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Examen de la pyroptose par cytométrie en flux

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DOI :

10.3791/66912

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31 mai 2024

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1National Key Laboratory of Veterinary Public Health Security, 2Animal Epidemiology of the Ministry of Agriculture, 3College of Veterinary Medicine, China Agricultural University

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit l’identification des cellules pyroptotiques à l’aide de la cytométrie en flux après double coloration avec des anticorps contre le fragment N-terminal de la GSDME de poulet (chGSDME-NT) et l’iodure de propidium (PI).

Résumé

La pyroptose est un type inflammatoire de mort cellulaire programmée principalement due à la formation de pores de la membrane plasmique par l’extrémité N-terminale générée par les protéines de la famille des gasdermines clivées (GSDM). L’examen de la GSDM-NT attachée à la membrane par Western Blot est la méthode la plus couramment utilisée pour évaluer la pyroptose. Cependant, il est difficile de différencier les cellules atteintes de pyroptose des autres formes de mort cellulaire en utilisant cette méthode. Dans cette étude, des cellules DF-1 infectées par le virus de la bursite infectieuse (IBDV) ont été utilisées comme modèle pour quantifier la proportion de cellules subissant une pyroptose par cytométrie en flux, en utilisant des anticorps spécifiques contre le fragment N-terminal de la coloration GSDME de poulet (chGSDME-NT) et l’iodure de propidium (PI). Les cellules positives pour chGSDME-NT étaient facilement détectables par cytométrie en flux à l’aide d’anticorps anti-chGSDME-NT marqués au Fluor 647. De plus, la proportion de cellules doublement positives chGSDME-NT/PI dans les cellules infectées par l’IBDV (environ 33 %) était significativement plus élevée que chez les témoins infectés par un placebo (P < 0,001). Ces résultats indiquent que l’examen de la chGSDME-NT liée à la membrane par cytométrie en flux est une approche efficace pour déterminer les cellules pyroptotiques parmi les cellules en cours de mort cellulaire.

Introduction

La pyroptose est un type inflammatoire de mort cellulaire programmée qui dépend principalement de la formation de pores de la membrane plasmique par la gasdermine (GSDM) D chez les mammifères 1,2,3. En raison de la déficience génétique de la GSDMD chez les poulets 4,5, le mécanisme de la pyroptose chez les poulets reste insaisissable. La famille des gasdermines comprend des protéines conservées, notamment GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME et DFNB59 3,6. Des études ont rapporté que la GSDME des poissons téléostéens et des canards est clivée par la caspase-1/3/7 ou la caspase-3/7 pour induire la mort cellulaire pyroptotique 7,8. Cependant, le rôle de la pyroptose médiée par la GSDME dans la réponse de l’hôte aux infections pathogènes chez les poulets reste à élucider.

La bursite infectieuse (MICI) est une maladie aiguë, hautement contagieuse et immunosuppressive de la volaille causée par le VCI9. L’IBDV, un virus à ARN double brin (ds) bi-segmenté non enveloppé, appartient au genre Avibirnavirus de la famille des Birnaviridae10. Des études antérieures menées par d’autres personnes et par notre laboratoire ont montré que l’infection par le virus de l’IBDV induit la mort cellulaire dans les cellules hôtes par différentes voies 11,12,13,14. Des résultats antérieurs ont démontré que l’infection par l’IBDV déclenche la libération de lactate déshydrogénase (LDH), un indicateur de la mort des cellules lytiques 6,15, suggérant que l’infection par l’IBDV induit la mort des cellules lytiques dans les cellules hôtes. De plus, les données montrent que les cellules infectées par l’IBDV présentent des caractéristiques morphologiques de la mort cellulaire pyroptotique, notamment un gonflement cellulaire avec de grosses bulles soufflant de la membrane plasmique et une coloration à l’iodure de propidium (PI) positive, ce qui suggère que l’infection par l’IBDV induit une pyroptose dans les cellules.

