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Article de recherche

Aperçu mécaniste de la protection mitochondriale du salidroside via la voie AMPK/Sirt1/HIF-1α dans les cellules hypoxiques HT22

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DOI :

10.3791/66923

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25 avril 2025

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1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Research Service Office, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan

Dans cet article

Résumé

La présente étude a identifié un mécanisme unique par lequel le salidroside exerce des effets protecteurs mitochondriaux sur les cellules hypoxiques HT22, en partie par la voie AMPK/Sirt1/HIF-1α.

Résumé

On a constaté que le salidroside (Sal), un ingrédient actif de Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba, exerce des effets protecteurs mitochondriaux en améliorant le métabolisme et en augmentant l’apport énergétique des cellules cérébrales dans des conditions hypoxiques. Cependant, son mécanisme d’action n’a pas été entièrement clarifié. Dans la présente étude, la chromatographie liquide à haute performance a d’abord été utilisée pour analyser les effets du Sal sur les niveaux de nucléotides (ATP, ADP et AMP). Le test CETSA (Cellular Thermal Shift Assay), une méthode d’interaction moléculaire largement utilisée pour valider et quantifier l’engagement des cibles médicamenteuses dans les cellules et les tissus de différentes espèces, a ensuite été choisi pour confirmer l’affinité de Sal pour les protéines liées à la voie AMPK/Sirt1/HIF-1α. Les résultats ont révélé que Sal augmentait les niveaux d’ATP et d’ADP dans les cellules hypoxiques HT22 tout en réduisant les niveaux d’AMP. De plus, Sal a montré une liaison stable aux protéines AMPKα, p-AMPKα, Sirt1 et HIF-1α. En conclusion, Sal peut exercer des effets protecteurs mitochondriaux en modulant la voie AMPK/Sirt1/HIF-1α pour réguler le contenu nucléotidique. Cette étude fournit une référence méthodologique pour l’analyse du contenu nucléotidique dans des échantillons cellulaires et contribue à l’identification et à la découverte de cibles pour des composés issus de la médecine traditionnelle chinoise.

Introduction

Le cerveau est très sensible à l’oxygène en raison de ses exigences métaboliques élevées, de sa capacité glycolytique limitée et de sa dépendance à la phosphorylation oxydative. Par conséquent, l’exposition à un environnement pauvre en oxygène à haute altitude peut facilement entraîner des lésions cérébrales hypobares et hypoxiques (HHBI)1,2. Des études épidémiologiques indiquent que lorsque des individus non acclimatés à la haute altitude montent rapidement vers des régions de haute altitude, l’incidence du mal aigu des montagnes peut atteindre jusqu’à 75 %, avec un taux de mortalité d’environ 1 % pour les cas graves. De plus, en l’absence de soins médicaux, les taux de mortalité par œdème cérébral ou pulmonaire de haute altitude peuvent atteindre 40 %3,4.

L’HHBI se manifeste par un large éventail de symptômes cliniques. Les cas légers à modérés peuvent inclure des maux de tête, des étourdissements et des pertes de mémoire5, tandis que les cas graves peuvent entraîner des troubles cognitifs, une altération de la conscience et des issues potentiellement mortelles5. La prévention et le traitement de l’HHBI dans les régions d’altitude sont devenus un axe clé de la recherche médicale. Les stratégies préventives impliquent principalement un entraînement adaptatif dans des environnements de haute altitude, y compris un repos adéquat, une alimentation équilibrée, une bonne nutrition et un exercice physique approprié 6,7. De plus, les interventions pharmacologiques visant à protéger les cellules cérébrales et à soulager l’hypoxie cérébrale restent au cœur de la recherche actuelle sur les HHBI.

