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Élucidation des propriétés physicochimiques de la #946 ;-1,3-glucanase et de la peroxydase du mécanisme de défense de la paroi cellulaire du blé contre l’infestation par Diuraphis noxia

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DOI :

10.3791/66903

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26 juillet 2024

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1Carbohydrates and Enzymology Laboratory (CHEM-LAB), Department of Plant Sciences, University of the Free State, 2Faculty of Natural and Agricultural Sciences, Department of Plant Science, Botany, Plant Biochemistry and Physiology, University of the Free State, 3Agricultural Research Council - Small Grain Institute

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit les procédures utilisées pour étudier et caractériser les enzymes liées à la paroi cellulaire, principalement la β-1,3-glucanase et la peroxydase, chez les plants de blé. Leurs niveaux d’activité augmentent lors de l’interaction blé-RWA et sont impliqués dans la réponse de défense des plantes par le renforcement de la paroi cellulaire, ce qui dissuade l’alimentation des pucerons.

Résumé

Les plants de blé infestés par des pucerons russes du blé (RWA) induisent une cascade de réponses de défense, y compris les réponses d’hypersensibilité (HR) et l’induction de protéines liées à la pathogenèse (PR), telles que la β-1,3-glucanase et la peroxydase (POD). Cette étude vise à caractériser les propriétés physicochimiques de la POD et de la β-1,3-glucanase associées à la paroi cellulaire et à déterminer leur synergie sur la modification de la paroi cellulaire lors de l’interaction RWASA2-blé. Les cultivars sensibles Tugela, Tugela-Dn1 modérément résistant et Tugela-Dn5 résistant ont été prégermés et plantés en serre, fertilisés 14 jours après la plantation et irrigués tous les 3 jours. Les plantes ont été infestées de 20 individus parthénogénétiques du même clone RWASA2 au stade 3 feuilles, et les feuilles ont été récoltées 1 à 14 jours après l’infestation. Le liquide de lavage intercellulaire (IWF) a été extrait par filtration sous vide et stocké à -20 °C. Les résidus foliaires ont été broyés en poudre et utilisés pour les composants de la paroi cellulaire. L’activité et la caractérisation du POD ont été déterminées à l’aide d’un substrat de gaïacol de 5 mM et de H2O2, en surveillant la variation de l’absorbance à 470 nm. L’activité de la β-1,3-glucanase, le pH et les conditions optimales de température ont été démontrés en mesurant les sucres réducteurs totaux dans l’hydrolysat avec le réactif DNS à l’aide de substrats β-1,3-glucane et β-1,3-1,4-glucane, en mesurant l’absorbance à 540 nm et en utilisant la courbe étalon du glucose. Le pH optimal a été déterminé entre 4 et 9, la température optimale entre 25 et 50 °C et la stabilité thermique entre 30 °C et 70 °C. La spécificité du substrat de β-1,3-glucanase a été déterminée à 25 °C et 40 °C à l’aide de substrats de β-1,3-1,4-glucane de curdlan et d’orge. De plus, le mode d’action de la β-1,3-glucanase a été déterminé à l’aide de la laminaribiose à la laminaripentaose. Les profils de produits d’hydrolyse des oligosaccharides ont été analysés qualitativement par chromatographie sur couche mince (CCM) et quantitativement par HPLC. La méthode présentée dans cette étude démontre une approche robuste pour infester le blé avec des actifs pondérés en roturier la rose, extraire la peroxydase et la β-1,3-glucanase de la région de la paroi cellulaire et leur caractérisation biochimique complète.

Introduction

Les pucerons russes du blé infestent le blé et l’orge, causant des pertes de rendement importantes ou une réduction de la qualité des grains. Le blé réagit à l’infestation en induisant plusieurs réponses de défense, notamment l’augmentation des niveaux d’activité de la β-1,3-glucanase et de la peroxydase chez les cultivars résistants, tandis que les cultivars sensibles réduisent l’activité de ces enzymes au début de la période d’infestation 1,2,3,4. Les principales fonctions de la β-1,3-glucanase et du POD dans la plante de blé comprenaient la régulation de l’accumulation de callose dans le cultivar résistant et l’extinction des espèces réactives de l’oxygène (ROS) au niveau de la paroi cellulaire et des régions apoplasiques lors de l’infestation par les RWA 1,3,5,6,7. Mafa et al.6 ont démontré qu’il y avait une forte corrélation entre l’augmentation de l’activité du POD et l’augmentation de la teneur en lignine dans le cultivar de blé résistant lors d’infestations par RWASA2. De plus, l’augmentation de la teneur en lignine indique que la paroi cellulaire du cultivar de blé résistant infesté a été renforcée, ce qui a entraîné une réduction de l’alimentation en actifs pondérés en eau.

La plupart des groupes de chercheurs ont extrait et étudié la β-1,3-glucanase apoplasique et le POD au cours de l’interaction blé/orge-APR ; De plus, la plupart de ces études ont affirmé que ces enzymes influencent la paroi cellulaire du plant de blé infesté d’APR sans mesurer la présence d’enzymes dans la région de la paroi cellulaire. Seules quelques études ont utilisé des techniques microscopiques pour montrer que les niveaux d’activité de la β-1,3-glucanase étaient liés à la régulation de la callose 7,8,9 ou ont extrait les principaux composants de la paroi cellulaire pour démontrer la corrélation entre les activités de la POD et la modification de la paroi cellulaire chez les 6,10 résistants. L’absence de sonde de l’association de la β-1,3-glucanase et de la POD à la paroi cellulaire indique la nécessité de développer des méthodes permettant aux chercheurs de mesurer directement les enzymes liées à la paroi cellulaire.

La méthode actuelle propose qu’il soit nécessaire d’éliminer le liquide apoplasique du tissu foliaire avant d’extraire les enzymes liées à la paroi cellulaire. La procédure d’extraction du liquide apoplasique doit être effectuée deux fois à partir du tissu foliaire, qui est utilisé pour extraire les enzymes liées à la paroi cellulaire. Ce processus réduit la contamination et la confusion des enzymes apoplasiques avec celles trouvées dans les régions de la paroi cellulaire. Ainsi, dans cette étude, nous avons extrait la POD, la β-1,3-glucanase liée à la paroi cellulaire et la β-glucanase spécifique de la MLG et effectué leur caractérisation biochimique.

