Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Amélioration de l’extraction de l’ADN de faible poids moléculaire des eaux usées pour une évaluation complète de la résistance aux antimicrobiens

2.4K vues

⸱

DOI :

10.3791/66899

⸱

19 juillet 2024

 ,  ,  ,  , 
1Ashoka University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons une technique simple pour évaluer la résistance aux antimicrobiens environnementaux (RAM) en augmentant la proportion d’ADN extracellulaire de faible poids moléculaire. Un traitement antérieur avec 20 à 30 % de PEG et 1,2 M de NaCl permet de détecter à la fois les gènes génomiques et les gènes AMR transférés horizontalement. Le protocole se prête à un processus sans kit avec une optimisation supplémentaire.

Résumé

La surveillance environnementale est reconnue comme un outil important pour évaluer la santé publique dans l’ère post-pandémique. L’eau, en particulier les eaux usées, est devenue la source de choix pour échantillonner les charges d’agents pathogènes dans l’environnement. Les eaux usées provenant des drains à ciel ouvert et des usines de traitement de l’eau des collectivités sont un réservoir d’agents pathogènes et de gènes de résistance aux antimicrobiens (RAM), et entrent fréquemment en contact avec les humains. Bien qu’il existe de nombreuses méthodes pour suivre la résistance aux antimicrobiens dans l’eau, l’isolement d’ADN de bonne qualité à haut rendement à partir d’échantillons hétérogènes reste un défi. Pour compenser, les volumes d’échantillons doivent souvent être élevés, ce qui crée des contraintes pratiques. De plus, l’ADN environnemental est fréquemment fragmenté et les sources de RAM (plasmides, phages, ADN linéaire) sont constituées d’ADN de faible poids moléculaire. Pourtant, peu de procédés d’extraction se sont concentrés sur des méthodes d’extraction à haut rendement d’ADN linéaire et de faible poids moléculaire. Ici, une méthode simple d’extraction linéaire d’ADN à haut rendement à partir de petits volumes d’eaux usées en utilisant les propriétés de précipitation du polyéthylène glycol (PEG) est présentée. Cette étude plaide en faveur de l’augmentation des rendements globaux en ADN à partir d’échantillons d’eau collectés pour des analyses métagénomiques en enrichissant la proportion d’ADN linéaire. De plus, l’amélioration de l’ADN de faible poids moléculaire permet de surmonter le problème actuel du sous-échantillonnage de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement en raison de l’accent mis sur l’ADN de haut poids moléculaire et intracellulaire. Cette méthode devrait être particulièrement utile lorsque l’ADN extracellulaire existe, mais à de faibles concentrations, comme dans le cas des effluents des usines de traitement. Il devrait également améliorer l’échantillonnage environnemental des fragments de gènes de la résistance aux antimicrobiens qui se propagent par transfert horizontal de gènes.

Introduction

Le SRAS-CoV-2 et ses conséquences ont souligné l’importance de la surveillance environnementale dans le suivi et la prévision des épidémies de maladies infectieuses 1,2. Bien que les pandémies virales soient apparentes, l’augmentation de la résistance aux antimicrobiens (RAM) est souvent décrite comme une pandémie insidieuse qui constitue un problème de santé publique majeur dans le monde 3,4. Par conséquent, il est urgent d’élaborer des stratégies coordonnées pour comprendre l’évolution et la propagation de la RAM. Les plans d’eau, ainsi que les eaux usées, peuvent servir de réservoirs pour les agents pathogènes et les RAM5, 6, 7 et 8. Les sources d’eau partagées sont donc une source puissante de transmission de maladies parmi les humains, en particulier dans les pays à revenu faible et intermédiaire (PRFI) où le manque d’hygiène et la surpopulation vont de pair 9,10,11. L’analyse des sources d’eau est utilisée depuis longtemps pour évaluer la santé communautaire 12,13,14. Récemment, les eaux usées des stations d’épuration urbaines se sont avérées être un bon indicateur précoce des cas de COVID dans les cliniques 1,2,15,16,17,18.

Par rapport à la surveillance de maladies spécifiques, la détection et le suivi de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement posent un problème plus complexe. Le grand nombre d’antibiotiques utilisés, la diversité des gènes de résistance, les différentes pressions de sélection locale et le transfert horizontal de gènes entre les bactéries rendent difficile l’évaluation de la charge réelle de la résistance aux antimicrobiens et, une fois évaluée, sa corrélation avec les observations cliniques 19,20,21,22. Par conséquent, alors que la surveillance concertée de la résistance aux antimicrobiens clinique est menée par plusieurs organisations à travers le monde 3,23,24, la surveillance environnementale de la résistance aux antimicrobiens n’en est qu’à ses balbutiements, comme en témoigne 19,25,26.

