Utilisation d’oligonucléotides synthétiques modifiés pour doser des enzymes métabolisant des acides nucléiques

Résumé

Ici, un protocole pour doser les enzymes métabolisant les acides nucléiques est présenté, à l’aide d’exemples d’enzymes ligase, nucléase et polymérase. Le test utilise des oligonucléotides marqués par fluorescence et non marqués qui peuvent être combinés pour former des duplex imitant les dommages à l’ARN et/ou à l’ADN ou les intermédiaires de voie, permettant la caractérisation du comportement enzymatique.

Résumé

La disponibilité d’une gamme d’oligonucléotides synthétiques modifiés auprès de fournisseurs commerciaux a permis la mise au point de tests sophistiqués pour caractériser diverses propriétés des enzymes métabolisantes des acides nucléiques qui peuvent être exécutés dans n’importe quel laboratoire de biologie moléculaire standard. L’utilisation d’étiquettes fluorescentes a rendu ces méthodes accessibles aux chercheurs disposant d’un équipement d’électrophorèse PAGE standard et d’un imageur fluorescent, sans utiliser de matières radioactives ni nécessiter un laboratoire conçu pour le stockage et la préparation de matières radioactives, c’est-à-dire un laboratoire chaud. L’ajout facultatif de modifications standard telles que la phosphorylation peut simplifier la configuration du test, tandis que l’incorporation spécifique de nucléotides modifiés qui imitent les dommages à l’ADN ou les intermédiaires peut être utilisée pour sonder des aspects spécifiques du comportement enzymatique. Ici, la conception et l’exécution de tests pour interroger plusieurs aspects du traitement de l’ADN par des enzymes à l’aide d’oligonucléotides synthétiques disponibles dans le commerce sont démontrées. Il s’agit notamment de la capacité des ligases à se joindre ou des nucléases à dégrader différentes structures hybrides d’ADN et d’ARN, de l’utilisation différentielle de cofacteurs par l’ADN ligase et de l’évaluation de la capacité de liaison à l’ADN des enzymes. Les facteurs à prendre en compte lors de la conception de substrats nucléotidiques synthétiques sont discutés, et un ensemble de base d’oligonucléotides pouvant être utilisés pour une gamme de dosages de ligase d’acide nucléique, de polymérase et d’enzymes nucléases est fourni.

Introduction

Toutes les formes de vie ont besoin d’enzymes de traitement des acides nucléiques pour mener à bien les processus biologiques fondamentaux, notamment la réplication, la transcription et la réparation de l’ADN. Les principales fonctionnalités enzymatiques de ces voies sont les polymérases, qui génèrent des copies de molécules d’ARN/ADN, les ligases qui se joignent aux substrats polynucléotidiques, les nucléases qui les dégradent, et les hélicases et topoisomérases, qui font fondre les duplex d’acide nucléique ou modifient leur topologie 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . De plus, bon nombre de ces enzymes fournissent des outils moléculaires essentiels pour des applications telles que le clonage, le diagnostic et le séquençage à haut débit 11,12,13,14,15.

Les caractéristiques fonctionnelles, la cinétique et les spécificités des substrats de ces enzymes peuvent être déterminées à l’aide de substrats d’ADN/ARN marqués produits par des oligonucléotides de recuit. Le suivi des substrats et des produits est traditionnellement réalisé par l’introduction d’un marqueur radioactif (³²P) à l’extrémité du brin 5', qui peut ensuite être détecté par un film photographique ou à l’aide d’un système d’imagerie au phosphore^16,17. Bien que les substrats radiomarqués offrent l’avantage d’une sensibilité expérimentale accrue et ne modifient pas les propriétés chimiques d’un nucléotide, les risques potentiels pour la santé liés au travail avec des radio-isotopes ont encouragé le développement d’un marquage des acides nucléiques non radioactifs afin de fournir une alternative plus sûre pour la détection de l’ADN et de l’ARN 18,19,20 . Parmi ceux-ci, la détection de fluorescence, y compris la détection de fluorescence directe, la fluorescence résolue dans le temps et les tests de transfert d’énergie/extinction de fluorescence se distinguent comme les plus polyvalents 21,22,23,24. La vaste gamme de fluorophores permet différentes conceptions de substrats d’ADN/ARN avec des rapporteurs uniques sur chaque oligonucléotide²⁵. De plus, la stabilité des fluorophores, par rapport aux radio-isotopes, permet aux utilisateurs de produire et de préserver des quantités importantes de substrats d’ADN marqués par fluorescence¹⁹. Ces substrats marqués au fluorophore peuvent être incubés avec la protéine d’intérêt, ainsi que différentes combinaisons de cofacteurs métalliques et nucléotidiques, pour analyser la liaison et/ou l’activité enzymatique. La visualisation de la liaison ou de l’activité peut être observée à l’aide de divers canaux de colorant fluorophore avec un système d’imagerie sur gel. Comme seuls les oligonucléotides marqués par fluorescence seront visibles à l’aide de cette technique, toute augmentation ou diminution de la taille de l’oligonucléotide marqué sera facile à suivre. Les gels peuvent également être colorés par la suite, avec des colorants de coloration aux acides nucléiques pour visualiser toutes les bandes d’ADN présentes sur le gel.

Les ligases d’acides polynucléiques sont des enzymes qui joignent des fragments d’ADN/ARN, catalysant le scellement des cassures par la formation d’une liaison phosphodiester entre les terminaisons de l’ADN phosphorylé 5' et les 3' OH de l’ADN. Ils peuvent être divisés en deux groupes en fonction de leurs besoins en substrat nucléotidique. Les ligases dépendantes du NAD, hautement conservées, se trouvent dans toutes les bactéries²⁶, tandis que les enzymes dépendantes de l’ATP structurellement diverses peuvent être identifiées dans tous les domaines de la vie ^8,27. Les ligases d’ADN jouent un rôle important dans le traitement des fragments d’Okazaki pendant la réplication et sont impliquées dans diverses voies de réparation de l’ADN, telles que la réparation par excision de nucléotides et de bases, en scellant les entailles spontanées et les entailles laissées après la réparation ^8,10. Différentes ligases d’ADN présentent des capacités variables pour joindre différentes conformations de cassures d’ADN, y compris des entailles dans un duplex, des cassures double brin, des discordances et des lacunes, ainsi que des hybrides d’ARN et d’ADN 28,29,30. Une gamme variée de substrats ligaturables peut être assemblée en recuit d’oligonucléotides avec un phosphate 5' pour générer des terminaisons 5' et 3' juxtaposées dans un duplex d’acide nucléique 31,32,33. La méthode d’analyse la plus courante est la résolution par PAGE d’urée dans un format de test final ; Cependant, les innovations récentes ont inclus l’utilisation de l’électrophorèse sur gel capillaire, qui permet un débit élevé³⁴, le profilage par spectrométrie de masse³⁵, ainsi qu’un test de balise moléculaire homogène, qui permet une surveillance résolue dans le temps³⁶.

