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Article de méthode

Transfert mitochondrial via des nanotubes à effet tunnel entre les cellules souches mésenchymateuses et l’épithélium pigmentaire rétinien in vitro

2.1K vues

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DOI :

10.3791/66917

⸱

4 octobre 2024

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole comprenant le traçage mitochondrial, les procédures de co-culture directe de cellules souches mésenchymateuses (CSM) et de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (ARPE19), ainsi que les méthodes d’observation et d’analyse statistique de la formation de nanotubes à effet tunnel (TNT) et du transfert mitochondrial pour caractériser l’échange mitochondrial via les TNT entre les CSM et les cellules ARPE19.

Résumé

Le transfert mitochondrial est un phénomène physiologique normal qui se produit largement entre divers types de cellules. Dans l’étude à ce jour, la voie la plus importante pour le transport mitochondrial est à travers les nanotubes à effet tunnel (TNT). De nombreuses études ont rapporté que les cellules souches mésenchymateuses (CSM) peuvent transférer des mitochondries à d’autres cellules par des TNT. Cependant, peu d’études ont démontré le phénomène de transfert mitochondrial bidirectionnel. Ici, notre protocole décrit une approche expérimentale pour étudier le phénomène de transfert mitochondrial entre les CSM et les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes in vitro par deux méthodes de traçage mitochondrial.

Nous avons co-cultivé des CSM transfectées par mito-GFP avec des cellules ARPE19 transfectées par mito-RFP (une lignée cellulaire épithéliale pigmentaire rétinienne) pendant 24 h. Ensuite, toutes les cellules ont été colorées à la phalloïdine et imagées par microscopie confocale. Nous avons observé des mitochondries à fluorescence verte dans les cellules ARPE19 et des mitochondries à fluorescence rouge dans les CSM, indiquant qu’un transfert mitochondrial bidirectionnel se produit entre les CSM et les cellules ARPE19. Ce phénomène suggère que le transport mitochondrial est un phénomène physiologique normal qui se produit également entre les CSM et les cellules ARPE19, et que le transfert mitochondrial des CSM vers les cellules ARPE19 se produit beaucoup plus fréquemment que l’inverse. Nos résultats indiquent que les CSM peuvent transférer les mitochondries dans l’épithélium pigmentaire rétinien, et prédisent de la même manière que les CSM peuvent réaliser leur potentiel thérapeutique par le transport mitochondrial dans l’épithélium pigmentaire rétinien à l’avenir. De plus, le transfert mitochondrial des cellules ARPE19 vers les CSM reste à explorer.

Introduction

Les mitochondries servent de source d’énergie principale pour la plupart des types de cellules, le dysfonctionnement mitochondrial ayant un impact particulier sur les tissus à forte demande d’énergie comme la rétine1. Les altérations métaboliques de la rétine peuvent déclencher une crise bioénergétique, entraînant finalement la mort des photorécepteurs et/ou des cellules EPR2. Les thérapies à base de cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont démontré leur efficacité dans le traitement de la dégénérescence oculaire, et l’un des mécanismes précis sous-jacents aux effets bénéfiques des CSM sur les tissus rétiniens peut être attribué au transfert mitochondrial fonctionnel 3,4,5,6. En 2004, Rustom et al. ont rapporté pour la première fois le phénomène du transfert mitochondrial par le biais d’une nouvelle interaction de cellule à cellule facilitée par des nanotubes à effet tunnel (TNTs)7.

En culture 2D, les nanotubes à effet tunnel (TNT) sont identifiés par leurs fines protubérances membranaires (20-700 nm) allant de dizaines à des centaines de nanomètres de longueur, qui sont suspendues au-dessus du substrat et peuvent établir directement des connexions entre deux ou plusieurs cellules homotypiques et hétérotypiques. Ces structures sont notamment enrichies en F-actine et facilitent le transport de marchandises, telles que les mitochondries, entre les cellules. De plus, les TNT possèdent des ouvertures aux deux extrémités, permettant la continuité du contenu cytoplasmique entre les cellules interconnectées8.