Au cours des dernières années, différentes méthodes de suivi de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement ont été signalées 5,27, examinées dans28,29. Le point de départ de la plupart d’entre eux est l’extraction d’ADN de bonne qualité à partir d’échantillons environnementaux hétérogènes, ce qui constitue en soi un défi. De plus, l’ADN environnemental est généralement fragmenté en raison de l’exposition à un environnement hostile. L’ADN extracellulaire fragmenté est depuis longtemps reconnu comme un réservoir important de gènes AMR (examiné dans30, 31 et 32), avec le potentiel supplémentaire d’entrer et de sortir des bactéries par transfert horizontal de gènes. Par conséquent, il est important que tout protocole visant à mesurer la charge de résistance aux antimicrobiens dans l’environnement échantillonne le mieux possible l’ADN linéaire et de faible poids moléculaire. Étonnamment, peu d’attention a été accordée au développement de méthodes spécifiques à l’extraction à haut rendement d’ADN linéaire et de faible poids moléculaire : ce travail se concentre sur la résolution de cette lacune.

Une méthode simple et courante pour précipiter l’ADN consiste à combiner du polyéthylène glycol (PEG) et des sels tels que le chlorure de sodium (NaCl)33. Le PEG est un agent d’encombrement macromoléculaire utilisé pour obtenir une précipitation spécifique à la taille des fragments d’ADN34,35. Plus la concentration de PEG est faible, plus le poids moléculaire de l’ADN qui peut être précipité efficacement est élevé. De nombreuses études ont utilisé le PEG lors de l’extraction environnementale de l’ADN et de l’ARN 1,2 (résumés dans le tableau 1 17,33,36,37,38,39) soit à l’étape finale 33,36,37, soit pour concentrer de grands échantillons d’eau pour l’extraction de particules virales comme avec le SARS-CoV-2 15,40. Dans les travaux actuels, on constate que les concentrations de PEG utilisées précédemment pour les extractions d’ADN environnemental (largement déterminées par les protocoles de surveillance virale) ne capturent pas l’ADN linéaire de faible poids moléculaire. Par conséquent, ils ne permettent pas d’échantillonner de courts fragments d’ADN et ne conviennent pas à l’évaluation précise du contenu en RAM. Cette étude a exploité les propriétés du polyéthylène glycol et du chlorure de sodium pour précipiter efficacement des fragments d’ADN linéaires de faible poids moléculaire à un rendement élevé qui peut, à l’avenir, conduire à une méthode d’extraction d’ADN rentable. Cette méthode peut être utilisée pour enrichir la proportion d’ADN fragmenté et de faible poids moléculaire à partir d’échantillons naturels complexes, capturant ainsi une image plus précise de la RAM environnementale. Avec un peu plus de raffinement, la technique se prête à une application facile et peu coûteuse par les sociétés municipales locales et d’autres organismes gouvernementaux pour être utilisée comme outil de surveillance avec une formation technique minimale.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Échantillonnage des eaux usées

  1. Trempez un bécher en polypropylène de 500 mL dans le drain à ciel ouvert ou le réservoir de la station d’épuration des eaux usées (STP) et prélevez ~300 mL d’échantillon d’eaux usées.
  2. Transférez ~250 ml de l’échantillon dans une bouteille en polypropylène autoclavée de 250 ml.
  3. Vissez le bouchon de la bouteille et fermez-le avec un film plastique. Gardez la bouteille à la verticale dans un sac fermé.
  4. Transportez l’échantillon à la verticale dans un récipient fermé à température ambiante.
  5. Inactiver thermiquement l’échantillon à 70 °C dans un four à air chaud pendant 4 h avant de le traiter pour l’extraction de l’ADN.