Les mitochondries servent de centres de production d’énergie primaire dans les cellules, synthétisant l’adénosine triphosphate (ATP) pour répondre aux demandes d’énergie cellulaire. Dans des conditions hypoxiques, la production d’énergie mitochondriale diminue, ce qui entraîne une réduction des niveaux d’ATP et une altération de la fonction cellulaire8. La lésion hypoxique perturbe également la régulation mitochondriale de Ca2+ et l’homéostasie du pH, déclenchant l’apoptose et la nécrose 9,10. Il existe une relation de renforcement mutuel entre le dysfonctionnement mitochondrial et les lésions cérébrales hypoxiques. D’une part, l’insuffisance mitochondriale induite par l’hypoxie exacerbe le manque d’oxygène en réduisant davantage le métabolisme énergétique cellulaire, créant ainsi un cercle vicieux. D’autre part, le dysfonctionnement mitochondrial élève les niveaux intracellulaires de Ca2+, activant les cascades apoptotiques et conduisant à la mort cellulaire11. Bien que les mécanismes sous-jacents aux lésions cérébrales hypoxiques restent complexes et ne soient pas entièrement compris, de nombreuses études ont identifié une altération du métabolisme énergétique mitochondrial neuronal comme un facteur critique de sa pathogenèse12,13. Par conséquent, une exploration plus approfondie de la fonction mitochondriale pourrait fournir des informations précieuses sur les cibles thérapeutiques potentielles des lésions cérébrales hypoxiques.

Le salidroside (Sal) est un ingrédient actif extrait de la plante de plateau Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba et est largement utilisé dans les produits alimentaires, de santé et pharmaceutiques14. La formule moléculaire de Sal est C14H20O7, et il est également connu sous le nom de 2-(4-hydroxyphényl)-éthyle β-D-glucopyranoside. Il possède diverses propriétés pharmacologiques, notamment des effets protecteurs anti-hypoxie, antioxydants, anti-fatigue, antitumoraux, immunomodulateurs, anti-inflammatoires et cardiovasculaires et cérébrovasculaires 15,16,17. Parmi ceux-ci, son effet anti-hypoxie est l’un des plus documentés. Des études récentes ont de plus en plus mis en évidence les effets protecteurs mitochondriaux significatifs de Sal en tant que mécanisme potentiel de ses effets préventifs et thérapeutiques sur les lésions cérébrales induites par le plateau chez la souris14,18. Cependant, les mécanismes moléculaires précis par lesquels Sal influence les niveaux d’ATP, d’ADP et d’AMP restent mal compris.

La protéine kinase activée par l’AMP (AMPK) agit comme un capteur d’énergie clé qui aide à maintenir l’homéostasie de l’énergie cellulaire. L’activation de l’AMPK stimule la sirtuine 1 (Sirt1), entraînant une augmentation des niveaux intracellulaires de NAD+ 19. Des études ont montré que Sirt1 peut réguler le facteur 1-alpha inductible par l’hypoxie (HIF-1α) pour coordonner la réponse cellulaire à l’hypoxie20. Des recherches antérieures ont démontré que Sal inhibe l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale neuronale, régule les processus énergétiques mitochondriaux médiés par HIF-1α, atténue l’apoptose neuronale et maintient l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique, protégeant ainsi les rats contre les lésions cérébrales induites par le plateau14,21. Cependant, l’effet de Sal sur l’ATP et ses métabolites, l’ADP et l’AMP, reste incertain.

Pour étudier cela, la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) a d’abord été utilisée pour quantifier les niveaux de ces trois nucléotides. De plus, le test de décalage thermique cellulaire (CETSA), une technique biophysique largement utilisée introduite en 2013 pour étudier les interactions ligand-protéine dans les cellules intactes22, a été utilisé. Cette méthode est couramment appliquée pour valider et quantifier l’engagement médicament-cible dans les cellules et les tissus de différentes espèces. Plus précisément, après avoir co-incubé des lysats de cellules cibles avec le médicament à des températures variables pendant une durée déterminée, la protéine liée au médicament présente une stabilité thermique accrue, ce qui la rend moins sujette à la dénaturation et à la précipitation. Les protéines non liées précipitées sont ensuite éliminées par centrifugation, et les interactions médicament-cible sont ensuite identifiées par l’analyse par transfert Western du surnageant22. Afin d’identifier des cibles moléculaires potentielles de Sal, CETSA a été sélectionné pour évaluer son affinité de liaison avec les protéines liées à la voie AMPK/Sirt1/HIF-1α.

