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Article de méthode

Génération et caractérisation d’organoïdes utérins de rat à partir de cellules souches épithéliales de l’endomètre de rat

1.5K vues

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DOI :

10.3791/66928

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2 août 2024

 ,  ,  ,  , 
1Meizhou Clinical Institute of Shantou University Medical College, 2Department of Pathology, Meizhou People's Hospital, 3Guangdong Engineering Technological Research Center of Clinical Molecular Diagnosis and Antibody Drugs, Meizhou Academy of Medical Sciences, Meizhou People's Hospital

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour isoler et cultiver des cellules souches épithéliales épithéliales de l’endomètre de rat (reESC), générant des organoïdes de l’endomètre du rat. Cette méthode facilite les études in vitro des maladies de l’endomètre, permettant l’édition de gènes et d’autres manipulations cellulaires.

Résumé

Les organoïdes de l’endomètre offrent des informations précieuses sur le développement et la physiopathologie des maladies de l’endomètre et servent de plateformes pour les tests de médicaments. Bien que des organoïdes endométriaux humains et murins aient été développés, la recherche sur les organoïdes endométriaux de rat reste limitée. Étant donné que les rats peuvent mieux simuler certaines pathologies de l’endomètre, telles que les adhérences intra-utérines, cette étude visait à établir des organoïdes de l’endomètre du rat. Nous présentons un protocole détaillé pour l’isolement et la culture de cellules souches épithéliales épithéliales de l’endomètre du rat (reESC) et la génération d’organoïdes de l’endomètre du rat. À l’aide d’un milieu d’expansion reESC affiné, nous avons réussi à isoler et à étendre de manière stable les reESC, démontrant ainsi leur potentiel de culture à long terme. Les organoïdes générés par reESC présentaient des caractéristiques structurelles et fonctionnelles typiques de l’endomètre, y compris la réactivité hormonale. Nos résultats ont montré que les organoïdes de l’endomètre du rat pouvaient être cultivés à long terme avec une prolifération stable, en maintenant la structure glandulaire, la polarité cellulaire et les caractéristiques fonctionnelles de l’épithélium de l’endomètre. Ce nouveau modèle d’organoïde de l’endomètre dérivé d’un rat fournit une plate-forme précieuse pour étudier les maladies de l’endomètre et tester des interventions thérapeutiques, avec des applications potentielles sur diverses espèces de mammifères.

Introduction

L’endomètre, un tissu polyvalent et régénérateur du corps humain, subit une chute, une régénération et une différenciation périodiques sous l’influence des hormones ovariennes1. Les anomalies de l’endomètre sont liées à diverses maladies du système reproducteur féminin, telles que l’endométriose, le cancer de l’endomètre et l’infertilité2. Le manque de modèles de recherche fiables pour l’endomètre entrave les études approfondies de la pathogenèse, le diagnostic clinique et le traitement de ces maladies. Bien que les lignées cellulaires et les modèles animaux soient couramment utilisés pour la recherche sur l’endomètre, des défis tels que l’instabilité phénotypique des lignées cellulaires, les différences interespèces dans les modèles animaux et d’autres limitations rendent difficile la reproduction de la structure physiologique complexe et des changements fonctionnels dynamiques de l’endomètrehumain 3.

Les organoïdes sont des structures tridimensionnelles formées par la culture de cellules souches dans un environnement extracellulaire, possédant des capacités d’auto-renouvellement et d’auto-organisation. Ils peuvent imiter la structure et la fonction des tissus physiologiques et pathologiques et sont reconnus comme des modèles précliniques de maladies humaines4. En 2017, la construction réussie d’organoïdes endométriaux de souris et d’humains a été obtenue en intégrant du tissu endométrial libre fragmenté obtenu par digestion enzymatique dans un échafaudage de matrice extracellulaire, suivi de l’ajout d’un mélange de facteurs de croissance spécifiques et de facteurs de signalisation pour la culture5. Les résultats ont démontré que les organoïdes endométriaux ex vivo présentent une capacité de prolifération stable et à long terme, maintenant la structure glandulaire, la polarité cellulaire et les caractéristiques fonctionnelles de l’épithélium endométrial, y compris la sécrétion de mucus et la réponse hormonale6. Cependant, la culture ex vivo de cellules souches adultes formant les organoïdes de l’endomètre nécessite un soutien structurel semblable à celui d’une glande, ce qui entraîne des défis tels que la perte de souche et des difficultés de passage7.