Il est difficile de détecter le transfert mitochondrial médié par le TNT in vivo en raison de la densité de l’arrangement cellulaire et des défis liés au suivi des mitochondries. L’expérimentation in vitro, utilisant des techniques de co-culture cellulaire et de traçage mitochondrial, permet d’observer la formation de TNT et le transfert mitochondrial 8,9. Nous avons également observé le phénomène de transfert mitochondrial médié par le TNT par la co-culture de CSM et de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes in vitro10.

De nombreuses études antérieures n’ont observé qu’un transfert mitochondrial unidirectionnel des CSM vers d’autres cellules 3,4,5,6. Auparavant, nous avons également essayé d’analyser le transfert mitochondrial bidirectionnel en utilisant deux types de cellules marquées respectivement mito-tracker vert et mito-tracker rouge, mais la diaphonie des colorants a interféré avec les résultats expérimentaux. Pour étudier plus précisément le transfert bidirectionnel mitochondrial, nous avons construit deux lignées cellulaires avec une fluorescence mitochondriale différente en utilisant la technique de transfection lentivirale, et par la suite, nous avons observé et analysé les phénomènes de formation de TNT et de transfert bidirectionnel mitochondrial par co-culture directe in vitro.

En bref, un protocole étape par étape et exploitable est décrit ici sur la façon de tracer les mitochondries, de co-cultiver des CSM avec des cellules ARPE19 et d’analyser la formation de TNT et le transfert mitochondrial. Les résultats de cette expérience ont démontré un transfert mitochondrial bidirectionnel médié par le TNT, ce qui a non seulement prouvé que le transport mitochondrial est un phénomène physiologique courant, mais a également montré la capacité thérapeutique potentielle des CSM sur les cellules rétiniennes.

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Protocole

1. Génération de lignées cellulaires MSC-mito-GFP et ARPE19-mito-RFP

  1. Culture cellulaire
    REMARQUE : Seuls les MSC sont utilisés ici à titre d’exemple.
    1. Cultivez des CSM humaines dans une plaque à 6 puits dans un milieu hMSC avec 1 % de pénicilline et de streptomycine (voir le tableau des matériaux) jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne 80 % à 90 %. En fonction de la densité de croissance cellulaire, changez le milieu une fois tous les 2-3 jours.
      1. Retirez le milieu d’origine et lavez une fois les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) (voir le tableau des matériaux). Ajouter 1 mL du mélange trypsine-EDTA-DPBS (0,05 % de trypsine-EDTA : 0,25 % de trypsine-EDTA dilué avec du DPBS dans un rapport de 1:5 ; voir le tableau des matériaux), et incuber pendant 3 à 4 minutes (selon les cellules) dans un incubateur à 37 °C.
        REMARQUE : Observez la digestion cellulaire au microscope et arrêtez la digestion si la plupart des cellules sont arrondies et détachées.
      2. Tapotez doucement la plaque à 6 puits pour détacher les cellules adhérentes à la surface, puis ajoutez 1 ml de milieu complet frais pour terminer la digestion.
      3. Remettez doucement toutes les cellules en suspension à l’aide d’un pistolet à pipette, puis transférez toutes les cellules collectées dans un tube à centrifuger de 15 ml.
      4. Centrifuger les cellules à 200 × g pendant 5 min.
      5. Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension en ajoutant 1 mL de milieu frais. Prélever 10 μL de suspension cellulaire pour le comptage cellulaire.
      6. Dix-huit à 24 h avant la transfection lentivirale, ensemencer les cellules MSC à une densité de 1 × 105 cellules par puits dans des plaques à 6 puits, en veillant à ce que la densité cellulaire au moment de la transfection soit d’environ 50 %.
  2. Transfection du lentivirus
    REMARQUE : Toutes les opérations liées à la transfection lentivirale doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité.
    1. Remplacer le milieu initial par 2 mL de milieu frais le lendemain et ajouter 25 μL de suspension de lentivirus (5,00E+08 UT/mL) avec des adjuvants, puis incuber à 37 °C.
      REMARQUE : L’empaquetage du lentivirus a été effectué à l’aide du plasmide Mito-GFP (pCT-Mito-copGFP) (voir le tableau des matériaux et la figure supplémentaire S1) par une entreprise.
    2. Après 6 h d’incubation, remplacer le milieu contenant le virus par 2 mL de milieu frais. Continuez à incuber et à changer de milieu une fois par jour.
      REMARQUE : Une expression significative de la fluorescence mitochondriale est observée dans les CSM 48 h après la transfection, avec une augmentation supplémentaire évidente au point temporel de 72 h.
    3. Criblez avec succès les cellules transfectées en complétant le milieu de culture avec de la puromycine (1 μg/mL) 2 jours après la transfection. En même temps, ajouter une concentration équivalente de puromycine aux cellules souches mésenchymateuses sans transfection virale comme contrôle.
      REMARQUE : Le vecteur viral mito-GFP est conçu pour inclure le gène de résistance à la puromycine.
    4. Changer de milieu tous les jours en introduisant la puromycine (1 μg/mL). Arrêter l’ajout de puromycine en cas de mort cellulaire presque complète dans le groupe témoin.
      REMARQUE : Le milieu ne contient pas cette concentration de puromycine. L’ajout de puromycine n’est nécessaire que lorsque le milieu est ajouté à une plaque à 6 puits.
    5. Poursuivre la culture sans puromycine jusqu’à ce que les cellules soient passées et congelées. Nommez ce type de cellule comme MSC-mito-GFP.
      REMARQUE : Les cellules ARPE19 ont été dérivées de la banque de cellules ATCC et cultivées dans du DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline et de streptomycine (voir le tableau des matériaux), et les méthodes de leur digestion et de leur passage sont les mêmes que celles des CSM. Enfin, nous avons nommé les cellules transfectées avec succès comme ARPE19-mito-RFP.