Protocole

L’étude a été menée avec l’approbation et la permission du Comité d’éthique de la recherche sur l’environnement et la biosécurité de l’Université de l’État libre (UFS-ESD2022/0131/22). Les détails des réactifs et de l’équipement ici sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Conditions de croissance des plantes

  1. Faites germer 250 graines de chaque cultivar de blé, c’est-à-dire Tugela, Tugela-Dn1 sensible, Tugela-Dn1 modérément résistant et Tugela-Dn5 résistant, dans des boîtes de Pétri séparées.
  2. Ajoutez 5 ml d’eau distillée dans chaque boîte de Pétri, scellez-la avec un film de paraffine et incubez dans la chambre de germination réglée à 25 °C pendant 2 jours.
  3. Repiquez les graines germées de chaque cultivar dans des pots de 15 cm contenant de la terre 1:1 et de la tourbe (15 plantes par pot) dans des conditions de serre contrôlées.
  4. Réglez les régimes de température à 18 °C et 24 °C pendant la nuit et le jour, respectivement.
  5. Irriguez les plantes tous les 3 jours avec de l’eau du robinet et apportez-leur 2 g/L d’engrais 14 jours après la germination.
  6. Placez les plantes dans des cages enfermées dans des filets et laissez-les pousser jusqu’au stade 2,6 de la troisième feuille (avec quatre réplicats biologiques de chaque cultivar).

2. Infestation de cultivars de blé par RWASA2

  1. Infestez les cultivars de blé Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 avec RWASA2 selon Jimoh et al.11 et Mohase et Taiwe12.
  2. Gardez les plantes en deux ensembles séparés dans des cages ; Infester un ensemble avec 20 individus parthénogénétiques du même clone RWASA2 par plante dans chaque pot dans les chambres de culture recouvertes de filets. Gardez un autre ensemble de plants de blé dans une pièce séparée sous la chambre de croissance avec des filets propres et traitez-les comme des témoins.
    REMARQUE : Conservez les deux traitements dans des pièces séparées et couvrez les plantes dans des cages enfermées dans des filets. De plus, dans le cas où deux biotypes différents d’actifs pondérés en commun sont utilisés dans une étude, conservez autant que possible les plantes infestées par un biotype d’actifs pondérés en fonction des risques par rapport à celles infestées par le deuxième biotype ou dans des pièces séparées sous des chambres de culture recouvertes de filets pour éviter toute contamination croisée possible de l’hydrotype d’eau et d’assainissement de l’eau de type 2.
  3. Pour la récolte, sélectionnez les deuxième et troisième feuilles à deux régimes temporels différents, période d’alimentation à court terme (1, 2 et 3 jours) et période d’alimentation à long terme (7 et 14 jours), et enveloppez-les dans du papier absorbant humide.
  4. Transférez immédiatement les feuilles récoltées dans une boîte contenant de la glace pour réduire le métabolisme des feuilles avant l’extraction par liquide de lavage intercellulaire (IWF).

3. Extraction du liquide de lavage intercellulaire (IWF) de l’apoplast

  1. Coupez les feuilles récoltées d’environ trois cultivars de blé en morceaux de 7 cm.
  2. Rincez les morceaux de feuilles deux fois à l’eau distillée pour éliminer toute contamination cytosolique des extrémités coupées 6,13.
  3. Insérez les morceaux de feuilles dans un tube de verre à paroi épaisse et immergez les échantillons dans un tampon d’extraction (50 mM de Tris-HCl, pH 7,8).
  4. Appliquer l’infiltration sous vide pendant 5 min à l’aide d’une pompe à jet d’eau pour imprégner les feuilles avec le tampon d’extraction.
  5. Ensuite, retirez les morceaux de feuilles du tube en verre et séchez-les avec une serviette en papier.
  6. Insérer les morceaux de feuilles séchées verticalement dans des tubes de centrifugation pré-refroidis équipés de disques perforés et centrifuger à 500 x g pendant 10 min à 4 °C.
  7. À l’aide d’une pipette de 100 μL, recueillir le surnageant dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL prérefroidis.
  8. Répétez toute la procédure d’extraction avec le même matériau foliaire.
  9. Combinez le surnageant recueilli et conservez-le à −20 °C.
    REMARQUE : Les aliquotes surnageantes sont traitées comme la source de la teneur en apoplaste ou IWF. L’IWF n’a pas été utilisé dans l’étude actuelle, mais il était important de l’éliminer des tissus foliaires avant d’extraire la β-1,3-glucanase et la peroxydase (POD) liées à la paroi cellulaire.

4. Extraction de la β-1,3-glucanase et du POD associés à la paroi cellulaire

REMARQUE : Les résidus foliaires laissés après l’extraction par l’IWF ont été utilisés pour extraire la protéine totale de la paroi cellulaire.

  1. Broyez les résidus de feuilles en une fine poudre avec de l’azote liquide à l’aide d’un mortier et d’un pilon.
  2. Transvaser environ 200 mg de tissu foliaire en poudre dans un mortier contenant 4 mL de tampon d’extraction (50 mM de phosphate de sodium avec 1 % (p/v) de polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) ; pH 5,0) suivi d’un broyage au pilon jusqu’à obtenir une pâte lisse, qui est ensuite transférée dans des tubes de microcentrifugation.
  3. Incuber le mélange dans les tubes de microcentrifugation pendant 3 min sur de la glace, puis centrifuger à 10 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
  4. Prélever le surnageant (extraits protéiques totaux) dans des tubes de microcentrifugation (aliquotes de 2 mL) et l’utiliser comme source de β-1,3-glucanase et de POD pour toute l’étude.

5. Détermination de l’étalon protéique

  1. Déterminer la concentration totale en protéines des extraits selon la méthode de Bradford14.
  2. Préparer les solutions d’albumine sérique bovine (BSA) aux concentrations de 0,0 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL et 1,0 mg/mL dissoutes dans un tampon de phosphate de sodium de 50 mM pour produire l’étalon de protéine.
  3. Préparez l’étalon en ajoutant 10 μL de chaque solution BSA dans la microplaque à 96 puits avec 190 μL (0,25 % v/v) de réactif Bradford (voir le tableau des matériaux).
  4. Incuber à 25 °C pendant 20 min et mesurer l’absorbance à 595 nm à l’aide du lecteur de microplaques et utiliser les valeurs d’absorbance pour préparer la courbe standard de quantification de la concentration en protéines.
  5. Quantifier la concentration en protéines
    1. Ajouter 10 μL de l’enzyme extraite (étape 4) dans une microplaque à 96 puits avec 190 μL (0,25 % v/v) de réactif Bradford en trois exemplaires.
    2. Incuber à température ambiante (25 °C) pendant 20 min.
    3. Mesurer l’absorbance à 595 nm à l’aide du spectrophotomètre équipé d’un lecteur de microplaques et utiliser les valeurs d’absorbance pour déterminer la concentration en protéines à l’aide de l’étalon de protéines BSA (préparé à l’étape 5.4).