La première étape d’une réaction de ligature est l’adénylation de l’enzyme ligase par l’adénosine triphosphate (ATP) ou le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), ce qui donne un intermédiaire enzymatique covalent. La deuxième étape de la réaction est l’adénylation du substrat d’acide nucléique à l’extrémité 5' du site de l’entaille, qui est suivie de la ligature des brins d’entaille d’acide nucléique. De nombreuses enzymes ligases qui sont exprimées de manière recombinante dans E. coli sont purifiées sous la forme adénylée et, par conséquent, sont capables de ligaturer avec succès les acides nucléiques sans l’ajout d’un cofacteur nucléotidique. Il est donc difficile de déterminer le type particulier de cofacteur nucléotidique dont ils ont besoin pour la ligature des acides nucléiques. En plus de décrire des tests permettant d’évaluer l’activité de l’ADN ligase, une méthode permettant de déterminer de manière fiable l’utilisation des cofacteurs en désadénylant l’enzyme à l’aide de substrats non marqués est également présentée.

Les nucléases sont un groupe vaste et diversifié d’enzymes modifiant l’ADN/ARN et d’ARN catalytiques qui clivent les liaisons phosphodiester entre les acides nucléiques³⁷. Les fonctionnalités de l’enzyme nucléase sont nécessaires à la réplication, à la réparation et au traitement de l’ARN et peuvent être classées en fonction de leur spécificité de sucre pour l’ADN, l’ARN ou les deux. Les endonucléases hydrolysent les liaisons phosphodiester à l’intérieur d’un brin d’ADN/ARN, tandis que les exonucléases hydrolysent les brins d’ADN/ARN un nucléotide à la fois à partir de l’extrémité 3' ou 5' et peuvent le faire à partir de l’extrémité 3' à 5' ou de l’extrémité 5' à 3' de l’ADN³⁸.

Alors que de nombreuses protéines nucléases sont non spécifiques et peuvent être impliquées dans plusieurs processus, d’autres sont très spécifiques pour une séquence particulière ou des dommages à l’ADN ^6,39,40. Les nucléases spécifiques à une séquence sont utilisées dans un large éventail d’applications biotechnologiques, telles que le clonage, la mutagénèse et l’édition du génome. Les nucléases populaires pour ces applications sont les nucléases de restriction⁴¹, les nucléases à doigts de zinc⁴², les nucléases effectrices de type activateur transcriptionnel et, plus récemment, les nucléases CRISPR⁴³ guidées par l’ARN. Des nucléases spécifiques aux dommages ont récemment été identifiées, telles que la nucléase EndoMS, qui a une spécificité pour les mésappariements dans l’ADN grâce à son domaine nucléase de type RecB spécifique aux mésappariements ^5,44. Historiquement, les essais d’activité des nucléases ont été effectués sous forme d’essais discontinus avec des substrats radiomarqués ; Cependant, en plus de leurs autres inconvénients, ceux-ci ne permettent pas d’identifier le site qui est coupé par une protéine nucléase, ce qui est possible lors de l’utilisation de substrats marqués par fluorescence^45,46. Plus récemment, des tests de nucléases continues ont été mis au point et fonctionnent en utilisant différents colorants d’ADN qui interagissent avec l’ADN dans différents états ; par exemple, émettre un signal fluorescent plus élevé lors de l’interaction avec l’ADNdb qu’à l’état non lié, ou se lier spécifiquement à des ARN courts⁴⁷. D’autres tests de nucléases continues utilisent des épingles à cheveux d’ADN avec un groupe fluorophore à l’extrémité 5' et un quencher à l’extrémité 3', de sorte que la fluorescence augmente à mesure que l’oligonucléotide est dégradé en raison d’une séparation du fluorophore et du quencher⁴⁸. Bien que ces tests permettent de caractériser la cinétique des protéines dégradant l’ADN, ils nécessitent une connaissance préalable de la fonction et du substrat de l’enzyme et sont également limités aux enzymes qui modifient la conformation de l’ADN pour provoquer une différence dans la liaison du colorant. Pour cette raison, les tests de paramètres qui résolvent les produits nucléases individuels sont toujours souhaitables pour fournir un aperçu des modifications de l’ADN causées par l’activité des protéines.

Ici, une procédure détaillée est présentée pour la conception d’oligonucléotides d’ADN/ARN marqués par fluorescence qui peuvent être mélangés et appariés pour générer des substrats permettant de tester l’activité de nouvelles enzymes nucléases, polymérases et ligases. La validation de cet ensemble de base de séquences d’oligonucléotides simplifie la conception expérimentale et facilite le profilage économique d’un large éventail de fonctionnalités enzymatiques sans avoir besoin d’acheter un grand nombre de substrats sur mesure. Une procédure détaillée est fournie pour l’exécution d’un test enzymatique standard de traitement de l’ADN avec ces substrats, en utilisant l’exemple de l’activité de l’ADN ligase et des modifications pour le dosage et l’analyse des enzymes nucléases et polymérases sont décrites. De plus, un test modifié pour déterminer la spécificité du cofacteur de l’enzyme ADN ligase avec une grande précision est fourni, et des sondes à double marquage sont utilisées pour évaluer l’assemblage de ligatures à plusieurs composants. Enfin, des modifications au format de base de l’essai sont discutées pour permettre son utilisation pour déterminer les interactions protéine-ADN avec les mêmes substrats par l’essai de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA).

Protocole

1. Conception et achat d’oligonucléotides

REMARQUE : Concevez des oligonucléotides monobrin à assembler et à recuire dans les duplex souhaités. Un ou plusieurs des brins d’un duplex doivent porter une fraction fluorescente pour suivre le traitement des oligonucléotides par l’enzyme d’intérêt. Le tableau 1 présente un ensemble de base de séquences monocaténaires pouvant être assemblées pour une gamme d’activités.

