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Utilisation d’un modèle de cœur de rat isolé pour tester les stratégies de préservation du cœur d’un donneur

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DOI :

10.3791/66910

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4 octobre 2024

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1Cardiac Physiology and Transplantation, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent's Healthcare Clinical Campus, University of New South Wales, 3Heart and Lung Transplant Unit, St Vincent's Hospital, 4Faculty of Medicine, University of New South Wales

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un protocole de cœur de rat de travail isolé ex vivo pour tester les stratégies de préservation du cœur du donneur. Cet article décrit le protocole d’utilisation dans l’entreposage frigorifique statique des cœurs de donneurs de rongeurs ; Cependant, le protocole peut également être utilisé pour les cœurs de donneurs obtenus après un don après une mort circulatoire et une mort cérébrale.

Résumé

L’optimisation des solutions de préservation du cœur du donneur a joué un rôle clé dans la réduction des lésions d’ischémie-reperfusion dans le cœur du donneur lors du prélèvement, du transport et de la transplantation d’organes. Des travaux antérieurs de notre laboratoire ont montré que l’ajout de trinitrate de glycéryle et d’érythropoïétine aux solutions de préservation du cœur du donneur pouvait améliorer considérablement la récupération fonctionnelle cardiaque après un stockage prolongé au froid et dans le don après une mort circulatoire cardiaque. Ce protocole de supplémentation a été mis en œuvre en utilisation clinique dans des unités de transplantation en Australie, en Belgique et au Royaume-Uni. Ici, nous décrivons un protocole pour tester des stratégies de supplémentation à l’aide d’un circuit de perfusion de cœur de rat de travail isolé ex vivo (IWRH). À l’aide de cette méthodologie, les stratégies de supplémentation peuvent être testées dans le contexte d’un stockage statique froid prolongé, d’un don après une mort cérébrale et d’un don après la mort circulatoire d’un donneur. La récupération fonctionnelle cardiaque, mesurée par le débit aortique, le débit coronarien, le débit cardiaque, la pression du pouls et la fréquence cardiaque, peut être utilisée pour déterminer si une stratégie de préservation particulière peut minimiser les lésions d’ischémie-reperfusion du cœur du donneur.

Introduction

Le succès d’une transplantation cardiaque peut être grandement influencé par la méthode de conservation utilisée pour le cœur du donneur. Les cœurs des donneurs sont soumis à des agressions ischémiques tout au long du processus de prélèvement, de transport et de transplantation d’organes. Le degré de lésions ischémiques de l’organe du donneur peut être atténué par le choix d’une stratégie appropriée de préservation du cœur du donneur. Le stockage statique à froid (CSS) reste la méthode la plus réalisable et la plus courante pour la préservation du cœur d’un donneur ; cependant, le CSS n’est pas nécessairement la meilleure option pour toutes les voies de don de cœur. Par exemple, les cœurs obtenus par la voie du don après la mort circulatoire (DCD) sont maintenus et évalués pour leur viabilité à l’aide de la perfusion mécanique normothermique, tandis que les cœurs obtenus par la voie du don après la mort cérébrale (DBD) peuvent être préservés à l’aide de la CSS ou de la perfusion par machine hypothermique. Un autre déterminant important de la stratégie de préservation utilisée est la quantité d’ischémie chaude (pour le TDC) ou d’ischémie froide (pour le DBD) à laquelle le cœur est soumis lors du prélèvement et du transport des organes.

De nombreux centres utilisent une supplémentation pharmacologique supplémentaire de la solution de préservation cardiaque pour augmenter la tolérance ischémique et améliorer la fonction cardiaque post-greffe. Des études sur des rongeurs de notre laboratoire ont montré que la supplémentation de la cardioplégie avec de l’érythropoïétine et du trinitrate de glycéryle était capable d’améliorer considérablement la récupération fonctionnelle cardiaque après un stockage prolongé au froid du cœur du donneur 1,2. Ces études ont ensuite évolué vers des études porcines sur la préservation du cœur d’un donneur et ont fourni les bases précliniques qui ont conduit à l’incorporation de l’érythropoïétine et du trinitrate de glycéryle dans la solution de cardioplégie des cœurs obtenue par une voie DCD en utilisant la perfusion de machine normothermique 3,4,5. À l’heure actuelle, la supplémentation en érythropoïétine et en trinitrate de glycéryle est également utilisée dans les unités de transplantation australiennes pour les prélèvements cardiaques cliniques de DBD intégrant du CSS. L’objectif global du protocole de perfusion du cœur de rat de travail isolé (IWRH) décrit ci-dessous est de tester les stratégies de préservation du cœur du donneur en laboratoire et de tester leur efficacité pour préserver la fonction cardiaque du donneur après la reperfusion. Le protocole de travail isolé du cœur de rat décrit est utilisé depuis plus de deux décennies au sein de notre laboratoire et s’est avéré extrêmement utile dans le dépistage de suppléments et/ou de stratégies potentiels pouvant améliorer la préservation du cœur du donneur 2,7,8,9.

