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Article de méthode

Modèle de lésion pulmonaire aiguë à la suite d’une ischémie-reperfusion viscérale par clampage croisé de l’aorte supra-cœliaque chez le rat

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DOI :

10.3791/66896

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15 août 2025

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1Department of Vascular Surgery, Rouen University Hospital, 2INSERM U1096, FHU REMOD-VHF, Rouen University Hospital

Dans cet article

Résumé

Cette étude décrit un modèle de lésion pulmonaire aiguë suite à une ischémie-reperfusion viscérale lors d’un clampage croisé de l’aorte supra-cœliaque par laparotomie chez le rat. Il permet d’étudier à la fois les effets cliniques et biologiques du clampage aortique ainsi que l’impact de l’ischémie-reperfusion sur les organes sous-jacents et les lésions pulmonaires à distance.

Résumé

La chirurgie ouverte des anévrismes de l’aorte abdominale nécessite une interruption transitoire de la circulation sanguine, provoquant une ischémie-reperfusion des organes en aval. Les artères rénales, mésentériques et splanchniques peuvent être touchées. Aucune thérapie ne s’est avérée efficace pour prévenir les lésions pulmonaires à distance causées par l’ischémie-reperfusion après un clampage aortique supra-cœliaque. Pour étudier les voies physiopathologiques des lésions pulmonaires aiguës et les traitements pharmacologiques, un modèle expérimental de clampage aortique a été développé chez le rat.

Une analgésie sous-cutanée à la buprénorphine (0,05 mg/kg) est administrée avant l’intervention. L’anesthésie générale avec ventilation spontanée est induite à l’aide d’un gaz halogène (Isoflurane 2,5 %) via un masque. Une laparotomie xypho-pubienne est réalisée sur une table chauffée (température surveillée par voie intrarectale). Le bloc gastro-splénique et les intestins sont rétractés vers le flanc droit, et le foie est mobilisé vers la partie supérieure de l’abdomen. Le diaphragme et ses piliers sont identifiés pour permettre la libération progressive de l’aorte supra-cœliaque de son passage intradiaphragmatique. La dissection est effectuée en douceur pour obtenir un contrôle circonférentiel de l’aorte entre les piliers du diaphragme. Le tronc cœliaque sous-jacent et l’artère mésentérique supérieure sont soigneusement identifiés. Une pince microvasculaire peut être utilisée pour l’occlusion aortique au-dessus des artères viscérales. Le bon clampage est vérifié par l’absence de pulsatilité aortique, associée à la pâleur de l’intestin grêle. Le rat reste anesthésié pendant toute la durée de l’ischémie. À la fin de la durée de l’ischémie, le microclamp est retiré et la pulsatilité aortique, ainsi que la recoloration intestinale, sont vérifiées. La paroi abdominale est fermée par une suture, suivie d’une fermeture de la peau du rat. À la fin de la période de reperfusion, l’animal est anesthésié de la même manière. Il est euthanasié par exsanguination lors d’un prélèvement sanguin, et le poumon peut ensuite être prélevé. Les lésions pulmonaires peuvent être évaluées par l’analyse des gaz du sang, la gravimétrie pulmonaire et l’examen histologique. Les échantillons de poumons peuvent également être utilisés pour les analyses RT-PCR et Western blot.

Introduction

Un anévrisme de l’aorte est une dilatation focale et permanente de l’aorte1. L’évolution d’un anévrisme tend vers une rupture, associée à une hémorragie massive, qui entraîne une mortalité importante2. Par conséquent, l’objectif du traitement réside dans la prévention de cette complication dramatique. Les anévrismes de l’aorte sont le plus souvent infrarénaux et peuvent être traités par une endoprothèse aortique. Une endogreffe aorto-bi-iliaque est un stent bifurqué couvert qui est introduit de manière peu invasive à travers les artères fémorales par une approche percutanée. Cette technique ne nécessite pas de clampage aortique et évite de provoquer une ischémie viscérale. Il peut être réalisé sous anesthésie locale. En revanche, les anévrismes de l’aorte plus étendus, tels que les anévrismes thoraco-abdominaux et les anévrismes complexes de l’aorte abdominale, sont plus difficiles à traiter à l’aide de techniques endovasculaires. Cela est dû à l’implication des artères rénales, de l’artère mésentérique supérieure et du tronc cœliaque dans le segment anévrismal (Figure 1). Ces principales artères viscérales doivent être reconstruites en plus de l’aorte elle-même. L’approche endovasculaire, mini-invasive, nécessite donc une procédure plus complexe impliquant l’utilisation d’endogreffes fenestrées et/ou ramifiées pour la reconstruction de l’artère viscérale. La principale limitation de ces endogreffes est le long temps de fabrication - souvent plusieurs mois - qui les rend inadaptées au traitement d’urgence. Dans de tels cas, la réparation chirurgicale ouverte conventionnelle reste une option réalisable et fiable.