2. Extraction d’ADN à partir d’échantillons d’eaux usées

  1. Une fois l’échantillon d’eaux usées refroidi, vortex les échantillons à la vitesse maximale et laissez les débris/boues se déposer.
  2. Décanter 27,5 ml des eaux usées dans des tubes à centrifuger de 50 ml et y ajouter 13,5 g de PEG-8000 (concentration finale 30%) et 3 g de NaCl (concentration finale 1,2 M) et bien mélanger jusqu’à dissolution complète.
  3. Incuber l’échantillon pendant la nuit (~16-18 h) à 4 °C.
  4. Centrifuger l’échantillon à 15 500 x g à 4 °C pendant 30 min.
  5. Jetez le surnageant.
    REMARQUE : Le PEG-8000 à 30% est très visqueux et le granulé peut se déloger lors de la mise au rebut du surnageant. Le surnageant doit être transvasé lentement et soigneusement pour s’assurer que la pastille n’est pas perdue. Les étapes 2.6 à 2.23 sont effectuées à l’aide du kit d’extraction d’ADN du sol selon les instructions du kit, avec quelques modifications.
  6. Dissoudre la pastille dans 800 μL de la solution de lyse du kit et ajouter la solution dans le tube à billes de zirconium mélangé.
    REMARQUE : Si vous traitez de plus grands volumes, regroupez les granulés du nombre souhaité de tubes. Par exemple, si vous traitez 160 mL d’échantillon ; il y aura quatre tubes de 50 mL contenant des eaux usées contenant du PEG et du NaCl. Après centrifugation des quatre tubes à 15 500 x g à 4 °C pendant 30 min, jeter le surnageant des quatre tubes. Ajoutez 200 μL de solution CD1 à chacun, remettez les pastilles en suspension et regroupez-les dans un tube à billes.
  7. Fixez le tube de perle horizontalement sur un vortex. Vortex le tube à vitesse maximale pendant 20-30 min.
    REMARQUE : Le vortex prolongé assure la lyse et l’homogénéisation complètes des échantillons, ce qui améliore le rendement en ADN.
  8. Faites tourner les tubes à 8 000 x g pendant 15 s pour déposer les billes au fond, retirez la mousse et transférez complètement le surnageant du tube dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Certaines perles peuvent également être transférées au cours de cette étape.
  9. Centrifuger le surnageant à 15 000 x g pendant 1 min.
  10. Transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugation propre de 2 ml. Le surnageant peut encore contenir quelques particules en suspension.
  11. Ajouter 200 μL de solution de précipitant et agiter à vitesse maximale pendant 5 s. Incuber à 4 °C pendant 5 min.
    REMARQUE : L’incubation à 4 °C augmente l’efficacité de la précipitation des protéines et des débris cellulaires pendant que l’ADN reste en solution. Il est possible d’interrompre le protocole à cette étape jusqu’à 2 h sans diminution significative du rendement et de la qualité de l’ADN extrait.
  12. Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 1 min à température ambiante (RT). Évitez la pastille et transférez le surnageant transparent dans un tube de microcentrifugation propre de 2 ml.
  13. Ajouter 600 μL de tampon de liaison par 700 μL de surnageant et vortex à vitesse maximale pendant 5 s.
  14. Chargez 700 μL de lysat sur une colonne de spin de silice, incubez pendant 2 min et centrifugez à 15 000 x g pendant 1 min.
    REMARQUE : L’incubation du lysat sur la colonne de silice améliore la liaison de l’ADN à la colonne, ce qui se traduit par un meilleur rendement en ADN.
  15. Jetez l’écoulement et répétez l’étape 2.14 jusqu’à ce que tout le lysat ait traversé la colonne d’essorage.
  16. Placez délicatement la colonne d’essorage dans un tube de collecte propre de 2 ml. Assurez-vous qu’aucun flux n’est éclaboussé sur la colonne d’essorage.
  17. Ajoutez 500 μL de tampon de lavage dans la colonne d’essorage et centrifugez la colonne d’essorage à 15 000 x g pendant 1 min.
  18. Jeter le liquide d’écoulement et remettre la colonne d’essorage dans le même tube de collecte de 2 ml.
  19. Ajoutez 500 μL de tampon de lavage à l’éthanol dans la colonne d’essorage. Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 1 min.
  20. Jetez le liquide d’écoulement et placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de collecte de 2 ml.
  21. Centrifuger à 16 000 x g pendant 2 min pour éliminer l’éthanol résiduel. Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de 1,5 ml.
  22. Ajouter 100 μL de tampon d’élution (préchauffé à 55 °C) au centre de la membrane filtrante blanche et incuber pendant 5 min.
    REMARQUE : Le tampon d’élution chauffé, ainsi que l’incubation sur la membrane, augmentent l’efficacité de l’élution de l’ADN, en particulier de l’ADN de haut poids moléculaire.
  23. Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 1 min. Jetez la colonne de rotation.
  24. À l’ADN élué, ajouter 10 μL de NaCl 3 M (1/10 volume d’éluat d’ADN) et 250 μL d’éthanol absolu réfrigéré (2,5 volumes d’éluat d’ADN). Retournez pour bien mélanger et faites tourner le contenu à 8 000 x g pendant 15 s.
  25. Incuber le mélange ADN-éthanol à -20 °C pendant au moins 1 h.
    REMARQUE : L’incubation du mélange ADN-éthanol peut être augmentée à 16 h sans diminution significative du rendement ou de la qualité de l’ADN extrait.
  26. Centrifugeuse à 19 000 x g à 4 °C pendant 30 min. Jeter le surnageant par décantation.
  27. Ajoutez 500 μL d’éthanol réfrigéré à 70 % dans la pastille.
  28. Centrifugeuse à 19 000 x g à 4 °C pendant 15 min. Jeter le surnageant par décantation.
  29. Retournez et tapotez doucement le tube sur du papier de soie pour éliminer l’éthanol résiduel par capillarité.
  30. Séchez complètement la pastille d’ADN en gardant les tubes ouverts sur un bloc chauffant pendant 5 à 10 minutes à 37 °C jusqu’à ce que tout l’éthanol se soit évaporé.
  31. Remettez en suspension la pastille d’ADN dans 30 à 50 μL d’eau double distillée autoclavée (ddH2O). Incuber à 37 °C pendant 5 à 10 min.
  32. Faites tourner l’ADN à 8 000 x g pendant 15 s.
  33. Sélectionnez l’application dsDNA dans les paramètres Acides nucléiques d’un spectrophotomètre Nanodrop.
    1. Nettoyez le socle avec du papier de soie non pelucheux et de l’eau. Utilisez le ddH2O pour effacer l’instrument, puis chargez 2 μL de l’échantillon d’ADN sur le socle.
    2. Mesurer les rapports de concentration et d’absorbance (A260/280 et A260/230) pour déterminer la pureté.
  34. Conservez l’échantillon d’ADN à -20 °C.