Protocole

Tous les animaux ont reçu des soins sans cruauté conformément aux directives du National Health and Medical Research Council (Australie). Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale du Garvan Institute of Medical Research (Sydney, Australie).

1. Préparation du tampon Krebs-Henseleit (KH)

  1. Préparer 2 L d’une solution mère 20x de tampon KH contenant 2,36 M de NaCl, 0,094 M de KCl, 0,024 M de MgSO4, 0,024 M KH2PO4. Humidifier dans des tubes de 50 mL et conserver à -20 °C.
  2. Avant l’expérience, préparez deux flacons Erlenmyer de 2 L contenant 1 tampon KH contenant 1900 ml d’eau déminéralisée, 100 ml de tampon KH 20 kg, 4,20 g de NaHCO3 (25 mM) et 3,96 g de glucose (11 mM).
    1. Placer les ballons tampons dans un bain-marie à 37 °C et gazer la solution avec du carbogène (95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone, débit réglé à 2 L/min) à l’aide de pierres à air (filtre d’entrée à enfiler) pendant 5 min, puis ajouter 2,8 mL de 1 M de CaCl2 (1,4 mM). Continuez à faire bouillonner la solution pendant au moins 1 h avant le début de l’expérience. L’utilisation d’une pierre à air aide à l’aération uniforme de la zone tampon.
    2. Placez un petit volume (~50 ml) de tampon dans un plat rond en métal à -20 °C pour refroidir et former une couche de tampon glacé.

2. Préparation du circuit de perfusion

  1. Assurez-vous que tous les tubes et la verrerie sont propres, sans croissance ou contamination visible.
  2. Régler les hauteurs des chambres en verre pour correspondre aux pressions de perfusion requises sur la base de 1 cm H2O équivalant à 1,36 mmHg : Langendorff-cœur 100 cm (environ 75 mmHg), précharge latérale 15 cm (environ 11 mmHg), chambre cœur-cœur 100 cm (environ 75 mmHg).
  3. Commencer la circulation de l’eau chaude autour du circuit au moins 10 minutes avant la perfusion cardiaque.
  4. Placez les filtres en microfibre (1,2 μm) dans les porte-filtres et fixez-les hermétiquement.
  5. Amorcez le circuit avec un tampon KH, en vous assurant que tout l’air est éliminé, et utilisez une pince de tube de contrôle de débit pour ajuster le débit du côté Langendorff (Figure 1A, B) à ~50 mL/min. Le débit plus lent facilite la canulation aortique et empêche le cœur d’être délogé avant le liage. Placez un thermomètre dans le circuit via un connecteur de tube en forme de T pour surveiller la température du tampon à ~37 °C.

3. Mise en place du logiciel Lab Chart (analyse de données)

  1. Assurez-vous que le Powerlab (système d’acquisition de données) et le débitmètre sont allumés et connectés à l’ordinateur avant d’ouvrir le logiciel d’analyse de données.
  2. Ouvrez un nouveau fichier.
  3. Configurez la collecte de données en sélectionnant le menu déroulant Paramètres et en sélectionnant Paramètres du canal. Sélectionnez la pression aortique, le débit aortique et la fréquence cardiaque (Figure 2A).
  4. Configurez chaque canal avec les paramètres indiqués à la Figure 2B.

4. Préparation de l’animal à l’isolement du cœur du rat

REMARQUE : La méthodologie d’isolement et de perfusion du cœur de rat pour les cœurs non DBD et non DCD pour l’entreposage statique à froid est décrite ci-dessous. Les méthodes d’instrumentation cardiaque sur le circuit de perfusion sont relativement similaires, quelle que soit la méthode de don utilisée. Les différences dans le protocole pour le don de cœur de rat DBD et DCD se produisent principalement à partir du moment où l’anesthésie animale a pris effet jusqu’au moment où le cœur est excisé de l’animal.

