Tous les animaux ont reçu des soins sans cruauté conformément aux directives du National Health and Medical Research Council (Australie). Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale du Garvan Institute of Medical Research (Sydney, Australie).
1. Préparation du tampon Krebs-Henseleit (KH)
- Préparer 2 L d’une solution mère 20x de tampon KH contenant 2,36 M de NaCl, 0,094 M de KCl, 0,024 M de MgSO4, 0,024 M KH2PO4. Humidifier dans des tubes de 50 mL et conserver à -20 °C.
- Avant l’expérience, préparez deux flacons Erlenmyer de 2 L contenant 1 tampon KH contenant 1900 ml d’eau déminéralisée, 100 ml de tampon KH 20 kg, 4,20 g de NaHCO3 (25 mM) et 3,96 g de glucose (11 mM).
- Placer les ballons tampons dans un bain-marie à 37 °C et gazer la solution avec du carbogène (95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone, débit réglé à 2 L/min) à l’aide de pierres à air (filtre d’entrée à enfiler) pendant 5 min, puis ajouter 2,8 mL de 1 M de CaCl2 (1,4 mM). Continuez à faire bouillonner la solution pendant au moins 1 h avant le début de l’expérience. L’utilisation d’une pierre à air aide à l’aération uniforme de la zone tampon.
- Placez un petit volume (~50 ml) de tampon dans un plat rond en métal à -20 °C pour refroidir et former une couche de tampon glacé.
2. Préparation du circuit de perfusion
- Assurez-vous que tous les tubes et la verrerie sont propres, sans croissance ou contamination visible.
- Régler les hauteurs des chambres en verre pour correspondre aux pressions de perfusion requises sur la base de 1 cm H2O équivalant à 1,36 mmHg : Langendorff-cœur 100 cm (environ 75 mmHg), précharge latérale 15 cm (environ 11 mmHg), chambre cœur-cœur 100 cm (environ 75 mmHg).
- Commencer la circulation de l’eau chaude autour du circuit au moins 10 minutes avant la perfusion cardiaque.
- Placez les filtres en microfibre (1,2 μm) dans les porte-filtres et fixez-les hermétiquement.
- Amorcez le circuit avec un tampon KH, en vous assurant que tout l’air est éliminé, et utilisez une pince de tube de contrôle de débit pour ajuster le débit du côté Langendorff (Figure 1A, B) à ~50 mL/min. Le débit plus lent facilite la canulation aortique et empêche le cœur d’être délogé avant le liage. Placez un thermomètre dans le circuit via un connecteur de tube en forme de T pour surveiller la température du tampon à ~37 °C.
3. Mise en place du logiciel Lab Chart (analyse de données)
- Assurez-vous que le Powerlab (système d’acquisition de données) et le débitmètre sont allumés et connectés à l’ordinateur avant d’ouvrir le logiciel d’analyse de données.
- Ouvrez un nouveau fichier.
- Configurez la collecte de données en sélectionnant le menu déroulant Paramètres et en sélectionnant Paramètres du canal. Sélectionnez la pression aortique, le débit aortique et la fréquence cardiaque (Figure 2A).
- Configurez chaque canal avec les paramètres indiqués à la Figure 2B.
4. Préparation de l’animal à l’isolement du cœur du rat
REMARQUE : La méthodologie d’isolement et de perfusion du cœur de rat pour les cœurs non DBD et non DCD pour l’entreposage statique à froid est décrite ci-dessous. Les méthodes d’instrumentation cardiaque sur le circuit de perfusion sont relativement similaires, quelle que soit la méthode de don utilisée. Les différences dans le protocole pour le don de cœur de rat DBD et DCD se produisent principalement à partir du moment où l’anesthésie animale a pris effet jusqu’au moment où le cœur est excisé de l’animal.
- Pesez l’animal en vous assurant qu’il pèse > 330 g. La fourchette de poids idéale pour les rats mâles est de 330 à 420 g.
- Administrer une injection intrapéritonéale de kétamine (80 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg). Assurer un plan chirurgical adéquat de l’anesthésie en fonction de l’absence de réflexe de pédale (réflexe de pincement des orteils) et de réflexe de clignement des yeux.
- Placez l’animal en position couchée, en fixant les membres avec du ruban adhésif. Administrez de l’oxygène à l’animal via un cône nasal.
- Disposez du tampon KH, d’un récipient en métal pour la glace fondue et d’un petit récipient en métal avec de la glace au poste de dissection. Trempez une gaze de 7,5 cm x 7,5 cm dans un tampon KH et placez-la sur le récipient avec de la glace.
- Une fois que le plan chirurgical adéquat de l’anesthésie est confirmé, rasez la peau au site d’incision chirurgicale et nettoyez la peau avec des produits aseptiques tels que la bétadine ou l’alcool à 70%. Faites une incision latérale à travers l’abdomen (laparotomie) et déplacez l’estomac et les intestins sur le côté pour permettre l’accès à la veine rénale gauche. Injectez 1500 UI d’héparine et appliquez une pression sur le site d’injection jusqu’à ce que le saignement cesse. Attendez 1 à 2 minutes pour que l’héparine circule avant de poursuivre la récupération cardiaque.