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Protocole

Les détails commerciaux des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont fournis dans la table des matériaux.

1. Préparation de la solution

  1. Préparez le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complet en ajoutant 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine.
  2. Préparez une solution de 20 mM de Sal en dissolvant 3 mg de Sal dans 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)21.
  3. Filtrer 500 mL d’acétonitrile pur par chromatographie (phase A mobile) à l’aide d’une membrane organique de 0,45 μm.
  4. Préparez 1000 mL de phase B mobile en ajoutant 3,5 mL de réactif I à 1 L d’eau déminéralisée. Ajustez le pH à 6,15 avec le réactif II, en suivant les instructions du kit de dosage de la teneur en nucléotides (ATP, ADP et AMP) (voir la table des matériaux).
    REMARQUE : Les réactifs I et II sont inclus dans le kit de dosage de la teneur en nucléotides (ATP, ADP et AMP).
  5. Filtrer la phase B mobile à l’aide d’une membrane aqueuse de 0,22 μm.
    REMARQUE : La phase mobile B doit être utilisée immédiatement après la préparation. Les phases mobiles A et B doivent être soniquées pendant 30 minutes avant utilisation pour éliminer les bulles d’air.
  6. Diluer une solution mère étalon de 1 μM ATP, ADP et AMP avec de l’eau désionisée pour obtenir des solutions étalons des séries ATP, ADP et AMP de 0,5 μM, 0,1 μM, 0,05 μM, 0,01 μM et 0,005 μM.
  7. Filtrez la série de solutions standard à l’aide d’une membrane filtrante microporeuse de type aiguille de 0,22 μm.
    REMARQUE : Des flacons d’injection bruns doivent être utilisés pour stocker les solutions étalons en série. La série préparée de solutions standard doit être utilisée dès que possible.

2. Culture cellulaire

REMARQUE : La culture cellulaire HT22 et le modèle d’hypoxie stimulée par le CoCl2 ont été établis selon un rapport précédent21.

  1. Cultivez des cellules HT22 à 37 °C avec 5 % de CO2 jusqu’à ce que 80 % de confluence soit atteinte dans la boîte de Pétri. Digérer les cellules avec de la trypsine à 0,25 % pendant 1 min.
  2. Ensemencez 2 × 10cellules de 5 cellules de l’étape 2.1 dans des plaques à 6 puits avec du DMEM complet (groupe témoin sans traitement médicamenteux) ou du DMEM complet contenant le médicament (250 μM CoCl2, 250 μM CoCl2 + 10 μM Dor, 250 μM CoCl2 + 20 μM Sal et 250 μM CoCl2 + 10 μM Dor + 20 μM Sal). Incuber pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO2.
    REMARQUE : Trois échantillons parallèles ont été mis en place dans chaque groupe.