  1. Pesez l’animal en vous assurant qu’il pèse > 330 g. La fourchette de poids idéale pour les rats mâles est de 330 à 420 g.
  2. Administrer une injection intrapéritonéale de kétamine (80 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg). Assurer un plan chirurgical adéquat de l’anesthésie en fonction de l’absence de réflexe de pédale (réflexe de pincement des orteils) et de réflexe de clignement des yeux.
  3. Placez l’animal en position couchée, en fixant les membres avec du ruban adhésif. Administrez de l’oxygène à l’animal via un cône nasal.
  4. Disposez du tampon KH, d’un récipient en métal pour la glace fondue et d’un petit récipient en métal avec de la glace au poste de dissection. Trempez une gaze de 7,5 cm x 7,5 cm dans un tampon KH et placez-la sur le récipient avec de la glace.
  5. Une fois que le plan chirurgical adéquat de l’anesthésie est confirmé, rasez la peau au site d’incision chirurgicale et nettoyez la peau avec des produits aseptiques tels que la bétadine ou l’alcool à 70%. Faites une incision latérale à travers l’abdomen (laparotomie) et déplacez l’estomac et les intestins sur le côté pour permettre l’accès à la veine rénale gauche. Injectez 1500 UI d’héparine et appliquez une pression sur le site d’injection jusqu’à ce que le saignement cesse. Attendez 1 à 2 minutes pour que l’héparine circule avant de poursuivre la récupération cardiaque.
  6. Ouvrez la cavité thoracique en coupant à travers la cage thoracique de chaque côté et en coupant à travers le diaphragme. Tenez et soulevez soigneusement le bloc cœur-poumon tout en coupant le long de l’aorte descendante, en vous assurant que l’arc aortique reste intact. Cela permettra à l’aorte de rester suffisamment longue pour la canulation.
  7. Le rat est euthanasié par l’ablation du cœur et des poumons sous anesthésie. Immergez le bloc cœur-poumon dans la gadoue de glace tampon KH pour permettre au cœur de s’arrêter.

5. Canulation du cœur sur le circuit de perfusion du cœur de travail isolé

  1. Transférez le bloc cœur-poumon dans une gaze sur de la glace. Disséquez l’excès de graisse autour de l’aorte, coupez l’aorte pour laisser une longueur de 3 à 5 mm pour la canulation et faites une petite incision de ~ 1 à 2 mm dans l’artère pulmonaire. Cela permettra de tracer un chemin pour l’effluent coronaire.
  2. Placez le bloc cœur-poumon coupé (encore sur de la glace) directement sous les canules. Ajustez le débit du côté Langendorff à l’aide d’une pince de tube de contrôle de débit pour faciliter la canulation aortique. Canulez soigneusement l’aorte sur la canule gauche, maintenez-la avec une pince noire et attachez-la avec une suture en soie 2-0.
  3. Augmentez le débit de la perfusion Langendorff en ouvrant complètement la pince de la tubulure de contrôle de débit. Ouvrez la pince de postcharge. Assurez-vous qu’il y a un écoulement continu de la chambre Langendorff. Commencez à surveiller l’activité cardiaque à l’aide d’un logiciel.
    REMARQUE : si la valeur du débit aortique sur l’affichage du débitmètre est de <10 mL / min, assurez-vous que l’artériotomie pulmonaire est de taille suffisante. Une trace/valeur de flux aortique faible peut également indiquer que la canule aortique a été insérée trop loin.
  4. Ajustez le bloc cœur-poumon de manière à ce que la surface antérieure des poumons soit face à l’opérateur. Attachez le lobe pulmonaire gauche avec une suture en soie 2-0 et coupez l’excès de tissu pulmonaire gauche. Attachez les lobes pulmonaires restants en un seul coup avec une suture en soie 2-0 et coupez le tissu. Faites pivoter le cœur de manière à ce que les poumons attachés soient vers l’arrière.
  5. À l’aide de petits ciseaux Vannas, coupez un bord de 2 à 3 mm de l’appendice auriculaire gauche, en veillant à ce qu’une petite ouverture dans les oreillettes soit obtenue. Canulez soigneusement l’appendice auriculaire gauche sur la canule gauche, maintenez-le avec une pince noire et attachez-le avec une suture en soie 2-0. La figure 3A montre l’emplacement des deux canules.
  6. Ajustez l’enveloppe d’eau de la chambre cardiaque de manière à ce que le cœur se trouve au centre de la chambre.
  7. Ouvrez le transducteur de pression à l’air et mettez-le à zéro dans le logiciel en sélectionnant le menu déroulant Pression aortique > Bridge Amp > Zero. Cliquez sur OK.
  8. Perfuser le cœur en mode Langendorff pendant 10 min. Assurez-vous que le débit aortique de Langendoff mesure entre 10 et 20 ml/min (idéal : 20 ml/min).
  9. Avant de changer de mode de fonctionnement, assurez-vous que la pierre à air (filtre d’entrée à enfiler) du réservoir tampon Langendorff KH est placée dans le réservoir tampon KH de travail.
  10. Mettez le cœur en mode de fonctionnement en fermant la grande pince menant à la canule aortique et en ouvrant le flux menant à l’appendice auriculaire gauche. Ouvrez le robinet à trois voies menant au perfusat de travail. Transférez la tubulure de retour commune (ramenant le tampon KH dans le réservoir) du réservoir Langendorff vers le réservoir de travail.
  11. Perfuser le cœur en mode de travail pendant 15 min. Les valeurs de débit aortique doivent idéalement être de >30 mL/min à la fin de la perfusion de 15 min. Une fois que le cœur s’est stabilisé, commencez à enregistrer les données dans un logiciel d’analyse de données.
  12. Mesurez l’effluent coronaire (débit coronaire) à 1 min, 5 min, 10 min et 15 min.
    REMARQUE : Les valeurs de débit coronaire doivent être comprises entre 10 et 20 mL/min. Un débit coronaire supérieur à 22 mL/min indique généralement une fuite provenant d’un vaisseau pulmonaire non attaché. La fréquence cardiaque doit être comprise entre 200 et 300 bpm. Les effluents coronaires peuvent être prélevés pour l’analyse en aval des marqueurs de lésions tissulaires (p. ex., troponine I, libération de lactate déshydrogénase).