6. Préparez l’étalon de glucose pour l’activité de la β-1,3-glucanase

  1. Préparez les solutions étalons à des concentrations comprises entre 0,00 mg/mL et 1,0 mg/mL (0,0 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1,0 mg/mL) avec du glucose dissous dans de l’eau distillée.
  2. Ajouter 300 μL de chaque solution de glucose et 600 μL de réactif d’acide 3,5-dinitrosalicylique (DNS) dans un rapport de 1:2 dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et incuber les réactions à 100 °C pendant 5 minutes (voir le Tableau des matériaux pour les réactifs DNS) (Miller et coll.15).
  3. Laissez le mélange refroidir à température ambiante avant de mesurer l’absorbance à 540 nm à l’aide du spectrophotomètre.
  4. Utilisez les valeurs moyennes d’absorbance pour élaborer la courbe standard permettant de déterminer l’activité de l’enzyme β-1,3-glucanase.

7. Détermination de l’activité de la β-1,3-glucanase

REMARQUE : L’activité enzymatique de la β-1,3-glucanase liée à la paroi cellulaire extraite de Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 a été déterminée par la quantité de sucres réducteurs totaux libérés par l’hydrolyse de 0,5 % (p/v) de substrats de β-1,3-1,4-glucane liés mixtes (MLG) et de β-1,3-glucane à 0,4 % (p/v) à l’aide d’une méthode modifiée décrite par Miller et al.15. Gardez toujours les tubes avec des aliquotes de protéines sur la glace. Si les échantillons ont été congelés, décongelez-les sur de la glace et procédez immédiatement après la décongélation.

  1. Ajouter 200 μL de l’extrait enzymatique (maintenir la concentration en protéines entre 20 μg/mL et 90 μg/mL dans toutes les réactions, sauf indication contraire) et 300 μL du substrat dissous dans un tampon de citrate de sodium de 50 mM (pH 5,0) dans les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
    REMARQUE : Exécutez une réaction à blanc parallèle sans l’extrait enzymatique pour tous les substrats (premier blanc), et le blanc enzymatique est constitué d’un extrait enzymatique sans substrat (deuxième blanc). Le substrat et l’extrait enzymatique ont été remplacés par le tampon dans le premier et le deuxième noir, respectivement.
  2. Incuber les réactions à 37 °C pendant 24 h et terminer la réaction en chauffant à 100 °C pendant 5 min, puis centrifuger à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
  3. Mélanger 300 μL de surnageant avec 600 μL de réactif DNS (rapport 1:2) dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et faire bouillir à 100 °C pendant 5 min.
  4. Laissez la solution refroidir à température ambiante et mesurez l’absorbance à 540 nm à l’aide du spectrophotomètre.
    REMARQUE : Si la concentration de sucres réducteurs totaux est élevée dans le mélange, il en résultera une solution brun foncé, difficile à lire à l’aide du spectrophotomètre. Par conséquent, une dilution supplémentaire des échantillons est nécessaire avant de lire l’absorbance.
  5. Utilisez la courbe étalon de glucose développée à l’étape 6.4 ci-dessus pour déterminer l’activité enzymatique dans les unités SI de la courbe standard.
  6. Pour convertir l’activité en une activité spécifique exprimée en μmol de glucose/h/mg de protéine, utilisez l’équation ci-dessous :
    Activité spécifique = [(activité enzymatique/180,16)*1000]/temps/concentration en protéines
    REMARQUE : Convertir l’activité enzymatique en mg/mL en g/mL ; 180,16 g/mol est le poids moléculaire du glucose, 1000 est un facteur qui convertit M en micromoles, le temps est la période de réaction et la concentration de l’extrait de protéine est représentée en mg/mL. Une unité d’activité de la β-1,3-glucanase est définie comme 1 μmol de glucose libéré du substrat au cours d’une période de réaction de 1 h.

8. Détermination de l’activité de la peroxydase (PDD)

REMARQUE : L’activité de la peroxydase liée à la paroi cellulaire des cultivars de blé Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 a été déterminée en quantifiant la formation du tétra-gaïacol produit par unité de temps à partir du gaïacol16.

  1. Ajouter 30 μL d’extrait enzymatique, 30 μL 1% (v/v) H2O2 et 970 μL de 5 mM de gaïacol dans les cuvettes à 25 °C.
    REMARQUE : Effectuez la réaction à blanc sans l’extrait enzymatique (premier blanc), et un autre blanc pour les échantillons d’enzymes sans substrat (deuxième blanc). Les échantillons d’enzyme ou de substrat ont été remplacés par un tampon de phosphate de sodium de 50 mM dans le premier et le deuxième blanc, respectivement.
  2. Utilisez le mode cinétique du spectrophotomètre pour surveiller la variation de l’absorbance à 470 nm.
  3. Déterminez la pente où le graphique était linéaire et utilisez-la comme valeur d’absorbance.
  4. Calculez l’absorbance moyenne et utilisez-la pour calculer l’activité du PDO.
  5. Calculer l’activité de la peroxydase à l’aide du coefficient d’extinction molaire du gaïacol (26,6 mM-1 cm-1) et exprimer l’activité en μmol tétra-gaïacol/min/mg de protéine.
  6. Calculer l’activité du POD à l’aide de l’équation utilisée par Mafa et al.6 :
    ACTIVITÉ DU POD = [(ΔABS × DF) ÷ Concentration en protéines] × 26,6 mM-1 cm-1 × 1 cm
    REMARQUE : où ΔABS = absorbance moyenne ; DF = Facteur de dilution ; 26,6 mM-1 cm-1 = coefficient d’extinction du gaïacol.

9. Caractérisation du POD

REMARQUE : Des essais de caractérisation du POD ont été réalisés à l’aide d’extraits enzymatiques de Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 3 jours après l’infestation, selon des méthodes similaires décrites à l’étape 8, avec des changements mineurs dans les tampons de réaction et les températures. Les échantillons d’enzymes étaient toujours conservés sur de la glace pendant que les expériences étaient menées. Exécutez les réactions en quadrilats avec une réaction à blanc parallèle.

