Article de méthode

Isolement de capillaires rétiniens de souris et de matrice sous-endothéliale pour la mesure de la rigidité à l’aide de la microscopie à force atomique

DOI :

10.3791/66922

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12 juillet 2024

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1Department of Ophthalmology, University of California, Los Angeles, 2Doheny Eye Institute, 3Molecular, Cellular, and Integrative Physiology Interdepartmental PhD Program, University of California, Los Angeles, 4Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons récemment identifié le raidissement capillaire rétinien comme un nouveau paradigme pour le dysfonctionnement rétinien associé au diabète. Ce protocole détaille les étapes d’isolement des capillaires rétiniens de souris et de la matrice sous-endothéliale à partir de cultures endothéliales rétiniennes, suivi d’une description de la technique de mesure de la rigidité par microscopie à force atomique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La dégénérescence capillaire rétinienne est une caractéristique clinique des premiers stades de la rétinopathie diabétique (RD). Nos études récentes ont révélé que le raidissement capillaire rétinien induit par le diabète joue un rôle causal crucial et jusqu’alors méconnu dans la dégénérescence des capillaires rétiniens induite par l’inflammation. L’augmentation de la rigidité capillaire rétinienne résulte de la surexpression de la lysyl oxydase, une enzyme qui réticule et rigidifie la matrice sous-endothéliale. Étant donné que le fait de s’attaquer à la RD à un stade précoce devrait prévenir ou ralentir la progression de la RD et la perte de vision associée, la matrice sous-endothéliale et la rigidité capillaire représentent des cibles thérapeutiques pertinentes et nouvelles pour la prise en charge précoce de la RD. De plus, la mesure directe de la rigidité capillaire rétinienne peut servir d’étape de validation préclinique cruciale pour le développement de nouvelles techniques d’imagerie pour l’évaluation non invasive de la rigidité capillaire rétinienne chez les sujets animaux et humains. Dans cette optique, nous proposons ici un protocole détaillé pour la mesure de l’isolement et de la rigidité des capillaires rétiniens de souris et de la matrice sous-endothéliale à l’aide de la microscopie à force atomique.

Introduction

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Les capillaires rétiniens sont essentiels au maintien de l’homéostasie rétinienne et de la fonction visuelle. En effet, leur dégénérescence au stade précoce du diabète est fortement impliquée dans le développement de complications menaçant la vision de la rétinopathie diabétique (RD), une affection microvasculaire qui touche près de 40 % de toutes les personnes atteintes de diabète1. L’inflammation vasculaire contribue de manière significative à la dégénérescence capillaire rétinienne dans la RD. Des études antérieures ont démontré un rôle important pour les signaux moléculaires et biochimiques aberrants dans l’inflammation vasculaire rétinienne induite par le diabète 2,3. Cependant, des travaux récents ont introduit un nouveau paradigme pour la pathogenèse de la RD qui identifie le raidissement capillaire rétinien comme un déterminant crucial mais jusqu’alors non reconnu de l’inflammation et de la dégénérescence vasculaires rétiniennes 4,5,6.

Plus précisément, l’augmentation de la rigidité capillaire rétinienne induite par le diabète est causée par la régulation à la hausse de l’enzyme lysyl oxydase (LOX) de réticulation du collagène dans les cellules endothéliales rétiniennes (CE), ce qui rigidifie la matrice sous-endothéliale (membrane basale)4,5,6. Le raidissement matriciel, à son tour, rigidifie les CE rétiniens sus-jacents (en raison de la réciprocité mécanique), conduisant ainsi à l’augmentation globale de la rigidité capillaire rétinienne4. De manière cruciale, ce raidissement capillaire rétinien induit par le diabète peut à lui seul favoriser l’activation de la CE rétinienne et la mort de la CE médiée par l’inflammation. Cette régulation mécanique des défauts EC rétiniens peut être attribuée à une altération de la mécanotransduction endothéliale, le processus par lequel les signaux mécaniques sont convertis en signaux biochimiques pour produire une réponse biologique 7,8,9. Il est important de noter que l’altération des signaux mécaniques de la CE et de la structure de la matrice sous-endothéliale a également été impliquée dans la dégénérescence vasculaire choroïdienne associée à la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) précoce10,11,12, ce qui atteste des implications plus larges de la mécanobiologie vasculaire dans les maladies dégénératives de la rétine.

Notamment, le raidissement capillaire de la rétine se produit au début du diabète, ce qui coïncide avec le début de l’inflammation rétinienne. Ainsi, l’augmentation de la rigidité capillaire rétinienne peut servir à la fois de cible thérapeutique et de marqueur diagnostique précoce de la RD. À cette fin, il est important d’obtenir des mesures fiables et directes de la rigidité des capillaires rétiniens et de la matrice sous-endothéliale. Cela peut être réalisé à l’aide d’un microscope à force atomique (AFM), qui offre une technique unique, sensible, précise et fiable pour mesurer directement la rigidité des cellules, de la matrice extracellulaire et des tissus13. Un AFM applique une force d’indentation minuscule (de l’ordre du nanoNewton) sur l’échantillon dont la rigidité détermine la mesure dans laquelle le porte-à-faux AFM en retrait se plie - plus l’échantillon est rigide, plus le cantilever se plie, et vice versa. Nous avons largement utilisé l’AFM pour mesurer la rigidité des cellules endothéliales en culture, des matrices sous-endothéliales et des capillaires rétiniens isolés de souris 4,5,6,11,12. Ces mesures de rigidité AFM ont permis d’identifier la mécanobiologie endothéliale comme un déterminant clé de la pathogenèse de la RD et de la DMLA. Pour aider à élargir le champ de la mécanobiologie dans la recherche sur la vision, nous fournissons ici un guide étape par étape sur l’utilisation de l’AFM pour les mesures de rigidité des capillaires rétiniens isolés de souris et de la matrice sous-endothéliale.

Protocole

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Toutes les procédures sur des animaux ont été effectuées conformément à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et approuvées par les comités institutionnels d’utilisation des animaux et de soins (IACUC ; numéro de protocole ARC-2020-030) à l’Université de Californie à Los Angeles (numéro d’assurance du bien-être animal de l’institution OLAW A3196-01). Le protocole suivant a été réalisé à l’aide de capillaires rétiniens isolés de souris C57BL/6J mâles adultes (âgées de 20 semaines) pesant ~25 g (souris diabétiques) et ~32 g (souris non diabétiques ; Jackson Laboratory).

1. Isolement des capillaires rétiniens de souris pour la mesure de la rigidité de l’AFM (jours 1 à 4)

REMARQUE : Ce protocole, rapporté dans une étude récente4, détaille l’énucléation et la fixation légère de l’œil de souris, l’isolement rétinien et la digestion de la trypsine, ainsi que le montage ultérieur du système vasculaire rétinien résultant sur des lames de microscopie pour la mesure de la rigidité de l’AFM.