6. Administration de la cardioplégie pour le stockage statique froid du cœur

  1. Remplissez la chambre de cardioplégie (positionnée à une hauteur de 60 cm pour produire une pression de perfusion d’environ 40 mmHg) avec 50 ml de solution de préservation cardiaque désignée (avec ou sans supplémentation).
  2. Abaissez la chemise d’eau et fermez le robinet à trois voies du côté du mode de fonctionnement.
  3. Arrêtez l’écoulement vers la canule auriculaire gauche en fermant la pince.
  4. Ouvrez le flux vers la canule aortique.
  5. Fermez la pince du côté Langendoff et sur la postcharge.
  6. Ouvrez la pince à partir de la ligne de cardioplégie et évacuez 15 ml de cardioplégie de la ligne de pression. Fermez le robinet au niveau de la conduite de pression.
  7. Laissez le cœur être rincé avec la cardioplégie via la canule aortique et collectez l’effluent coronaire. Exécutez cardioplégie pendant 3 minutes et enregistrez le volume de cardioplégie administré.
  8. Arrêtez d’enregistrer les données dans le logiciel et enregistrez le fichier.
  9. Au bout de 3 min, refermer la pince de cardioplégie et la petite pince bleue menant à la canule aortique.
  10. Placez une pince bouledogue sur la canule aortique et une deuxième pince bouledogue sur la canule gauche. Débranchez le bloc canule cardiaque du circuit et placez-le dans un bécher contenant la cardioplégie dans une glacière (Figure 3B, C).
  11. Conservez le cœur au réfrigérateur pendant 6 h (ou le temps de conservation au froid souhaité).