- Ouvrez la cavité thoracique en coupant à travers la cage thoracique de chaque côté et en coupant à travers le diaphragme. Tenez et soulevez soigneusement le bloc cœur-poumon tout en coupant le long de l’aorte descendante, en vous assurant que l’arc aortique reste intact. Cela permettra à l’aorte de rester suffisamment longue pour la canulation.
- Le rat est euthanasié par l’ablation du cœur et des poumons sous anesthésie. Immergez le bloc cœur-poumon dans la gadoue de glace tampon KH pour permettre au cœur de s’arrêter.
5. Canulation du cœur sur le circuit de perfusion du cœur de travail isolé
- Transférez le bloc cœur-poumon dans une gaze sur de la glace. Disséquez l’excès de graisse autour de l’aorte, coupez l’aorte pour laisser une longueur de 3 à 5 mm pour la canulation et faites une petite incision de ~ 1 à 2 mm dans l’artère pulmonaire. Cela permettra de tracer un chemin pour l’effluent coronaire.
- Placez le bloc cœur-poumon coupé (encore sur de la glace) directement sous les canules. Ajustez le débit du côté Langendorff à l’aide d’une pince de tube de contrôle de débit pour faciliter la canulation aortique. Canulez soigneusement l’aorte sur la canule gauche, maintenez-la avec une pince noire et attachez-la avec une suture en soie 2-0.
- Augmentez le débit de la perfusion Langendorff en ouvrant complètement la pince de la tubulure de contrôle de débit. Ouvrez la pince de postcharge. Assurez-vous qu’il y a un écoulement continu de la chambre Langendorff. Commencez à surveiller l’activité cardiaque à l’aide d’un logiciel.
REMARQUE : si la valeur du débit aortique sur l’affichage du débitmètre est de <10 mL / min, assurez-vous que l’artériotomie pulmonaire est de taille suffisante. Une trace/valeur de flux aortique faible peut également indiquer que la canule aortique a été insérée trop loin.
- Ajustez le bloc cœur-poumon de manière à ce que la surface antérieure des poumons soit face à l’opérateur. Attachez le lobe pulmonaire gauche avec une suture en soie 2-0 et coupez l’excès de tissu pulmonaire gauche. Attachez les lobes pulmonaires restants en un seul coup avec une suture en soie 2-0 et coupez le tissu. Faites pivoter le cœur de manière à ce que les poumons attachés soient vers l’arrière.
- À l’aide de petits ciseaux Vannas, coupez un bord de 2 à 3 mm de l’appendice auriculaire gauche, en veillant à ce qu’une petite ouverture dans les oreillettes soit obtenue. Canulez soigneusement l’appendice auriculaire gauche sur la canule gauche, maintenez-le avec une pince noire et attachez-le avec une suture en soie 2-0. La figure 3A montre l’emplacement des deux canules.
- Ajustez l’enveloppe d’eau de la chambre cardiaque de manière à ce que le cœur se trouve au centre de la chambre.
- Ouvrez le transducteur de pression à l’air et mettez-le à zéro dans le logiciel en sélectionnant le menu déroulant Pression aortique > Bridge Amp > Zero. Cliquez sur OK.
- Perfuser le cœur en mode Langendorff pendant 10 min. Assurez-vous que le débit aortique de Langendoff mesure entre 10 et 20 ml/min (idéal : 20 ml/min).
- Avant de changer de mode de fonctionnement, assurez-vous que la pierre à air (filtre d’entrée à enfiler) du réservoir tampon Langendorff KH est placée dans le réservoir tampon KH de travail.
- Mettez le cœur en mode de fonctionnement en fermant la grande pince menant à la canule aortique et en ouvrant le flux menant à l’appendice auriculaire gauche. Ouvrez le robinet à trois voies menant au perfusat de travail. Transférez la tubulure de retour commune (ramenant le tampon KH dans le réservoir) du réservoir Langendorff vers le réservoir de travail.
- Perfuser le cœur en mode de travail pendant 15 min. Les valeurs de débit aortique doivent idéalement être de >30 mL/min à la fin de la perfusion de 15 min. Une fois que le cœur s’est stabilisé, commencez à enregistrer les données dans un logiciel d’analyse de données.
- Mesurez l’effluent coronaire (débit coronaire) à 1 min, 5 min, 10 min et 15 min.
REMARQUE : Les valeurs de débit coronaire doivent être comprises entre 10 et 20 mL/min. Un débit coronaire supérieur à 22 mL/min indique généralement une fuite provenant d’un vaisseau pulmonaire non attaché. La fréquence cardiaque doit être comprise entre 200 et 300 bpm. Les effluents coronaires peuvent être prélevés pour l’analyse en aval des marqueurs de lésions tissulaires (p. ex., troponine I, libération de lactate déshydrogénase).