Actuellement, la culture des organoïdes de l’endomètre repose sur la méthode de culture par digestion par blocs tissulaires. Dans une étude précédente, notre équipe de recherche a cultivé des cellules souches épithéliales de l’endomètre humain pendant une période prolongée in vitro en utilisant un milieu de culture primaire principalement composé de Y27632, que nous avons utilisé pour construire des organoïdes de l’endomètre8. Forts de ce succès, nous avons isolé et cultivé des cellules souches épithéliales de l’endomètre à partir de tissu endométrial de rat à l’aide d’un milieu de culture composé de petites molécules, établissant ainsi un système de culture in vitro à long terme. De plus, nous avons utilisé des cellules souches épithéliales épithéliales de l’endomètre de rat (reESC) pour générer des organoïdes de l’endomètre de rat. Le développement de ce modèle améliorera les futures études in vitro et in vivo des maladies liées à l’endomètre en conjonction avec des modèles de rats.

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Protocole

Six rats Sprague-Dawley femelles âgés de 7/8 semaines pesant de 200 à 250 g ont été utilisés dans ce travail. Les rats ont été logés dans une animalerie climatisée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Toutes les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été menées dans le respect des directives institutionnelles pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le comité d’examen institutionnel des expériences sur les animaux du comité d’éthique de la recherche de l’hôpital populaire de Meizhou.

La section suivante décrit le processus d’isolement, de passage, de congélation et de décongélation des cellules souches épithéliales épithéliales de l’endomètre de rat à l’aide d’un milieu d’expansion reESCs raffiné (REEM) composé principalement de Y27632, A8301 et CHIR990217 8,9. La formulation REEM est basée sur du DMEM/F12 sans sérum enrichi de concentrations spécifiques de composants clés : 10 μM Y27632, 3 μM CHIR99021 et 0,5 μM A8301. Vous trouverez des détails complets concernant les composants dans le tableau des matériaux. Une fois que les rats ont été anesthésiés par inhalation d’isoflurane, les procédures ultérieures décrites à la figure 1 doivent être mises en œuvre.

1. Intervention chirurgicale

  1. Anesthésier le rat par inhalation d’isoflurane.
    1. Placez les rats dans une chambre d’induction remplie de 3 à 5 % d’isoflurane mélangé à de l’oxygène. Confirmer la bonne anesthésie par l’absence de réponse à un pincement de l’orteil et la perte du réflexe de redressement.
    2. Une fois anesthésiés, maintenez les rats sous 1 à 3 % d’isoflurane via un cône nasal pendant la procédure. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant que le rat est sous anesthésie.
  2. Faites une incision abdominale basse pour exposer les cornes de l’utérus.
    REMARQUE : Tous les instruments chirurgicaux doivent être stérilisés avant utilisation. La zone chirurgicale du rat est rasée et désinfectée avec une solution antiseptique. Le chirurgien porte des gants stériles, un masque et une blouse. L’intervention chirurgicale est réalisée sur un champ stérile.
  3. Effectuez des incisions longitudinales des deux côtés de l’utérus pour exposer l’endomètre interne. À l’aide d’une lame de scalpel T10, grattez l’endomètre jusqu’à ce que la surface soit rugueuse.
  4. Après l’intervention chirurgicale, transférez les rats dans une zone de récupération stérile et chaude avec des niveaux de température et d’humidité régulés et surveillez-les de près jusqu’à ce qu’ils retrouvent leur pleine conscience et puissent se soutenir en position couchée sternale. Hébergez des groupes de trois rats postopératoires séparément dans des cages séparées. Pour soulager la douleur postopératoire, administrez des analgésiques comme la buprénorphine (0,05-0,1 mg/kg, par voie sous-cutanée) ; Répétez l’opération toutes les 8 à 12 h jusqu’à 48 à 72 h au besoin.