2. Co-culture directe de cellules MSC et ARPE19

REMARQUE : Dans ce système de co-culture, les cellules MSC-mito-GFP serviront de cellules donneuses tandis que les cellules ARPE19-mito-RFP fonctionneront comme cellules réceptrices. Pour faire la distinction entre les cellules donneuses et receveuses, nous avons tracé les cellules receveuses.

  1. Marquez les cellules ARPE19-mito-RFP avec CellTrace Violet (voir Tableau des matériaux) dans la membrane cytoplasmique.
    REMARQUE : L’excitation et l’émission du colorant CellTrace violet sont respectivement de 405 nm et 450 nm.
    1. Préparez une solution mère de CellTrace Violet (voir le tableau des matières) en ajoutant 20 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un flacon de réactif CellTrace Violet et en mélangeant bien immédiatement avant l’utilisation.
    2. Augmentez la densité souhaitée de 80 à 90 % pour atteindre les cellules ARPE19-mito-RFP.
    3. Diluer la solution mère de CellTrace Violet dans du DPBS préchauffé (37 °C) à la concentration de travail souhaitée (1:1 000). C’est la solution de chargement.
      REMARQUE : La dilution de CellTrace Violet doit être effectuée avec du DPBS et ne peut pas être remplacée par un milieu de culture car cela entraînerait de très mauvais résultats de coloration.
    4. Retirer le milieu de culture et le remplacer par 1 mL de solution de chargement. Incuber les cellules pendant 10 min à 37 °C.
      REMARQUE : Si les conditions le permettent, la coloration peut être observée au microscope à fluorescence après 5 min. La coloration peut être interrompue dès que les résultats souhaités sont obtenus, car certaines cellules peuvent ne pas être en mesure de tolérer une exposition prolongée au DPBS.
    5. Retirez la solution de chargement, lavez les cellules 2 fois avec du DPBS et remplacez-les par 2 ml de milieu complet frais. Incuber les cellules pendant au moins 10 minutes après la coloration pour permettre au CellTrace Violet de subir une hydrolyse de l’acétate.
      REMARQUE : Cette étape est nécessaire pour que les cellules reviennent à leur état optimal et pour éviter d’interférer avec les expériences ultérieures.
  2. Préparez une plaque à 24 puits en ajoutant 50 μL de DPBS dans chaque puits. Ensuite, insérez le verre de protection (d’un diamètre spécifié de 15 mm) (voir tableau des matériaux) dans la plaque et laissez-le reposer pendant 1 min. Retirez le DPBS des puits, en utilisant une pression négative pour vous assurer que la glissière du couvercle est proche du fond du plat.
  3. Trypsinisez les CSM du donneur et les cellules ARPE19 du receveur comme décrit à l’étape 1.1.1.
  4. Comptage cellulaire
    1. Placer 10 μL de suspension cellulaire sur une plaque de comptage pour le dénombrement.
      REMARQUE : Si la densité des cellules est trop élevée, elles peuvent être diluées 10 fois avec du fluide, puis procéder comme ci-dessus.
    2. Ensemencez 10 000 CSM et 10 000 cellules ARPE19 dans 500 μL de milieu par puits d’une plaque de 24 puits. Mélangez bien les cellules avant de les ajouter à la plaque à 24 puits. Voir les calculs ci-dessous pour un compte de CSM de A/mL et un nombre de cellules ARPE19 de B/mL.
      REMARQUE : Pour 4 puits, 40 000 MSC et 40 000 cellules ARPE19 sont nécessaires dans 2 mL de milieu.
      Volume de suspension de CSM (C) contenant 40 000 CSM = 40 000/A μL
      Volume de suspension ARPE19 (D) contenant 40 000 CSM = 40 000/B μL
      Augmenter le volume à 2 mL avec 2 - (C + D) mL de milieu.
  5. Observez les cellules au microscope, secouez la plaque jusqu’à ce qu’elles soient uniformément réparties, puis incubez-les dans la culture pendant 24 h.