  1. Énucléation et fixation légère (Jour 1)
    1. Après avoir euthanasié la souris avec une exposition au dioxyde de carbone suivie d’une luxation cervicale, insérez des micro-pinces derrière le globe oculaire, tenez l’attache musculaire et retirez soigneusement l’œil sans pincer trop fort la micro-pince, ce qui pourrait sectionner le nerf optique.
    2. Placez l’œil énucléé dans du formol à 5 % (v/v) dans du PBS pendant 24 h à 4 °C pour une fixation légère.
      REMARQUE : D’après l’expérience4, les yeux non fixes ou plus légèrement fixes produisent des capillaires fragiles qui se fragmentent lors de la préparation des échantillons AFM et de la mesure de la rigidité.
  2. Isolement rétinien (jour 2)
    1. Placez l’œil fixe sur un morceau de papier ciré sous un microscope à dissection. Ensuite, à l’aide d’une micro-pince, tenez les restes du muscle et du nerf optique attachés à l’extérieur de l’œil postérieur et orientez l’œil de manière à ce que la cornée soit tournée vers un côté (Figure 1).
    2. À l’aide d’une lame chirurgicale, faites une incision de 1 à 2 mm en arrière et parallèlement au limbe (jonction cornée-sclérotique). Ensuite, tout en maintenant l’œil en place avec la micro-pince, appliquez une force vers le bas avec la lame et continuez à appuyer jusqu’à ce que le segment antérieur de l’œil soit totalement séparé de l’extrémité postérieure (Figure 1). Jetez le segment antérieur et le cristallin. Ne sciez pas d’avant en arrière car cela pourrait causer des dommages à la rétine.
    3. Transférez le segment postérieur (sclère, choroïde et rétine) dans une boîte de 6 cm remplie de PBS (pH 7,4).
    4. À l’aide d’une micro-spatule et en tenant doucement le nerf optique avec une micro-pince, retirez la rétine. Conservez la rétine dans un tube de microcentrifugation de 2 mL contenant du PBS à 4 °C jusqu’à l’isolement capillaire.
       
  3. Rinçage de la rétine
    1. Pour rincer une rétine, remplissez six puits d’une plaque à 12 puits avec 1 mL de H2O (jjH2O) doublement distillé. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur inversée, transférez la rétine du tube de microcentrifugation de 2 mL dans le premier puits.
    2. Rincez la rétine sur l’agitateur orbital à 120 tr/min pendant 30 min à température ambiante (RT).
    3. À l’aide d’une pipette P1000, pipetez soigneusement l’eau de haut en bas à côté de la rétine, en soufflant de l’eau sur la rétine pour provoquer une légère agitation.
    4. À l’aide de la pipette en verre inversé, transférez la rétine dans le deuxième puits et répétez les étapes 1.3.2 et 1.3.3 4 fois, chaque rinçage étant effectué dans un puits frais (contenant du ddH2O).
    5. Enfin, transférez la rétine dans le sixième puits et rincez-la pendant la nuit (O/N) à RT sur l’agitateur orbital réglé à 100 RPM pour faciliter la séparation de la neuroglie rétinienne des vaisseaux sanguins lors de la digestion de la trypsine.
  4. Digestion de la trypsine rétinienne (Jour 3)
    1. Préparez une solution de trypsine à 10 % (p/v) en dissolvant la poudre de trypsine 1:250 dans un tampon Tris (pH 8 ; 0,1 M). Mélangez doucement en inversant le tube conique plusieurs fois pour minimiser la formation de bulles, ce qui rend plus difficile la confirmation de la solubilité de la trypsine.
    2. Équilibrer la solution de trypsine à 10 % dans un bain-marie à 37 °C pendant 10 à 15 min. Une fois que la poudre de trypsine est complètement dissoute, filtrez la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm.
    3. Dans une plaque à 12 puits, ajouter 2 mL/puits/rétine de la solution de trypsine filtrée à 10 %. Ajoutez un peu de solution de trypsine supplémentaire dans le puits voisin (pour équilibrer les parois de la pipette en verre pour les étapes suivantes).
    4. Ajoutez 3 mL de ddH2 Odans trois puits d’une plaque à 6 puits (dédiez ces trois puits à une rétine).
    5. Dans un tube conique de 15 ml, insérer un embout P200 avant d’ajouter 4 ml de la solution de trypsine filtrée à 10 %. Transférez ce tube conique dans le bain à 37 °C pour permettre à l’embout d’être trempé dans de la trypsine pendant 2-3 min, car cela aide à empêcher la rétine de coller aux parois de l’embout dans les dernières étapes.
    6. Après le rinçage O/N de la rétine (à partir de l’étape 1.3.5), utilisez une pipette P1000 pour pipeter soigneusement l’eau de haut en bas à côté de la rétine, en projetant de l’eau sur la rétine pour provoquer une légère agitation.
    7. À l’aide d’une pipette en verre inversé, transférez la rétine rincée dans le puits contenant la trypsine de la plaque à 12 puits (à partir de l’étape 1.4.3). Assurez-vous que la rétine est transférée avec une quantité minimale de ddH2O résiduelle afin de ne pas diluer considérablement la solution de trypsine. Incuber pendant 3 h à 37 °C.
    8. En centrant l’embout P200 imbibé de trypsine (à partir de l’étape 1.4.5) sur la zone du nerf optique, pipetez doucement l’ensemble du réseau vasculaire de haut en bas pour dissocier le tissu non vasculaire14.
    9. À l’aide d’une pipette en verre inversé pré-rincée à la trypsine (en pipetant la trypsine de haut en bas 5 fois), transférez le système vasculaire rétinien dans le premier puits contenant de la ddH2O de la plaque à 6 puits (à partir de l’étape 1.4.4).
    10. Faites tourner la plaque et pipetez le système vasculaire de haut en bas à l’aide d’une pipette en verre inversé rincé à la trypsine pour éliminer tout tissu non vasculaire résiduel.
    11. À l’aide de la pipette en verre, transférez le système vasculaire rétinien dans le deuxième puits contenant du ddH2O de la plaque à 6 puits et conservez-le à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit monté sur la lame pour la mesure de la rigidité AFM.
      REMARQUE : Le système vasculaire rétinien hydraté (en PBS) est structurellement intact à 4 °C jusqu’à 2 semaines. Cependant, les mesures de rigidité de routine doivent être effectuées à partir de capillaires fraîchement isolés.
  5. Montage du système vasculaire rétinien pour la mesure de la rigidité de l’AFM (jour 4)
    1. À l’aide d’une pipette en verre inversée rincée à la trypsine, transférez le système vasculaire rétinien dans le troisième puits contenant de la ddH2O de la plaque à 6 puits pour éliminer toute solution résiduelle de trypsine.
    2. Nettoyez soigneusement (à l’aide de ddH2O et d’un chiffon essuie-glace) une lame de microscopie à surface chargée qui sera utilisée pour monter le réseau vasculaire pour la mesure de la rigidité de l’AFM.
      REMARQUE : La surface chargée de la lame assure une liaison solide pour le réseau vasculaire lors de la mesure AFM.
    3. Étiquetez la diapositive et dessinez une zone circulaire de 4 à 5 cm autour du centre avec un stylo hydrophobe pour éviter les déversements d’eau lors des étapes suivantes.
    4. À l’aide d’une pipette en verre inversée rincée à la trypsine, transférez soigneusement le système vasculaire rétinien au centre de la région marquée.
    5. À l’aide d’une pipette P200, retirez soigneusement autant d’eau que possible d’un bord sans aspirer accidentellement le système vasculaire dans la pointe.
    6. Placez la lame dans une enceinte de biosécurité (hotte BSL-2) près de la face avant (maille filtrée) et laissez l’eau résiduelle s’évaporer.
    7. Une fois que le système vasculaire est presque sec, sous un microscope à contraste de phase (grossissement 4x), réhydratez soigneusement le système vasculaire en ajoutant lentement du ddH2O à l’aide d’une pipette P200 sur un côté de la région marquée. L’ajout de ddH2O directement sur le système vasculaire le fait se détacher.
    8. Prenez des images en contraste de phase du système vasculaire réhydraté à des grossissements de 4x et 20x pour vous assurer qu’il a une bonne intégrité structurelle et qu’il est correctement étalé (sans se replier sur lui-même) et fixé à une lame de verre, qui sont des critères essentiels pour une mesure fiable de la rigidité AFM.