2. Traitement des tissus

  1. Placez tous les fragments d’endomètre utérin dans un plat de 3,5 cm et lavez-les 3 fois avec du PBS.
  2. Mélanger les fragments d’endomètre utérin avec 3 ml de collagénase à 1 % de type I (diluée dans de la trypsine à 0,25 % / 1 mM d’EDTA) à 37 °C pendant 60 min. Filtrer le tissu non digéré à l’aide d’une passoire cellulaire de 100 μm pour isoler et recueillir le filtrat en vue d’une culture ultérieure.
  3. Ensemencez les cellules collectées dans des plaques à 12 puits dans un milieu REEM pour une culture ultérieure. Calculez le volume de la suspension cellulaire nécessaire pour ensemencer les cellules dans chaque puits de la plaque à 12 puits afin d’obtenir la densité cellulaire souhaitée (généralement ~1-2 × 105 cellules/puits dans 1,5 mL de REEM).
  4. Lavez les cellules collectées à l’étape 2.2 pendant 3 fois avec du PBS. Après le lavage initial, centrifugez les cellules à 300 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant ; remettre en suspension la pastille cellulaire dans du PBS contenant 1 % de BSA (albumine sérique bovine) pour minimiser la liaison non spécifique et incuber pendant 15 à 30 minutes sur de la glace.
  5. Incuber les cellules avec des anticorps primaires spécifiques à différents marqueurs (voir le Tableau des matières) pendant 30 min à 1 h à 4 °C. Diluez les anticorps dans du PBS avec 1 % de BSA selon les instructions du fabricant.
  6. Après l’incubation, lavez les cellules 2x avec du PBS pour éliminer tous les anticorps non liés. Après le lavage final, remettre les cellules en suspension dans 600 μL de PBS avec 1 % BSA pour l’analyse par cytométrie en flux.
  7. Configurer l’instrument avec des lasers et des filtres adaptés aux fluorophores utilisés dans l’expérience (p. ex., FITC, PE, APC). Utilisez les paramètres de diffusion directe (FSC) et de diffusion latérale (SSC) pour cibler la population de cellules uniques en direct, à l’exclusion des débris et des agrégats de cellules. Calibrez le cytomètre en flux à l’aide d’une commande non colorée pour assurer un bon alignement. Définissez des seuils spécifiques basés sur le contrôle non coloré pour définir des populations positives pour chaque marqueur d’intérêt (le seuil est de 0,02 %).