  1. Pour des dosages de pH optimaux, effectuez les étapes suivantes.
    1. Dissoudre le substrat de gaïacol dans des tampons de 50 mM (citrate de sodium, pH 4 et 5), du phosphate de sodium (pH 6 et 7) et du Tris-HCl (pH 8 et 9) (voir le tableau des matériaux).
    2. Exécutez les réactions à 25 °C comme décrit à l’étape 8.
  2. Pour des dosages de température optimaux, effectuez les étapes suivantes.
    1. Exécutez les réactions à 25 °C, 30 °C, 40 °C et 50 °C, respectivement.
    2. Utilisez un substrat de gaïacol dissous dans le tampon pH 5 (pH optimum) et exécutez les réactions comme décrit à l’étape 8.
  3. Pour les tests de thermostabilité, effectuez les étapes suivantes.
    1. Avant de commencer les réactions, incubez l’enzyme à 37 °C, 50 °C et 70 °C pendant 30 min.
    2. Exécutez les réactions selon les méthodes décrites à l’étape 8 à l’aide d’un tampon de citrate de sodium de 50 mM (pH 5) et à 40 °C (température optimale).

10. Caractérisation de la β-1,3-glucanase

REMARQUE : Effectuer les essais de caractérisation en suivant la méthode décrite à l’étape 7 en utilisant des extraits enzymatiques à 3 dpi, avec quelques modifications dans les tampons de réaction et les températures. Exécutez les réactions en quadrilicats, avec une réaction à blanc parallèle pour chaque substrat.

  1. Pour des dosages de pH optimaux, procédez comme suit :
    1. Dissoudre les substrats MLG et β-1,3-glucane dans des tampons de 50 mM (citrate de sodium, pH 4 et 5), du phosphate de sodium (pH 6 et 7) et du Tris-HCl (pH 8 et 9).
    2. Exécutez la réaction comme décrit à l’étape 7.
  2. Pour des dosages de température optimaux, procédez comme suit :
    1. Exécutez les réactions à 25 °C, 30 °C, 40 °C et 50 °C, respectivement.
    2. Utilisez des substrats MLG et β-1,3-glucane dissous dans le tampon de citrate de sodium de 50 mM (pH 5) avec un pH optimal (obtenu à l’étape 10.1) et exécutez les réactions comme décrit à l’étape 7.
  3. Pour les tests de thermostabilité, procédez comme suit :
    1. Avant de commencer les réactions, incubez l’enzyme à 37 °C, 50 °C et 70 °C pendant 30 min.
    2. Exécutez les réactions à l’aide de substrats dissous dans un tampon de citrate de sodium de 50 mM (pH 5) et incubez à 25 °C et 40 °C pendant 24 h.

11. Évaluation du mécanisme d’action de la β-1,3-glucanase sur différents substrats de glucane

REMARQUE : Les substrats glucaniques contiennent le même résidu de glucose dans leur squelette, mais les liaisons glycosidiques entre les unités de glucopyranose sont diverses et peuvent prendre la α ou β orientation17. Les liaisons glycosidiques peuvent se former entre plusieurs atomes de carbone de molécules de glucose, définissant leur structure chimique, par exemple, β-1,3-glucane, β-1,4-glucane et β-1,3-1,4-glucane lié mixte (MLG)18,19,20. Le mécanisme d’action de la β-1,3-glucanase a été déterminé à l’aide d’échantillons de Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 (sources d’enzymes) et des substrats suivants β-1,3-glucane (CM-curdlan), MLG (d’orge) et β-1,4-glucane (AZO-CM-cellulose). Le mécanisme d’action est déterminé dans des conditions d’essai optimales (25 °C et 40 °C, pH 5,0), en utilisant des substrats β-1,4-glucane à 0,1 % (p/v), β-1,3-glucane à 0,1 % (p/v) ou 0,5 % (p/v) de GRM.

  1. Dissoudre les substrats dans un tampon de citrate de sodium de 50 mM (pH 5).
  2. Ajouter 200 μL de l’extrait enzymatique et 300 μL du substrat dans les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
  3. Incuber les réactions à deux températures distinctes, 25 °C et 40 °C pendant 8 h.
  4. Fin des réactions par chauffage à 100 °C.
  5. Centrifuger le mélange réactionnel de β-1,3-glucane et de MLG à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C et procéder comme décrit à l’étape 7.3.
  6. Pour le β-1,4-glucane, après avoir terminé la réaction à 100 °C, diluer le mélange avec 800 μL d’éthanol absolu et centrifuger à 4 °C pendant 10 min à 10 000 x g.
  7. Transférez le surnageant dans les courbes, mesurez l’absorbance à 590 nm avec le spectrophotomètre et calculez l’activité de la β-1,3-glucanase sur le β-1,4-glucane en utilisant la procédure du fabricant (voir le tableau des matériaux) et exprimez l’activité en unités/mg de protéines.

12. Détermination du mode d’action de la β-1,3-glucanase

REMARQUE : Le mode d’action de la β-1,3-glucanase induite par Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 infestés de RWASA2 a été analysé avec des oligosaccharides laminarins (LAMs) dont le degré de polymérisation (DP) est compris entre 5 et 2. Utilisez la chromatographie sur couche mince (CCM), la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) et le kit de glucose oxydase peroxydase (GOPOD) pour déterminer le DP nécessaire à l’hydrolyse de la β-1,3-glucanase du substrat. La CCM a été utilisée pour l’analyse qualitative, et la LC-MS a été utilisée pour l’analyse quantitative, qui a déterminé la concentration des oligosaccharides dans l’hydrolysat après la réaction21.