1. Incorporer les modifications spécifiques nécessaires pour l’enzyme d’intérêt, comme décrit ci-dessous.
   1. Pour les substrats d’ADN ligase (Figure 1) : Assemblez le substrat le plus simple à partir de trois oligonucléotides : un brin donneur phosphorylé 5' (NL2), un brin accepteur 5' marqué FAM (NL1) et un complément qui relie les deux (NL3).
      1. Assurez-vous que les brins fournissant l’extrémité 5' de l’entaille ligaturable sont phosphorylés avant l’assemblage du mélange maître de substrat à l’étape 2. Commandez ceci en tant que modification sur NL2 (comme indiqué dans le tableau 1) ou utilisez la phosphorylation enzymatique avec la polynucléotide kinase T4 après remise en suspension des oligonucléotides.
      2. Inclure la phosphorylation 5'-terminale de NL6 et NL8, qui comprennent le complément des cassures double brin illustrées à la figure 1A (NL6/NL7 et NL8/NL9) car elle ressemble le plus au substrat naturel produit à partir d’une endonucléase de restriction. Utilisez un substrat à double marquage pour déterminer l’étendue relative de la ligature pour les assemblages en plusieurs parties (voir étape 6).
      3. Modifier le brin du complément pour produire des décalages (NL10) et des lacunes (NL11).
         REMARQUE : Des variations sur le substrat à entailles simples sont illustrées à la figure 1A. Il est possible d’utiliser d’autres séquences pour produire une gamme encore plus large de décalages ou d’écarts plus longs en variant la position soulignée.
      4. Remplacez les oligonucléotides d’ARN par des oligonucléotides d’ADN.
         REMARQUE : Des variations sur le substrat entaillé simple sont illustrées à la figure 1B. Une gamme plus large de duplex ADN/ARN peut être générée par des combinaisons supplémentaires de l’ensemble de base donné ici pour générer, par exemple, des cassures double brin contenant à la fois de l’ARN et de l’ADN. Un exemple de cette variation est donné à l’étape 6 ci-dessous, où une stratégie de double étiquette est utilisée.
   2. Pour les substrats d’ADN polymérase : Assemblez les oligonucléotides NL1 et NL3 énumérés dans le tableau 1 pour obtenir un test simple d’extension-amorce. Étudier d’autres aspects de l’activité de la polymérase en introduisant des modifications dans les brins NL1 (amorce) ou NL3 (matrice).
      1. Incorporer des analogues de base endommagés dans l’oligonucléotide NL3 avant la position 20 pour déterminer la capacité de contourner les lésions endommagées sur le brin matrice.
      2. Incorporer des analogues de base endommagés dans l’oligonucléotide NL1 à la position 20 pour déterminer la capacité d’extension d’une amorce endommagée.
      3. Utilisez RNL1 ou RNL3 dans le duplex pour étudier l’extension d’une amorce d’ARN ou l’utilisation d’une matrice d’ARN.
   3. Pour les substrats de nucléases (Figure 2) : Assembler les oligonucléotides pour obtenir une gamme non exhaustive de substrats double et simple brin (Figure 2Ai) ainsi qu’une gamme de jonctions à rabats et évasés (Figure 2Aii) et de substrats endommagés (Figure 2B).
      1. Pour sonder les activités des ribonucléases, remplacez de manière itérative NL1, NL2 et NL3 par RNL1, RNL2 et RNL3. Utilisez des versions d’ARN supplémentaires de HJ5 et HJ6 pour élargir davantage cet ensemble.
      2. Utilisez les oligonucléotides MD5, MD6 et MD9 qui ont une modification placée au centre qui imite les dommages oxydatifs, un intermédiaire de réparation abasique ou un produit de désamination (Figure 2B). Les substrats détecteront le clivage du brin à cette position. Étiquetez le brin NL3 du complément avec un fluorophore orthogonal tel que TAMRA pour détecter le clivage double brin (voir étape 6).
      3. Utilisez le marquage orthogonal du complément pour détecter la coupe double brin aux sites non appariés sur les brins de la sonde (NL5 et ND9) et du complément (MD10 et NL10).
2. Commandez des oligonucléotides synthétiques incorporant des fluorophores pertinents et d’autres modifications auprès d’un fournisseur commercial.
   REMARQUE : Une échelle de synthèse de 100 nM et une purification HPLC après la synthèse conviennent aux tests décrits.

2. Assemblage et recuit de duplex d’acide nucléique

1. Mise en suspension et dilution des oligonucléotides
   1. Avant l’ouverture, centrifugez les oligonucléotides lyophilisés dans leurs tubes de 2 ml à pleine vitesse dans une centrifugeuse de paillasse pendant 2 à 5 minutes pour vous assurer que l’acide nucléique se trouve au fond du tube.
   2. Préparer une pâte mère de 100 μM en remettant en suspension les oligonucléotides dans un tampon TE (10 mM de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris), 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)). Assurez-vous que les oligonucléotides sont complètement remis en suspension par un vortex doux répété et une brève centrifugation à pleine vitesse.
   3. Préparez une pâte de 10 μM en diluant une aliquote de matière mère avec un tampon TE. Diluer la pâte de 10 μM avec de l’eau ultrapure (eau MQ) pour préparer des matières de travail avec des concentrations de 0,5 μM, 0,7 μM ou 2,5 μM comme indiqué dans le tableau 2.
2. Assemblage et recuit des mélanges maîtres de réaction
   1. Utilisez des matériaux de travail pour constituer les mélanges maîtres de réaction en utilisant les combinaisons fournies dans le tableau 2 et les volumes indiqués dans le tableau 3. Pour le test standard de ligase de l’ADN et la plupart des autres tests décrits ici, la composition tampon finale est de 50 mM de Tris pH 8,0, 50 mM de NaCl, 10 mM de dithiothréitol (DTT) avec 10 mM de Mg comme cation divalent.
   2. Recuit les oligonucléotides dans un tube de PCR ou de microcentrifugation en chauffant à 95 °C pendant 5 min à l’aide d’un bloc chauffant ou d’un thermocycleur. Laisser refroidir à température ambiante pendant 30 min (volumes <1 ml) à 1 h (volumes >1 ml). Pour les oligonucléotides plus longs (>40 nt), effectuez un refroidissement plus lent à l’aide d’un thermocycleur avec une rampe de descente de 95 °C à 25 °C pendant 45 min, ou faites flotter le tube contenant le mélange de recuit dans un bécher de 1 L d’eau bouillante et laissez-le refroidir à température ambiante pendant la nuit.
   3. Ajoutez des cofacteurs nucléotidiques et d’autres composants tampons sensibles à la chaleur au mélange maître après refroidissement à température ambiante. Utilisez le mélange réactionnel final directement pour le dosage par l’ajout d’enzyme (voir l’étape 3 ci-dessous) ou conservez-le à -20 °C pour une utilisation future.

3. Configuration standard du test

1. Montage et lancement de la réaction de dosage
   1. Combinez 22,5 μL du mélange maître de substrat d’intérêt avec 2,5 μL d’ADN ligase ou d’une autre enzyme d’intérêt dans un tube PCR. Exécutez des réactions en double ou en triple, surtout si les résultats seront quantifiés.
   2. Inclure un témoin sans protéine (tampon seulement) dans les échantillons d’essai. N’incluez aucune commande de cofacteur à ce stade, si nécessaire.
      REMARQUE : Les enzymes peuvent être stockées à -20 °C dans du glycérol à 50 % v/v, ce qui permet de les pipeter directement à partir de la solution. Assurez-vous que les solutions enzymatiques contenant du glycérol sont bien mélangées avant l’ajout, soit par pipetage pour mélanger, soit par vortex doux.
2. Transférez immédiatement les réactions dans un appareil de PCR à 25 °C et incubez pendant 30 min. Variez la température et la durée en fonction des conditions optimales pour l’activité enzymatique.
3. Tremper les réactions en ajoutant 5 μL de colorant de charge (formamide à 95 %, acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 0,5 M, bleu de bromophénol) et incuber à 95 °C pendant 5 min.