Le traitement par réparation ouverte nécessite une laparotomie et un clampage supra-viscéral, c’est-à-dire une ischémie viscérale temporaire. Le taux de complications est élevé lors du traitement de ces anévrismes thoraco-abdominaux. La mortalité varie de 5 à 15 %3. Des complications pulmonaires surviennent chez 60 % des patients et des complications rénales chez 40 %4. Ces complications, associées à une réponse inflammatoire systémique, peuvent évoluer vers une insuffisance multiviscérale5. Cette morbi-mortalité est multifactorielle, impliquant des agressions chirurgicales, une anesthésie, une analgésie, des variations hémodynamiques, un choc hémorragique et des phénomènes d’ischémie-reperfusion. L’agression chirurgicale contribue à la manifestation de complications, que l’approche comprenne une thoracotomie, une phrénotomie, une lombomie, ou une laparotomie, en modifiant la mécanique ventilatoire, avec notamment une altération de la fonction diaphragmatique6.

La reperfusion temporaire de l’ischémie viscérale affecte les organes en aval, notamment le tube digestif, le système splanchnique, les reins et les membres inférieurs7. Les complications pulmonaires sont les effets indésirables les plus fréquents après une chirurgie de l’aorte thoraco-abdominale. Leur origine est multifactorielle. Le clampage aortique supracœliaque ne provoque pas directement d’ischémie-reperfusion pulmonaire. Cependant, l’ischémie-reperfusion des organes viscéraux en aval déclenche une réponse inflammatoire systémique majeure. L’hypothèse d’un lien de causalité entre l’ischémie-reperfusion viscérale et la survenue de lésions à distance - en particulier des lésions pulmonaires - est bien étayée. La dysfonction endothéliale pulmonaire, un composant essentiel de la membrane alvéolaire-capillaire, semble être essentielle au développement de l’insuffisance pulmonaire aiguë (ALI). Une réponse inflammatoire systémique massive et l’activation des neutrophiles jouent un rôle central dans ce processus.

L’ALI est souvent définie sur la base de critères histologiques plutôt que sur la présentation clinique. L’ALI fait référence à un trouble inflammatoire aigu caractérisé par la perturbation des barrières endothéliales et épithéliales pulmonaires. La membrane alvéolaire-capillaire, l’unité fonctionnelle du poumon, se compose de trois composants : l’endothélium microvasculaire, l’espace interstitiel et l’épithélium alvéolaire.

L’une des caractéristiques de l’ALI est l’augmentation de la perméabilité de cette barrière, entraînée par l’infiltration des neutrophiles et la libération de médiateurs cytotoxiques pro-inflammatoires. Les lésions épithéliales alvéolaires impliquent à la fois des pneumocytes de type I et de type II. Les cellules de type I, qui couvrent 95 % de la surface alvéolaire, sont très sensibles aux lésions et jouent un rôle clé dans les échanges gazeux. Les cellules de type II, plus nombreuses mais couvrant une zone plus petite, sont essentielles à la production de tensioactifs, à la réparation épithéliale et au transport des ions. Après une lésion, les cellules de type II contribuent à la restauration de l’intégrité alvéolaire grâce à leur capacité de régénération et de différenciation en cellules de type I.

De multiples voies de mort cellulaire ont été impliquées dans les lésions épithéliales au cours de l’ALI, les cellules de type I étant particulièrement vulnérables. L’ALI est généralement évaluée en évaluant l’œdème pulmonaire, avec ou sans mesures de la perméabilité microvasculaire pour refléter le dysfonctionnement endothélial.

L’objectif de ce modèle est d’étudier le lien entre l’ischémie-reperfusion viscérale et le développement de lésions pulmonaires à distance, tant au niveau métabolique que mécaniste, comme illustré sur la figure 2. Ce lien spécifique n’est que partiellement compris. Notre modèle de clampage aortique représente un scénario d’ischémie-reperfusion viscérale sur une aorte saine, sans la présence d’un anévrisme de l’aorte abdominale chez le rat. Au-dessus du tronc cœliaque, il n’y a pas de branches majeures chez les humains ou les rats. L’aorte au-dessus de ce niveau correspond à l’aorte supra-cœliaque, qui ne donne naissance qu’à de petites branches pariétales alimentant la paroi thoracique. Par conséquent, il n’y a pas de différence significative dans l’anatomie vasculaire des principaux vaisseaux à ce niveau entre les humains et les rats.