  1. Préparer les réactions du mode d’action de la β-1,3-glucanase
    REMARQUE : Préparez l’extrait protéique concentré à l’aide d’un filtre à membrane concentrateur centrifuge de 10 kDa, et obtenez ainsi des extraits protéiques concentrés et non concentrés infestés de RWASA2 pour l’expérience.
    1. Pour concentrer les enzymes extraites de chaque cultivar, transférez 5 mL des extraits dans les filtres à membrane concentrateurs de la centrifugeuse de 10 kDa.
    2. Centrifuger les tubes filtrants à membrane contenant l’extrait à 15 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
    3. Dissoudre le laminaripentaose (LAM5), le laminaritétraose (LAM4), le laminaritriose (LAM3) et le laminaribiose (LAM2) (voir le tableau des matières) dans 50 mM de citrate de sodium (pH 5) pour obtenir 10 mg/mL.
    4. Pour démarrer la réaction, ajoutez 20 μL d’extrait de protéine et 40 μL de laminaripentaose (LAM5), de laminaritétraose (LAM4), de laminaritriose (LAM3) et de laminaribiose (LAM2).
    5. Incuber la réaction à 40 °C pendant 16 h et terminer par ébullition à 100 °C pendant 5 min.
  2. Effectuer la chromatographie sur couche mince (CCM)
    1. Coupez 4 plaques de silice en2 morceaux de 10 cm et tracez une ligne sur la surface de l’assiette, en laissant un espace de 1 cm à partir du bas d’un bord.
    2. Marquez les points sur la ligne et marquez-les selon différents cultivars et DP des oligosaccharides laminarins, à 1 cm de distance et. Prenez 2 plaques de silice pour les extraits protéiques concentrés et les 2 autres pour les extraits non concentrés.
    3. Ajouter 3 μL des mélanges réactionnels 3 à 5 fois sur les points marqués correspondants sur la plaque de silice et laisser les points sur la plaque sécher complètement avant de répéter le processus.
    4. Placez délicatement les plaques de silice dans le réservoir de CCM contenant la phase mobile du n-butanol : acide acétique : eau (2:1:1 v/v/v) avec le côté contenant les taches des échantillons au fond.
    5. Laissez la phase mobile se déplacer du bas vers le haut de la plaque.
      REMARQUE : Cette étape peut prendre environ 2 h. Ne déplacez pas et ne dérangez pas le réservoir pendant la séparation des échantillons.
    6. Retirez les plaques de la phase mobile et laissez-les sécher à température ambiante.
    7. Ajoutez la solution de coloration dans le petit récipient, immergez doucement la plaque de silice dans la solution de coloration de naphtol à 0,3 % (v/v) dans de l’éthanol à 95 % (v/v) en utilisant de l’acide sulfurique à 5 % (v/v) pendant 5 s, retirez-la, puis laissez-la sécher à température ambiante.
      REMARQUE : À cette étape, allumez le bloc chauffant/four et réglez la température sur 100 °C.
    8. Placez les plaques de silice séchées sur le bloc chauffant et chauffez à 100 °C pendant 7 à 10 minutes ou jusqu’à ce que les taches bleu-violet apparaissent. Prenez des photos des plaques de silice montrant les taches bleu-violet et documentez-les.
  3. Quantifier la concentration des hydrolysats de laminarins-oligosaccharides
    REMARQUE : La concentration des hydrolysats de LAM sera quantifiée pour les extraits protéiques concentrés et non concentrés21.
    1. Ajouter 20 μL de chaque échantillon sur une colonne C18 (glucides 4,6 × 250 mm) et laisser séparer à un débit de 500 μL/min en utilisant un gradient d’eau (solvant A) et d’acétonitrile (solvant B) de 100 % B à 60 % B sur 10 min, suivi d’étapes de rééquilibrage de la colonne avec une durée totale de 20 min pour permettre le rééquilibrage de la colonne.
    2. Ionisez les analytes éluants en mode électronébulisation négative dans la source d’ions de spectrométrie de masse avec une température de chauffage de 400 °C pour évaporer l’excès de solvant, le gaz de nébulisation de 30 psi, le gaz de chauffage de 30 psi et le gaz de rideau de 20 psi.
    3. Réglez le potentiel de désagrégation sur 350 V.
    4. Analysez les analytes éluants sur le spectromètre de masse en mode de balayage Q1 allant de 150 Da à 1000 Da avec un temps de séjour de 3 s.
    5. Notez les concentrations des analytes sur la feuille de calcul.
  4. Quantifier la concentration de glucose
    1. Analysez la concentration de glucose produite par l’hydrolyse de la laminarine à l’aide du réactif GOPOD en suivant les instructions du fabricant22,23.
    2. Mesurer l’absorbance à 510 nm en mode fixe du spectrophotomètre.

13. Collecte et analyse des données

  1. Randomisez toutes les expériences pour éviter tout biais lors de l’infestation ou du prélèvement d’échantillons et effectuez l’analyse en quadrillats.
  2. Sauf indication contraire, utilisez les moyennes ±écart-type pour représenter les valeurs dans les graphiques et les tableaux générés à partir des données expérimentales collectées.
  3. Utilisez Microsoft Excel pour analyser toutes les données et générer des graphiques.
  4. Effectuez des analyses statistiques avec des logiciels compatibles.
    REMARQUE : Effectuer une analyse multifactorielle de variance (ANOVA) pour tester la signification entre les traitements et la LSD de Fisher pour tester les groupes homogènes à une valeur alpha de 0,05.

Résultats

Quatre réplicats biologiques de cultivars de blé (Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5) ont été infestés par RWASA2 au stade de croissance à 3 feuilles. Après l’infestation, les feuilles ont été récoltées à 1-, 2-, 3-, 7-, 14 dpi. Les traitements témoins n’ont pas été infestés par RWASA2 pour rendre les résultats de l’expérience comparables à ceux des plants de blé non exposés au stress. Les expériences ont été menées en quadrilcalitats, et les résultats ont été présentés sous forme de valeurs moyennes.

Les concentrations en protéines des extraits infestés par RWASA2 et des extraits témoins ont été quantifiées à l’aide de la BSA comme étalon protéique. Cela s’est avéré utile pour déterminer l’activité enzymatique de la β-1,3-glucanase et du POD et pour s’assurer que les concentrations de protéines utilisées dans chaque réaction étaient connues pour chaque échantillon ; Les différences étaient négligeables. Les données peuvent être présentées sous forme de graphique ou de tableau. Le premier format de graphique a été utilisé pour exprimer les activités spécifiques de l’enzyme (axe des y) tracées en fonction des jours suivant l’infestation (axe des x) pour l’activité enzymatique et les résultats des tests de caractérisation. L’augmentation de l’activité spécifique de la β-1,3-glucanase, de la β-glucanase spécifique du MLG et du POD dans des échantillons résistants de Tugela-Dn5 infestés de RWASA2 a montré que les enzymes jouaient un rôle dans la réponse de défense (Figure 1 et Figure 2). De plus, les deux enzymes ont considérablement perdu de leur activité au fil du temps chez Tugela sensible infestée par RWASA2.