3. Culture à long terme de cellules souches épithéliales épithéliales de l’endomètre de rat

  1. Essai de formation de colonies
    REMARQUE : Cet essai a permis de déterminer le milieu de culture optimal pour les CSE.
    1. Implantez les cellules souches réactives P0 dans des plaques à 6 puits à une densité de 1 000 cellules/puits et cultivez-les pendant 14 jours dans des REEM ou des REEM dépourvus d’A8301, de Y27632 ou de CHIR99021.
    2. Après la période de culture, fixez les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 minutes à température ambiante, puis colorez-les avec une solution de violet cristallin pendant encore 20 minutes.
    3. Quantifiez le nombre d’amas de cellules contenant plus de 50 cellules. Sélectionnez le milieu de culture en fonction du milieu qui favorise la croissance des amas de cellules.
      REMARQUE : L’omission de facteurs spécifiques dans le REEM a entraîné une diminution de la capacité de prolifération des REECs (figures 1B et C). Sur la base de ces résultats, REEM a été sélectionné comme milieu privilégié pour la culture des reESC afin d’optimiser les conditions de culture.
  2. Changez le REEM tous les 2 jours. Lorsque les cellules atteignent 80-90 % de confluence, digérez-les avec 0,25 % de trypsine/1 mM d’EDTA pendant 5-6 min.
  3. Passage des cellules dans un rapport de 1:3 dans REEM.
  4. Essai de prolifération
    1. Ensemencez les reESC P1, P7 et P14 dans des plaques de 96 puits à une densité de 4 × 103 cellules/puits dans 150 μL de REEM.
    2. Ajouter 10 μL de réactif CCK-8 dans chaque puits après 24, 48, 72 et 96 h de culture, suivi d’une incubation de 2 h à 37 °C.
    3. Déterminer le taux de prolifération en mesurant l’absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
  5. Préparation et utilisation des bouillons congelés
    1. Préparez la solution mère congelée à l’aide de REEM avec 10 % de DMSO.
    2. Récoltez les reESC avec 0,25 % de trypsine / 1 mM d’EDTA.
    3. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans une solution mère congelée à une concentration de 1 × 106 cellules/mL. Transférez la suspension cellulaire dans des tubes.
    4. Congelez d’abord les tubes à -80 °C, puis transférez-les dans de l’azote liquide dans les 24 heures.
      REMARQUE : Si vous avez l’intention de décongeler les cellules bientôt, il est recommandé de conserver les cellules congelées à -80 °C pendant une durée maximale de 6 mois.
    5. Préchauffez le REEM à 37 °C.
    6. Récupérez les reESC congelés et plongez-les dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 à 2 min.
    7. Transférez les reESC décongelés dans des plaques à 6 puits avec une densité d’ensemencement de 1 × 105 cellules/puits dans du REEM.
  6. Coloration par immunofluorescence
    1. Semez les reESC dans la phase de croissance logarithmique sur des plaques U-Slide à 8 puits à une densité de 2 × 103 cellules par puits, et cultivez-les dans REEM.
    2. Lorsque les reESC atteignent 90 % de confluence, fixez-les avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 20 min. Lavez les reESC avec du PBS 2x avant et après la fixation.
    3. Perméabiliser les cellules avec 0,2 % de Triton X-100 pendant 10 min.
    4. Bloquez les cellules avec 30 % de sérum de chèvre dilué dans 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) pendant 30 min à température ambiante. Lavez les reESC avec du PBS 2x avant et après le blocage.
    5. Incuber les cellules avec des anticorps primaires (anti-SSEA-1 et anti-cytokératine) pendant 12 h à 4 °C. Lavez les reESC avec du PBS 2x après l’incubation.
    6. Incuber les cellules avec des anticorps secondaires pendant 1 h à température ambiante. Lavez les reESC avec du PBS 2x après l’incubation.
    7. Contre-colorez les cellules avec 150 μL de DAPI pour marquer tous les noyaux.
    8. Capturez des images des cellules colorées à l’aide d’un microscope confocal inversé.