2. Obtention de matrice sous-endothéliale à partir de cultures de cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes (jours 1 à 17)

REMARQUE : Ce protocole, adapté de Beacham et al.15 et rapportée dans des études récentes 4,5,6, décrit la culture REC sur des lamelles en verre modifiées, suivie d’une décellularisation pour obtenir une matrice sous-endothéliale pour la mesure ultérieure de la rigidité de l’AFM.

  1. Préparation des lamelles en verre revêtues de gélatine et placage cellulaire (Jour 1)
    REMARQUE : Effectuez l’enrobage de gélatine et les étapes de rinçage PBS++ ultérieures dans une hotte de culture tissulaire avant de passer à une hotte chimique pour les étapes ultérieures de traitement au glutaraldéhyde et à l’éthanolamine.
    1. Placer une lamelle en verre circulaire de 12 mm de diamètre autoclavée par puits d’une plaque stérile à 24 puits et ajouter 500 μL de gélatine stérile à 0,2 % (p/v) préchauffée (diluée dans du PBS contenant du calcium et du magnésium ; PBS++) à chaque puits contenant une lamelle. Incuber pendant 1 h à 37 °C.
    2. Aspirer la solution de gélatine, rincer une fois les lamelles avec du PBS++ stérile et réticuler la gélatine enrobée en ajoutant 500 μL de glutaraldéhyde à 1 % (v/v) pendant 30 min à RT.
    3. Récupérez et éliminez correctement (conformément aux directives de l’établissement) la solution de glutaraldéhyde avant de rincer les lamelles avec du PBS++ pendant 5 minutes sur un agitateur orbital à 100 tr/min en RT. Répétez cette étape de rinçage 5 fois. Lors des trois premiers rinçages, soulevez les lamelles à l’aide d’une pince à épiler stérile pour permettre un rinçage complet du glutaraldéhyde. Toute quantité résiduelle peut réduire la viabilité cellulaire.
    4. Ajouter 800 μL d’éthanolamine 1 M dans la lamelle réticulée de gélatine pendant 30 min à RT pour éteindre toute trace restante de glutaraldéhyde dans le puits.
    5. Recueillir et éliminer correctement (conformément aux directives de l’établissement) la solution d’éthanolamine et rincer les lamelles 5 fois avec du PBS++ pendant 5 minutes sur un agitateur orbital à 100 tr/min en RT. Lors des trois premiers rinçages, soulevez les lamelles à l’aide d’une pince à épiler stérile pour permettre un rinçage complet de l’éthanolamine. Toute quantité résiduelle peut réduire la viabilité cellulaire.
    6. Les lamelles réticulées sont maintenant prêtes pour le placage cellulaire.
      REMARQUE : Bien que nous plaquions régulièrement les cellules immédiatement après la préparation des lamelles, il peut être utile de comparer le placage des cellules sur des lamelles de gélatine réticulée stockées dans PBS++ à 4 °C pendant 1 à 2 jours.
    7. Dans des conditions stériles dans un capot de culture tissulaire, mettez en plaques des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes (CER) dans un milieu/puits de 500 μL à une densité qui atteint 100 % de confluence en 24 heures, comme le confirme la microscopie à contraste de phase.
      REMARQUE : Il est important d’atteindre la confluence dans les 24 heures, car la quiescence REC qui en résulte augmentera la capacité des cellules à sécréter de la matrice (reportez-vous à l’étape suivante). D’après notre expérience avec les CER humaines, une densité de placage de 4 x 104 cellules/cm2 est suffisante pour atteindre la confluence en 24 heures. Cependant, comme la taille des CER varie selon les espèces (p. ex. les CER de souris sont beaucoup plus petites), il peut être nécessaire d’optimiser la densité initiale du placage.
  2. Production de matrice sous-endothéliale par culture REC (Jour 2-16)
    1. Une fois que les cellules ont atteint la confluence (~24 h), remplacer le milieu de culture par un milieu frais complété par de l’acide ascorbique stérilement filtré (concentration finale de 200 μg/mL).
      REMARQUE : Tout traitement REC avec des facteurs de risque de maladie (par exemple, une glycémie élevée, des produits finaux de glycation avancée, etc.) ou des agents pharmacologiques peut commencer dès maintenant, avec le traitement à l’acide ascorbique.
    2. Changez le milieu de culture supplémenté en acide ascorbique tous les deux jours pendant 15 jours.
      REMARQUE : L’acide ascorbique est instable en solution. Préparez une solution mère fraîche 100X tous les deux jours pour une supplémentation moyenne.
  3. Décellularisation des cultures REC pour obtenir la matrice sous-endothéliale (Jour 16)
    1. Après 15 jours de traitement à l’acide ascorbique, retirez le milieu et rincez les cellules avec du PBS sans calcium/magnésium.
    2. Décellulariser les cultures REC en ajoutant 250 μL/par puits de tampon de décellularisation chaud (20 mM d’hydroxyde d’ammonium et 0,5 % de Triton X-100 dans du PBS) pendant ~2-3 min. Confirmez l’élimination des cellules à l’aide d’un microscope à contraste de phase (grossissement de 10x).
    3. Retirez délicatement le tampon de décellularisation sans perturber la matrice sous-endothéliale sécrétée par REC et ajoutez 0,5 mL de PBS dans chaque puits.
      REMARQUE : Pour s’assurer que la matrice sous-endothéliale ne se détache pas pendant cette étape de rinçage et les suivantes, effectuez un rinçage doux uniquement avec une pipette P1000. Ne pas effectuer d’aspiration intra-utérine.
    4. Conservez les plaques à 4 °C pendant la nuit pour stabiliser la matrice sécrétée par REC.
  4. Traitement à la DNase de la matrice sous-endothéliale pour éliminer les débris cellulaires (Jour 17)
    1. Rincer la matrice sous-endothéliale de l’étape 2.3.4 avec 800 μL de PBS/puits.
    2. Retirez délicatement le PBS et incubez la matrice avec 200 μL de DNase I sans RNase (30 K unités) à 37 °C pendant 30 min pour éliminer toute trace de débris cellulaires. Vérifiez l’efficacité du traitement par DNase en recherchant soigneusement les débris cellulaires au microscope à contraste de phase.
    3. Retirez délicatement la solution de DNase I et rincez la matrice sous-endothéliale deux fois avec 800 μL de PBS/well.
    4. Vérifiez que la matrice sous-endothéliale fibreuse à l’échelle macroscopique est visible au microscope à contraste de phase (grossissement de 10x). La visualisation des fibres matricielles plus fines à l’échelle nanométrique nécessite un balayage topographique AFM ou une imagerie confocale haute résolution de protéines matricielles immunomarquées à un grossissement de 100x.
    5. Utilisez immédiatement la matrice sous-endothéliale fraîche (non fixée) pour la mesure de la rigidité AFM.
    6. Après la mesure de l’AFM, fixer les échantillons de matrice avec 1 % (v/v) de paraformaldéhyde (15 min à température ambiante) et stockés à 4 °C pour l’immunomarquage avec des anticorps contre les protéines de la matrice sous-endothéliale et/ou les enzymes de réticulation.