La caractérisation biochimique de la β-1,3-glucanase et du POD associés à la paroi cellulaire a été déterminée en exprimant l’activité en pourcentages d’activité relative ou d’activité enzymatique spécifique, qui ont été représentés par des graphiques linéaires et à barres, respectivement (figure 3). Le résultat a montré que la β-1,3-glucanase et la POD présentaient des conditions optimales au pH similaire (pH 5) correspondant aux conditions acides de la paroi cellulaire (Figure 3). Il est important de noter que la β-glucanase spécifique du MLG a également montré une activité spécifique à pH 5. Cependant, elle était plus stable dans des conditions de base que la β-1,3-glucanase, qui a perdu jusqu’à 80% de son activité relative dans la même condition. Les résultats ont confirmé que deux enzymes qui catalysaient les substrats MLG et β-1,3-glucane ont été extraites avec succès de la région de la paroi cellulaire sur la base de l’optimum de pH. Cette affirmation a été validée par les résultats d’un test de thermostabilité (figure 4), qui ont confirmé que la β-1,3-glucanase ne pouvait tolérer que des températures allant jusqu’à 50 °C et perdait plus de 80 % de son activité relative à 70 °C (le POD avait les mêmes profils). En revanche, l’enzyme β-glucanase spécifique de la MLG a montré l’activité la plus élevée à 25 °C, suivie d’une activité progressivement diminuée, mais cette enzyme a conservé plus de 50 % d’activité relative à 50 °C et 70 °C. Les observations ont confirmé que la β-glucanase spécifique du MLG présentait des propriétés biochimiques uniques par rapport à la β-1,3-glucanase et au POD extraits de Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5.

Le mode d’action de la β-1,3-glucanase a été démontré avec des oligosaccharides laminariens ayant une DP comprise entre 5 et 2 (appelés LAM5 à LAM2). Les résultats de la CCM ont montré que Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 infestés avaient une enzyme β-1,3-glucanase qui hydrolysait principalement les oligosaccharides plus longs (LAM5 et LAM4) par rapport aux oligosaccharides plus courts (LAM3). L’intensité des taches bleu-violet visualisées sur la plaque CCM a montré que LAM5 et LAM4 avaient des bandes moins intenses, suivies de LAM3 chez les cultivars résistants et modérément résistants (figure 5). Le cultivar Tugela sensible a montré que la β-1,3-glucanase hydrolysait le LAM5 mieux que les autres oligosaccharides (LAM4-LAM2), qui présentaient des bandes plus intenses. Le mode d’action est également exprimé par les concentrations des hydrolysats, présentées dans un tableau avec une carte thermique montrant l’hydrolyse efficace des oligosaccharides de laminarine avec une DP plus élevée et une activité modérée pendant l’hydrolyse des oligosaccharides plus courts (LAM3 et LAM2) (tableau 1).

figure-results-1
Figure 1 : L’activité spécifique de la peroxydase extraite de Tugela (A), Tugela-Dn1 (B) et Tugela-Dn5 (C) infestées par RWASA2 14 jours après l’infestation. Les expériences ont été réalisées en quadruplicates ; les valeurs et les barres d’erreur représentent respectivement les moyennes ± écart-type. U en protéine U/mg représente μmol tétra-gaïacol/min. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Activité spécifique de la β-1,3-glucanase mesurée chez les cultivars Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 infestés par RWASA2. L’activité enzymatique a été menée à l’aide de deux substrats de glucane chimiquement distincts, c’est-à-dire le β-1,3-1,4-glucane (A-C) et le curdlan (D-F). Les expériences ont été réalisées en quadruplicates ; les valeurs et les barres d’erreur représentent respectivement les moyennes ± écart-type. U en protéine U/mg représente μmol/h. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Les dosages optimaux du pH de l’enzyme β-1,3-glucanase extraite de Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 infestés par RWASA2 3 jours après l’infestation. Les expériences ont été menées à l’aide de substrats mixtes β-1,3-1,4-glucane (A-C) et curdlan (D-F). Les expériences ont été réalisées en quadruplicates ; les valeurs et les barres d’erreur représentent respectivement les moyennes ± écart-type. U en protéine U/mg représente μmol/h. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Dosage de la thermostabilité. Les analyses de thermostabilité de la β-1,3-glucanase provenant de Tugela, Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 infestées par RWASA2 3 jours après l’infestation ont été analysées sur le β-1,3-1,4-glucane (A-C) et le β-1,3-glucane (D-F). Les expériences ont été réalisées en quadruplicates ; les valeurs et les barres d’erreur représentent respectivement les moyennes ± écart-type. U en protéine U/mg représente μmol/h. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-5
Figure 5 : Analyse du mode d’action de la β-1,3-glucanase sur les oligosaccharides de laminarine. Les oligosaccharides de laminarine étaient représentés par L5, L4, L3 et L2, qui étaient équivalents au laminaripentaose (LAM5), au laminaritétraose (LAM4), à la laminaritriose (LAM3) et à la laminaribiose (LAM2), respectivement. La flèche rouge montre le glucose (GLU), et la flèche bleue montre les profils de l’enzyme sans les oligosaccharides. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Oligosaccharides laminariens produits avec de la β-1,3-glucanase concentrée extraite de cultivars de blé infestés par RWASA2 pendant 3 jours. Les concentrations d’oligosaccharides dans l’hydrolysat ont été déterminées par LC-MS. LAM5, LAM4, LAM3, LAM2 et GLU représentent respectivement le laminaripentaose, le laminaritétraose, le laminaritriose, le laminaribiose et le glucose. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Le blé et l’orge sont des cultures céréalières fréquemment infestées par des espèces de pucerons, y compris les pucerons russes du blé (Diuraphis noxia)7,24. Les plants de blé résistants induisent la régulation positive des activités POD et β-1,3-glucanase en tant que réponses de défense tout au long de la période d’infestation pour modifier la paroi cellulaire en régulant l’accumulation de callose et de lignine 6,25,26,27. Il est important de noter que la plupart des études ont extrait les enzymes POD et β-1,3-glucanase de l’apoplast 3,12,28, ce qui rend leurs fonctions de paroi cellulaire hautement spéculatives. L’étude actuelle a développé une méthode qui a extrait la β-1,3-glucanase liée à la paroi cellulaire, la β-glucanase spécifique de la MLG et la POD dans le cadre de la protéine totale. Ces enzymes étaient très actives chez les cultivars de blé résistants par rapport aux cultivars témoins, tandis que leur activité était retardée chez les cultivars sensibles. L’utilisation des contrôles dans les expériences a permis de comprendre les effets de l’infestation sur les niveaux d’activité des enzymes liées à la paroi. L’échantillonnage des tissus des troisième et deuxième feuilles pour les échantillons infestés ou témoins est important car il apporte de l’uniformité. De plus, échantillonnez les infestés et les témoins avec la même période, car l’activité de la PDS, de la β-1,3-glucanase et de la β-glucanase spécifique du MLG augmente la croissance des semis de blé.