L’utilisation de ce modèle permet une exploration approfondie. Il aidera à identifier des biomarqueurs précoces dans le développement de lésions tissulaires à distance. De plus, ce modèle permet d’étudier des inhibiteurs potentiels, y compris les inhibiteurs des médiateurs circulants ou les inhibiteurs de lésions spécifiques d’organes distants.

D’autres modèles d’ischémie-reperfusion sont utilisés pour étudier les lésions à distance. Les modèles d’ischémie-reperfusion cérébrale, intestinale et rénale sont fortement représentés 8,9,10. Des recherches approfondies ont été menées sur les lésions pulmonaires après une ischémie-reperfusion intestinale due à une occlusion transitoire de l’artère mésentérique supérieure (SMA)11,12,13. Les durées d’ischémie et de reperfusion sont extrêmement variables, allant de quelques minutes à plusieurs heures14,15. La raison d’être de la durée de l’ischémie est d’induire une agressivité suffisante pour déclencher une réponse significative conduisant à la survenue de lésions à distance. Une durée trop courte d’ischémie peut ne pas provoquer une altération significative de la voie métabolique étudiée. En ce qui concerne la durée de reperfusion, la raison réside dans l’apparition précoce de lésions à distance et la nature potentiellement transitoire des changements physiopathologiques. La durée idéale de la reperfusion ne doit être ni trop précoce ni trop tardive pour caractériser adéquatement une déficience métabolique.

Les modèles sont principalement chez les rongeurs. Les avantages des rongeurs comprennent leur petite taille, leur facilité d’entretien, leur cycle de vie court et leurs ressources génétiques abondantes16. L’utilisation de grands animaux tels que les porcs, les chiens ou les primates ne semble pas justifiée en l’absence de bénéfices supplémentaires, ce qui s’aligne sur les règles éthiques de l’expérimentation animale en matière de raffinement. De plus, en raison de leur similitude anatomique, physiologique et génétique avec l’homme, les rongeurs permettent des études translationnelles16.

L’une des principales limites des modèles de clampage de l’AS est que, dans la pratique clinique, le début de la période d’ischémie intestinale n’est pas identifiable. Cela rend l’extrapolation aux situations cliniques humaines plus incertaine. En revanche, lors d’une chirurgie aortique complexe, les périodes d’ischémie et de reperfusion des différents organes sont clairement identifiées. De plus, lors du clampage aortique supra-cœliaque, tous les viscères sous-jacents sont en période ischémique (tube digestif, foie, rate, reins, organes pelviens et membres inférieurs). Tous ces organes subissent le phénomène d’ischémie-reperfusion. À l’inverse, les modèles d’ischémie-reperfusion centrés sur un organe spécifique (intestin, rein, foie, etc.), les modèles de clampage aortique et donc d’ischémie-reperfusion de plusieurs organes avec physiopathologie métabolique sont moins étudiés. De même, les lésions à distance telles que les lésions pulmonaires après le clampage aortique sont peu étudiées en termes de métabolisme17,18.

Les modèles de clampage aortique existants sont principalement axés sur le clampage de l’aorte abdominale sous les artères rénales. La limitation de ce modèle est qu’il n’induit pas d’ischémie-reperfusion viscérale. Par conséquent, il ne permet pas de démontrer un lien entre l’ischémie-reperfusion viscérale et les lésions potentielles à distance18,19. De plus, il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier l’ischémie-reperfusion par clampage aortique, c’est pourquoi l’analyse à l’aide de modèles in vivo reste nécessaire.

Par conséquent, ce modèle expérimental de clampage aortique supra-cœliaque chez le rat facilite une étude complète des mécanismes physiopathologiques et des interventions pharmacologiques ciblant les lésions pulmonaires à distance.

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Protocole

La création de ce modèle est conforme aux directives en matière de soins et d’expérimentation animale, ainsi qu’à la législation française et européenne. Ce modèle a été validé dans une étude expérimentale sur des animaux qui a été approuvée par le Comité Régional d’Éthique Universitaire de Normandie, Rouen, France (n°APAFIS : #18974).