7. Reperfusion cardiaque après un stockage statique à froid

  1. Préparez le tampon KH conformément à la section 1.
  2. Amorcez le circuit de perfusion conformément à la section 2.
  3. Ouvrez le fichier enregistré à partir de la perfusion de base.
  4. Retirez avec précaution le bloc de canule cardiaque de la glacière et fixez-le sur le circuit de perfusion. Avant de reconnecter la canule aortique, utilisez une seringue à bout émoussé de 18 G remplie d’un tampon KH pour évacuer l’air de la canule. Connectez d’abord la canule aortique, ouvrez la pince de tubulure du côté de Langendorff et assurez-vous que la pince de tubulure de postcharge est ouverte.
  5. Rebranchez la canule auriculaire gauche, en vous assurant que l’air a été évacué de la canule avant de la connecter au circuit de perfusion. Gardez la pince côté travail fermée jusqu’à ce qu’il soit temps de passer du mode Langendorff au mode de travail.
  6. Perfuser le cœur en mode Langendorff pendant 15 min. Assurez-vous de commencer à enregistrer les données au début de la reperfusion de Langendorff.
  7. Avant de passer en mode de travail, placez les deux pierres bouillonnantes dans le tampon KH, ouvrez le robinet à 3 voies du côté de travail et transférez le tube de retour commun dans le réservoir de travail.
  8. Fermez la pince Langendorff blanche, ouvrez la pince blanche du côté ouvrant et perfuser le cœur pendant 30 min. Mesurer et recueillir les effluents coronaires à des moments précis pour l’analyse en aval (p. ex., marqueurs de lésions cardiaques). Assurez-vous d’arrêter-redémarrer l’enregistrement du logiciel pour démarrer un nouveau segment (ou alternativement, ajoutez un commentaire).
  9. À environ 15 minutes de reperfusion en mode de travail, fermez le robinet à trois voies.
  10. À la fin de la reperfusion, enregistrez le fichier de données, arrêtez le flux dans le circuit et déconnectez le bloc cardiaque. Prélever des échantillons du ventricule gauche pour un traitement histologique et/ou les congeler pour des études ultérieures (p. ex., extraction de protéines pour les études par transfert Western).
  11. Retirez les filtres des porte-filtres, vidangez le tampon du circuit et rincez deux fois avec 5 L d’eau distillée.
    REMARQUE : Bien que cela ne soit pas nécessaire, il est utile de préchauffer l’eau distillée dans un grand récipient à l’intérieur du bain-marie.

8. Analyse de la récupération fonctionnelle

  1. Ouvrez le fichier LabChart.
  2. Mettez en surbrillance une zone d’enregistrement d’au moins 30 s, puis cliquez sur Commande > Ajouter une sélection de données OU Ajouter plusieurs fois aux données. Cela ajoutera les paramètres souhaités à un fichier DataPad dans le logiciel.
  3. Sélectionnez le menu déroulant Fenêtre > DataPad.
  4. Mettez en surbrillance et copiez les valeurs de récupération du DataPad dans une feuille de calcul pour l’analyse de la récupération fonctionnelle. Calculer la récupération fonctionnelle en pourcentage de sa valeur de référence respective 1,6,7.

Résultats

Les résultats de la perfusion de base détermineront si l’expérience initiale (pré-stockage) a été couronnée de succès. Le débit aortique affiché en mode Langendorff doit être compris entre 14 et 22 mL/min. Le débit de Langendorff est affiché sous la forme d’une valeur négative sur le débitmètre en raison de la perfusion rétrograde de l’aorte. La figure 4A montre un exemple de trace de Langendorff acceptable.

Une fois mis en mode de fonctionnement, le débit aortique doit être d’au moins 30 ml/min une fois que le cœur s’est stabilisé. Il est normal que le débit augmente d’abord à environ 50 ml/min, puis diminue à environ 25 ml/min avant de revenir à un débit aortique de base stable. Une fois que les paramètres de base sont satisfaisants (AF > 30 mL/min, CF 10-20 mL/min, HR 200-300 bpm), le cœur peut être stocké. La figure 4B est un exemple d’un bon tracé de référence.

Selon la solution de conservation testée, certains cœurs ne se rétabliront pas bien après un stockage statique prolongé à froid, malgré une excellente base de référence. La figure 4C montre un exemple de trace indiquant une mauvaise récupération en mode de fonctionnement.

La récupération fonctionnelle finale du flux aortique peut être calculée sur la base de la lecture finale du flux aortique en pourcentage de la valeur de référence. Par exemple, si la FA de base du cœur était de 40 mL/min et que la FA à la fin de la reperfusion après stockage statique à froid était de 20 mL/min, la récupération de la FA pour ce cœur était de 50 %. La figure 5 donne un exemple de cette représentation des données.