Le substrat de curdlan utilisé dans cette étude a une structure chimique similaire à celle du callose, un polymère déposé dans la région de la paroi cellulaire lors de l’interaction blé-RWA 7,24. Le substrat MLG de l’orge représente la partie de l’hémicellulose de la paroi cellulaire présente en faible proportion par rapport au xylane chez la plupart des monocotylédones. Les substrats ont été dissous dans un tampon de citrate de sodium pH 5 pour imiter l’état acide de la paroi cellulaire végétale de la région29. Si la β-1,3-glucanase et la β-glucanase spécifique de la MLG étaient éliminées avec l’IWF, la protéine totale extraite du tissu foliaire restant n’aurait pas d’activité sur les substrats de la MLG et du curdlan. De plus, si les extraits de protéines provenaient de la région cytoplasmique, ils montreraient une activité dans la plage de pH neutre. Il est intéressant de noter que les deux enzymes étaient présentes dans l’extrait protéique total parce qu’elles ont réussi à hydrolyser les substrats MLG et Curdlan. L’hydrolyse du MLG et du curdlan par les enzymes respectives a produit les sucres réducteurs, qui ont été détectés par le réactif DNS selon une méthode modifiée par Mafa et al.6. Lorsque les échantillons ont une concentration plus élevée de sucres réducteurs totaux, la couleur du réactif DNS passe du jaune au brun foncé ou passe du jaune au brun clair (semble orange foncé) lorsque la concentration de sucres réducteurs est faible.

Le substrat gaïacol a été utilisé pour mesurer l’activité des POD. En raison de l’efficacité catalytique élevée de POD, nous avons mesuré son activité à l’aide du mode cinétique du spectrophotomètre. Le POD est activé par la faible concentration de H2O2 en présence du substrat (Gaïacol). L’activité de cette enzyme convertit le gaïacol en tétra-gaïacol, qui est un composé de couleur brun-orange. La production du tétra-gaïacol confirme que le POD réticule les composés phénoliques pour produire des oligomères ou incorpore des composés phénoliques dans la lignine. Le POD a montré des niveaux d’activité plus élevés chez le Tugela-Dn5 résistant infesté par RWASA2, suivi du Tugela-Dn1 modérément résistant par rapport aux témoins. Cependant, les niveaux d’activité du POD ont été considérablement réduits au fil du temps chez la Tugela sensible infestée. Les résultats de cette étude ont été étayés par l’affirmation selon laquelle les cultivars de blé résistants infestés par RWASA2 utilisent le POD pour renforcer leur paroi cellulaire en réticulant la lignine ou les connexions lignine-hémicellulose6. Le POD nécessitait que le H2O2 fonctionnait, ce qui indique qu’il réduisait l’oxydation ou le blanchiment des glucides structurels de la paroi cellulaire en régulant les niveaux de H2O2 dans la région de la paroi cellulaire.

Différentes conditions de pH et de température ont été utilisées pour déterminer les conditions biochimiques optimales pour ces enzymes liées à la paroi cellulaire. Les conditions optimales ont montré que les enzymes ont des activités optimales à des plages de pH acides (pH 5), ce qui suggère qu’elles étaient associées à la région de la paroi cellulaire. La température optimale pour la β-1,3-glucanase a été obtenue à 25 °C et 40 °C lors de l’hydrolyse des substrats β-1,3-1,4-glucane et β-1,3-glucane, respectivement. Cette observation a confirmé que les β-1,3-glucanases et la β-glucanase spécifique de la MLG étaient deux enzymes différentes induites dans la région de la paroi cellulaire des cultivars de blé résistants lors de l’infestation par RWASA2. Même si la caractérisation biochimique est une méthode prometteuse pour découvrir ou identifier différentes enzymes avec des substrats similaires, nous recommandons tout de même d’utiliser d’autres méthodes laborieuses mais précises, notamment les tests de western blot et de zymogramme. Enfin, nous n’avons pas pu quantifier le mode d’activité enzymatique de la β-glucanase spécifique du MLG en raison d’un manque d’oligosaccharides MLG. Cependant, les β-1,3-glucanases extraites de Tugela-Dn5 et Tugela-Dn1 infestées par RWASA2 ont montré une activité plus élevée sur LAM5, LAM4 et LAM3, tandis que celles provenant de Tugela sensible ont montré une activité plus élevée sur LAM5 et LAM4. Cela confirme que l’étude du mode d’activité enzymatique peut également permettre de détecter des différences subtiles entre les β-1,3-glucanases induites chez les cultivars résistants et sensibles infestés de RWA.

L’étude actuelle donne une procédure détaillée pour extraire les enzymes liées à la paroi cellulaire du tissu des feuilles de blé. Après l’extraction, nous avons identifié trois enzymes liées à la paroi cellulaire, à savoir la β-1,3-glucanase, la β-glucanase spécifique du MLG et la POD. Les niveaux d’activité de ces enzymes étaient significativement plus élevés chez les cultivars Tugela-Dn1 et Tugela-Dn5 modérément résistants infestés par RWASA2 que chez les cultivars témoins. Ceux-ci ont confirmé que les enzymes liées à la paroi cellulaire contribuaient à la réponse de défense chez les cultivars résistants. Les résultats de la caractérisation donnent un aperçu que la POD de paroi cellulaire et la β-1,3-glucanase fonctionnent dans les mêmes conditions, suggérant qu’elles renforcent en synergie la paroi cellulaire lors de l’interaction blé-RWASA2.

Certaines limites ont été identifiées qui interfèrent avec les protocoles actuels discutés. La pénurie de plants de blé peut limiter le matériel foliaire disponible pour extraire les échantillons d’enzymes. Si l’IWF de l’apoplaste n’est pas extraite avec succès des échantillons de feuilles avant d’extraire les enzymes de la paroi cellulaire, cela peut conduire à la combinaison de l’apoplaste et des enzymes de la paroi cellulaire. La combinaison de l’IWF et des enzymes de la région de la paroi cellulaire rend difficile l’étude des enzymes liées à la paroi cellulaire qui sont liées à la paroi cellulaire. Aucune autre limite n’a été identifiée dans le protocole actuel.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts impliqué dans ce travail.