3. Mesure de la rigidité AFM

REMARQUE : Ce protocole, adapté d’un manuel d’utilisation standard de l’AFM et rapporté dans des études récentes 4,5, détaille l’acquisition et l’analyse des données de rigidité des capillaires rétiniens et de la matrice sous-endothéliale à l’aide d’un logiciel d’AFM et d’analyse de données. Bien que les étapes décrites ci-dessous soient basées sur un modèle spécifique d’AFM (voir le tableau des matériaux), les principes sous-jacents sont généralement applicables à tous les modèles AFM.

  1. Sélection de la sonde en porte-à-faux
    REMARQUE : Les échantillons biologiques mous nécessitent des porte-à-faux souples qui peuvent se plier lors de l’indentation de l’échantillon tandis que les dimensions de la sonde sont sélectionnées pour correspondre aux dimensions de l’échantillon.
    1. Pour mesurer la rigidité des vaisseaux rétiniens de souris de 5 à 8 m de diamètre, utilisez une sonde cantilever de 1 m de rayon avec une constante de ressort (k) de 0,2 à 0,3 N/m. Pour mesurer la rigidité d’une matrice sous-endothéliale composée de fibres à l’échelle nanométrique, utilisez une sonde en porte-à-faux de rayon de 70 nm avec une constante de ressort (k) de 0,06-0,1 N/m.
  2. Montage en porte-à-faux
    1. Sur l’ordinateur AFM, ouvrez le logiciel qui contrôle l’unité AFM et la caméra reliée à un microscope à contraste de phase utilisé pour visualiser le cantilever et l’échantillon.
    2. Fixez le support de porte-à-faux sur le support de changement en porte-à-faux et montez le porte-à-faux sélectionné sur le support à l’aide d’une pince d’horloger sous un stéréoscope sans endommager physiquement le porte-à-faux. Serrez la vis du support pour fixer le cantilever.
    3. Placez et verrouillez le support en porte-à-faux sur la tête AFM qui repose sur le support.
    4. À l’aide de la fonction de moteur pas à pas du logiciel AFM, retirez la tête AFM au point le plus élevé et réglez cette position sur le point zéro dans le logiciel. Cette étape empêche le cantilever AFM de heurter accidentellement l’étage d’échantillonnage lors du montage de la tête AFM (étape suivante).
    5. Soulevez avec précaution la tête AFM de son support et montez-la sur l’étage d’échantillonnage AFM en plaçant les pieds dans leurs fentes respectives.
  3. Alignement laser
    REMARQUE : L’alignement laser initial est effectué sans aucun échantillon (c’est-à-dire en mode Air) car il assure un alignement plus précis du faisceau laser sur la pointe en porte-à-faux (en empêchant la réfraction laser dans le liquide). Cependant, comme les échantillons biologiques sont immergés dans un milieu dont l’indice de réfraction est différent de celui de l’air, il est important de réaligner le laser dans le milieu avant de mesurer la rigidité.
    1. Pour l’alignement laser dans l’air, placez la tête AFM sur la platine d’échantillonnage et utilisez l’objectif 10x et la caméra attachée pour visualiser le porte-à-faux sur le moniteur en mode direct. Le laser infrarouge est caché à la vue de l’utilisateur mais est visible avec une caméra CCD.
    2. Sélectionnez la fonction Spectroscopie de force en mode contact sur le logiciel et ouvrez la fenêtre intitulée Alignement laser.
    3. À l’aide des deux vis marquées sur le côté laser sur la tête AFM, focalisez le faisceau laser sur le porte-à-faux de sorte que la valeur SUM dans la fenêtre d’alignement du laser soit la plus élevée. Pour ce faire, focalisez le laser au centre ou autour du centre du cantilever.
    4. À l’aide des vis de réglage du détecteur, réglez le photodétecteur de manière à ce que le point laser soit au centre de la fenêtre d’alignement laser.
    5. À l’aide de la vis de réglage du miroir, ajustez le miroir pour vous assurer que la valeur SUM est à la valeur la plus élevée possible.
      REMARQUE : Une valeur SUM élevée garantit une évaluation sensible et précise de la rigidité de l’échantillon. Ainsi, les étapes d’alignement du laser et de réglage du miroir doivent être effectuées pour obtenir la valeur SUM la plus élevée.
    6. Ensuite, pour l’alignement laser dans un liquide, ajoutez le milieu de culture souhaité dans une boîte et montez-le fermement sur la scène pour éviter toute vibration ou dérive, ce qui crée des artefacts de mesure lors de l’indentation de l’échantillon.
    7. Tout en regardant le flux de la caméra en direct concentré sur le cantilever, abaissez-le dans le liquide à l’aide de la fonction de moteur pas à pas.
    8. Répétez les étapes 3.3.4 et 3.3.5 pour vous assurer que la valeur SUM reste la plus élevée et que le spot laser se trouve au centre de la fenêtre d’alignement laser.
  4. Étalonnage de la constante de ressort en porte-à-faux
    REMARQUE : Bien que les sondes en porte-à-faux soient équipées d’une constante de ressort calibrée par le fabricant (k), il est recommandé de vérifier indépendamment sa valeur (en liquide) avant de commencer une mesure. Utilisez une surface en verre propre qui minimise les interactions entre la sonde en porte-à-faux et la surface en verre.
    1. La force de consigne appliquée par le porte-à-faux définit la déviation laser maximale du porte-à-faux autorisée pour une indentation de force. Réglez-le initialement à 1,5 V. Si le cantilever ne parvient pas à s’approcher de cette force de consigne donnée, augmentez-la progressivement jusqu’à ce qu’elle intaille l’échantillon et génère une courbe d’indentation de force.
    2. La longueur Z signifie la distance maximale à laquelle le piézo z se retire une fois que le porte-à-faux a atteint le point de consigne lors de l’indentation de l’échantillon. La longueur Z doit être au moins suffisante pour garantir que la sonde en porte-à-faux se sépare proprement de l’échantillon. Pour l’étalonnage de la constante de ressort sur une surface en verre, réglez la longueur Z à 1 μm.