3. Dosage de la teneur en nucléotides (ATP, ADP et AMP)

  1. Ajouter 1 mL de réactif d’extraction I dans chaque puits des plaques à 6 puits de l’étape 2.2.
    REMARQUE : Le réactif d’extraction I est inclus dans le kit de dosage de la teneur en nucléotides (ATP, ADP et AMP) (voir la table des matériaux).
  2. Lyser les cellules par soniquation sur un bain de glace à l’aide d’un appareil de perturbation de cellule à ultrasons (puissance : 300 W, ondes ultrasonores pendant 3 s, intervalle de 7 s, durée totale : 3 min).
  3. Centrifuger les cellules lysées à 10 304 × g pendant 10 min à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse.
  4. Transvaser 0,75 mL de surnageant de l’étape 3.3 dans un tube de 2,0 mL. Ajouter 0,75 mL de réactif d’extraction II, agiter et mélanger à l’aide d’un mélangeur vortex, puis centrifuger à nouveau à 10 304 × g pendant 10 min à 4 °C.
    REMARQUE : Le réactif d’extraction II est inclus dans le kit de dosage de la teneur en nucléotides (ATP, ADP et AMP).
  5. Pipeter le surnageant à partir de l’étape 3.4 et le filtrer à l’aide d’une membrane filtrante microporeuse de type aiguille de 0,22 μm dans un flacon brun.
    REMARQUE : L’ATP, L’ADP et l’AMP dans l’échantillon extrait ne sont pas stables. Toutes les procédures expérimentales doivent être effectuées à basse température ou sur de la glace. Les échantillons doivent être traités et analysés dès que possible.
  6. Ouvrez le logiciel de chromatographie et réglez les paramètres suivants : volume d’injection : 10 μL ; température de la colonne : 27 °C ; débit : 0,8 mL/min ; longueur d’onde de détection : 254 nm ; Durée de détection : 70 min. Réglez la procédure d’élution du gradient conformément au tableau 1.
  7. Cliquez sur le bouton Exécuter pour injecter automatiquement l’échantillon et détecter le contenu de l’ATP, de l’ADP et de l’AMP dans les solutions standard en série (étape 1.7) et les solutions d’échantillon (étape 3.5) conformément au programme défini à l’étape 3.6.
    REMARQUE : À la fin de l’expérience, laver la colonne chromatographique avec 98 % de phase B mobile pour éviter le colmatage.
  8. Tracez les courbes standard de l’ATP, de l’ADP et de l’AMP à l’aide d’un logiciel de graphique et d’analyse statistique, avec des concentrations standard en série sur l’axe des x et des zones de pics sur l’axe des y.
  9. Calculez la teneur en ATP, en ADP et en AMP dans les échantillons à l’aide de l’équation de la courbe standard de l’étape 3.8.