Remerciements

M. Mafa a bénéficié d’un financement de la NRF-Thuthuka (numéro de référence : TTK2204102938). S.N. Zondo a reçu la bourse d’études supérieures de la National Research Foundation pour son diplôme de maîtrise. Les auteurs sont reconnaissants à l’Institut ARC-SG (Agricultural Research Council-Small Grains) de nous avoir fourni les semences utilisées dans cette étude. Toutes les opinions, conclusions et recommandations exprimées dans ce document sont celles de l’auteur ou des auteurs, et par conséquent, les bailleurs de fonds n’acceptent aucune responsabilité à cet égard.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Centrifugeuse à membrane concentratrice de 10 kDaSigma-AldrichR1NB84206À usage scientifique uniquement. Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic. Pour la concentration et la purification de solutions biologiques.
2 g LaminaribioseMegazyme (Wicklow, Irlande)O-LAM2Laminaribiose de haute pureté pour la recherche, les dosages d’enzymes biochimiques et l’analyse diagnostique in vitro.
3 g LaminaritrioseMegazyme (Wicklow, Irlande)O-LAM3Laminaritriose de haute pureté pour la recherche, les tests d’enzymes biochimiques et l’analyse diagnostique in vitro.
Acide 3,5 dinitrosalicyliqueSigma-AldrichD0550Utilisé dans la détermination colorimétrique des sucres réducteurs
4 g de laminaritétraose  ;Megazyme (Wicklow, Irlande)O-LAM4Laminaritétraose de haute pureté pour la recherche, les dosages biochimiques d’enzymes et l’analyse diagnostique in vitro.
5 g de LaminaripentaoseMegazyme (Wicklow, Irlande)O-LAM5Laminaripentaose de haute pureté pour la recherche, les dosages biochimiques d’enzymes et l’analyse diagnostique in vitro.
Éthanol absolu à 95 %Sigma-Aldrich107017Absolu d’éthanol pour l’analyse
l’acide acétiqueSigma-AldrichB00063Acide acetc glacial 100 % pour l’analyse (contient de l’acide acétique)
Azo-CM-CelluloseMegazyme (Wicklow, Irlande)S-ACMCLe polysaccharide est teint avec du Remazolbrilliant Blue R à raison d’environ une molécule de colorant pour 20 résidus de sucre.
Bêta-glucane (orge)  ;Megazyme (Wicklow, Irlande)G6513Un substrat en poudre, moins soluble dans l’eau. Utilisé pour déterminer l’activité de la &bêta ;-1,3-glucanase.
Colorant d’essai de protéines Bio-RadBio-Rad Laboratories, Afrique du Sud500-0006Colorant d’essai colorimétrique, concentré, à utiliser avec les kits d’analyse de protéines Bio-Rad I et II  ;
Albumine sérique bovine (BSA)Gibco Europe810-1018Pour usage en laboratoire uniquement
Acide citrateSigma-AldrichC0759Pour la recherche en sciences de la vie uniquement. Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic.
CM-curdlan  ;Megazyme (Wicklow, Irlande)P-CMCURSubstrat en poudre pour la détermination de l’activité de la &bêta ;-1,3-glucanase. Insoluble dans l’eau.
D-GlucoseSigma-AldrichG8270Pour la recherche en sciences de la vie uniquement. Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic.
GuaiacolSigma-AldrichG5502Indicateur d’oxydation. Utilisé pour déterminer l’activité de la peroxydase.
Peroxyde d’hydrogèneBDH Laboratory Supplies, Angleterre10366Puissant agent oxydant.
Mikskaar Professional SubstarteMikskaar (Estonie)NISubstrat de semis à base de tourbe.
Engrais Multifeed (5.2.4 (43))Multifeed ClassicB1908248Un engrais soluble dans l’eau pour les jeunes plantes en développement et les semis ayant un besoin élevé en phosphore (P) afin d’assurer un développement racinaire optimal.
NaphtolMerck, AllemagneN2780Subit des hydrogénations en présence d’un catalyseur.
PhénolSigma-Aldrich33517Sensible à la lumière. Pour R& D d’utilisation uniquement. Ne pas utiliser à des fins médicamenteuses, domestiques ou autres. Tartrate
de sodium de potassium tétrahydraté (sel de Rochelle)Sigma-AldrichS2377utilisé dans la préparation de la solution d’acide 3,5-dinitrosalicylique utilisée dans le dosage du sucre réducteur.
Plaque de silice (TLC Gel de silice 60 F254)Sigma-Aldrich60778-25EAMatrice de gel de silice, avec indicateur fluorescent 254 nm
Hydroxyde de sodiumSigma-AldrichS8045Pour R& D d’utilisation uniquement. Ne pas utiliser à des fins médicamenteuses, domestiques ou autres.
Métabisulfite de sodiumSigma-Aldrich31448Ajouté en tant qu’antioxydant lors de la préparation de solutions d’acide 3,5-dinitrosalicylique.
Phosphate de sodium dibasique heptahydratéSigma-AldrichS9390Utilisé comme solution tampon dans la recherche biologique pour maintenir le pH constant.
Phosphate de sodium heptahydraté monobasiqueSigma-Aldrich71500Un composé inorganique, soluble dans l’eau. Utilisé comme réactif dans le développement de coulis à base de silicate.
Logiciel d’analyse statistiqueTIBCO Statisticaversion 13.1
Acide sulfuriqueMerck, Darmstadt, Allemagne30743Acide sulfurique 95-97 % pour l’analyse du Hg, réactif ACS.
Tris-HClSigma-Aldrich10812846001Agent tampon dans les mélanges d’incubation. Il a également été utilisé comme composant de la lyse et du tampon TE (Tris-EDTA). Pour la recherche en sciences de la vie uniquement. Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic.
UV&ndash ; Spectrophotomètre visibleGENESYS 120  ;
  ; NI = non identifié.
de

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B ta 1activit peroxydasepuceron du bl russeprot ines li es la pathogen secaract risation enzymatiquechromatographie sur couche mincesp cificit du substrat de la glucanaseinteraction plante ravageur
Élucidation des propriétés physicochimiques de la #946 ;-1,3-glucanase et de la peroxydase du mécanisme de défense de la paroi cellulaire du blé contre l’infestation par Diuraphis noxia
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