4. Etablissement d’organoïdes endométriaux de rat à partir de reESC

  1. Génération des organoïdes
    1. Lorsque les reESC atteignent 70 % de confluence, digérer les cellules avec 0,25 % de trypsine/1 mM d’EDTA pendant 5 à 6 min.
    2. Mettre en suspension 5 × 105 reESC dans 500 μL de Matrigel décongelé et les placer dans des plaques à 12 puits. Incuber les plaques à 37 °C pendant 20 min pour permettre la gélification.
    3. Une fois que le mélange cellule-Matrigel se solidifie, ajoutez 1,5 mL/puits de REEM pour couvrir le Matrigel. Changez le REEM tous les 2-3 jours.
  2. Coloration par immunofluorescence
    1. Aspirez le REEM et ajoutez 1 mL/puits de solution de récolte d’organoïdes prérefroidie dans les plaques à 12 puits. Incuber sur glace pendant 40 à 60 min.
    2. Prélever les organoïdes à l’aide d’une pipette Pasteur et centrifuger à 300 × g pendant 3 min à 4 °C.
    3. Rincez les organoïdes 2-3x avec du PBS.
    4. Fixez les organoïdes avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 min et bloquez avec du BSA à 5 % pendant 60 min.
      REMARQUE : Lavez 2 fois avec du PBS avant et après chaque étape.
    5. Incuber les organoïdes pendant la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dilués dans 1 % de BSA.
    6. Incuber les organoïdes avec les anticorps secondaires pendant 1 h à température ambiante.
    7. Contre-colorez les organoïdes avec 200 μL de DAPI.
    8. Capturez des images à l’aide d’un microscope confocal inversé.
  3. Coloration HE
    1. Déshydrater les organoïdes grâce à une série d’éthanol gradué : 70 % d’éthanol pendant 30 min ; 80 % d’éthanol pendant 30 min ; 95 % d’éthanol pendant 30 min ; 100 % éthanol pendant 2 x 30 min. Nettoyez les organoïdes en les immergeant dans du xylène pendant 2 x 30 min.
    2. Plongez les organoïdes clairs dans de la paraffine fondue à 60 °C pendant 1 h. Transférez les organoïdes infiltrés de paraffine dans des moules d’enrobage, remplissez les moules de paraffine fondue et placez les moules dans une plaque froide pour que la paraffine se solidifie. Retirez les blocs de paraffine des moules une fois que la paraffine s’est solidifiée et coupez l’excès de paraffine.
    3. Montez les blocs de paraffine sur le microtome. Coupez des sections de 5 m d’épaisseur et faites-les flotter sur un bain d’eau tiède (42-45 °C) pour les aplatir. Transférez soigneusement les sections sur des lames de verre et séchez-les sur un chauffe-lames.
    4. Déparaffiniser les sections en immergeant les lames dans du xylène pendant 2 x 5 min. Réhydrater grâce à une série d’éthanol gradué : 100 % éthanol pendant 2 x 3 min ; 95 % d’éthanol pendant 3 min ; 70 % d’éthanol pendant 3 min ; Rincer à l’eau distillée.
    5. Colorer avec de l’hématoxyline pendant 5 min ; Ensuite, rincez à l’eau courante du robinet pendant 5 min. Différencier dans de l’alcool acide à 1 % pendant quelques secondes ; rincer à l’eau courante du robinet pendant 5 min ; placer en bleu dans de l’eau ammoniacale à 0,2 % pendant 30 s ; rincer à l’eau courante du robinet pendant 5 min ; Colorer avec de l’éosine pendant 2 min. Déshydrater par l’éthanol gradué : 70 % d’éthanol pendant 1 min ; éthanol à 95 % pendant 1 min ; 100 % éthanol pendant 2 x 1 min. Transparent dans du xylène pendant 2 x 1 min.
    6. Ajoutez une goutte de support de montage sur les sections tachées. Ensuite, placez une lamelle sur la section du tissu, en évitant les bulles d’air. Observez les coupes colorées au microscope optique.
  4. Coloration par fluorescence
    1. Effectuez la déparaffinisation et la réhydratation comme décrit aux étapes 4.3.1. à 4.3.4.
    2. Préchauffer la solution de récupération de l’antigène dans un four à micro-ondes. Placez les lames dans la solution chauffée de récupération de l’antigène et maintenez-les à une température inférieure à l’ébullition pendant 20 min. Laisser refroidir les lames dans la solution de récupération de l’antigène pendant 40 min. Rincer les lames à l’eau déminéralisée pendant 5 min.
    3. Incuber les lames dans du peroxyde d’hydrogène à 0,3 % dans du méthanol pendant 10 min pour éteindre l’activité de la peroxydase endogène. Rincer les lames pendant 3 x 5 min dans du PBS et les incuber dans une solution de blocage pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humidifiée. Tapotez l’excès de solution de blocage mais ne rincez pas.
    4. Diluer l’anticorps primaire dans une solution bloquante selon les instructions du fabricant. Appliquez l’anticorps primaire dilué sur les coupes de tissus et incubez toute la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée.
    5. Lavez les lames pendant 3 x 5 min dans du PBS. Diluer l’anticorps secondaire conjugué à la HRP dans une solution bloquante conformément aux instructions du fabricant. Appliquez l’anticorps secondaire dilué sur les coupes de tissus et incubez pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humidifiée. Laver les lames pendant 3 x 5 minutes dans du PBS pour éliminer l’anticorps secondaire non lié.
    6. Préparez la solution de travail de fluorescéine tyramide selon les instructions du kit. Appliquez la solution de travail sur les sections de tissu et incubez pendant 15 min à température ambiante dans une chambre humidifiée. Rincez les lames pendant 3 x 5 min dans du PBS.
    7. Répétez l’étape 4.4.1. à 4.4.5 jusqu’à ce que la coloration soit terminée avec les trois anticorps. Appliquez une goutte de support de montage fluorescent avec DAPI sur chaque section de tissu. Placez soigneusement une lamelle sur la section du tissu pour éviter les bulles d’air. Examinez les lames du microscope confocal inversé.
  5. Quantitative PCR
    1. Prélevez les organoïdes comme décrit aux étapes 4.2.1. à 4.2.3. Aspirez le PBS et extrayez les ARN totaux des organoïdes en suivant les instructions du fabricant.
    2. Utilisez n’importe quel kit de transcription inverse disponible dans le commerce pour synthétiser l’ADNc à partir de 1 μg d’ARN total. Configurez une réaction q-PCR selon le protocole du fabricant du kit. Voir le tableau des matériaux pour les séquences d’amorces utilisées pour la q-PCR.