Étant donné que la formation de pores membranaires dans les cellules pyroptotiques par le fragment N-terminal de GSDM clivé (GSDM-NT) est une caractéristique de la pyroptose, théoriquement, les cellules pyroptotiques pourraient être détectées par cytométrie en flux en examinant GSDM-NT sur la membrane cellulaire à l’aide d’anticorps spécifiques. Dans les cellules pyroptotiques aviaires, le fragment N-terminal de la gasdermine E de poulet (chGSDME-NT) forme des pores membranaires, permettant à l’iodure de propidium (PI) de passer à travers l’ADN et de le lier. Ainsi, la proportion de cellules pyroptotiques peut être détectée à l’aide de la cytométrie en flux, distinguant ainsi la pyroptose d’autres formes de mort cellulaire, telles que l’apoptose et la nécrose. Cependant, la méthode d’examen des cellules pyroptotiques par cytométrie en flux n’a pas été rapportée. Dans cette étude, les cellules DF-1 ont été infectées par l’IBDV, et la cytométrie en flux a été réalisée pour examiner les cellules pyroptotiques à l’aide d’anticorps monoclonaux (McAb) contre le fragment chGSDME-NT (lié à la membrane) et la coloration PI. Étonnamment, les cellules pyroptotiques ont été efficacement détectées par cytométrie en flux. De plus, la proportion de cellules pyroptotiques a pu être quantifiée. Ces résultats fournissent un moyen puissant et efficace de déterminer la pyroptose.

Cet article décrit une méthode d’examen de la pyroptose dans des cellules infectées par l’IBDV par cytométrie en flux à l’aide de la coloration anti-chGSDME-NT, McAb et PI. Cette méthode peut également être étendue à d’autres cellules infectées par des agents pathogènes et appliquée pour examiner divers types de cellules atteintes de pyroptose, en les distinguant des autres formes de mort cellulaire.

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des cellules d’échantillonnage

  1. Cultivez des cellules DF-1 (fibroblastes d’embryon de poulet immortel) dans des plaques à six puits (5 x 10,5 cellules par puits) avec le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS) dans un incubateur à 5 % de CO2 à 38 °C.
  2. Lorsque les cellules atteignent 80 % de confluence, jetez le milieu de culture cellulaire contenant du sérum, lavez les cellules trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis ajoutez 2 ml de milieu de culture cellulaire sans sérum dans chaque puits.
  3. Ajoutez la solution virale IBDV (contenant le MOI calculé) à chaque puits, et configurez un contrôle de l’infection fictive en ajoutant un volume de DMEM égal à celui de la solution virale.
  4. Après 1 h d’adsorption du virus, jeter le milieu de culture, laver les cellules avec du PBS trois fois, ajouter 2 mL de DMEM complété par 2 % de FBS dans chaque puits et poursuivre les cultures cellulaires pendant 24 h.
  5. 24 h après l’infection par le virus de l’IBD, effectuer un traitement à la trypsine (500 μL par puits) pendant 1 min, puis neutraliser par DMEM complété par 10 % de FBS (2 mL par puits). Ensuite, les cellules doivent être récoltées pour préparer des suspensions unicellulaires pour la cytométrie en flux.
  6. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 5 min à 2-8 °C. Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette.
  7. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans le PBS et agitez doucement les tubes pendant 3 s.
  8. Centrifugez les cellules comme décrit à l’étape 1.6 (400 x g pendant 5 min à 2-8 °C).
  9. Répétez le lavage des cellules comme décrit à l’étape 1.7 et à l’étape 1.8.
  10. Effectuer le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre sous microscope. Ensuite, remettre les cellules en suspension dans un volume approprié de tampon de coloration par cytométrie en flux (de sorte que la concentration cellulaire finale soit de 1 x 107 cellules/mL). Tourbillonnez doucement les suspensions.

2. Coloration cellulaire pour la cytométrie en flux

  1. Ajouter 100 μL des suspensions unicellulaires de l’étape 1.10 dans des tubes de polystyrène à fond rond de 5 mL (12 mm × 75 mm). Préparez des cellules fictives et infectées par l’IBDV pour la coloration des anticorps anti-chGSDME-NT/CT , et utilisez des IgG de souris normales comme contrôle d’isotype. Pendant ce temps, préparez des tubes témoins vierges et des tubes colorés uniques avec des cellules infectées par le virus de l’IBDV.
  2. Ajoutez 1 μg de McAb anti-chGSDME-NT marqué par Alexa Fluor 647, de McAb anti-chGSDME-CT ou d’IgG de souris normale (en tant que contrôle isotype) dans des tubes infectés par l’IBDV et des tubes de contrôle fictifs, respectivement. Par la suite, agitez doucement les tubes pendant 3 s.
  3. Incuber les cellules colorées à 2-8 °C ou sur de la glace pendant 30 min dans l’obscurité. Agitez doucement les tubes tourbillonnaires toutes les 10 min.
  4. Laver les cellules avec 1 mL de tampon de coloration par cytométrie en flux par centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 2-8 °C. Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette.
  5. Répétez le lavage des cellules comme décrit à l’étape 2.4.
  6. Remettre la pastille en suspension dans 100 μL de tampon de coloration par cytométrie en flux.
  7. Colorer les cellules du groupe infecté par le virus IBDV et du groupe infecté par un simulacre, ainsi que les tubes monocolorés par PI, avec 10 μg/mL de PI pendant 10 min à température ambiante, puis ajouter 400 μL de tampon de coloration par cytométrie en flux pour le test de cytométrie en flux.