4. Analyse des résultats d’analyse

1. Préparez les gels Tris-Borate-EDTA (TBE)-Urea PAGE comme décrit ci-dessous.
   1. Préparez un bouillon de 20 % d’acrylamide, de 7 M d’urée et d’une solution de TBE x. Pour l’ensemble d’oligonucléotides décrit ici, utilisez la solution Acrylamide/Bis dans un rapport de 29:1 pour une résolution optimale.
   2. Pour un gel, combiner 10 ml d’acrylamide à 20 % et une solution d’urée à 7 M avec 100 μL d’APS (10 %) et 3 μL de tétraméthyléthylènediamine (TMED) et couler dans une roulette de gel.
2. Une fois le gel solidifié, analysez les échantillons sur le gel d’urée TBE à 45 - 55 °C.
   1. Pré-exécutez le gel dans 1x tampon TBE pendant 30 min à 10 mA par gel avec chauffage externe.
   2. Éliminez l’excès d’urée dans les puits du gel en rinçant avec 1x TBE à l’aide d’une pipette de pâturage.
   3. Chargez 10 μL de chaque réaction et faites fonctionner à 10 mA pendant 1,0 à 1,5 h avec chauffage externe.
3. Visualisez le gel sur l’imageur avec les bons réglages pour le fluorophore choisi. Pour la FAM, utilisez un ensemble de filtres qui donne une excitation/émission à 495/519 nm, qui est stocké en tant que préréglage dans la plupart des imageurs.
4. Quantifiez l’intensité de la bande du produit et du substrat à l’aide d’un logiciel de traitement d’image avec l’imageur, ou d’un programme externe tel que ImageJ^49,50 et calculez le pourcentage du produit à l’aide de la formule
   
   Où P est la valeur intégrée de la bande de produit et S est l’aire intégrée de la bande de substrat. Dans le cas de l’exemple de la réaction de ligase de l’ADN, la bande de produit est de 40 nucléotides (nt) et la bande de substrat de 20 nt.

5. Dé-adénylation de l’ADN ligase pour tester la spécificité du cofacteur

1. Préparation de mélanges maîtres de réaction
   1. Préparez un ensemble du mélange maître contenant l’oligonucléotide NL1 marqué au FAM, comme décrit dans le tableau 4. Préparez une deuxième série contenant l’oligonucléotide NL1 sans étiquette FAM, comme décrit dans le tableau 4.
   2. Séparément, chauffer les deux duplex DNA à 95 °C pendant 5 min et refroidir pendant 30 min à 1 h à 25 °C. N’ajoutez pas de cofacteur nucléotidique à l’un ou l’autre des mélanges maîtres.
2. Assemblage et initiation de la réaction de désadénylation
   1. Préparez une réaction de désadénylation unique pour chaque type/concentration de cofacteur à tester en combinant 10 μL du mélange maître non marqué avec 2,5 μL d’enzyme ligase.
   2. Préparez des tubes supplémentaires comme contrôle sans cofacteur et sans contrôle protéique (2,5 μL de tampon ajouté à la place de l’enzyme).
   3. Incuber les réactions à une température spécifique à l’activité optimale de l’enzyme, pendant 1 à 2 h. Le temps d’incubation peut être augmenté si l’enzyme est encore adénylée.
3. Exécutez la réaction de ligature avec le cofacteur.
   1. Ajoutez 10 μL du mélange maître marqué et 2,5 μL des cofacteurs nucléotidiques souhaités (par exemple, ATP, NAD, ADP ou GTP) directement à la réaction désadénylée (concentration finale de 0,1 à 1 mM).
   2. Ajouter 2,5 μL de tampon de réaction au témoin sans cofacteur nucléotidique.
   3. Incuber les réactions pendant la même période et à la même température que celles utilisées précédemment. Trempez et visualisez comme décrit à l’étape 4.

6. Utilisation de substrats à double marquage pour la ligature par attelle ou l’assemblage en plusieurs parties

1. Concevoir et acheter un oligonucléotide avec une fraction fluorescente qui a un spectre d’excitation/émission différent de celui du fluorophore déjà utilisé.
   1. Dans la configuration décrite ici, utilisez l’oligonucléotide NL2 (TAMRA) ayant de la 5-carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA) à l’extrémité 3' (tableau 1).
2. Assemblez le mixage principal comme décrit ci-dessous.
   1. Combinez les composants de la réaction décrits à l’étape 2, y compris les rapports équimolaires de tous les oligonucléotides utilisés dans l’assemblage, ainsi que les cations tampons et divalents.
   2. Recuit par chauffage à 95 °C pendant 5 min et refroidissement à 25 °C pendant 30 min - 1 h. Ajoutez le cofacteur et l’enzyme et incubez comme décrit à l’étape 3.
3. Analysez et imagez les échantillons comme décrit à l’étape 4 en utilisant les canaux appropriés pour la paire de fluorophores dans le substrat. Dans le cas de FAM et TAMRA, il s’agit des canaux Fluorescéine (FITC) et Tétraméthylrhodamine (TRITC) présents sur la plupart des imageurs.

7. Évaluation de la liaison à l’ADN par Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) sur gel natif

1. Préparez un gel TBE PAGE natif à 10 % comme décrit ci-dessous.
   1. Mélanger 2,5 ml d’acrylamide à 40 %, 1 mL de 10x TBE, 100 μL d’APS à 10 %, 3 μL de TMED et 6,5 mL d’eau MQ et couler dans un fondeur de gel.
2. Assemblez la réaction de liaison comme décrit ci-dessous.
   1. Assemblez le substrat de l’EMSA conformément au tableau 5 de manière à ce que l’EDTA (10 mM) soit inclus et que les ions métalliques soient omis.
   2. Combinez 20 μL du mélange maître de substrat EMSA avec 5 μL de protéine dans un tube PCR. Inclure un échantillon de contrôle sans protéines. Incuber pendant 30 min à 25 °C.
3. Analyser par électrophorèse native comme décrit ci-dessous.
   1. Ajouter 5 μL de colorant de charge natif 5x (100 mM d’EDTA, 0,25 % de bleu de bromophénol, 25 % de glycérol v/v et de l’eau MQ jusqu’à 1 mL) aux échantillons.
   2. Chargez sur le gel préparé et faites-le fonctionner à 60 V pendant 2-3 h avec refroidissement par circulation d’eau jusqu’à ce que le front du colorant soit à quelques cm au-dessus de l’extrémité du gel.
   3. Visualisez et analysez les gels comme décrit à l’étape 4.

Résultats

Ligature par l’ADN ligase
L’activité enzymatique de l’ADN ligase entraînera une augmentation de la taille de l’oligonucléotide marqué par fluorescence lorsqu’elle est visualisée sur un gel d’urée PAGE. Dans le cas des substrats pour la ligature de l’ADN et de l’ARN énumérés dans le tableau 2, cela correspond à un doublement de la taille de 20 nt à 40 nt (figure 3A). L’activité enzymatique optimale peut être déterminée par des conditions changeantes telles que la température, la concentration en protéines ou le temps d’incubation (Figure 3B), les cofacteurs nucléotidiques, les cofacteurs métalliques (Figure 3C). Les activités relatives d’une ligase sur différents substrats peuvent être comparées en parallèle (Figure 3D).