5. Culture à long terme d’organoïdes endométriaux de rat

  1. Aspirez le REEM et ajoutez 1 mL de solution de récolte d’organoïdes pendant 40 min pour dissocier les organoïdes. Incuber sur glace pour maintenir l’intégrité des organoïdes.
  2. Après l’incubation, prélever les organoïdes à l’aide d’une pipette Pasteur et centrifuger à 300 × g pendant 3 min à 4 °C pour les granuler en vue d’un traitement ultérieur.
    REMARQUE : Le découpage de la pointe de la pipette peut être utile pour manipuler des organoïdes plus grands (plus de 500 μm) sans causer de dommages.
  3. Remettre en suspension les organoïdes granulés dans Matrigel, dans un rapport de 1:2 ou 1:3, pour l’enrobage et la culture ultérieure dans des plaques à 12 puits.
  4. Préparez la solution mère congelée : REEM avec 10 % de DMSO.
  5. Récoltez les organoïdes, mettez-les en suspension dans la solution mère congelée, puis conservez-les dans un congélateur à -80 °C ou dans de l’azote liquide pour une conservation à long terme.
  6. Pour décongeler les organoïdes congelés, préchauffez le REEM dans un bain-marie à 37 °C et plongez le tube de bouillon congelé dans le bain-marie pour décongeler doucement les organoïdes.
  7. Après décongélation, remettre les organoïdes en suspension dans 500 μL de Matrigel pour les réintégrer et les cultiver dans une plaque à 12 puits. Suivez les étapes 4.1.2. à 4.1.3.
    REMARQUE : Il est conseillé de stocker les organoïdes congelés à -80 °C pour des durées plus courtes ou de les transférer dans de l’azote liquide pour un stockage à plus long terme.

6. Facultatif : Transition des organoïdes vers la culture adhérente

REMARQUE : Le protocole mentionne une méthode alternative pour obtenir des reESC cultivés à plat en faisant passer les organoïdes à la culture adhérente, permettant la restructuration de la morphologie des organoïdes.

  1. Aspirez le REEM et ajoutez 1 mL de solution de récolte d’organoïdes pour dissocier les organoïdes. Incuber sur glace pour maintenir l’intégrité des organoïdes.
  2. Après l’incubation, prélever les organoïdes à l’aide d’une pipette Pasteur et d’une centrifugeuse pour les granuler à 300 × g pendant 3 min à 4 °C.
  3. Remettez les organoïdes en suspension dans 3 ml de REEM préchauffé et transférez les organoïdes remis en suspension dans une parabole de 3,5 cm. Changez le support REEM tous les 2 jours.
  4. Lorsque les cellules atteignent 70 % de confluence, digérez-les avec 0,25 % de trypsine/1 mM d’EDTA pendant 5 à 6 minutes.
  5. Reconstruisez les organoïdes à l’aide de reESC en suivant les étapes 4.1.1 à 4.1.3.

7. Culture séquentielle d’organoïdes avec de l’œstradiol (E2) et de la progestérone (P4)

  1. Préparer des solutions mères de E2 et P4 dans du DMSO. Diluer les solutions mères aux concentrations d’utilisation souhaitées (E2 : 10 nM ; P4 : 1 μM) dans la REEM, en veillant à ce que la concentration finale de DMSO ne dépasse pas 0,1 % pour éviter les effets cytotoxiques.
  2. Cultiver des organoïdes dans REEM en tant qu’étapes 4.1.1. à 4.1.3. pendant 4 jours. Remplacer le milieu par de la semence enrichie en E2 et faire cultiver pendant 7 jours. Surveillez quotidiennement la croissance et la morphologie des organoïdes. Changez de milieu tous les 2-3 jours.
  3. Remplacer le milieu par de la REEM complétée par E2 et P4. Surveillez quotidiennement la croissance et la morphologie des organoïdes. Changez de milieu tous les 2-3 jours. Continuez à cultiver les organoïdes pendant 7 jours.