3. Précipitation de l’ADN linéaire amplifié par réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour vérifier la récupération de l’ADN sur une gamme de poids moléculaires

  1. À l’aide de l’ADN génomique d’E. coli MG155, amplifier les fragments de gènes par PCR pour générer un pool de fragments linéaires à partir des gènes suivants : fusA, lacZ, gapA, rpsD, ARNr 16S, marR (voir le tableau 2 pour les séquences d’amorces et les conditions de PCR).
  2. Purifiez les produits PCR à l’aide du kit de purification PCR et regroupez les produits PCR entre eux.
  3. Divisez les amplicons regroupés dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL de volumes égaux - étiquetez un tube comme « ADN d’entrée ».
  4. Ajoutez du PEG et du NaCl selon les conditions souhaitées (9 %, 20 %, 30 % PEG-8000 ; 0,3 M, 1,2 M de NaCl) dans chacun des tubes, à l’exception de celui étiqueté « ADN d’entrée », et augmentez le volume final à 1 ml.
  5. Incuber les tubes pendant la nuit (~16-18 h) à 4 °C.
    REMARQUE : Pour le reste des étapes jusqu’à 3.16, 'Input DNA' est conservé inchangé dans le réfrigérateur.
  6. Faites tourner les tubes dans une microcentrifugeuse de table selon la vitesse souhaitée (15 000 x g ou 20 000 x g) pendant 1 h à 4 °C.
  7. Retirez avec précaution 900 μL de surnageant du côté opposé à la pastille à l’aide d’une micropipette.
  8. Premier lavage à l’éthanol : Ajoutez 900 μL d’éthanol à 70 % réfrigéré dans la pastille et mélangez en inversant doucement les tubes.
  9. Faites tourner les tubes à la même vitesse que celle utilisée à l’étape 3.6 (15 000 x g ou 20 000 x g) pendant 30 min à 4 °C.
  10. Retirer le surnageant par décantation.
  11. Deuxième lavage à l’éthanol : Ajoutez 500 μL d’éthanol réfrigéré à 70 % dans le granulé.
  12. Faites tourner les tubes à la même vitesse que celle utilisée à l’étape 3.6 (15 000 x g ou 20 000 x g) pendant 30 min à 4 °C. Jeter le surnageant par décantation.
  13. Retournez et tapotez doucement le tube sur du papier de soie pour éliminer l’éthanol résiduel par capillarité.
  14. Séchez complètement la pastille d’ADN en gardant les tubes ouverts sur un bloc chauffant pendant 5 à 10 minutes à 37 °C jusqu’à ce que tout l’éthanol s’évapore.
  15. Remettre la pastille en suspension dans 20 μL d’eau bidistillée autoclave.
  16. Mesurez la concentration d’ADN précipitée par les différentes conditions et l’ADN d’entrée à l’aide d’un spectrophotomètre Nanodrop ou d’un fluoromètre.
  17. Chargez l’ADN précipité sur un gel d’agarose à 1 % pour la visualisation de l’ADN.