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Figure 1 : Circuit de perfusion du cœur de travail. (A) Photo du circuit de perfusion du cœur de rat de travail isolé. La case rouge indique où se positionne le cœur isolé. (B) Schéma du circuit de perfusion du cœur de travail isolé indiquant la direction d’écoulement du tampon KH à travers le circuit pour la perfusion de Langendorff (ligne pointillée) et en mode de fonctionnement (ligne continue). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Configuration du logiciel LabChart. (A) Configuration des paramètres de canal pour la pression aortique, le débit aortique et la fréquence cardiaque. (B) Exemple de modèle LabChart configuré avec trois canaux. Les fenêtres de droite montrent chaque canal configuré. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Canulation et cardioplégie. (A) Canulation cardiaque avant la mise en place dans la chambre de la chemise d’eau. La canule gauche est insérée dans l’aorte et la canule droite est insérée dans le ventricule gauche via l’appendice auriculaire gauche. Les vaisseaux pulmonaires ont été ligotés et le tissu pulmonaire disséqué. (B) Après l’administration de la cardioplégie, le cœur est placé dans un bécher contenant la solution de cardioplégie. Les canules ont été serrées avec des pinces bulldog avant de se déconnecter de la plate-forme. (C) Exemple de cœurs placés dans une glacière pour un stockage frigorifique prolongé. Ici, deux cœurs ont été stockés pour la reperfusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Exemples de traces LabChart. Traces de pression (graphique rouge), de débit aortique (graphique bleu) et de fréquence cardiaque (graphique vert) pour un cœur avec (A) Bonne trace de Langendorff, (B) Bonne récupération lors de la reperfusion en mode de travail, (C) Mauvaise récupération lors de la reperfusion en mode de travail. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Graphiques représentatifs de la récupération fonctionnelle. (A) le flux aortique, (B) le débit coronarien, (C) le débit cardiaque et (D) la fréquence cardiaque. Cette figure a été réutilisée avec la permission de Gao et al.8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Étant donné la nature sensible de la fonction cardiaque de base, des précautions doivent être prises pour maintenir le dispositif de perfusion propre et avec des composants compatibles. Par exemple, il faut utiliser le bon tube en PVC. Certains matériaux de tubulaire, tels que le silicone, peuvent contribuer à réduire le flux aortique et la contractilité, ce qui peut être dû à une perte d’oxygène via le tube. Bien qu’il existe des circuits de perfusion cardiaque de rat fonctionnels isolés disponibles dans le commerce, la plupart d’entre eux sont principalement utilisés pour la perfusion de Langendorff uniquement. En général, des mesures fonctionnelles peuvent être obtenues dans un modèle de perfusion de Langendoff via l’insertion d’un cathéter à ballonnet dans le ventricule gauche pour obtenir des mesures de pression diastolique ventriculaire gauche (LVDP). Cependant, il n’est pas possible de mesurer les mesures brutes du débit aortique et du débit cardiaque dans un système de perfusion Langendoff. L’un des principaux avantages du protocole IWRH est la possibilité d’obtenir des mesures fonctionnelles du débit aortique et du débit cardiaque sans qu’il soit nécessaire d’effectuer des interventions supplémentaires du cœur (c’est-à-dire un cathéter à ballonnet). Il existe des options commerciales pour un système de perfusion cardiaque de rat fonctionnel et bien que celles-ci puissent être personnalisables pour les exigences d’étude individuelles, ces systèmes peuvent être coûteux.

Le protocole comporte des étapes essentielles pour assurer un fonctionnement de base optimal du cœur des rongeurs pendant la perfusion. La préparation des solutions mères tampons de KHB ne doit pas dater de plus de 4 semaines. Le circuit de perfusion doit être exempt de bulles d’air lors de l’amorçage. Des précautions doivent être prises lors de la canulation de l’appendice auriculaire gauche. Une manipulation excessive des tissus peut augmenter le risque de déchirure et peut également ajouter à l’irritabilité fonctionnelle du cœur.

La qualité des performances du circuit de perfusion IWRH peut généralement être déterminée par les lectures de base obtenues dans les cœurs (AF > 30 mL/min, CF ~20 mL/min). D’autres tests de contrôle de la qualité dans un modèle CSS peuvent être effectués en arrêtant et en stockant le cœur dans une solution de conservation Celsior complétée par 1 μmol/L de zoniporide et 0,1 mg/mL de trinitrate de glycéryle. Les cœurs arrêtés avec Celsior complété par du trinitrate de glycéryle plus zoniporide garantissent une récupération immédiate de la reperfusion de Langendorff et une récupération fonctionnelle finale entre 40 et 60% après 6 h de stockage au froid. En cas de doute quant aux bonnes performances de la plate-forme, ce complément de contrôle de la qualité est utile à tester.