La quantification des bandes de produit et de substrat est exprimée en pourcentage du substrat total ligaturé et, comme le montre la figure 3, peut être utilisée pour évaluer l’activité spécifique de l’enzyme ou pour déterminer des optima d’activité tels que la préférence cationique divalente, la température ou le pH.

L’ADN ligase bactérien DV-1-1-Lig (Figure 3) est capable de ligaturer les substrats d’ADN et peut utiliser à la fois le magnésium et le manganèse pour l’activité de ligature, avec une préférence pour le magnésium. De plus amples détails sur cette enzyme sont fournis dans⁵¹.

Extension de l’amorce par ADN polymérase
L’activité de l’ADN polymérase par l’extension de l’amorce marquée par fluorescence de 20 nt entraînera une augmentation de taille allant jusqu’à 40 nt lors de l’utilisation de l’ensemble d’oligonucléotides présenté ici (Figure 4A). Les produits partiellement étendus apparaîtront sous la forme d’une échelle de produits jusqu’à la taille du modèle (Figure 4B et Figure 4C). Le test d’extension de l’amorce illustré ici (Figure 4C) a conduit à la synthèse complète du brin d’amorce.

Dégradation par nucléase
L’activité des nucléases entraîne une réduction de la taille de l’oligonucléotide marqué par fluorescence lorsqu’elle est visualisée sur un gel d’urée PAGE. Les nucléases ayant une activité endonucléase spécifique peuvent donner un seul produit de 20 nt (Figure 5A-C). Les nucléases ayant une activité d’exonucléase donneront des oligonucléotides marqués par fluorescence de tailles variables (Figure 5D-F). Ici, les résultats d’une protéine nucléase du métagénome bactérien de l’Antarctique sont présentés, qui présente une activité endonucléase spécifique sur le substrat du site abasique double brin et une activité exonucléase non spécifique sur le substrat simple brin (Figure 5C et Figure 5F, respectivement).

Dosage de la désadénylation de la ligase et de l’utilisation des cofacteurs nucléotidiques
De nombreuses enzymes ligases exprimées de manière recombinante sont purifiées dans un état déjà adénylé à partir d’ATP ou de NAD récupérés de leur hôte 51,52,53,54,55. L’élimination de cet intermédiaire covalent de l’AMP est nécessaire pour identifier avec précision la gamme des cofacteurs nucléotidiques que l’enzyme peut utiliser pour la ligature des substrats d’acides nucléiques⁵¹. Le renouvellement de l’enzyme adénylée ligase avec un substrat non marqué en l’absence d’un cofacteur nucléotidique exogène épuisera l’intermédiaire d’adénylation. En utilisant des substrats d’ADN marqués par fluorescence et en ajoutant un cofacteur nucléotidique dans la deuxième étape uniquement, tout produit de ligature visible lors de l’utilisation d’un canal fluorescent (Fluorescéine-FITC) sur l’imageur sur gel est le résultat d’une adénylation avec le cofacteur nucléotidique ajouté à cette étape.

Les tests d’activité mis en place avec une ADN ligase bactérienne exprimée dans un système E. coli montrent qu’elle a été purifiée sous une forme pré-adénylée et a montré une capacité de fond à ligaturer l’ADN entaillé sans cofacteur supplémentaire (Figure 6Ai-ii). L’ajout d’ATP à la ligase adénylée augmente la quantité de produit ligaturé formé dans la réaction, mais cela n’est pas toujours fiable car cette activité basale pourrait donner une impression incorrecte de l’utilisation de cofacteurs à large spectre ou des ajouts supplémentaires de cofacteurs nucléotidiques à une réaction pourraient inhiber la ligature du substrat. En incubant d’abord la ligase avec une version non marquée du substrat d’ADN entaillé, l’AMP est retourné, et aucune ligature n’est observée sur le substrat d’entaille d’ADN marqué à moins que de l’ATP ne soit ajouté à la réaction. Le deuxième test d’activité (Figure 6B) montre que l’ADN ligase désadénylée a amélioré l’activité de ligature sur le substrat d’ADN nick avec l’ajout d’ATP et d’ADP. Il y a également une certaine amélioration de la ligature avec l’ajout de GTP, qui est plus importante que la ligature de fond observée dans le contrôle sans cofacteur. La ligature observée dans les réactions avec le NAD est comparable à la ligature observée dans les réactions de contrôle sans cofacteur, ce qui exclut le NAD comme cofacteur de la ligature.

Résultats du test à double marquage
Les fluorophores orthogonaux peuvent être utilisés pour établir une activité dans différentes parties d’un substrat complexe. L’exemple de la figure 7 montre l’activité d’une ADN ligase R2D⁵⁶ récemment décrite par rapport à l’ADN ligase T4 sur un duplex ADN/ARN attelli. La ligature de l’accepteur d’ADN à la section donneuse d’ARN du substrat a été détectée à l’aide du 6-FAM, tandis que la ligature de l’accepteur d’ARN à un donneur d’ADN a été détectée à l’aide du 5-TAMRA (Figure 7A). L’étendue relative de la ligature de l’ADN aux deux extrémités du substrat d’ARN a pu être évaluée par la présence d’une bande de produit avec fluorescence dans les canaux 6-FAM et 5-TAMA, qui apparaît en jaune sur l’image composite, tandis que les 6-FAM et 5-TAMRA individuels sont respectivement verts et jaunes (Figure 7B). Comme détaillé dans une publication précédente⁵⁶, seule la ligase R2D était capable de ligaturer l’ADN à l’extrémité 5' de l’ARN, tandis que les deux ligases étaient capables de ligaturer l’ADN à l’extrémité 3' de l’ARN. Lors de la ligature des deux molécules d’ADN à l’ARN dans des mélanges à réaction unique, la ligase R2D peut ligaturer les oligos de l’ADN aux deux extrémités de l’ARN, lorsqu’une bande se déplace vers le haut et qu’un changement de couleur en jaune est observé (Figure 7C).

Le deuxième exemple de la figure 8 utilise une approche de double marquage pour démontrer la ligature de plusieurs oligonucléotides à différents pH. Le substrat, assemblé à partir d’un mélange de sept oligonucléotides, a été utilisé pour montrer la capacité de la ligase R2D à assembler de courts fragments. Le brin 5' a un brin de 14 nt marqué au fluorophore FAM, tandis que le brin du complément a un fluorophore TAMRA à l’extrémité 3' de l’oligonucléotide de 16 nt. La réussite de la ligature peut être observée par des bandes supérieures supplémentaires pour l’oligo FAM (vert) et l’oligo TAMRA (rouge). Le chevauchement des deux fluorophores donne la bande nucléotidique en jaune comme des brins complètement ligaturés de la même taille.