3. Co-culture indirecte de cellules MSC et ARPE19 dans un système de transpuits

  1. Effectuez la culture cellulaire, l’étiquetage, la digestion et le comptage comme décrit aux étapes 2.1 à 2.4.1.
  2. Ensemencez 20 000 cellules ARPE19 dans 1 mL de milieu par puits d’une plaque de 24 puits.
    REMARQUE : Dans cette expérience, nous avons utilisé des cellules ARPE19 sans mitochondries marquées.
  3. Placez l’insert dans le puits où la cellule a été ensemencée.
  4. Ensemencez 10 000 CSM dans 100 μL de milieu dans la chambre cellulaire supérieure par puits.
  5. Répétez l’étape 2.5.

4. Coloration du cytosquelette

REMARQUE : Protéger de la lumière pendant toute la durée de l’expérience.

  1. Retirez le milieu des plaques à 24 puits. Lavez toutes les cellules une fois avec 500 μL/puits de polyformaldéhyde (PFA) à 4 %, ajoutez 500 μL de PFA frais à 4 % et fixez les échantillons pendant 20 min.
    REMARQUE : Les inserts du système transwell sont mis au rebut.
    REMARQUE : Les nanotubes étant très fragiles, nous avons lavé les cellules directement avec 4 % de PFA au lieu de DPBS afin de maximiser la rétention des nanotubes intacts.
  2. Retirez le fixateur et lavez les échantillons pendant 3 x 10 min avec DPBS.
  3. Ajouter 500 μL/puits de solution bloquante composée de 0,5 % de Triton X-100 (voir le tableau des matières) et de 4 % d’albumine sérique bovine (voir le tableau des matériaux) et incuber pendant 1 h à température ambiante.
  4. Retirez la solution de blocage et lavez les échantillons pendant 3 x 10 min avec du DPBS.
  5. Préparation de la solution de coloration à la phalloïdine (voir tableau des matériaux)
    REMARQUE : L’excitation et l’émission de la phalloïdine sont respectivement de 650 nm et 668 nm.
    1. Préparez des solutions mères en dissolvant le contenu du flacon dans 150 μL de DMSO anhydre pour obtenir une solution mère 400x.
    2. Préparez la solution de coloration en diluant la solution de stockage 400x à 1x avec DPBS. Il s’agit de la solution de coloration à la phalloïdine.
  6. Ajouter 200 μL de solution de coloration à la phalloïdine dans chaque puits et incuber pendant 1 h à température ambiante.
  7. Récupérer la solution de coloration et laver l’échantillon 3 x 10 min avec DPBS.
    REMARQUE : Lors du lavage des cellules avec DPBS, il sera préférable de laisser la plaque sur un shaker.
  8. Prenez le verre de protection avec une aiguille de seringue et laissez-le sécher à l’air.
    REMARQUE : L’état optimal est celui dans lequel aucun liquide visible n’est visible sur le verre de protection mais il n’est pas non plus sec.
  9. Appliquez une petite quantité de support de montage (voir le tableau des matériaux) sur la diapositive et retournez soigneusement la vitre de couverture de la diapositive pour vous assurer que le support recouvre uniformément toute la surface. Scellez les bords avec du vernis à ongles.
    REMARQUE : Attendez quelques minutes pour permettre au vernis à ongles de sécher.
  10. Capturez rapidement une image confocale ou transférez-la dans une boîte à tranches et stockez-la à 4 °C pendant une courte durée.
    REMARQUE : La durée de conservation idéale est de 2 semaines. Si ce temps est dépassé, l’effet d’imagerie peut se détériorer.