  

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Mise en place d’un protocole d’extraction à haut rendement d’ADN à partir d’échantillons d’eaux usées
Une version modifiée des protocoles précédemment établis a été utilisée pour l’extraction d’ADN et d’ARN de haute qualité à partir d’échantillons d’eau17. Les échantillons provenaient de drains à ciel ouvert ainsi que de stations d’épuration des eaux usées de la région de Delhi-NCR, dans le nord de l’Inde. Après un prétraitement à l’aide de PEG ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La résistance aux antimicrobiens est l’une des 10 principales menaces pour la santé aujourd’hui, selon l’OMS, et la surveillance environnementale de la résistance aux antimicrobiens est reconnue comme un outil important dans le monde entier. Comme nous l’avons mentionné dans l’introduction, un registre complet de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement comprend de l’ADN de faible poids moléculaire, fragmenté et extracellulaire. Le protocole de prétraitement rapporté ici, utilisant une forte concentration de...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous reconnaissons le soutien financier de la Fondation Rockefeller (numéro de subvention de la Fondation Rockefeller 2021 HTH 018) dans le cadre de l’équipe APSI India (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). Nous reconnaissons également l’aide financière fournie par Axis Bank pour soutenir cette recherche et par la Trivedi School of Biosciences de l’Université Ashoka pour l’équipement et d’autres soutiens.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microcentrifugeuse à 24 placesEppendorf Centrifuge 5425 REP5406000046
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Éthanol absolu pour analyse)Supelco100983-0511
AgaroseInvitrogen16500500
Centrifugeuse réfrigérée de paillasseEppendorf Centrifuge 5920 REP5948000131
Système d’imagerie ChemiDocBioRad12003153
DNeasy PowerSoil Pro KitQiagen47014
DNeasy PowerWater Pro KitQiagen14900-100-NF
dNTPs (dNTP Mix 10mM chacun, 0.2 mL, R0191)Thermo FisherR0191
DreamTaq ADN polymérase, 5 U/µ ; L + 10x DreamTaq Buffer*ThermofscientificEP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express Échelle d’ADNInvitrogen10488091
Maxiamp Tubes PCR 0,2 mLTarsons510051
Biologie moléculaire Eau de qualité pour PCRHiMediaML065-1.5ML
NanoDrop OneC Microvolume Spectrophotomètre UV-VisThermo Scientific13400519
ParafilmBemisS37440
PEG-8000SRL54866
QIAquick PCR & Kit de nettoyage de gelQiagen28506
Qubit 4 Fluorimètre (avec WiFi)ThermofisherQ33238
Tubes de dosageQubit ThermofisherQ32856
Kit de réactifs Qubitt pour ADN ds, large gammeThermo ScientificQ32853 (500 dos)
Chlorure de sodiumHiMediaTC046M-500G
SYBR Teinture de gel d’ADN sans dangerThermocycleur InvitrogenS33102
T100 ThermocycleurBioRad1861096
(système PCR ProFlex 3 x 32 puits)Applied Biosystems4484073
Wizard Kit de purification d’ADN génomiquePromegaA1125