3. Réalisation du test de cytométrie en flux

  1. Allumez le cytomètre en flux pour initialiser l’instrument et lancez le logiciel.
  2. Commencez par faire fonctionner le tube de contrôle à blanc suivi des tubes à coloration unique pour ajuster la tension et les paramètres de compensation du cytomètre en flux. Utilisez les canaux de fluorescence FL3 et FL4, qui émettent à 635 nm, pour détecter les fluorophores PI et Alexa Fluor 647, respectivement.
  3. Après avoir configuré tous les paramètres, exécutez tous les échantillons de manière séquentielle.

4. Analyse des données de cytométrie en flux

  1. Analysez la coloration Alexa Fluor 647 de chaque échantillon dans l’histogramme du canal FL4.
  2. Pour évaluer la proportion de cellules doublement positives dans chaque échantillon, utilisez le diagramme à quatre quadrants des FL3/FL4.
  3. Fixez des seuils positifs basés sur des échantillons à double coloration IgG/PI de contrôle d’isotype, en veillant à ce que la proportion de cellules doublement positives reste inférieure à 1 %. Cette approche facilite la mesure de la proportion de cellules doublement positives dans tous les échantillons.

Résultats

chGSDME-NT sur la membrane des cellules DF-1 infectées par le virus IBDV a pu être facilement détecté par cytométrie en flux
L’une des caractéristiques les plus importantes des cellules pyroptotiques est la formation de pores membranaires par des fragments GSDM-NT générés par le clivage de la gasdermine. Par conséquent, les cellules pyroptotiques pourraient théoriquement être détectées par cytométrie en flux en examinant le GSDM-NT sur les membranes cellulaires à l’aide d’anticorps spécifiques. Ainsi, les cellules DF-1 ont été infectées par l’IBDV, et les cellules pyroptotiques ont été examinées par cytométrie en flux à l’aide de la coloration anti-chGSDME-NT McAb et PI marquée à l’Alexa Fluor 647. Un nombre considérable de cellules positives à la chGSDME-NT ont été détectées par cytométrie en flux après une infection par IBDV (Figure 1). En revanche, les témoins faussement infectés ou les cellules colorées avec des IgG de contrôle d’isotype ont montré un minimum de cellules positives à Alexa Fluor 647. Ces résultats démontrent la détection efficace et spécifique de la chGSDME-NT liée à la membrane par cytométrie en flux. Il convient de noter que, comme les fragments C-terminaux de la chGSDME clivée (chGSDME-CT) étaient conservés à l’intérieur du cytoplasme plutôt que transloqués vers la membrane plasmique comme la chGSDME-NT, les fragments de la chGSDME-CT étaient à peine détectables par cytométrie en flux à l’aide de la coloration de l’antigène de surface de la membrane, ce qui était en accord avec le fait que la pyroptose était associée à des fragments de la chGSDME-NT liés à la membrane.