    3. La vitesse Z fait référence à la vitesse à laquelle le piézo Z déplace le porte-à-faux verticalement vers l’échantillon lors de l’indentation de force. Il doit être optimisé car une vitesse très faible capturera principalement le comportement visqueux de l’échantillon, tandis qu’une vitesse très élevée capturera principalement le comportement élastique. La vitesse optimale est censée capturer la véritable nature viscoélastique des échantillons biologiques. Réglez la vitesse Z à 2 μm/s pour les échantillons biologiques viscoélastiques.
    4. La hauteur cible sur la plage Z indique la distance approximative de l’échantillon à laquelle le piézo z repose après avoir mesuré une courbe de force et avant de se déplacer vers un autre emplacement de l’échantillon. La hauteur cible de la plage Z doit être supérieure à la hauteur des entités de l’échantillon. Réglez la hauteur cible sur la plage Z à 7,5 μm.
    5. À l’aide de la fonction Step Motor , rapprochez le cantilever assez près de la surface de l’échantillon (à en juger par la mise au point dans l’image en contraste de phase à un grossissement de 10x) avant de sélectionner la fonction d’approche dans la fenêtre de spectroscopie de force du mode contact pour abaisser le cantilever par petits incréments de 15 μm.
    6. Cliquez sur Acquérir pour capturer une courbe de force.
    7. Sélectionnez la courbe de force, ouvrez-la dans la fenêtre du gestionnaire d’étalonnage et sélectionnez Mode basé sur le contact dans la section méthode.
    8. À l’aide de la fonction Select-fit Range, sélectionnez la courbe de rétraction en porte-à-faux pour un ajustement de courbe linéaire. Ensuite, cochez la case Vérification de la sensibilité pour convertir l’unité de force de V à N.
    9. Soulevez le porte-à-faux de 100 à 200 μm dans le liquide et sélectionnez la fonction Bruit thermique . Encore une fois, à l’aide de la plage de sélection d’ajustement, ajustez la courbe en cloche du bruit thermique avec une courbe de Lorentz. Après l’ajustement de la courbe, sélectionnez la case Constante de ressort (k). Vérifiez que la constante de ressort (k) est proche de la valeur du fabricant et notez-la pour référence future. Après l’étalonnage, l’unité de consigne passera de mV à nN.
      REMARQUE : Le bruit thermique est la fréquence naturelle du porte-à-faux à une température particulière. Une correction du bruit thermique est nécessaire pour une mesure précise de la constante du ressort.
  5. Acquisition des courbes force-distance
    1. Placez l’échantillon monté sur lame (vaisseaux rétiniens ou matrice sous-endothéliale) sur la platine AFM et sélectionnez Spectroscopie de force en mode contact dans la section expérience du logiciel.
    2. Réglez la force de consigne à 0,5 nN et cliquez sur Approche, qui est nettement supérieure à la déflexion thermique des sondes en porte-à-faux SAA-SPH 1 μm et PFQNM-LC-A 70 nm, assurant une approche en porte-à-faux douce vers l’échantillon.
    3. Une fois que le porte-à-faux a détecté la surface et est revenu à sa hauteur cible au repos, réglez le point de consigne à 0,2 nN pour la sonde en porte-à-faux SAA-SPH 1 μm plus rigide ou à 0,1 nN pour la sonde en porte-à-faux PFQNM-LC-A 70 nm plus souple. Ce réglage du point de consigne garantit que les porte-à-faux rigides et souples se plient facilement lors de l’indentation de l’échantillon (voir section 3.1).
    4. Réglez la longueur Z à ~2,5 μm pour assurer une séparation nette de la sonde en porte-à-faux des échantillons biologiques lors de la rétraction (voir l’étape 3.4.2) et la vitesse Z à 2 μm/s (voir l’étape 3.4.3).
    5. À l’aide des vis de platine sur la platine AFM, positionnez soigneusement la sonde en porte-à-faux à l’endroit souhaité sur l’échantillon.
      REMARQUE : Étant donné que les capillaires ne s’écartent pas toujours à plat sur la glissière, il est prudent de retirer le cantilever de 10 à 20 μm supplémentaires de sa hauteur cible de repos avant de déplacer la platine.
    6. Cliquez sur Approche pour rapprocher le porte-à-faux de l’échantillon, puis cliquez sur Acquérir pour capturer les courbes de force pour les emplacements souhaités. Enregistrez toutes les courbes de force pour analyse.
  6. Analyse des données
    1. Ouvrez la courbe de force dans le logiciel de traitement des données.
    2. Sélectionnez la courbe de force de rétraction pour l’analyse des données (similaire à l’étape 3.4.8).
    3. À l’aide de la fonction de lissage des données, lissez la courbe de force à l’aide d’un filtre gaussien pour supprimer le bruit indésirable dans les données acquises.
    4. À l’aide de la fonction de soustraction de la ligne de base, ajustez la valeur de la pente et de l’amplitude de la partie de la ligne de base (sans contact) de la courbe de force à zéro.
    5. Cliquez sur la fonction Point de contact pour ramener automatiquement le point de contact de la courbe de force aux coordonnées (0,0) sur les axes X et Y.
    6. À l’aide de la fonction Position verticale de la pointe, calculez la position verticale réelle du porte-à-faux sur l’axe Y en corrigeant toute indentation de l’échantillon.
    7. Sur la courbe de force traitée, appliquez la fonction d’ajustement de l’élasticité en sélectionnant d’abord la forme et le rayon de la pointe (en fonction de la sonde en porte-à-faux sélectionnée), puis en ajustant la courbe de force à l’aide du modèle Hertz/Sneddon.
      1. Si l’indentation de la matrice par la sonde de rayon de 70 nm dépasse 70 nm, ce qui est généralement le cas, sélectionnez la forme de l’extrémité paraboloïde . Pour la mesure de la rigidité capillaire, l’indentation de l’échantillon par la sonde de rayon de 1 μm ne dépasse jamais 1 μm, sélectionnez donc la forme de l’embout Sphere . De plus, si le point de contact de la courbe ajustée ne coïncide pas avec le point de contact de la courbe de rétraction réelle, cochez la case Courbe de décalage .
    8. Notez et enregistrez la valeur du module de Young (rigidité).