1. Modèle animal et acclimatation

  1. Période d’adaptation des modèles animaux
    REMARQUE : Le modèle adhère aux principes de raffinement.
    1. Hébergez les animaux dans des installations non surpeuplées pendant une semaine pour permettre l’adaptation avant la chirurgie.
    2. Hébergez les rats deux par cage avec un accès ad libitum à de l’eau et de la nourriture, qui seront vérifiées quotidiennement par du personnel expérimenté.
    3. Vérifiez quotidiennement la propreté de la literie (bandes de papier) et changez-la systématiquement par du personnel expérimenté deux fois par semaine ou plus si nécessaire.
    4. Après une période d’acclimatation d’une semaine, au cours de laquelle ils auront un contact quotidien avec l’expérimentateur et une exposition à des cycles d’éclairage de 12 heures, les procédures auront lieu dans une pièce séparée et calme avec le même expérimentateur.
  2. Espèces modèles animales
    1. Utilisez des rats Wistar ou Sprague Dawley mâles pour éviter les influences hormonales, telles que l’œstradiol, sur l’analyse de la physiopathologie de l’ischémie-reperfusion viscérale provenant d’un établissement d’élevage accrédité et certifié11,20.
    2. Déterminez à l’avance les groupes expérimentaux et le nombre d’animaux par groupe.
    3. Choisissez l’âge, il est recommandé d’utiliser des rats de 6 à 10 semaines (350 g).

2. Anesthésie et analgésie

  1. Analgésie
    1. Pesez chaque animal le jour de l’intervention.
    2. Administrer la buprénorphine (0,05 mg/kg) par voie sous-cutanée au niveau de la peau du dos du rat 1 h avant l’intervention à des fins analgésiques à l’aide d’une aiguille de 25 g et d’une seringue de 2 mL.
    3. Appliquez le gel de chlorhydrate de lidocaïne 1 % sur la peau de l’abdomen au niveau de la future incision cutanée. Réévaluez la douleur régulièrement (au moins deux fois par jour) en postopératoire à l’aide d’une échelle pour évaluer les expressions faciales de la douleur chez le rat21.
    4. Administrer pendant les premières 24 h, des injections sous-cutanées systématiques de buprénorphine (0,01 à 0,05 mg/kg) toutes les 8 h.
    5. Par la suite, administrer des injections de buprénorphine (0,01 à 0,05 mg/kg) basées sur l’échelle de douleur faciale du Centre national pour le remplacement, le raffinement et la réduction des animaux en recherche, et répétées toutes les 8 heures si nécessaire21.
  2. Anesthésie générale
    1. Utiliser des gaz halogénés (Isoflurane) pour l’anesthésie générale22.
    2. Utiliser une chambre ventilée avec de l’isoflurane (5 %) à un débit d’air de 2 L/min pendant 2 min pour la phase d’induction.
    3. Pour l’entretien de l’anesthésie, passer le rat à un masque sur mesure pour une ventilation spontanée à l’isoflurane (2-2,5 %) à un débit d’air de 2 L/min tout au long de l’intervention.
    4. Dégagez les voies respiratoires supérieures en retirant la langue de la cavité buccale pour permettre la ventilation via le masque.
    5. Surveillez en permanence la profondeur de l’anesthésie pendant la procédure et ajustez la concentration d’isoflurane au besoin.

3. Mise en place du rat pendant la procédure

  1. Placez le rat en position couchée dorsale avec les membres antérieurs et postérieurs immobilisés à l’aide de ruban adhésif, tout en respectant les amplitudes de mouvement articulaires physiologiques du rat.
  2. Placez le rat sur un coussin chauffant réglé à 37 °C avec surveillance de la température rectale.
  3. Protégez les yeux en appliquant du dacryogel. Rasez la fourrure abdominale et désinfectez soigneusement l’abdomen avec une solution de povidone iodée.