5. Imagerie confocale

REMARQUE : L’imagerie confocale est effectuée conformément au manuel d’utilisation et peut varier d’un microscope à l’autre. Nous ne donnons ici que quelques-unes des étapes clés.

  1. Démarrez le microscope confocal et ouvrez quatre canaux laser (405, 488, 561, 640) conformément au manuel d’utilisation.
  2. Accédez au logiciel sur l’ordinateur et effectuez les paramétrages préliminaires du logiciel.
    1. Ajoutez les canaux fluorescents CF-405, CF-488, CF-561 et CF-640 dans le panneau de gestion des processus .
    2. Réglez le temps d’exposition de chaque canal de fluorescence sur 200 ms et réglez l’intensité du gain sur 2 dans le panneau de commande de l’appareil photo .
    3. Réglez le combinateur laser/LED sur une valeur de 80.
  3. Manipulez le panneau de commande externe du microscope pour régler l’objectif à un grossissement de 20x et assurez-vous que l’objectif est positionné à son réglage le plus bas.
  4. Positionnez la glissière dans une orientation inversée sur la table porteuse.
  5. Activez le laser de 405 nm et manipulez la mise au point à l’aide des spirales de mise au point grossières et fines. Observez l’échantillon sous l’oculaire jusqu’à ce que des cellules fluorescentes bleues soient visibles.
  6. Sélectionnez Live Imaging dans l’interface logicielle de l’ordinateur, passez au canal CF-405 et réajustez l’hélice de mise au point fine jusqu’à ce qu’une image distincte des cellules présentant une fluorescence bleue soit visible sur l’écran de l’ordinateur.
  7. Ajustez l’objectif à un grossissement de 40x et passez au canal CF-640, puis ajustez soigneusement la mise au point jusqu’à ce qu’une structure de microfilament cellulaire distincte soit visible.
  8. Maintenir une distance focale constante, passer aux canaux CF-405, CF-488 et CF-561 de manière séquentielle, et modifier les paramètres du temps d’exposition optimal, de l’intensité de gain et du combinateur laser/LED pour l’imagerie dans chaque canal, si nécessaire.
  9. Activez la fonction Pile d’images Z et définissez les points de début et d’arrivée de l’axe Z en manipulant la distance focale pour capturer une image avec de la profondeur à l’aide de l’axe Z.
  10. Cliquez sur le bouton Démarrer dans le panneau Gestion des processus pour prendre une photo.
  11. Sélectionnez 10 champs de vue au hasard pour chaque tranche.
    REMARQUE : Il ne doit pas y avoir de chevauchement entre deux champs de vision.
  12. Activez la fonction time-lapse, en spécifiant une durée totale d’imagerie de 24 h et un intervalle photo de 5 min après l’identification du champ de vision souhaité.
    REMARQUE : Pour capturer une séquence time-lapse, il est nécessaire d’inoculer les cellules dans une parabole à fond de verre et de les positionner dans une boîte ventilée contenant 5 % de gaz CO2 .
  13. Enregistrez et exportez toutes les images.
    REMARQUE : Pour améliorer l’examen du TNT et du transfert mitochondrial, l’imagerie à super-résolution a été utilisée. L’imagerie à super-résolution a été réalisée à l’aide de HIS-SIM commercialisée, appelée HIS-SIM (High Intelligent and Sensitive SIM) fournie par une entreprise. Les images ont été acquises à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 100x/1,5 NA.