4. Essai de décalage thermique cellulaire (CETSA)

  1. Lyser des cellules HT22 normales pendant 20 minutes dans une boîte de Pétri à l’aide d’un lysat contenant un inhibiteur de protéase (lysat : inhibiteur de protéase = 100:1) en pipetant les cellules à plusieurs reprises.
    REMARQUE : Effectuez cette étape sur un bain de glace pour éviter la dégradation des protéines.
  2. Prélever le lysat cellulaire à partir de l’étape 4.1 et le sonicate dans un bain de glace à l’aide d’un appareil de rupture cellulaire à ultrasons (puissance : 300 W, ondes ultrasonores pendant 3 s, intervalle de 7 s, temps total : 3 min). Centrifuger à 10 304 × g, 4 °C pendant 20 min et recueillir le surnageant.
    REMARQUE : Divisez le surnageant en 14 portions : 7 groupes pour la coïncidation avec Sal et 7 groupes pour la coïncidation avec PBS comme contrôle. Pour le groupe traité au Sal, ajouter 100 μL de surnageant et 0,1 μL de 20 μM de Sal par échantillon. Pour le groupe témoin, ajouter 100 μL de surnageant et 0,1 μL de PBS par échantillon.
  3. Incuber chaque échantillon à température ambiante pendant 30 min, puis incuber à 37 °C, 42 °C, 47 °C, 52 °C, 57 °C, 62 °C et 67 °C pendant 3 min à l’aide d’un appareil de contrôle de la température de chauffage en métal.
  4. Centrifuger les échantillons de l’étape 4.3 à 10 304 × g pendant 20 min à 4 °C et prélever le surnageant à l’aide d’une pipette.
  5. Mesurer la concentration totale en protéines du surnageant à partir de l’étape 4.4 à l’aide d’une trousse de dosage de la concentration en protéines BCA, en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matières).
  6. Préparez le gel de séparation à 10 % à l’aide d’un kit de préparation rapide de gel PAGE, en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
  7. Chargez 3 μL de marqueur de protéine de couleur pré-coloré et 14 μL d’échantillons dans les puits du gel de séparation (quantité finale de protéines par puits : 20 μg).
  8. Faites fonctionner le gel à l’aide d’un tampon d’électrophorèse pendant 1 h à 80-100 mV pour obtenir des protéines séparées.
  9. Transférez les protéines de l’étape 4.8 sur une membrane PVDF à l’aide d’une solution de transfert membranaire rapide et d’une structure sandwich (coton-papier filtre-membrane PVDF-gel protéique-papier filtre-coton) à 400 mA pendant 30 min.
  10. Bloquez les membranes PVDF à partir de l’étape 4.9 avec une solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % pendant 1 à 2 h à température ambiante.
    REMARQUE : Préparez une solution de BSA à 5 % en dissolvant 5 mg de poudre de BSA dans 100 mL de solution de TBST contenant 100 mL de tampon TBS et 0,05 % de Tween 20.
  11. Incuber les membranes PVDF à partir de l’étape 4.10 avec 5 mL d’anticorps primaire dilué à 4 °C pendant la nuit.
    REMARQUE : Diluer l’anticorps primaire dans une solution de BSA (rapport 1:1000).
  12. Lavez les membranes PVDF trois fois avec du TBST pendant 5 minutes chacune pour éliminer les anticorps primaires non liés.
  13. Incuber les membranes à partir de l’étape 4.12 avec un anticorps secondaire couplé à la peroxydase de raifort dilué (HRP) pendant 2 h à température ambiante sur un agitateur de décoloration.
    REMARQUE : Diluer l’anticorps secondaire couplé à la HRP dans une solution de BSA (rapport 1:10 000).
  14. Lavez les membranes trois fois avec du TBST pendant 5 minutes chacune pour éliminer les anticorps secondaires résiduels.
  15. Couvrez les membranes à partir de l’étape 4.14 avec un révélateur de chimiluminescence ECL, puis imagez le signal de la protéine cible à l’aide d’un système d’imagerie.
    REMARQUE : Effectuez cette étape dans l’obscurité pour éviter l’extinction de la fluorescence.
  16. Analysez et quantifiez la valeur de gris des protéines cibles à l’aide du logiciel ImageJ (voir T able des matériaux).

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Résultats

Les courbes standard pour l’ATP, l’ADP et l’AMP détectées par HPLC étaient Y = 7006,5X - 222,99, Y = 5217,3X - 17,796 et Y = 9280,1X + 22,749, respectivement (Figure 1A-C). Les teneurs en nucléotides mesurées dans chaque groupe par HPLC ont été calculées à l’aide des courbes standard (Figure 1D-I). Il a été constaté que le CoCl2 réduisait significativement les niveaux d’ATP et d’ADP d...

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Discussion

Les mitochondries sont des organites clés impliqués dans la prévention thérapeutique de l’HHBI 23,24,25. Des études antérieures du groupe ont confirmé que Sal régule l’expression des protéines AMPK, Sirt1 et HIF-1α, améliorant ainsi la fonction mitochondriale neuronale et protégeant contre HHBI21,24. Cependant, l’effet direct de Sal sur ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82274207 et 82474185), le Département des sciences et de la technologie de la province du Sichuan (2024NSFSC1845), la Fondation scientifique pour les jeunes du Département des sciences et de la technologie de la province du Sichuan (2023NSFSC1776), le Programme clé de recherche et de développement du Ningxia (2023BEG02012), le Projet de soutien aux jeunes talents de l’Association chinoise de médecine chinoise pour 2024-2026 (2024-QNRC2-B07) et le Xinglin Scholar Research Projet de promotion de l’Université de Chengdu de MTC (XKTD2022013 et QJJJ2024027).