4. Intervention chirurgicale

  1. État de l’intervention chirurgicale
    1. Effectuez la procédure sous une loupe microchirurgicale pour faciliter les manœuvres délicates, bien que cela ne soit pas indispensable.
  2. Incision
    1. Après la palpation de l’apophyse xiphoïde au bord supérieur de l’incision, inciser la peau au centre de l’abdomen, révélant la linea alba des muscles abdominaux.
    2. Incision centrale du muscle abdominal sur la linea alba pour éviter les saignements des muscles abdominaux.
  3. Exposition intra-abdominale
    1. Maintenez la paroi abdominale des deux côtés à l’aide d’écarteurs auto-retenus.
    2. Assurez-vous de l’absence d’anomalies (tumeurs), mobilisez les viscères, l’estomac, la rate et le foie vers le côté droit de l’abdomen, puis exposez l’aorte supra-cœliaque.
    3. Gardez tous les viscères à l’intérieur de l’abdomen autant que possible à l’aide d’une petite compresse pliée dans le sens de la longueur et trempée dans une solution saline chaude (37 °C).
    4. Couvrez tous les viscères avec une compresse imbibée d’une solution saline réchauffée à 37 °C, pour prévenir l’hypothermie et la déshydratation.
  4. Identification des principaux vaisseaux intra-abdominaux
    1. Identifiez l’aorte supra-cœliaque par ses pulsations et sa localisation entre les piliers diaphragmatiques.
    2. Contrôle de l’aorte entre les piliers diaphragmatiques avec une dissection douce et minutieuse à l’aide d’applicateurs à bout de coton et de pinces à dissection pour libérer l’aorte de la manière la plus traumatisante possible.
    3. Encerclez l’aorte supra-cœliaque à l’aide d’une suture monofilament 5-0 avec une pince de dissection et de ligature.
    4. Vérifiez l’origine du tronc cœliaque et de l’artère mésentérique sous-jacente. La durée de cette intervention chirurgicale est de 10 à 15 minutes par rat.
    5. L’identification sous-jacente de la veine cave inférieure sous-rénale est facile en raison de la transparence du rétropéritoine.
    6. Libérez la veine cave inférieure sous-rénale uniquement sur sa surface antérieure, ce qui permet l’administration intraveineuse directe de tout agent pharmacologique.
  5. Injection intraveineuse
    1. Pour cela, utilisez une aiguille injectable de 30 G et placez quelques millimètres de compresse hémostatique pour obtenir une hémostase.
    2. En cas de préconditionnement pharmacologique, administrer l’injection avant le clampage aortique. Pour un traitement post-conditionnement, administrez-le pendant ou après le clampage aortique.
    3. Ce protocole étudiait le préconditionnement pharmacologique, donc administrer 5 min avant le clampage aortique.
  6. Période ischémique
    1. Clampez l’aorte cœliaque avec une pince microvasculaire atraumatique pendant toute la période ischémique de 40 minutes. Vérifier l’efficacité de la pince par la disparition des pulsations aortiques sous-jacentes et la décoloration des viscères et des membres à plusieurs reprises pendant le clampage.
    2. Fermez partiellement l’abdomen avec trois simples sutures résorbables tressées 5-0 pour limiter les pertes d’eau et de chaleur. Couvrez l’incision chirurgicale avec une compresse stérile imbibée d’une solution saline chaude pendant toute la durée de l’ischémie.
  7. Période de reperfusion
    1. À la fin de la période ischémique, rouvrir l’abdomen et exposer l’aorte de la même manière que décrite précédemment.
    2. Retirez la pince vasculaire et vérifiez la reprise de la pulsatilité aortique sous-jacente et la recoloration des viscères et des membres. La période de reperfusion commence immédiatement après le retrait de la micro-pince.
  8. Fermeture de l’abdomen
    1. Remettez les viscères dans leur position d’origine et fermez l’abdomen avec une suture résorbable tressée 5-0 sur la linea alba et la peau avec une suture résorbable monofilament 5-0.
  9. Réveil animal
    1. Placez le rat en position de décubitus latéral gauche pour éviter de comprimer la veine cave inférieure par la masse viscérale et le contexte d’hypovolémie. Placez le rat dans une cage individuelle avec une lampe chauffante pour maintenir la température jusqu’au réveil, environ 10 minutes plus tard.
  10. Deuxième anesthésie générale
    1. À la fin de la période de reperfusion de 180 minutes, anesthésier le rat en utilisant le même gaz anesthésique à travers une chambre ventilée avec de l’isoflurane (5 %) à un débit d’air de 2 L/min pendant 2 min pour la phase d’induction.
    2. Pour le maintien de l’anesthésie, passer le rat à un masque sur mesure pour une ventilation spontanée à l’isoflurane (2-2,5 %) à un débit d’air de 2 L/min pendant toute la période de collecte de tissus.