Résultats de la liaison de l’ADN d’une enzyme de ligase de l’ADN à l’aide de l’EMSA
La liaison de l’enzyme ADN ligase à un ADN entaillé phosphorylé donne un complexe qui fonctionne à un poids moléculaire plus élevé que l’oligonucléotide seul (Figure 9A). Ici, la liaison d’une ADN ligase bactérienne dépendante de l’ATP à un substrat d’ADN nick est montrée. À des concentrations élevées de protéines, la majorité du substrat d’ADN marqué est liée et visible dans les bandes de poids moléculaire supérieur ; à des concentrations de protéines plus faibles, le substrat d’ADN libre prédomine (Figure 9B).

Figure 1 : Schémas des différents substrats d’acides nucléiques conçus pour tester l’activité enzymatique de la ligase. Les étoiles représentent l’étiquetage avec la 6-carboxyfluorescéine à l’extrémité 5' (5' FAM). Les brins marqués sont indiqués par une ligne noire ou bleu foncé/rouge (dans le cas des duplex d’ADN/ARN), tandis que les parties non marquées des duplex de substrat sont indiquées par une ligne grise ou bleu/rouge clair (dans le cas des duplex d’ADN/ARN). Les brins étiquetés mesurent 20 nt, et si les brins sont ligaturés, ils forment un produit de 40 nt. Les sites phosphorylés de 5' sont indiqués par un P dans un cercle. Les brins d’oligonucléotides sont étiquetés et les noms sont référencés dans les tableaux 1 et 2. (A) Conception de substrats d’ADN double brin avec différents types de cassures, utilisés pour tester l’activité enzymatique des ADN ligases. (B) Conception de substrats double brin d’ARN et d’ARN/ADN qui incorporent des oligonucléotides d’ADN et d’ARN. Les substrats contiennent un seul site d’entaille et sont utilisés pour tester la capacité des ligases à sceller les entailles des duplex d’ARN/ADN. La ligne rouge représente les oligonucléotides d’ARN, et les lignes bleues représentent les oligonucléotides d’ADN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Schémas des différents substrats d’acides nucléiques conçus pour tester l’activité enzymatique des nucléases. Les étoiles représentent l’étiquetage avec la 6-carboxyfluorescéine à la borne 5' (5' FAM). Les brins marqués sont indiqués par une ligne noire, tandis que les parties non étiquetées des duplex de substrat sont indiquées par une ligne grise. Les sites phosphorylés de 5' sont indiqués par un P dans un cercle. Les brins d’oligonucléotides sont étiquetés et les noms sont référencés dans les tableaux 1 et 2. (A) Conception de substrats avec des parties double et simple brin. (B) La conception des substrats d’ADN double brin est modifiée pour générer des lambeaux simple brin à l’extrémité 3' ou 5' (rabattés 3', battus 5' ou battants aux deux extrémités (évasés)). (C) Conception de substrats à double brin incorporant des bases endommagées ou des décalages en position centrale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Test de l’activité de ligature d’une ADN ligase DB-1-1-Lig dépendante de l’ATP bactérienne. (A) Schéma de dosages enzymatiques pour l’activité de la ligase sur des substrats d’ADN avec résultats analysés sur un gel d’urée TBE PAGE. Les étoiles représentent le marquage avec la 6-carboxyfluorescéine à la borne 5' (5' FAM). Les brins marqués sont indiqués par une ligne noire, tandis que les parties non étiquetées des duplex de substrat qui ne sont pas visibles lors de l’analyse sont indiquées par des lignes grises. (B) Quantification de la ligature par DV-1-1-Lig sur de l’ADN entaillé à différents points temporels. L’activité contre chaque substrat a été réalisée en double. Les réactions ont été incubées pendant différentes périodes de temps (0,5 h, 1 h, 2 h, 3 h et 4 h) à 25 °C, avec une concentration finale de protéines de 4 μM, une concentration finale d’ATP de 1 mM et une concentration finale d’ions magnésium de 10 mM. (C) Ligature d’un substrat d’ADN entaillé avec du magnésium (Mg) ou du manganèse (Mn). Les réactions ont été réalisées pendant 3 h, à 25 °C, avec une concentration finale en ATP de 1 mM et une concentration finale en ions métalliques de 10 mM. (D) Résultats de la ligature sur différents substrats d’ADN. Les réactions ont été réalisées pendant 8 h, à 20 °C, avec une concentration finale en protéines de 2 μM, une concentration finale de 1 mM d’ATP et une concentration finale de 10 mM de magnésium. L’ajout de protéines à la réaction est indiqué par un symbole plus (+). Les réactions de contrôle sont indiquées par C, et l’absence de protéine contenue est indiquée par un symbole moins (-). Le produit (40 nt) et le substrat (20 nt) sont indiqués par des flèches rouges. Les résultats des analyses d’activité ont été visualisés à l’aide d’un système d’imagerie. Les bandes ont été quantifiées par intégration de l’intensité à l’aide du logiciel ImageJ⁴⁹ et les graphiques ont été générés à l’aide d’un logiciel graphique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Dosage de l’ADN polymérase. (A) Schéma du dosage de l’extension de l’amorce sur un substrat d’ADN. Les étoiles représentent le marquage avec la 6-carboxyfluorescéine à la borne 5' (5' FAM). Les brins marqués sont indiqués par une ligne noire, tandis que les parties non étiquetées des duplex de substrat qui ne sont pas visibles lors de l’analyse sont indiquées par des lignes grises. (B) Schéma d’un gel d’urée TBE PAGE montrant une augmentation de la longueur de l’amorce marquée avec l’ajout de nucléotides. (C) Exemple d’extension d’amorce avec l’enzyme ADN polymérase de fragments de Klenow d’E. coli. L’ajout de protéines à la réaction est indiqué par un symbole plus (+). Couloir 1, 12,5 U ; Couloir 2, 2,5 U ; Couloir 3, 1,25U. Les réactions de contrôle sont indiquées par un C, et l’absence de protéine contenue est indiquée par un symbole moins (-). Les réactions ont été effectuées pendant 15 min à 25 °C et contenaient 5 mM de MgCl₂, 50 mM de Tris pH 8,0, 50 mM de NaCl₂, 1 mM de DTT et 0,25 mM de dNTP. Le produit (40 nt) et le substrat (20 nt) sont indiqués par des flèches rouges. Les résultats des analyses d’activité ont été visualisés à l’aide d’un système d’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Activité d’essai d’une nucléase bactérienne du métagénome de l’Antarctique à l’aide de différents substrats, métaux et températures d’incubation. (A) Activité endonucléase spécifique au schéma d’une protéine nucléase sur le substrat du site abasique (indiqué par un x). Les étoiles représentent le marquage avec la 6-carboxyfluorescéine à la borne 5' (5' FAM). Les lignes noires représentent les brins étiquetés et les lignes grises représentent les brins d’ADN non étiquetés. Une coupe spécifique par la nucléase est montrée sur le côté droit du site abasique, mais peut également se produire sur le côté gauche. (B) Schéma d’un gel d’urée PAGE dénaturant montrant le substrat non coupé (40 nt) en l’absence de protéine indiquée par un symbole moins (-) et le produit coupé (20 nt), en présence d’une nucléase indiquée par un symbole plus (+). (C) Un exemple de gel d’urée TBE PAGE montrant les résultats de l’activité spécifique des nucléases endonucléases sur un substrat d’ADN double brin avec un site abasique. Le dosage a été réalisé avec une concentration protéique de 1,0 μM et 1 mM MgCl₂. Deux réactions de contrôle ont été réalisées à 20 °C, l’une sans protéine (puits 1) et l’autre sans métal (puits 2). Les réactions ont été incubées pendant 5 h à des températures croissantes de 1 °C à 50 °C, comme indiqué au-dessus de l’image du gel. L’ajout de la protéine est indiqué par un symbole plus (+), et l’absence de protéine est indiquée par un symbole moins (-). Le substrat et le produit sont indiqués par des flèches rouges. (D) Schéma montrant l’activité exonucléase non spécifique d’une protéine nucléase sur un substrat simple brin. Les étoiles représentent le marquage avec la 6-carboxyfluorescéine à l’extrémité 5' (5'FAM). Les lignes noires représentent les brins étiquetés. La coupe non spécifique de la nucléase permet d’obtenir des brins marqués de longueurs variables (<39 nt). (E) Schéma représentant un gel PAGE d’urée dénaturant montrant un substrat non coupé (40 nt), où aucune protéine n’a été ajoutée (-), et montrant un substrat coupé de différentes longueurs, où la protéine a été ajoutée (+) qui peut résulter de l’activité d’une exonucléase non spécifique. (F) Les gels TBE urea PAGE montrent un exemple d’activité exonucléase