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Capillaires rétiniens de souris
La mesure de la rigidité AFM de capillaires rétiniens isolés implique des étapes de manipulation d’échantillons susceptibles d’endommager leur intégrité mécanostructurale. Pour éviter cela et garantir ainsi la faisabilité, la fiabilité et la reproductibilité des mesures AFM, les yeux énucléés sont fixés dans du formol à 5 % pendant une nuit à 4 °C avant d’être isolés du vaisseau. Ce protocole de fixation douce avec une concentration réduite de formol, une température de fixation basse, un temps de fixation limité et l’absence de ponction cornéenne a été mis au point pour minimiser tout artefact potentiel de réticulation/raidissement causé par la fixation chimique. Comme le montre la figure 2B,C, cette fixation relativement douce garantit que le système vasculaire rétinien isolé est structurellement robuste et suffisamment durable pour la mesure de l’AFM. En revanche, les vaisseaux rétiniens isolés des yeux non fixés (par la méthode hypotonique)4 ou des yeux brièvement fixes (pendant 8 h) se fragmentent ou s’affaissent, ce qui les rend impropres à la mesure de l’AFM (Figure 2B).

Matrice sous-endothéliale rétinienne
La rigidité vasculaire reflète la rigidité combinée des cellules vasculaires et de la membrane basale (matrice sous-endothéliale)4. Étant donné que les cellules s’adaptent à la rigidité matricielle en subissant un changement similaire de leur propre rigidité, un processus appelé réciprocité mécanique9, la rigidité de la matrice sous-endothéliale, devient un déterminant important de la rigidité vasculaire globale. Pour la mesure de la rigidité de la matrice, il est important d’obtenir une matrice sous-endothéliale homogène et dense. Pour les CE rétiniennes humaines cultivées dans un milieu de culture enrichi en acide ascorbique, cela prend généralement 10 à 15 jours (Figure 3A)4,5,6. Cette différence dans la période de culture peut provenir de différences d’un lot à l’autre dans les CE rétiniennes primaires disponibles dans le commerce. De plus, nous constatons généralement que les CE rétiniennes disponibles dans le commerce chez les souris C57BL/6 déposent une matrice plus dense par rapport à la culture primaire de CE rétinienne humaine, indiquant ainsi des différences spécifiques à l’espèce. Comme le montre la figure 3A, les images à contraste de phase ne fournissent qu’une vue grossière de la matrice à l’échelle macro. Cependant, la structure fibrillaire plus fine à l’échelle nano-microscopique devient apparente dans les images de fluorescence confocale à haute résolution de la matrice immunomarquées avec des anticorps contre les protéines structurelles de la matrice, le collagène IV et la fibronectine (Figure 3B). Il convient de noter que ces protéines matricielles fournissent également des signaux instructifs aux cellules endothéliales en se liant à des récepteurs d’intégrine spécifiques9.

Mesure de la rigidité AFM
Le choix de la rigidité en porte-à-faux (constante de ressort, k) et de la dimension de la sonde appropriées est essentiel pour des mesures fiables et sensibles. Ces paramètres doivent être choisis en fonction de la rigidité et des dimensions de l’échantillon biologique. Une fois que le porte-à-faux sélectionné a été monté sur l’AFM, le faisceau laser infrarouge doit être focalisé sur l’extrémité du porte-à-faux et le point laser réfléchi doit être centré sur le photodétecteur. Cet alignement laser assure une détection précise et sensible de la déflexion en porte-à-faux et, par conséquent, une mesure de la rigidité. Une mesure de rigidité AFM commence par le piézo z déplaçant le porte-à-faux verticalement vers le bas vers l’échantillon. Il n’y a pas de déviation en porte-à-faux à ce moment-là, ce qui produit une ligne de base plate de la courbe d’approche (figure 4A). Lorsque la sonde en porte-à-faux entre en contact avec l’échantillon et l’enfonce, le porte-à-faux se plie, provoquant une déviation laser sur le photodétecteur, qui est représentée par la déviation verticale de la courbe d’approche. Après avoir appliqué une force d’indentation prédéfinie (force de consigne) sur l’échantillon, le porte-à-faux se rétracte à la position de départ (hauteur cible Z) en s’éloignant de l’échantillon. La courbe de rétraction déviée est ensuite ajustée au modèle de Hertz/Sneddon pour calculer le module de Young (rigidité) de l’échantillon.

D’après la mesure représentative de l’indentation de la force montrée à la figure 4, il est clair que les courbes d’approche et de rétraction obtenues à partir d’un capillaire rétinien isolé d’une souris diabétique (Figure 4B) sont considérablement plus raides que celles obtenues à partir d’une souris non diabétique (Figure 4A). La pente plus raide des courbes d’indentation de force indique une plus grande déviation en porte-à-faux causée par une résistance plus élevée de l’échantillon à l’indentation de force, ce qui reflète une rigidité de l’échantillon plus élevée13. En effet, l’analyse ultérieure des données de plusieurs courbes d’indentation de force a révélé que les capillaires rétiniens de la souris deviennent significativement plus rigides dans le diabète4. Il convient également de noter que le contact entre la sonde en porte-à-faux et les échantillons biologiques provoque souvent une adhérence de surface non spécifique, ce qui conduit à une déviation négative du porte-à-faux lors de la rétraction, comme le montre l’extension de la courbe de rétraction au-delà de la ligne de base (Figure 4B). De plus, les échantillons biologiques tels que les cellules, la matrice et les vaisseaux sanguins sont viscoélastiques par nature et peuvent donc subir une déformation permanente et/ou un changement de rigidité apparente après l’indentation de force. Si c’est le cas, cela se traduira par le désalignement des courbes d’approche et de rétraction (hystérésis). En effet, la comparaison de la figure 4A et de la figure 4B confirme la tendance attendue selon laquelle l’indentation de force des capillaires plus mous chez les souris non diabétiques produit une hystérésis plus grande que celle observée chez leurs homologues plus rigides. Comme indiqué précédemment 5,6, la rigidité (module de Young) des matrices sous-endothéliales obtenues à partir de cultures EC rétiniennes est également calculée de la manière susmentionnée.