5. Échantillonnage

  1. Échantillons de sang
    1. Prélever des échantillons de sang à l’aide d’une aiguille de 23 G et d’une seringue de 5 mL par ponction directe dans la veine cave inférieure sous les veines rénales.
    2. Obtenir l’hémostase après la ponction en appliquant un petit morceau de compresse hémostatique.
    3. Utilisez une petite portion (100 μL) du sang total pour l’analyse des gaz et du sang standard sur une seule carte de test de température ambiante.
    4. Prélevez le sang total restant dans un tube EDTA de 4 mL et centrifugez-le à 1 000 × g pendant 10 min à +4 °C.
    5. Congeler le plasma dans des cryotubes dans de l’azote liquide et le conserver à -80 °C jusqu’à l’analyse.
  2. Échantillons de tissus
    1. Prélèvement de tissus
      1. Prélever des échantillons de tissus (poumons, intestins, reins, foie et cœur) pendant l’euthanasie de l’animal. Effectuer l’euthanasie par prélèvement sanguin conduisant à l’exsanguination après anesthésie générale à l’isoflurane selon le même protocole que celui mentionné précédemment.
      2. Par l’abdomen ouvert, prélevez 50 mg de chaque tissu : le pôle supérieur du rein gauche, le lobe hépatique gauche et l’intestin grêle distal 1 cm avant le caïcum.
      3. Ensuite, effectuez rapidement une sternotomie médiane pour identifier le cœur et les poumons.
      4. Libérez le poumon gauche de son ligament et retirez-le entièrement pour une analyse histologique. Libérez le poumon multilobe droit de ses ligaments. Séparez le lobe antérieur pour les analyses d’acides nucléiques et de protéines, conservez le reste dans une tasse avec du sérum physiologique à 37 °C pendant quelques minutes pour effectuer ensuite une gravimétrie.
      5. Extrayez le cœur dans son ensemble avec des sections de l’aorte, de l’artère pulmonaire et des deux veines caves. Prélever un échantillon du ventricule gauche pour des analyses d’acides nucléiques et de protéines, conserver le reste dans une tasse contenant du sérum physiologique à 37 °C pendant quelques minutes pour effectuer ensuite une gravimétrie.
    2. Analyse des acides nucléiques
      1. Pour l’analyse des acides nucléiques, prélever immédiatement une portion de 50 g de tissu. Congelez-le dans de l’azote liquide puis conservez-le à -80 °C jusqu’à l’analyse.
      2. Extraire l’ARN total avec un réactif prêt à l’emploi pour l’isolement d’ARN total de haute qualité selon le protocole du fabricant.
      3. Déterminez la concentration et la pureté de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre. Mesurez la concentration d’ARN à l’aide de 2 μL d’échantillon, avec 2 μL d’eau sans RNase comme référence à blanc. Utilisez l’absorbance à 260 nm pour déterminer la concentration d’ARN.
        REMARQUE : La pureté acceptable de l’ARN a été définie comme un rapport d’absorbance de 260/280 et 260/230 variant entre 1,7 et 2,0.
      4. Utilisez 1 μg de chaque échantillon d’ARN pour la transcription inverse.
      5. Mesurez les niveaux d’ARNm de cytokines pro-inflammatoires (IL-1bêta, TNF-alpha, IL-6) et d’une référence interne (bêta2-microglobuline), par réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR) dans un thermocycleur rapide à plaque avec des capacités de détection en ligne intégrées en temps réel à l’aide d’un mélange réactionnel à démarrage à chaud prêt à l’emploi (les amorces sont répertoriées dans le tableau 1).