6. Administration de la cardioplégie pour le stockage statique froid du cœur
- Remplissez la chambre de cardioplégie (positionnée à une hauteur de 60 cm pour produire une pression de perfusion d’environ 40 mmHg) avec 50 ml de solution de préservation cardiaque désignée (avec ou sans supplémentation).
- Abaissez la chemise d’eau et fermez le robinet à trois voies du côté du mode de fonctionnement.
- Arrêtez l’écoulement vers la canule auriculaire gauche en fermant la pince.
- Ouvrez le flux vers la canule aortique.
- Fermez la pince du côté Langendoff et sur la postcharge.
- Ouvrez la pince à partir de la ligne de cardioplégie et évacuez 15 ml de cardioplégie de la ligne de pression. Fermez le robinet au niveau de la conduite de pression.
- Laissez le cœur être rincé avec la cardioplégie via la canule aortique et collectez l’effluent coronaire. Exécutez cardioplégie pendant 3 minutes et enregistrez le volume de cardioplégie administré.
- Arrêtez d’enregistrer les données dans le logiciel et enregistrez le fichier.
- Au bout de 3 min, refermer la pince de cardioplégie et la petite pince bleue menant à la canule aortique.
- Placez une pince bouledogue sur la canule aortique et une deuxième pince bouledogue sur la canule gauche. Débranchez le bloc canule cardiaque du circuit et placez-le dans un bécher contenant la cardioplégie dans une glacière (Figure 3B, C).
- Conservez le cœur au réfrigérateur pendant 6 h (ou le temps de conservation au froid souhaité).
7. Reperfusion cardiaque après un stockage statique à froid
- Préparez le tampon KH conformément à la section 1.
- Amorcez le circuit de perfusion conformément à la section 2.
- Ouvrez le fichier enregistré à partir de la perfusion de base.
- Retirez avec précaution le bloc de canule cardiaque de la glacière et fixez-le sur le circuit de perfusion. Avant de reconnecter la canule aortique, utilisez une seringue à bout émoussé de 18 G remplie d’un tampon KH pour évacuer l’air de la canule. Connectez d’abord la canule aortique, ouvrez la pince de tubulure du côté de Langendorff et assurez-vous que la pince de tubulure de postcharge est ouverte.
- Rebranchez la canule auriculaire gauche, en vous assurant que l’air a été évacué de la canule avant de la connecter au circuit de perfusion. Gardez la pince côté travail fermée jusqu’à ce qu’il soit temps de passer du mode Langendorff au mode de travail.
- Perfuser le cœur en mode Langendorff pendant 15 min. Assurez-vous de commencer à enregistrer les données au début de la reperfusion de Langendorff.
- Avant de passer en mode de travail, placez les deux pierres bouillonnantes dans le tampon KH, ouvrez le robinet à 3 voies du côté de travail et transférez le tube de retour commun dans le réservoir de travail.
- Fermez la pince Langendorff blanche, ouvrez la pince blanche du côté ouvrant et perfuser le cœur pendant 30 min. Mesurer et recueillir les effluents coronaires à des moments précis pour l’analyse en aval (p. ex., marqueurs de lésions cardiaques). Assurez-vous d’arrêter-redémarrer l’enregistrement du logiciel pour démarrer un nouveau segment (ou alternativement, ajoutez un commentaire).
- À environ 15 minutes de reperfusion en mode de travail, fermez le robinet à trois voies.
- À la fin de la reperfusion, enregistrez le fichier de données, arrêtez le flux dans le circuit et déconnectez le bloc cardiaque. Prélever des échantillons du ventricule gauche pour un traitement histologique et/ou les congeler pour des études ultérieures (p. ex., extraction de protéines pour les études par transfert Western).
- Retirez les filtres des porte-filtres, vidangez le tampon du circuit et rincez deux fois avec 5 L d’eau distillée.
REMARQUE : Bien que cela ne soit pas nécessaire, il est utile de préchauffer l’eau distillée dans un grand récipient à l’intérieur du bain-marie.
8. Analyse de la récupération fonctionnelle
- Ouvrez le fichier LabChart.
- Mettez en surbrillance une zone d’enregistrement d’au moins 30 s, puis cliquez sur Commande > Ajouter une sélection de données OU Ajouter plusieurs fois aux données. Cela ajoutera les paramètres souhaités à un fichier DataPad dans le logiciel.
- Sélectionnez le menu déroulant Fenêtre > DataPad.
- Mettez en surbrillance et copiez les valeurs de récupération du DataPad dans une feuille de calcul pour l’analyse de la récupération fonctionnelle. Calculer la récupération fonctionnelle en pourcentage de sa valeur de référence respective 1,6,7.