6. Analyse des données

  1. Pour l’analyse statistique de chaque image, quantifiez le nombre total de cellules, le nombre de nanotubes, le nombre de cellules ARPE19-mito-RFE violettes positives, le nombre de cellules violettes positives présentant une fluorescence verte (représentant le nombre de cellules ARPE19 avec transfert mitochondrial à partir de CSM) et le nombre de cellules négatives violettes présentant une fluorescence rouge (représentant le nombre de cellules CSM présentant un transfert mitochondrial à partir de cellules ARPE19).
    1. Pour quantifier la formation de TNT, calculez le rapport entre le nombre de nanotubes intercellulaires et le nombre total de cellules.
    2. Calculez le taux de transfert mitochondrial comme le rapport entre le nombre de cellules violettes positives présentant une fluorescence verte et le nombre total de cellules violettes positives (représentant le transfert mitochondrial des CSM vers les cellules ARPE19) ou le rapport entre le nombre de cellules négatives violettes présentant une fluorescence rouge et le nombre total de cellules négatives violettes (représentant le transfert mitochondrial des cellules ARPE19 vers les CSM).

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Résultats

Le schéma de principe illustrant la co-culture directe de cellules souches mésenchymateuses (CSM) et de cellules ARPE19 est illustré à la figure 1. Les CSM, conçues pour exprimer la mito-GFP, en tant que cellules donneuses, et les cellules ARPE19-mito-RFP avec des membranes cytoplasmiques marquées en violet en tant que cellules réceptrices ont été co-cultivées dans un rapport de 1:1. Après une période de co-culture de 24 heures, les cellules ont été colorées pour la phalloïdine et examinées ...

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Discussion

De nombreuses études ont démontré que le phénomène du transfert mitochondrial médié par le TNT est un processus physiologique répandu dans divers types de cellules tissulaires 10,11,12,13. Le don mitochondrial fonctionnel de CSM à des cellules présentant un dysfonctionnement mitochondrial présente un fort potentiel thérapeutique

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts conflictuels.

Remerciements

Nous remercions Guangzhou CSR Biotech Co. Ltd pour l’imagerie avec son microscope commercial à super-résolution (HIS-SIM), l’acquisition de données, la reconstruction d’images SR, l’analyse et la discussion. Ce travail est en partie soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82125007,92368206) et la Fondation des sciences naturelles de Pékin (Z200014).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,25 % Trypsine-EDTAGibco25200-056
4 % paraformaldéhydeSolarbioP1110
Plaque 6 puitsNEST703001
15 mL Tube à centrifugerBD Falcon352097
24 puitsNEST702001
ARPE19 cellulesATCCCRL-2302Lignées cellulaires
Albumine sérique bovine (BSA)BeyotimeST025
CellTrace violetInvitrogenC34557
Lame de couvertureNEST801007
DMSOsigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAXGibco10565-042
Fœtus bovins Sérum (FBS)VivaCellC04002-500
FluorSave RéactifMillipore345789
MSCsNuwacellRC02003Lignées cellulaires
ncMissionShowninRP02010
Pen StrepGibco15140-122
pCT-Mito-GFPSBICYTO102-PA-1Plasmide; À partir de  ; https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
PuromycinMCEHY-B1743A
PipetteAxygenTF-1000-R-S
PhalloidinInvitrogenA22287
Triton X-100SolarbioT8200
Transwell plaqueCorning3470

Références

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