      6. Calculez le niveau relatif d’ARNm à l’aide de la méthode 2-ΔΔCT.
    3. Analyse des protéines
      1. Pour l’analyse des protéines, placez 50 mg de tissu dans un tube de lyse de 2 ml contenant cinquante billes de céramique d’oxyde de zirconium de 2,8 mm. Ce tube de lyse contient 1 mL de tampon de lyse par dosage par radioimmunoprécipitation (RIPA) avec un comprimé inhibiteur de protéase et un comprimé inhibiteur de phosphatase.
      2. Extraire les protéines des échantillons par homogénéisation sur le laminoir à tubes du laboratoire avec 3 répétitions de contrôle de 5 secondes, suivies d’une période de repos de 10 secondes.
      3. Centrifuger les échantillons à 10 000 g à +4 °C pendant 10 min, et stocker les surnageants dans des cryotubes à -20 °C jusqu’à l’analyse.
      4. Déterminer les concentrations de protéines à l’aide d’une méthode de dosage des protéines basée sur Bradford et conserver les échantillons à −80 °C.
      5. Séparez une quantité égale de protéines de chaque échantillon à l’aide de SDS-PAGE.
      6. Transférer les protéines sur des membranes de nitrocellulose de 0,2 μm.
      7. Incuber la membrane après l’avoir bloquée avec 5 % de lait écrémé en poudre TBS-Tween pendant 1 h, avec un anticorps primaire contre la protéine spécifique de votre choix. Par exemple, pour explorer l’héparanase, utilisez un anticorps primaire polyclonal de lapin contre l’héparanase humaine (dilution 1:2000) et une protéine témoin comme GAPDH, utilisez un anticorps primaire monoclonal de chèvre contre GAPDH (dilution 1:5000) pendant la nuit à 4 °C.
      8. Lavez les taches trois fois avec la mémoire tampon TBST-Tween 0,1 %.
      9. Incuber avec un anticorps secondaire conjugué à HRP dirigé contre l’anticorps primaire à température ambiante (RT) pendant 1 h dans une solution bloquante. Par exemple, pour explorer l’héparanase, utilisez l’anticorps secondaire de chèvre contre le lapin (dilution 1:5000) et pour explorer le GAPDH, utilisez l’anticorps secondaire du lapin contre la chèvre (dilution 1:10000).
      10. Détectez les complexes immuns à l’aide du système de détection par chimiluminescence améliorée (ECL).
      11. Analysez les membranes à l’aide d’un logiciel dédié pour déterminer les valeurs densitométriques des bandes cibles, en utilisant GAPDH comme contrôle interne. Effectuer une analyse densitométrique de la bande correspondant à l’héparanase (50 kDa) et la normaliser en bande protéique GAPDH (35 kDa) pour déterminer l’intensité relative du signal.
    4. Analyse histologique
      1. Pour l’analyse histologique, prélever le poumon unilobar gauche au niveau du hile, puis perfuser à travers la bronche principale gauche avec une solution de cryoconservation à l’aide d’un cathéter de 16 G. Congelez-le dans de l’azote liquide et conservez-le à -80 °C.
    5. Analyse gravimétrique
      1. Après l’analyse des échantillons d’acides nucléiques et de protéines, analysez la partie restante du cœur et du poumon multilobulaire droit par gravimétrie, avec dessiccation dans des fours à 70°C, ce qui permet d’estimer le rapport poids humide/sec pour fournir une estimation de l’œdème tissulaire.