non spécifique de la même nucléase métagénomique de l’Antarctique avec un substrat monobrin. Le dosage a été réalisé à 20 °C pendant 4 h avec des protéines à une concentration finale de 1,5 μM et une concentration finale de l’ion métal à 10 mM. L’ion métallique utilisé est indiqué au-dessus de l’image. L’ajout de la protéine est indiqué par un symbole plus (+), et l’absence de protéine est indiquée par un symbole moins (-). Le substrat (40 nt) est indiqué par la flèche rouge, et les produits de différentes longueurs sont indiqués par la pince rouge. Les résultats de toutes les réactions des nucléases ont été visualisés à l’aide d’un système d’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Résultats de ligature d’un substrat d’ADN entaillé par des versions adénylées et désadénylées d’une ADN ligase bactérienne. (A) i) Quantification de la ligature par l’enzyme ligase adénylée et désadénylée, avec et sans ATP. Les points sur le graphique représentent les moyennes de chaque répétition de réaction. Les barres d’erreur standard sont incluses. ii) TBE urea PAGE gel montrant les résultats de la ligature sur le substrat de l’ADN nick par l’enzyme ligase adénylée et désadénylée, avec et sans ATP. Les réactions ont été réalisées en trois exemplaires. L’enzyme désadénylée a été pré-incubée pendant 2 h à 25 °C avec un substrat d’ADN nick non marqué et une enzyme 0,1 μM, suivie d’une incubation de 1 h avec un substrat d’ADN nick marqué. L’enzyme adénylée n’a pas été pré-incubée avec le substrat non marqué. De l’ATP (1 mM) a été ajouté aux réactions en même temps que le substrat d’ADN marqué. (B) i) Quantification de la ligature par la ligase désadénylée sur l’ADN nick avec différents cofacteurs (ATP, NAD, ADP et GTP). Les points sur le graphique représentent les moyennes de chaque concentration. Les barres d’erreur d’écart-type sont incluses. ii) PAGE D’URÉE TBE montrant les résultats de la ligature par la ligase, avec et sans l’ajout de différents cofacteurs. L’activité contre chaque substrat a été réalisée en double. Les réactions ont été pré-incubées pendant 2 h à 25 °C avec un substrat d’ADN entaillé non marqué, une protéine 4 μM et 5 mM d’ions magnésium, suivies d’une incubation de 4 h avec l’ajout d’un substrat d’ADN entaillé marqué, de 5 mM de magnésium et de différents cofacteurs à une concentration finale de 1 mM. L’ajout de protéines à la réaction est indiqué par un symbole plus (+). On a utilisé des réactions de contrôle qui ne contenaient pas de protéines (témoins, C) ou de cofacteur (aucun cofacteur). Le produit (40 nt) et le substrat (20 nt) sont indiqués par des flèches rouges. Les résultats des analyses d’activité ont été visualisés à l’aide d’un système d’imagerie. Les bandes ont été quantifiées par intégration de l’intensité à l’aide du logiciel ImageJ⁴⁹. Les graphiques ont été générés à l’aide d’un logiciel de création de graphiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Ligature de courts oligonucléotides d’ADN marqués fluorescents à chaque extrémité d’un oligonucléotide d’ARN phosphorylé 5', positionné par des matrices d’ADN. (A) Schéma de ligature d’ADN-ARN avec attelle d’ADN montrant comment les produits de ligature possibles peuvent être visualisés à l’aide d’une stratégie de double marquage. (B) Schéma des produits possibles que l’on s’attend à voir sur un gel Urea-PAGE imagé dans deux canaux. (C) Résultats expérimentaux de la ligature double fluorophore. Les réactions de ligature ont été testées à l’aide de l’ADN ligase T4 et de la ligase R2D, à la fois dans des réactions isolées où l’ADN a été ligaturé à l’extrémité 5' (voie 2-4) ou à l’extrémité 3' (voie 5-7) de l’ARN ou dans une réaction unique où les deux oligonucléotides d’ADN ont été ligaturés dans le même mélange réactionnel (voie 8-10). Aucun témoin protéique (NPC) n’avait d’enzyme ajouté. Les conditions de réaction et les oligonucléotides spécifiques utilisés dans cet exemple sont les mêmes que ceux donnés en⁵⁶. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Ligature de plusieurs segments d’oligonucléotides courts avec trois variants R2D à différents pH. (A) Schéma de la stratégie de ligature en plusieurs parties. (B) Gel représentatif montrant la dépendance du pH d’un assemblage en plusieurs parties, imagé avec les canaux FAM et TAMA. Voie C sans contrôle enzymatique, voies 1-3 pH 6,0, voies 4-6 pH 6,5, voies 7-9 pH 7 et voies 10-12 pH 7,5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Résultats de l’AESM. Gel TBE PAGE schématique et natif d’un test de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) visualisant l’activité de liaison d’une ADN ligase dépendante de l’ATP (provenant de données métagénomiques des vallées sèches^{de Murdo}, Antarctique) sur un substrat d’ADN. (A) Schéma de l’activité de liaison EMSA/ADN par une ADN ligase sur un substrat d’ADN nick. Les résultats de liaison sont visualisés sur un gel TBE PAGE non dénaturant. Les substrats d’ADN liés à l’enzyme ligase migrent plus lentement à travers le gel, tandis que les substrats sans enzymes migrent plus rapidement, ce qui entraîne un décalage de la taille de la bande (cases jaunes) visualisée sur le gel. Lorsque les substrats sont visualisés sur un gel non dénaturant, les oligonucléotides resteront recuits, ce qui permet au brin marqué par FAM (étoile jaune) d’être présent sur les substrats libres et liés. Un gradient de concentration en protéines peut être utilisé pour déterminer la concentration en protéines pour une liaison optimale. (B) Visualisation d’une EMSA sur un gel natif de TBE PAGE, montrant la capacité de liaison d’une ADN ligase dépendante de l’ATP à un substrat d’ADN nick à différentes concentrations de protéines. L’enzyme a été incubée avec un substrat d’ADN entaillé pendant 30 min à 25 °C, avec une concentration finale de 1 mM d’ATP et 40 mM d’EDTA. Trois concentrations protéiques différentes ont été utilisées (5,5 μM, 2,3 μM et 1,5 μM). Les réactions ont été exécutées sur un gel TBE natif à 10 %, avec un colorant de charge natif dans les réactions. Les échantillons contenant des protéines ont été analysés en trois exemplaires pour différentes concentrations de protéines. Les voies de contrôle contiennent un substrat d’ADN entaillé avec 1 mM, de l’ATP final et de l’EDTA, mais pas de protéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Séquences d’oligonucléotides de substrats d’ADN utilisées pour construire des substrats de dosage. Les dommages sont indiqués en gras et soulignés. Les positions de décalages et d’écarts dans le duplex final sont soulignées. Abréviations : 5' 6-carboxyfluorescien (5' FAM), 8-Oxo-désoxyguanosine (8OxodG), tétrohydrofurane abasique (dSpacer). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Combinaisons d’oligonucléotides utilisées pour assembler des mélanges maîtres pour différents dosages enzymatiques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Mise en place de mélanges maîtres d’essai avec jusqu’à quatre oligonucléotides. Voir le tableau 2 pour les combinaisons d’oligonucléotides à utiliser pour différents substrats d’essai et le texte pour les détails des conditions de réaction. Au minimum, un oligonucléotide marqué est nécessaire - des parties supplémentaires du duplex sont indiquées par des parenthèses. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 : Composants d’un master mix étiqueté et non étiqueté pour la fabrication d’un duplex d’ADN nick. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5 : Mise en place des mixages maîtres EMSA pour différentes combinaisons de duplex. Voir le tableau 3 pour les combinaisons d’oligonucléotides à utiliser pour différents substrats de l’EMSA et le texte pour les détails des conditions de réaction. Les substrats de l’EMSA sont conçus à l’aide des mêmes oligonucléotides que ceux utilisés pour les dosages d’activité. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Étapes critiques du protocole
Conception et achat d’oligonucléotides : Lors de l’achat d’oligonucléotides pour la formation duplex, il est essentiel de prendre en compte la conception de séquences. Il est recommandé d’utiliser un outil d’analyse d’oligonucléotides pour prédire les propriétés de la séquence nucléotidique, telles que la teneur en GC, la température de fusion, la structure secondaire et le potentiel de dimérisation, avant d’en commander⁵⁷.

