs de remodelage osseux pendant l’OTM. De plus, les variations liées à l’âge de l’OTM ont été étudiées, mettant en lumière l’impact du vieillissement sur les processus de remodelage osseux23.

L’utilisation d’un ressort hélicoïdal NiTi, bien qu’efficace pour induire le mouvement des dents, présente certains inconvénients qui peuvent affecter le bien-être des animaux et les résultats expérimentaux. L’insertion d’un ressort hélicoïdal NiTi est considérée comme plus longue et plus exigeante techniquement par rapport aux méthodes alternatives, telles que l’utilisation de bandes élastiques7. Cette complexité accrue peut entraîner un risque plus élevé de blessure lors de l’insertion, ce qui peut à son tour entraîner des effets indésirables tels qu’une perte de poids corporel plus importante après la procédure et un taux de mortalité élevé chez les animaux7. D’après notre expérience, la surveillance quotidienne des animaux et la mise en œuvre de mesures de soutien, telles que des aliments adoucis, se sont avérées déterminantes pour minimiser les effets indésirables associés à l’utilisation de ressorts hélicoïdaux NiTi pour l’OTM dans les modèles animaux. Ces mesures contribuent non seulement au bien-être des animaux, mais améliorent également la fiabilité et la validité des résultats expérimentaux en réduisant les facteurs de confusion et en assurant la cohérence des protocoles de recherche 4,16,17,18,19,20.

L’utilisation de l’OTM chez la souris, combinée à l’analyse par micro-TDM, offre un modèle approprié pour sonder les mécanismes d’adaptation osseuse, de résorption radiculaire et de réponses cellulaires aux stimuli de force mécanique. Cette approche intégrée fournit des informations précieuses sur les processus complexes qui sous-tendent le traitement orthodontique et facilite le développement de nouvelles stratégies et interventions thérapeutiques.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous tenons à exprimer notre sincère gratitude à Mlle Beatriz M. Szawka pour sa contribution au schéma de principe et à Mme Ilma Marçal de Souza pour son soutien technique. J.A.A.A. est récipiendaire d’une bourse accordée par la Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, E-26/200.331/2024), Brésil. Cette étude a été soutenue par le Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (406928/2023-1), la Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais et le Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (code financier 001), Brésil. Les auteurs remercient le Prof. Dr. Eduardo H. M. Nunes de LabBio/UFMG pour l’analyse par microtomographie à rayons X.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AcétoneSigma-Aldrich67-64-1
Pince distaleQuinelatoQO.700.00
DynamomètreSHIMPOFGE-5XY
Illuminateur à fibre optiqueCole-ParmerN/A
kétamineSyntec100477-72-3
NiTi ressort hélicoïdal ouvert 0,25 x 0,76Lancer Orthodontics
Ø ; 0,20 mm rond chrome-nickel (CrNi)Morelli55.01.208
Fil orthodontique dur élastique rond CrNi & Oslash ; 0,50 mm (.020 pouce)Morelli55.01.050
Fil d’attache rond CrNi & Oslash ; 0,20 mm (.008 pouce)Morelli55.01.208
StéréomicroscopeQuimisQ7740SZ
Transbond Plus Amorce d’autogravure3MLE-Q100-1004-7
Pince WeingartQuinelatoQO.120.00
XylazineSyntec23076-35-9
MicroCT Analysis
Skyscan 1174v2Bruker1174v2
Software
NReconSkyscanN/A
DataViewerSkyscanN/A
CTAnSkyscanN/A
ImitesMaterialiseN/A

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