Références

  1. Kirby, A. E., et al. Using wastewater surveillance data to support the COVID-19 response - United States, 2020-2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 70 (36), 1242-1244 (2021).
  2. Amman, F., et al. Viral variant-resolved wastewater surveillance of SARS-COV-2 at national scale. Nat Biotechnol. 40 (12), 1814-1822 (2022).
  3. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: A systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  4. The L. Antimicrobial resistance. The L. Antimicrobial resistance: Time to repurpose the global fund. Lancet. 399 (10322), 335(2022).
  5. Munk, P., et al. Genomic analysis of sewage from 101 countries reveals global landscape of antimicrobial resistance. Nat Commun. 13 (1), 7251(2022).
  6. Parnanen, K. M. M., et al. Antibiotic resistance in European wastewater treatment plants mirrors the pattern of clinical antibiotic resistance prevalence. Sci Adv. 5 (3), 9124(2019).
  7. Grenni, P. Antimicrobial resistance in rivers: A review of the genes detected and new challenges. Environ Toxicol Chem. 41 (3), 687-714 (2022).
  8. Siri, Y., Precha, N., Sirikanchana, K., Haramoto, E., Makkaew, P. Antimicrobial resistance in southeast Asian water environments: A systematic review of current evidence and future research directions. Sci Total Environ. 896, 165229(2023).
  9. Hunter, P. R., Macdonald, A., Carter, R. C. Water supply and health. PLoS Med. 7 (11), e1000361(2010).
  10. Bain, R., et al. Fecal contamination of drinking-water in low- and middle-income countries: A systematic review and meta-analysis. PLoS Med. 11 (5), e1001644(2014).
  11. Collignon, P., Beggs, J. J., Walsh, T. R., Gandra, S., Laxminarayan, R. Anthropological and socioeconomic factors contributing to global antimicrobial resistance: A univariate and multivariable analysis. Lancet Planet Health. 2 (9), e398-e405 (2018).
  12. Asghar, H., et al. Environmental surveillance for polioviruses in the global polio eradication initiative. J Infect Dis. 210, Suppl 1 S294-S303 (2014).
  13. Gracia-Lor, E., Rousis, N. I., Hernandez, F., Zuccato, E., Castiglioni, S. Wastewater-based epidemiology as a novel biomonitoring tool to evaluate human exposure to pollutants. Environ Sci Technol. 52 (18), 10224-10226 (2018).
  14. Choi, P. M., et al. economic correlates of food and chemical consumption measured by wastewater-based epidemiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21864-21873 (2019).
  15. Hemalatha, M., et al. Surveillance of SARS-COV-2 spread using wastewater-based epidemiology: Comprehensive study. Sci Total Environ. 768, 144704(2021).
  16. Westhaus, S., et al. Detection of sars-cov-2 in raw and treated wastewater in Germany - suitability for COVID-19 surveillance and potential transmission risks. Sci Total Environ. 751, 141750(2021).
  17. Lamba, S., et al. SARS-COV-2 infection dynamics and genomic surveillance to detect variants in wastewater - a longitudinal study in Bengaluru, India. Lancet Reg Health Southeast Asia. 11, 100151(2023).
  18. Stockdale, S. R., et al. RNA-seq of untreated wastewater to assess COVID-19 and emerging and endemic viruses for public health surveillance. Lancet Reg Health Southeast Asia. 14, 100205(2023).
  19. Bengtsson-Palme, J., et al. Towards monitoring of antimicrobial resistance in the environment: For what reasons, how to implement it, and what are the data needs. Environ Int. 178, 108089(2023).
  20. Bengtsson-Palme, J., Kristiansson, E., Larsson, D. G. J. Environmental factors influencing the development and spread of antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev. 42 (1), 053(2018).
  21. Dunachie, S. J., Day, N. P., Dolecek, C. The challenges of estimating the human global burden of disease of antimicrobial resistant bacteria. Curr Opin Microbiol. 57, 95-101 (2020).
  22. Hughes, D., Andersson, D. I. Evolutionary trajectories to antibiotic resistance. Annu Rev Microbiol. 71, 579-596 (2017).
  23. World Health Organization. Global antimicrobial resistance and use surveillance system (GLASS). World Health Organization. , (2022).
  24. Walia, K., et al. Establishing antimicrobial resistance surveillance & research network in india: Journey so far. Indian J Med Res. 149 (2), 164-179 (2019).
  25. Hart, A., Warren, J., Wilkinson, H., Schmidt, W. Environmental surveillance of antimicrobial resistance (AMR), perspectives from a national environmental regulator in 2023. Euro Surveill. 28 (11), (2023).