Les méthodes d’utilisation des cœurs de rongeurs obtenus par don après la mort circulatoire ont déjà été décrites10,11. En bref, les rats sont anesthésiés, l’artère carotide canulée et les lectures de pression obtenues. L’héparine (500 UI) est injectée via la canule de l’artère carotide. La trachée est ligaturée pour amorcer le retrait du système de maintien de la vie. Une fois que le temps ischémique chaud requis est atteint, le cœur peut être excisé et canulé sur le circuit de perfusion. Pour l’administration de la solution de conservation dans le cœur DCD, 60 mL de solution de conservation sont évacués par l’aorte (~20 mL/min) via la conduite de pression sur le circuit. Les vaisseaux pulmonaires sont ligotés, les poumons sont disséqués, la canule gauche est insérée, puis 40 ml de solution de conservation sont rincés par la conduite de pression. Le cœur est ensuite perfusé selon le protocole ci-dessus. La récupération fonctionnelle est considérée comme une valeur brute de l’hémodynamique fonctionnelle, et une analyse statistique est effectuée en comparant les valeurs aux cœurs qui ont été opérés de manière simulée (aucun DCD, cependant, n’a été rincé sur le banc).

Les méthodes d’utilisation des cœurs de rongeurs obtenus après la mort cérébrale ont déjà été décrites12. En bref, les animaux sont anesthésiés, intubés et ventilés, avec une surveillance hémodynamique conformément au protocole des rongeurs DCD. Un trou de bavure est effectué dans le crâne temporo-pariétal, et un cathéter d’embolectomie 3F est placé sous la durel. Les commandes fictives ont des trous de bavure mais pas d’insertion de cathéter. Le ballon est gonflé avec 0,3 mL d’eau pendant 2 minutes et maintenu gonflé pendant 1 h. Après 1 h d’observation hémodynamique, les cœurs sont explantés et placés dans le circuit de perfusion cardiaque de travail isolé, les mesures de base sont enregistrées, la cardioplégie est administrée et les cœurs sont stockés au froid comme décrit ci-dessus.