La pyroptose dans les cellules DF-1 peut être déterminée par cytométrie en flux à l’aide d’une double coloration des cellules avec des anti-chGSDME-NT, McAb et PI marqués à la fluorescéine
Lorsque les cellules ont été colorées à l’aide d’un McAb et d’un PI anti-chGSDME-NT marqués au Fluor 647, puis à une analyse par cytométrie en flux dans les canaux de fluorescence FL3 et FL4, les cellules pyroptotiques ont pu être déterminées par une coloration chGSDME-NT et PI positive. Comme le montrent les figures 2A et B, un nombre considérable de cellules positives pour la chGSDME-NT avec une infection par le virus IBDV ont été détectées par des tests de cytométrie en flux, et la proportion de cellules doublement positives pour le chGSDME-NT/PI dans les cellules infectées par le virus IBDV (environ 33 %) était significativement supérieure à celle des témoins infectés par un virus fictif (P < 0,001), ce qui suggère que la formation de pores membranaires par le chGSDME-NT était synchronisée avec la perturbation des membranes cellulaires, provoquant ainsi la mort cellulaire pyroptotique de ces cellules infectées par l’IBDV. Ces données montrent clairement que l’infection par l’IBDV induit une pyroptose médiée par chGSDME dans les cellules hôtes. Alors que les cellules monopositives de l’IP peuvent représenter d’autres formes de mort cellulaire induite par l’infection par l’IBDV. Par conséquent, l’examen de la chGSDME-NT formant des pores par cytométrie en flux fournit une méthode précieuse pour distinguer les cellules pyroptotiques de celles subissant d’autres formes de mort cellulaire.

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Figure 1 : Examen des cellules liées à chGSDME-NT par cytométrie en flux. Les cellules DF-1 étaient faussement infectées ou infectées par le MIDCI à un moment d’inertie de 1. 24 h après l’infection, les cellules ont été prélevées et colorées avec Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT / anti-chGSDME-CT McAb ou IgG de contrôle d’isotype, puis analysées par cytométrie en flux. La coloration chGSDME-NT positive dans le test de cytométrie en flux a démontré que les cellules chGSDME-NT liées à la membrane présentent une pyroptose induite par l’IBDV. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Examen de la pyroptose par cytométrie en flux à l’aide d’une double coloration avec chGSDME-NT et PI. (A) Analyse en dot-plot de cellules pyroptotiques par cytométrie en flux. Les cellules DF-1 ont été infectées par l’IBDV à un moment d’inertie de 1. 24 h après l’infection, les cellules ont été prélevées, colorées avec Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT / anti-chGSDME-CT McAb et PI, et analysées par cytométrie en flux. (B) Le pourcentage de cellules pyroptotiques dans chaque groupe de (A) a été tracé et analysé statistiquement. L’ANOVA à deux facteurs a été utilisée pour analyser la signification statistique. Les données représentaient trois expériences indépendantes et ont été présentées comme des moyens ± l’écart-type. ***P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Cet article décrit une méthode efficace d’examen de la pyroptose à l’aide de la cytométrie en flux, obtenue par double coloration des cellules infectées avec Alexa Fluor 647, anti-chGSDME-NT, McAb et PI. Cette approche peut également être appliquée à divers types de cellules pour différencier la pyroptose d’autres types de mort cellulaire, tels que l’apoptose et la nécrose.

La pyroptose, un type inflammatoire de mort cellulaire programmée dépendant principalement de la formation de pores de la membrane plasmique induite par la gasdermine (GSDM) chez les mammifères 1,2,3, a traditionnellement été évaluée à l’aide de méthodes telles que la libération de LDH 6,15, les caractéristiques morphologiques16 et la détection de fragments de GSDM-NT/GSDM-CT par Western Blot ou IFA17. Cependant, aucune de ces méthodes ne quantifie avec précision le pourcentage de cellules pyroptotiques. Cette étude exploite les pores caractéristiques de la membrane plasmique dans les cellules pyroptotiques formées par des fragments de GSDM-NT pour développer une stratégie basée sur la cytométrie en flux pour leur détermination.

Lorsque les cellules ont été doublement colorées avec chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 et PI, puis analysées par cytométrie en flux dans les canaux de fluorescence FL3 et FL4, la pyroptose a été discernée via deux paramètres simultanément : la coloration chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 indiquant la formation de pores de la membrane plasmique par le fragment N-terminal de la chGSDME clivée, et la coloration PI indiquant la rupture de la membrane plasmique. Les données démontrent que la proportion de cellules doublement positives chGSDME-NT/PI dans les cellules infectées par le VCI (environ 33 %) était significativement plus élevée que chez les témoins infectés par un virus fictif (P < 0,001).