  26. Huijbers, P. M. C., Flach, C. F., Larsson, D. G. J. A conceptual framework for the environmental surveillance of antibiotics and antibiotic resistance. Environ Int. 130, 104880(2019).
  27. Liguori, K., et al. Antimicrobial resistance monitoring of water environments: A framework for standardized methods and quality control. Environ Sci Technol. 56 (13), 9149-9160 (2022).
  28. Hayward, C., Ross, K. E., Brown, M. H., Whiley, H. Water as a source of antimicrobial resistance and healthcare-associated infections. Pathogens. 9 (8), 667(2020).
  29. Booton, R. D., et al. One health drivers of antibacterial resistance: Quantifying the relative impacts of human, animal and environmental use and transmission. One Health. 12, 100220(2021).
  30. Sivalingam, P., Pote, J., Prabakar, K. Extracellular DNA (eDNA): Neglected and potential sources of antibiotic resistant genes (ARGs) in the aquatic environments. Pathogens. 9 (11), 874(2020).
  31. Woegerbauer, M., Bellanger, X., Merlin, C. Cell-free DNA: An underestimated source of antibiotic resistance gene dissemination at the interface between human activities and downstream environments in the context of wastewater reuse. Front Microbiol. 11, 671(2020).
  32. Kittredge, H. A., Dougherty, K. M., Evans, S. E. Dead but not forgotten: How extracellular DNA, moisture, and space modulate the horizontal transfer of extracellular antibiotic resistance genes in soil. Appl Environ Microbiol. 88 (7), 0228021(2022).
  33. Lever, M. A., et al. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front Microbiol. 6, 476(2015).
  34. Lis, J. T., Schleif, R. Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol. Nucleic Acids Res. 2 (3), 383-389 (1975).
  35. He, Z., Zhu, Y., Gu, H. A new method for the determination of critical polyethylene glycol concentration for selective precipitation of DNA fragments. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (20), 9175-9183 (2013).
  36. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. Biotechniques. 49 (3), 631-640 (2010).
  37. Arbeli, Z., Fuentes, C. L. Improved purification and PCR amplification of DNA from environmental samples. FEMS Microbiol Lett. 272 (2), 269-275 (2007).
  38. Verma, S. K., Singh, H., Sharma, P. C. An improved method suitable for isolation of high-quality metagenomic DNA from diverse soils. 3 Biotech. 7 (3), 171(2017).
  39. Narayan, A., Jain, K., Shah, A. R., Madamwar, D. An efficient and cost-effective method for DNA extraction from athalassohaline soil using a newly formulated cell extraction buffer. 3 Biotech. 6 (1), 62(2016).
  40. Sapula, S. A., Whittall, J. J., Pandopulos, A. J., Gerber, C., Venter, H. An optimized and robust peg precipitation method for detection of sars-cov-2 in wastewater. Sci Total Environ. 785, 147270(2021).
  41. Calderon-Franco, D., Van Loosdrecht, M. C. M., Abeel, T., Weissbrodt, D. G. Free-floating extracellular DNA: Systematic profiling of mobile genetic elements and antibiotic resistance from wastewater. Water Res. 189, 116592(2021).
  42. Sangamnere, R., Misra, T., Al Bherwani, H. E. t A critical review of conventional and emerging wastewater treatment technologies. Sustain Water Resour Manag. 9, 58(2023).
  43. Weiss, N., Heng, S. W., Lim, H. W. Centrifugation at 30,000 x g. in plasmid DNA precipitation allows better recovery rates and shorter centrifugation times. Application note no: 234, Eppendorf. , Available from: https://www.eppendorf.com/product-media/doc/en/157398_Application/Eppendorf_Centrifugation_Application-Note_234_Centrifuge-5430-familiy_Safe-Lock-Tubes_Centrifugation-at-30_000-x-g-plasmid-DNA-precipitation-allows-better-recovery-rates-shorter-centrifug.pdf (2017).
  44. Atha, D. H., Ingham, K. C. Mechanism of precipitation of proteins by polyethylene glycols. Analysis in terms of excluded volume. J Biol Chem. 256 (23), 12108-12117 (1981).
  45. Sivalingam, P., et al. Extracellular DNA includes an important fraction of high-risk antibiotic resistance genes in treated wastewaters. Environ Pollut. 323, 121325(2023).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Explorer plus d’articles

Extraction d'ADN des eaux uséesgènes de résistance aux antimicrobienssurveillance environnementaleprécipitation au polyéthylène glycoltransfert horizontal de gènesanalyse métagénomiquepurification de l'ADNADN extracellulairespectrophotométrie Nanodrop
Amélioration de l’extraction de l’ADN de faible poids moléculaire des eaux usées pour une évaluation complète de la résistance aux antimicrobiens
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.