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Résultats

Les reESC et les organoïdes utérins de rat ont été établis à partir de six rats Sprague-Dawley femelles pesant entre 200 g et 250 g selon le protocole décrit à la figure 1. S’appuyant sur le succès de la culture à long terme de cellules souches épithéliales de l’endomètre humain, la formulation REEM était principalement composée de Y27632, A8301 et CHIR99021. Pour stabiliser les cellules endométriales in vitro, nous avons d’abord isolé des cellules endométriales de l’endomètre de ra...

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Discussion

Dans cette étude, nous avons décrit une méthode simple pour isoler et cultiver des cellules souches épithéliales épithéliales de l’endomètre de rat (reESC) et affiné le système ex vivo précédemment établi pour les cellules souches épithéliales de l’endomètre humain8. Notre approche utilise un milieu de culture de petites molécules contenant Y27632, A8301 et CHIR99021 comme composants clés pour permettre une culture ex vivo stable et à long terme....

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation de recherche fondamentale et appliquée du GuangDong (2023A1515110760).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anti-CD15 (SSEA-1)Abcamab135377Lapin, 1:200 (IHC)
Récepteur anti-œstrogène alphaAbcamab32063Lapin, 1:200 (IHC)
Anti-cytokératineAbcamab7753Souris, 1:250 (IHC)
Récepteur anti-progestéroneAbcamab101688Lapin, 1:200 (IHC)
Anti-Ki67Abcamab279653Souris, 1:250 (IHC)
A8301TargetMol909910-43-6
&beta ;-EstradiolMerckE8875
Kit de comptage cellulaire-8BeyotimeC0038
CD9BioLegend1098191:20 (FC), Pacific Blue
CD24BioLegend1018061:20 (FC), FITC
CD31BioLegend3031201:20 (FC), APC
CD45BioLegend3017031:20 (FC), PE
CHIR99021TargetMolCT99021
Cultrex Organoïde Solution de récolteR& D Systems3700-100-01
Cy3 TSA Kit système de fluorescenceAPExBIOK1051
Cy5 Kit système de fluorescenceTSA APExBIOK1052
DAPISigmaD95421 &mu ; g/mL
DMEM/F-12Invitrogen11330032
EpCAMBioLegend3698031:20 (FC), PerCP
Fluorescéine TSA Fluorescence System KitAPExBIOK1050
Chèvre anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500
Chèvre anti-souris IgG, Alexa Fluor 555InvitrogenA-214221:500
Chèvre Anti-lapin IgG/HRPanticorps APExBIObs-0295G-HRP
Knockout sérum substitutInvitrogen10828028
MatrigelCorning356234
PrimeScript RT Master MixTakaraRR063A
ProgestéroneMerck57-83-0
Sprague-Dawley rat  ;Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, Chine
SSEA-1BioLegend3230471:20 (FC), APC
TB Green Fast qPCR MixTakaraRR820A
TriZOLInvitrogen15596026CNExtraction d’ARN
u-Slide Plaques à 8 puitsIbidi80827
Y27632TargetMol146986-50-7
qPCR fortes des gènes cibles"
Genes>CompanySequences
rat GAPDH FSangon biotechGACATGCCGCCTGGAGAAAC
rat GAPDH RSangon biotechAGCCCAGGATGCCCTTTAGT
rat Nanog FSangon biotechGACTAGCAACGGCCTGACTCA
rat Nanog R  ;Sangon biotechCTGCAATGGATGCTGGGATA
rat Sox2 FSangon biotechATTACCCGCAGCAAAATGAC
rat Sox2 RSangon biotechATCGCCCGGAGTCTAGTTTTCT
rat Oct4 FSangon biotechCCCAGCGCCGTGAAGTTGGA
rat Oct4 RSangon biotechACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA
GG

Références

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  10. Murphy, A. R., Campo, H., Kim, J. J. Strategies for modelling endometrial diseases. Nat Rev Endocrinol. 18 (12), 727-743 (2022).
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