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Résultats

Ce protocole s’est avéré sûr, avec des pertes d’animaux minimes (moins de 5 %) pendant l’anesthésie et la chirurgie, et efficace pour l’induction de lésions pulmonaires aiguës. L’anesthésie à l’isoflurane était plus sûre que celle de la kétamine associée à l’anesthésie à la xylazine (perte d’environ 15 %), avec un réveil rapide et une meilleure récupération chez le rat (données non présentées). Tous les animaux anesthésiés ont pu subir un clampage aortique sûr et efficace avec cette méthode. Tous les animaux (100 %) avec...

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Discussion

Ce modèle chirurgical de clampage croisé aortique offre l’avantage de permettre une analyse complète, à la fois tissulaire et plasmatique, de la lésion pulmonaire aiguë suite à une ischémie-reperfusion viscérale. Il offre également la possibilité de tester des molécules pharmacologiques avec une administration intrapéritonéale, entérale ou intraveineuse en pré ou post-conditionnement.

L’une des étapes critiques reste le clampage de l’aorte supracœliaque pendan...

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,2 et micro ; m membranes nitrocellulosiques Trans-Blot Turbo Transfert PackBio-Rad16201500,2 et micro ; M Membranes de nitrocellulose prédécoupées
Seringue Luer Slip 1cc sans aiguilleTerumoMDSS01SESeringue Luer Slip 1cc sans aiguille
Seringue Luer Slip 2cc sans aiguilleBecton DinckinsonSeringue Luer Slip 2cc sans aiguille
Tube EDTA de 4 mL BD K3 13 mm x75 mmBD VacutainerBD368860Tube EDTA de 5 mL BD K3 13 mm x 75 mm
Suture tressée 5-0 / Vicryl 5-0 (Ethicon) ou Novosyn (B. Braun)Ethicon - Johnson & JohnsonV7970EVicryl 5-0 Aiguille Cône Pointe 1/2 cercle 13 mm Longueur 45 cm
Suture résorbable monofilament 5-0 / Monocryil PoliglecaproneEthicon - Johnson & JohnsonY493GAiguille 3/8 cercle Longueur 18in
Seringue Luer Slip 5cc sans aiguilleTerumoSS-05LE1Seringue Luer Slip 5cc sans aiguille
Pince microvasculaire atraumatique/Pinces de vaisseaux jetables pour veineAROSurgiqueTKF-1-20gPince microvasculaire atraumatique pour utilisation veineuse afin de clamper l’aorte du rat
BD Microlance 3 23 G x 1 0,6 x 25 mmBD Vacutainer300800BD Microlance 3 23 G x 1 0,6 x 25 mm
BD Microlance 3 25 G x 5/8 0,5 x 16 mmBD Vacutainer300600BD Microlance 3 25 G x 5/8 0,5 x 16 mm
Microlance BD 3 30 G x 1/2 0,3 x 13 mmBD Vacutainer304000Microlance BD 3 30 G x 1/2 0,3 x 13 mm
bêta-actine InvitrogenCarlsbad, États-UnisRéférence 15G5A11/E2
Méthode de dosage des protéines basée sur BradfordBiorad, Marnes-la-Coquette, France5000201
BuprénorphineBuprénorphine
Centrifugeuse Sigma 3-30Sigma, Allemagne10375, 10376, 10377, 10378, 10379, 91276, 109014Centrifugeuse pour eppendorf
cOmplete MiniRoche11836153001Cocktail inhibiteur de protéase 25 comprimés
Coton-tige
Dacryogel /  ; Gel oculaire Lubrithal 10 gProduits vétérinaires DechraCode  ; ACL7376464Gel oculaire Lubrithal 10 g
Scalpel jetablePrimordialPDSS11Lame de scalpel jetable n° ; 11
ÉlectrocautérisationDentRMedEMB/87400Stylo hémostatique à température élevée
Système de détection ECL amélioréBiorad, Hercules, Californie, États-UnisN° 1705060S
Moulin à billes Fisherbrand 24Fisher scientifique15515799Utilisé pour  ; broyage, lyse et homogénéisation d’échantillons biologiques avant l’extraction moléculaire
Tampons de gaze  ;Raffin.010106Tampons de gaze  ;
Logiciel ImageLabTMBioradsur clé USB ou licence
Isoflurane 5 %Isoflurane 5 %
Lidocaïne Prilocaïne gel 5 %  ;Aguettant, Lyon, FranceLidocaïne Prilocaïne gel 5 %  ;
LightCycler 480 InstrumentRoche, Bâ ; le, Suisse5015243001thermocycleur
Gelée lubrifiante stérile K-Y 82 gRECKITT BENCKISERGelée lubrifiante stérile K-Y 82 g
NanoDrop 2000TermoScientific, Waltham, Massachusetts, États-UnisND-2000spectrophotomètre
Peha Pince anatomiqueHartmann991063Pince anatomique
PhosSTOPRoche4906837001inhibiteur de la phosphatase 20 comprimé
Plâtre/ruban adhésifAnapore135320Ruban adhésif chirurgical/pansement
Povione-iode en solution / Vé ; té ; dine SolutionVé ; le toquinolSolution antiseptique à usage externe
Tube du kit de lysing Precellys  ;Homogénéisation des tissus durs CK28, BertinCK28Tube du kit de lysing Precellys  ;
Prolè ; ne Suture en prolypropylèneEthicon - Johnson & Johnson7472HProlè ; ne 5-0 Aiguille Conique coupe 3/8 cercle 13 mm Longueur 75 cm
Tubes Safe-Lock 1,5 mLEppendorf.0030120086Tubes Safe-Lock 1.5cc no color 1000 tubes pour la centrifugation
Tubes Safe-Lock 2 mLEppendorf.0030120094Tubes Safe-Lock 2.0cc no color 1000 tubes pour la centrifugation
Tubes Safe-Lock 5 mLEppendorf.0030119401Tubes Safe-Lock 5.0cc no color 200 tubes pour la centrifugation
Solution saline NaCl 0,9 %Aguettant, Lyon, France600502Solution saline 0,9 % 500 mL
PAGE DE DONNÉES DE SÉCURITÉSigma-Alrich
Cathéter Surflash IV 16 gTerumoSR*FF1651
ChirurgieEthicon - Johnson & JohnsonÉcouvillons hémostatiques résorbables
Set de sutures n° ; 12Hartmann4701762Kit de suture stérile avec champ d’adhérence, ciseaux, pince Adson, porte-aiguille
SYBR Green KIT Light Cycler 480 SYBR Green I MasternRoche4707516001SYBR Vert
TBST-Tween 0,1 % tampon  ;Sigma-Alrich
Cartes de test Epoc 24 cartes 13 paramètresSiemens-Healthineers
Tissu TEKSakura FinetecSolution de cryoconservation  ;
Réactif TRIzol InvitrogenThermo Fisher Scientific, Carlsbad, Californie, États-Unis15596026Réactif TRIzol

Références

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