La méthode expérimentale nécessite plusieurs considérations pour garantir l’exactitude et la fiabilité. Tout d’abord, chaque tube d’échantillonnage utilisé pour l’analyse de flux doit contenir au moins 1 x 106 cellules pour maintenir la précision de l’analyse de flux. Étant donné les multiples étapes de lavage dans le protocole, il est conseillé d’augmenter le nombre initial de cellules dans chaque tube à l’étape 2.1 en conséquence, par exemple, à 2 x 106 cellules. Il est crucial de manipuler le lavage et le transfert des cellules avec une extrême prudence pour éviter une perturbation involontaire de l’intégrité des cellules. De plus, gardez à l’esprit que la densité cellulaire, la concentration d’anticorps et la durée de l’opération peuvent toutes influencer les paramètres optimaux. Par conséquent, il est nécessaire d’ajuster les paramètres et les réglages du cytomètre en flux en fonction des conditions expérimentales spécifiques. Dans cette étude, les paramètres utilisés étaient les suivants : le FSC AmpGain a été réglé à 1,40 et la tension SSC a été réglée à 490 V. La porte dans le graphique FSC/SSC a été réglée pour couvrir toutes les populations cellulaires pour l’analyse ultérieure des canaux FL3/4. Les tensions de fluorescence ont été réglées à 600 V pour le canal FL3 (PI) et à 600 V pour le canal FL4 (Alexa Fluor 647). La compensation a été fixée à 38,0 % entre les canaux FL4 et FL3. Le débit a été fixé à 200 événements/s, avec un seuil d’événements fixé à 10 000.

Grâce à cette nouvelle approche, cette compréhension du rôle de la pyoptose médiée par GSDME dans la réponse de l’hôte aux infections pathogènes chez les poulets et les mécanismes sous-jacents a considérablement progressé. Grâce à l’utilisation d’anticorps spécifiques, nous avons pu examiner la chGSDME-NT formant des pores par cytométrie en flux, distinguant les cellules pyroptotiques des autres et facilitant la détermination de la proportion de cellules subissant une pyroptose. Par conséquent, cette méthode offre un avantage certain par rapport aux tests Western Blot ou IFA dans la détection des cellules pyroptotiques.

Cependant, la limite de ce protocole réside dans l’utilisation du fragment N-terminal de poulet GSDME dans des cellules infectées par l’IBDV comme modèle expérimental pour l’étude de la pyroptose. Néanmoins, cette étude marque la première utilisation réussie de la cytométrie en flux pour déterminer la pyroptose.

En résumé, la méthode de cytométrie en flux décrite ici pour examiner la pyroptose présente un grand potentiel pour faire progresser notre compréhension des mécanismes à l’origine de la pyroptose chez les mammifères et les oiseaux. Cette méthode se présente comme un outil efficace qui contribue à la recherche sur la mort cellulaire dans les sciences de la vie.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Jue Liu pour son aimable aide. Cette étude a été soutenue par des subventions du Programme national de recherche et de développement clés de la Chine (n° 2022YFD1800300), de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 32130105) et du Fonds réservé pour le système de recherche technologique de l’agro-industrie moderne (n° 2022YFD1800300). CARS-40), Chine.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube en polystyrène à fond rond de 5 mL (12 & times ; 75 mm)Corning Falcon352052
6 Well Cell Culture PlateCorning3516
Alexa Fluor 647 kits de marquage d’anticorpsThermo Fisher ScientificA20186
Anti-chGSDME-CT McAbSAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, Chine)EU0228
Anti-chGSDME-NT McAbSAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, Chine)EU0227
Logiciel CellQuestBD Biosciences
CO2 incubateurThermo Fisher Scientific3100
Centrifugeuse de congélation cryogéniqueEppendorf5810R
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  ;Gibco by Life TechnologiesC11995500BT
Sérum de veau fœtal (FBS)Sigma-AldrichF0193-500ML
Cytomètre en fluxBD BiosciencesFACSCalibur
Cytométrie en flux Tampon de colorationThermo Fisher Scientific00-4222-26
HémocytomètreQiu-jing Réactif biochimique & Instrument Company (Shanghai, Chine)YX-JSB52
IBDV Lx soucheIBDV Lx souche a été aimablement fournie par le Dr Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Pékin, Chine
Microscope inverséChongqing Photoelectric Instrument CompanyXDS-1B
Normal Mouse IgGSanta Cruz Biotechnologysc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS)M& C  ; Technologie génétiqueCC017
Iodure de propidium (PI)Sigma-AldrichP4170
Trypsine-EDTA, 0,25 %M& C  ; Gene TechnologyCC008
Oscillateur VortexMIULABMIX-28+

Références

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