figure-results-1
Figure 1 : Illustration schématique de l’incision pratiquée sur l’œil d’une souris pour l’isolement de la rétine. À l’aide d’une pince à épiler pour tenir le nerf optique, un scalpel est utilisé pour faire une incision complète à l’arrière du limbe afin de séparer la rétine de la souris du cristallin et de la chambre antérieure. La ligne pointillée violette indique l’emplacement de l’incision verticale. Ce schéma a été dessiné à l’aide d’un logiciel d’image et d’illustration scientifique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Optimisation du protocole pour l’isolement des vaisseaux rétiniens intacts de souris pour la mesure de l’AFM. (A) L’image stéréoscopique montre une rétine intacte isolée d’un œil de souris légèrement fixé avant les étapes d’isolement capillaire. Barre d’échelle : 2 mm. (B) Des images représentatives en contraste de phase à un grossissement de 4x montrent les vaisseaux rétiniens de souris obtenus à l’aide des différentes méthodes d’isolement. En comparant l’intégrité structurelle et la durabilité des vaisseaux isolés, la digestion à la trypsine des rétines à partir d’yeux énucléés fixés dans du formol à 5 % pendant 24 h à 4 °C (boîte rouge) s’est avérée donner le système vasculaire rétinien le plus approprié pour la mesure de la rigidité de l’AFM. Les vaisseaux rétiniens isolés à l’aide de cette méthode présentaient un réseau vasculaire clair qui s’étendait uniformément le long de la surface du verre. Barre d’échelle : 500 μm. (C) La vue à fort grossissement (20x) d’un réseau capillaire rétinien intact, similaire à celle montrée en (B), confirme la haute intégrité structurelle des capillaires obtenus à partir d’yeux légèrement fixés. Barre d’échelle : 100 μm. Cette figure a été modifiée au lieu de4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Matrices décellularisées obtenues à partir de cultures primaires d’REC, d’humains et de souris. (A) Images représentatives en contraste de phase à un grossissement de 20x montrant des agrégats de matrice sous-endothéliale sur des lamelles de verre après décellularisation de cultures de 10 jours (10 j) ou de 15 jours (15 jours) de CER humaines ou de souris. Barre d’échelle : 100 μm. (B) Images de fluorescence confocale représentatives à fort grossissement (100x) de matrices décellularisées obtenues à partir de cultures de CER humaines de 15 jours et marquées avec des anticorps anti-collagène IV et anti-fibronectine révèlent un collagène nanofibrillaire IV dense et matrice de fibronectine. Barre d’échelle : 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Courbes de distance de force à partir de la mesure de la rigidité AFM des capillaires rétiniens de souris. Les graphiques linéaires indiquent une approche représentative (couleur claire) et une courbe de rétraction (couleur foncée) à partir d’une mesure d’indentation de force unique à un endroit d’un capillaire rétinien de souris isolé d’une souris non diabétique (A) ou d’une souris diabétique. Les courbes de force obtenues à l’aide d’une sonde hémisphérique en porte-à-faux SAA-SPH de 1 μm de rayon tracent la relation entre la distance en porte-à-faux de l’échantillon (contrôlée par le piézo z) et la force verticale appliquée qui provoque la déviation en porte-à-faux. (A) La flèche jaune indique l’approche en porte-à-faux pilotée par le piézo z vers l’échantillon, la flèche blanche indique le point de contact où la sonde en porte-à-faux entre en contact avec l’échantillon, et la flèche verte indique la déviation en porte-à-faux jusqu’à une force d’indentation de consigne (crête) (*). (B) Les courbes d’approche et de rétraction obtenues à partir d’un capillaire rétinien isolé chez des souris diabétiques présentent une pente nettement plus raide que celles de leurs homologues non diabétiques (illustrées en A), ce qui indique une rigidité capillaire plus élevée chez les souris diabétiques. La pointe de flèche indique un creux de la courbe de rétraction sous la ligne de base, ce qui reflète la déviation négative de la sonde en porte-à-faux causée par l’adhérence entre la sonde et l’échantillon lors de l’indentation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’AFM a été largement utilisée pour mesurer les changements associés à la maladie dans la rigidité des gros vaisseaux, tels que l’aorte et les artères16. Ces résultats ont permis d’établir le rôle de la mécanobiologie endothéliale dans les complications cardiovasculaires telles que l’athérosclérose17. Sur la base de ces résultats, nous avons commencé à étudier le rôle jusqu’alors non reconnu de la mécanobiologie endothéliale dans le développement des lésions microvasculaires rétiniennes au début de la RD. Le succès de cette poursuite, cependant, repose sur la mesure précise des changements induits par le diabète dans la rigidité capillaire rétinienne. Des études récentes ont révélé que, à l’instar des gros vaisseaux, la rigidité des capillaires rétiniens et de la matrice sous-endothéliale sécrétée par l’EC rétinienne peut également être mesurée directement, avec précision et de manière fiable à l’aide de l’AFM 4,5,6.

Cette approche implique l’isolement des capillaires rétiniens de souris des yeux légèrement fixés à l’aide de la digestion à la trypsine. D’après l’expérience, cette étape de fixation légère est nécessaire car les capillaires isolés des yeux non fixés (par la méthode hypotonique) sont fragiles et se fragmentent, ce qui les rend impropres à la mesure de la rigidité AFM4. À l’inverse, une fixation plus forte et la nécessité d’une digestion extensive de la trypsine, qui a été rapportée dans d’autres protocoles de digestion de la trypsinerétinienne 18, peuvent également compromettre l’intégrité structurelle des capillaires, comme en témoigne la perturbation des jonctions serrées. Ainsi, la fixation capillaire douce et la digestion douce de la trypsine utilisées ici aident à réduire les artefacts de rigidité résultant d’une réticulation excessive induite par le formol et garantissent l’intégrité structurelle des capillaires pour une mesure fiable de la rigidité AFM.

Comme approche alternative, une étude récente a rapporté une mesure de la rigidité AFM des capillaires rétiniens à partir de supports plats rétiniens légèrement fixés19. En effectuant des indentations de force AFM sur les capillaires rétiniens à l’intérieur de la rétine intacte, cette approche permet de mesurer la rigidité in situ . Cependant, ces mesures de rigidité capillaire incluent probablement la rigidité de la membrane limitante interne. De plus, cette approche est limitée à la mesure des capillaires superficiels accessibles sur une monture plate rétinienne, tout en laissant de côté le plexus capillaire plus profond qui est spécifiquement affecté au début de DR20. Ces problèmes peuvent être résolus à l’aide de cette approche, qui extrait les vaisseaux proprement (sans tissu rétinien résiduel) de toutes les couches de la rétine. Nous optimisons actuellement ce protocole pour isoler les vaisseaux choroïdiens à partir de modèles animaux de DMLA précoce. Cela dit, nous nous rendons compte que la légère fixation au formol utilisée dans le protocole peut provoquer un artefact de raidissement associé à la réticulation dans les mesures AFM. Par conséquent, il serait prudent d’interpréter les valeurs de rigidité vasculaire obtenues à l’aide de cette approche davantage en termes de changements relatifs de rigidité (entre différents groupes expérimentaux) que de rigidité absolue.

Contrairement aux capillaires rétiniens qui nécessitent une fixation légère, la matrice sous-endothéliale obtenue à partir de cultures EC rétiniennes peut être évaluée sans aucune modification. Cela est dû en grande partie à la robustesse de la matrice déposée, qui résulte d’une combinaison de plusieurs facteurs, notamment l’ajout d’acide ascorbique dans le milieu de culture (ce qui améliore la synthèse du collagène15), la modification chimique des lamelles de verre qui empêche le détachement de la matrice pendant la décellularisation et la durée prolongée de la culture (10 à 15 jours). Il est important de noter que nous avons montré que l’augmentation de la rigidité de la matrice sous-endothéliale induite par l’hyperglycémie in vitro est cohérente avec l’augmentation de la rigidité capillaire rétinienne induite par le diabète observée in vivo4. Ce n’est pas surprenant car une augmentation de la rigidité matricielle devrait augmenter la rigidité des CE rétiniennes sus-jacentes (en raison de la réciprocité mécanique) qui, ensemble, augmentent la rigidité capillaire globale. En effet, nous avons récemment montré que les CE rétiniennes deviennent plus rigides lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions diabétiques4, probablement via une augmentation de la tension cytosquelettique d’actine dépendante de Rho/ROCK21. Ces résultats impliquent également que le raidissement de la CE choroïdienne observé dans le modèle de singe rhésus de la DMLA précoce reflète la rigidité accrue de la matrice sous-endothéliale choroïdienne et des vaisseaux intacts12, une idée qui est testée dans des études en cours. Dans l’ensemble, le fait que les altérations de la rigidité dans la matrice sous-endothéliale rétinienne non fixée et les CE reflètent la tendance observée dans les vaisseaux rétiniens intacts légèrement fixés témoigne de la validité de l’approche de fixation légère.