CONTRIBUTION DE L’AUTEUR :
Ce projet est conçu par Xiaobo Wang, Yating Zhang, Ya Hou, Rui Li et Xianli Meng. Yating Zhang, Ya Hou et Tingting Kuang ont réalisé les expériences et analysé les données. Yating Zhang et Hong Jiang ont écrit le manuscrit. Xiaobo Wang et Xianli Meng ont révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AcétonitrileAladdinA104440
0,22 & micro ; m membrane aqueuseJintengJTMF0445
0,22 & micro ; membrane filtrante microporeuse de type aiguilleJintengJTSFM013001
0,45 & micro ; membrane organiqueJintengJTMF0448
logiciel Agilent OpenLab  ;   ;AgilentVersion 2.X
Anticorps-AMPK&alpha ;Technologie de signalisation cellulaire#2532
Anticorps-HIF-1&alpha ;Technologie de signalisation cellulaire#41560
Anticorps-p-AMPK&alpha ;Technologie de signalisation cellulaire#50081
de signalisation cellulaireAntibody-Sirt1#2028
de signalisation cellulaireanticorps-&bêta ;-actine#4970
Kit de dosage de concentration en protéines BCABoster Biological Technology17E17B46
Albumine sérique bovineCywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW127-02
Inhibiteur de la phosphatase à large spectre (100× ;)Boster Biological TechnologyAR1183
Colonne chromatographiqueAgilentSB-C18
CoCl2Sigma15862
Agitateur de décolorationKylin-BellTS-2
DorsomorphinMedChemExpress (MCE)HY-13418A
Aigle modifié de Dulbecco moyenGibco8121587
Tampon d’électrophorèseNCM Biotech 20230801
Sérum fœtal bovinGibco2166090RP
Chèvre Anti-lapin IgG H& L (TRITC)ZenBioScience Co., Ltd.
Logiciel GraphPad Prism LogicielGraphPad, LLCVersion 9.0.0
Chromatographie liquide haute performanceAgilent1260 Infinity II Prime  ;
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesseThermo Fisher ScientificLegend Micro 17R
HRP conjuguée affinipure chèvre anti-lapin IgG(H+L)Boster Biological Technology Co., Ltd.BA1054
HT22 cellulesGuangzhou Jennio Biotech Co., Ltd.JNO-02001
Kit de chimiluminescence ECL hypersensibleNCM BiotechP10300
Image J softwareNational Institutes of Healthv1.8.0
Instrument de contrôle de la température de chauffage en métalBaiwan Electronictechnology Co., Ltd.HG221-X3
M116118méthanolAladdin
(ATP, ADP et AMP)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.BC5114
PAGE kit de préparation rapide de gelBiosharpPL566B-5
Pénicilline-streptomycineNCM BiotechC125C5
Solution saline tamponnée au phosphate (1× ;)Gibco8120485
Marqueur protéique de couleur pré-coloré (10-180 kDa)Cywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW176-02
Tampon de charge protéique (5x)Boster Biological TechnologyAR1112
PVDF (0,45 &mu ; m)Cywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW120-01
Solution de transfert membranaire rapideCywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW171-02
Lysat RIPABoster Biological Technology Co., Ltd.AR0105
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., Ltd.RFS-H0400191102
Tampon TBSNCM Biotech23HA0102
Tampon transmembranaireNCM Biotech23CA2000
Trypsine (0.25 %, 1× ;)HyCloneJ210045
Tween 20Shanghai Canspec Scientific Instruments Co., Ltd.
Appareil de perturbation cellulaire à ultrasonsNingbo Xinyi équipement à ultrasons Co., Ltd.JY92-IIDN
Système d’imagerie VisionworksAnalytik JenaUVP ChemStudio
Mélangeur vortexKylin-BellXW-80A
Technologie Technologie 511202 Kit de dosage de la teneur en nucléotides dePM12012

Références

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