La principale limitation de l’utilisation du circuit de perfusion IWRH est l’impossibilité d’utiliser un tampon de perfusion sanguin pour circuler dans le système. Il serait impossible de trouver suffisamment de sang de rongeur pour l’ajouter au perfusat ; Par conséquent, la perfusion sanguine n’est pas possible. D’autres modèles, tels que des études sur la transplantation cardiaque hétérotopique chez des rongeurs ou sur des transplantations orthotopiques chez de grands animaux, devraient probablement être réalisés pour tester l’impact de la perfusion sanguine. Cependant, ces méthodes alternatives nécessitent une expertise en microchirurgie et/ou des installations chirurgicales pour grands animaux, ainsi que des anesthésistes, des perfusionnistes et des chirurgiens cardiothoraciques expérimentés.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les études décrites ici ont été financées par des subventions accordées à P.S. Macdonald par le National Health and Medical Research Council Australia, la St Vincent’s Clinic Foundation et la NSW Health Cardiovascular Research Capacity Senior Investigator Grant.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube Eppendorff incolore de 1,5 ml, 1000 par boîteBio Strategy Pty Ltd0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Manchon/25 PP ctn/500Sigma-aldrich Pty LtdCLS430791-500ea
BP Kit de transducteur/câbleADInstrumentsMLT1199Acquisition de données
Pont AmpliADInstrumentsFE221Acquisition de données
Carbogen 555G2BOCBOC002
Checktemp1 thermomètreHanna InstrumentsHI98509Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12Thomas Scientific2848Y40Rig Construction
Clamp w/Extension Stem Med.Thomas Scientific8847T08Collier de construction de plate-forme
avec tige d’extension Sm.Thomas Scientific8847T02
Rig Construction Clips, Vessel, 60 g Pressioncohérente Scientific14121Équipement chirurgical
Connecteur ferméThomas Scientific8847E25Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 noir prédécoupé 45 cm boîte de 24Fournitures médicales spécialiséesS195Consommables chirurgicaux
sur mesure 250 mL Dégazeur gainéVerrerie soufflée sur mesure Pty LtdN/AConstruction de plate-forme
Réservoir sur mesure de 750 mLVerrerie soufflée sur mesure Pty LtdN/AConstruction de plate-forme
D-(+)-Glucose Anhydrus SigmaUltraSigma-aldrich Pty LtdG7528-1KgPour fabriquer Krebs Buffer
Console à double canalADInstrumentsTS402Acquisition de données
Erlenmyer flacons 2 L  ;
Filtre Microfibre type GF/C fibre de verre 47 mm, 100Bio-strategy Pty Ltd1822047
Pince, 15 cm, 0,3 mm, CRVDCoherent Scientific14114Matériel chirurgical
Pinces à quatre broches avec bras de 9 mm x 115 mm de long pour la tenue d’objets de 2 à 70 mm de diamètre. Vinyle enduitMet-App Australia Pty Ltd1352Rig
Construction Heater Circulator. Contrôle numérique à semi-conducteurs. (1020 watts/240 volts)Thermoline ScientificTU3Rig Construction
Heparine 5000 U/5 mL boîte 50 Pfizer 02112115Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd1258693Médicaments
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mLCenvet Australia Pty LtdX5010Anesthésique
Johns Hopkins BulldogClamp Coherent Scientific  ;CS-WPI-14117
Kétamine 100 mg/50 mLProvet (NSW) Pty LtdKETAI1Anesthésique
sulfate de magnésium heptahydraté AR 500 g ChemsupplyBio Strategy Pty LtdMA048-500gPour fabriquer Krebs
Buffer Adaptateur à charnière mâle/femelleThomas Scientific8847V08Construction de plate-forme
Masterflex L/S Tête de chargement facile pour tube de précision, PPS, CRS RotorJohn Morris1015164Rig Construction
Ciseaux Metzenbaum, 11,5 cm incurvésCoherent ScientificWPI-501748Matériel chirurgical
Ciseaux Metzenbaum, 14,5 cm droitsCoherent ScientificWPI-501252d’équipement chirurgical
F/2-HEADS SSJohn Morris1014414Vis de montage pour têtes
de pompe Connecteur ouvertThomas Scientific8847E05Construction de plate-forme
ParaformadehydeSigma-AldrichP6148-500GTraitement d’échantillons
Chlorure de potassium (AnalaR NORMAPUR) 500 gVWR Chemicals  ;26764.26Pour faire le tampon Krebs
Phosphate de potassium monobasiqueSigma-Aldrich Pty LtdP5379-500gPour fabriquer Krebs Buffer
Powerlab 2/26, enregistreur 2 canaux + logiciel LabchartADInstrumentsML826Matériel et logiciel informatiques
Precision XN Inline Flowsensor, 3,2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XFADInstrumentsME4PXNScalpel de construction de plate-forme
avec poignée jetable #11 pkt/10BSN Medical (Aust) Pty Ltd73252-36
Joint en silicone pour Swinnex 47 mm 5/PKMerck MilliporeSX0004701Rig Construction
Joint torique en silicone 5-329 10/PKMerck MilliporeXX1104707Rig Construction
Single Buret ClampThomas Scientific8847T32Rig Construction
Slip-on Entrée Filtre pore size 10 µ ; m (bubbler)Sigma-aldrich59277Rig Construction
Sm. 360 Connecteur de rotationThomas Scientific8847E35Rig Construction
Bicarbonate de sodiumSigma-Aldrich Pty LtdS6297 - 250gPour faire Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mmMerck MilliporeSX0004700Rig Seringues de construction
mL boîte/100Becton Dickinson Pty Ltd302100
Pinces à trois broches avec bras de 9 mm de diamètre x 125 mm de long et double vis pour maintenir 5-80 mmMet-App Australia Pty Ltd1356Rig
Construction Tubing Flowmeter Module TS410ADInstrumentsTS410Tube d’acquisition de données
PVC 6,35 mm ID x 9,52 mm OD 50ft Rouleau 15,24 m, transparent, sans phtalate DEHP, de qualité alimentaire conforme à REACThermo FisherNAL 8701-0600Construction de plate-forme
Tube PVC 7,94 mm ID x 11,1 mm OD Rouleau de 50 pieds 15,24 m, transparent, sans phtalate de DEHP, qualité alimentaire conforme à REACThermo FisherNAL 8701-0900Tube de construction de plate-forme
PVC 9,52 mm ID x 12,7 mm OD Rouleau de 100 pieds ThermoFisherNAL 8701-4120Ciseaux de construction de plate-forme
Vannas, 8,5 cm, droit, 7 mm LamesCoherent ScientificWPI-500-086Équipement
chirurgicalBain-marie 30 litres avec plateau suspenduThermoline ScientificTLWB-30Rig Construction
Matériel de montage 1

Références

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  3. Chew, H. C., et al. Outcomes of donation after circulatory death heart transplantation in Australia. J Am Coll Cardiol. 73 (12), 1447-1459 (2019).
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  5. Joshi, Y., et al. Heart transplantation from DCD donors in Australia: Lessons learned from the first 74 cases. Transplantation. 107 (2), 361-371 (2023).
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