La mesure directe de la rigidité des capillaires rétiniens à partir de modèles animaux de RD permet non seulement d’établir la mécanobiologie endothéliale comme une nouvelle cible thérapeutique pour la prise en charge de la RD, mais elle fournit également une justification solide pour développer de nouvelles techniques d’imagerie sensibles pour l’évaluation non invasive de la rigidité capillaire rétinienne chez les patients atteints de RD à l’avenir. De telles techniques non invasives pourraient potentiellement détecter des changements subtils dans le flux sanguin qui devraient résulter d’un raidissement capillaire, similaires aux changements de vitesse de l’onde de pouls artériel qui sont couramment détectés dans les maladies cardiovasculaires induites par le diabète. Les mesures de la rigidité AFM de capillaires rétiniens isolés à partir d’yeux humains post-mortem de donneurs diabétiques fourniront une preuve de concept importante à cet égard. Étant donné que la rigidité capillaire rétinienne augmente tôt dans le modèle murin (streptozotocine) du diabète de type 14, l’utilisation réussie de l’AFM pour valider les modalités d’imagerie de mesure de la rigidité peut conduire à l’identification de la rigidité capillaire rétinienne comme biomarqueur clinique de la pathogenèse précoce de la RD.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la subvention du National Eye Institute/NIH R01EY028242 (à K.G.), le Research to Prevent Blindness/International Retinal Research Foundation Catalyst Award for Innovative Research Approaches for AMD (à K.G.), la subvention spéciale de la Stephen Ryan Initiative for Macular Research (RIMR) de la Fondation W.M. Keck (à l’Institut Doheny Eye), la bourse Ursula Mandel et la bourse de diversité du Conseil des diplômés de l’UCLA (à I.S.T.). Ce travail a également été soutenu par une subvention sans restriction de Research to Prevent Blindness, Inc. au département d’ophtalmologie de l’UCLA. Le contenu de cet article relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22 & micro ; m Filtre à seringue en PVDFMerck MilliporeSLGVM33RSLow Protein Binding Durapore
10X Dulbecco’s Phosphate Saline sans calcium % de magnésiumCorning20-031-CVConcentration finale 1X, pH 7,4
Plaque à 12 puitsFalcon Corning353043
15 mL Tube à centrifugerCorning430791sans Rnase-Dnase, apyrogène
20 mL Seringue Luer-Lok TIPBD302830
Pipette Pasteur jetable en verre borosilicaté de 5 3/4 pouces/non stérileFisherBrand13-678-20A
60x15 mm Plat de culture tissulaireFalcon Corning353002
Plaque à 6 puitsFalcon Corning353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 mL PenScientific Device Laboratory9804-02
Porte-lameX-ACTO
Acier au carbone Lame chirurgicale #10Bard-Parker371110
Cire dentaireMicroscopie électronique Sciences50-949-027
Microscope de dissectionAm-scope
Solution de formol, tamponnée neutre, 10 %Millipore SigmaHT501128-4LConcentration finale 5 % (v/v)
Kimwipes - chiffon d’essuie-glaceKimtech Science34133
Micro spatuleFine Science Tools10089-11
Orbital ShakerLab GeniusSK-O180
PELCO Economy #7 Acier inoxydable 115mm  ; Pince à épilerTed Pella, Inc.5667
Microscope à contraste de phaseNikon TS2
Purifier Logic+ Classe II, Type A2 Armoire de biosécuritéLabconco302380001
Safe-Lock Tubes à centrifuger 2 mLEppendorf22363352
StéréoscopeAmScopeSM-3 Series Zoom Stéréomicroscope trinoculaire 3.5X-90X
Lame de microscopie Superfrost Plus - Languette blanche - Pré-nettoyée - 25x75x1,0 mmFisherBrand1255015
Tris Buffer, solution 0,1M, pH 7,4 - Biotechnologie GradeVWRE553-500MLpH 8 pour solution de trypsine
Trypsine 1:250 poudre Tissue Culture GradeVWRVWRV0458-25G10 % (p/v) trypsine solution
Biologie moléculaire EauCorning46-000-CM
Matrice sous-endothéliale
10X PBSCorning20-031-CV
1X PBS avec calcium et magnésiumThermo Fisher Scientific14040-117pH 7,4
Hydroxyde d’ammoniumSigma-Aldrich338818
Acide ascorbiqueSigma-AldrichA4034
Collagène IV anticorpsNovus BiologicalsNBP1-26549
DNase IQiagen79254
ÉthanolamineSigma-Aldrich398136
Anticorps contre la fibronectineSigma-AldrichF6140
FluoromountInvitrogen-Thermo Fisher Scientific00-4958-02
GélatineSigma-AldrichG1890
Lamelles en verre (12mm)Fisher12-541-000
Microscopie électronique au glutaraldéhydeSciences16220
Cellules endothéliales rétiniennes humaines (HREC)Cell Systems CorpACBRI 181
MCDB131 moyenCorning15-100-CV
Cellules endothéliales rétiniennes de souris (mREC)Produits biologiques cellulairesC57-6065
Triton X-100Thermo Fisher Scientific  ; BP151-100
TrypsineGibco-Thermo Fisher Scientific25200-056
AFM Measurement
1 & micro ; sonde mBrukerSAA-SPH-1UMUne sonde hémisphérique de 19 microns de hauteur avec rayon d’extrémité de 1
micron, constante de ressort 0,25N/m
sonde LC de 70 nmBrukerPFQNM-LC-V2Une sonde hémisphérique de 19 microns de hauteur avec rayon d’extrémité de 70 nm,
  ; Constante de ressort 0,1 N/m
  ; appareil photoFamille XCAMToupcam1080P HDMI
Ordinateur de bureau pour faire fonctionner l’appareil photoAsusAsus DesktopIntel i5-6600 CPU, 8GB RAM
Support de parabole pour lamelleCellvisD29-14-1.5-N29mm plat à fond en verre avec
  ; Micro-puits de 14 mm
Nanowizard 4BrukerNanowizard 4Microscope à force atomique Bioscience monté sur un microscope optique pour la mesure sensible des propriétés mécanostructurelles (rigidité et topographie) d’échantillons biologiques mous
Microscope à contraste de phaseZeissAxiovert 200Microscope inversé avec objectif 10X

Références

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