Assemblage et recuit de duplex d’acides nucléiques : Lors de la préparation de duplex d’ARN/ARN-ADN, il faut prendre soin de prévenir la contamination par la RNase en utilisant des réactifs et de l’eau exempts de RNase ou en ajoutant un inhibiteur de l’ARNase (à condition que l’enzyme étudiée ne soit pas elle-même une ARNASE). L’équipement, les gants et l’espace de la paillasse doivent être traités avec une solution de décontamination de la RNase avant l’assemblage des mélanges maîtres afin d’éviter la dégradation des oligonucléotides⁵⁸. Les stocks maîtres d’oligonucléotides d’ARN peuvent être constitués en petits lots en cas de contamination.

Les ADN ligases nécessitent toujours un cofacteur nucléotidique, soit ATP ou NAD, à une concentration finale comprise entre 0,1 et 1 mM. Les ADN polymérases nécessitent des dNTP pour la synthèse des brins, et ceux-ci sont généralement ajoutés dans des rapports équimolaires à 50 μM de chaque. Lors de la préparation de mélanges maîtres pour les duplex ligases et polymérases, des cofacteurs nucléotidiques, tels que l’ATP, le NAD et les dNTP, doivent être ajoutés au mélange maître après que le mélange a été chauffé et refroidi à température ambiante, car ils sont sensibles à la chaleur.

Le tampon 10x pour le recuit des oligonucléotides nécessite l’ajout de DTT, qui a une demi-vie courte et doit idéalement être préparé frais ou congelé avant utilisation. Des aliquotes plus petites du tampon 10x peuvent être préparées à l’avance et stockées à 4 °C, avec l’ajout de DTT avant utilisation.

Les stocks d’oligonucléotides et les mélanges maîtres doivent être conservés à -20 °C pour une utilisation à long terme, et les oligonucléotides ou les mélanges marqués par fluorescence doivent être enveloppés dans une feuille d’aluminium pour empêcher le photoblanchiment du fluorophore. Pour éviter les cycles répétés de congélation-décongélation qui peuvent compromettre l’intégrité des oligonucléotides, il est conseillé de préparer et d’utiliser des volumes plus petits (>1 mL).

Configuration du test et analyse des résultats : L’inclusion de contrôles est essentielle pour l’interprétation correcte des résultats du test. Un témoin sans protéine (substrat d’ADN avec solution tampon) doit être utilisé pour s’assurer que l’activité apparente sur le substrat est le résultat de l’enzyme. Dans le cas des nucléases, la dégradation exogène du substrat entraînera des bandes de faible poids moléculaire ou une échelle dans le contrôle, tandis que dans le cas de la ligase ou de la polymérase, une dénaturation duplex incomplète entraînera une bande de poids moléculaire élevé chez le contrôle. Le tableau 2 fournit un contrôle positif de la taille du produit prévu et doit être inclus pour vérifier la bonne taille du produit.

Des paramètres importants pour une électrophorèse réussie du produit d’essai ont été décrits dans un protocole précédent⁵⁹. Il s’agit notamment de s’assurer que le pourcentage d’acrylamide est adapté à la taille du substrat et d’utiliser un colorant de chargement approprié en fonction de la taille du substrat et du type de gel requis pour la visualisation des résultats. Le colorant de suivi bleu de bromophénol a la taille approximative d’un oligonucléotide à 10 bases et convient donc à l’ensemble d’oligonucléotides décrit ici ; Cependant, s’il y a une bande de colorant chevauchant le produit fluorescent ou les bandes de substrat lors de l’utilisation de nucléotides plus courts, le colorant de suivi peut être remplacé par du xylène cyanol, qui se déroule plus lentement⁶⁰.

Pour assurer une bonne résolution des bandes de substrat/produit, le réservoir de gel doit être chauffé soit par l’extérieur à l’aide d’un bain-marie, soit en faisant fonctionner une tension élevée (par exemple, 180 V). Il est essentiel de pré-faire fonctionner l’urée PAGE pendant au moins 30 minutes et de rincer les puits avec une pipette pour éliminer l’excès d’urée afin d’obtenir des bandes nettes et droites adaptées à la quantification.

Pour la quantification des substrats et des produits, une plage de 20 à 80 % du matériau total doit être convertie en produit pour permettre une intégration précise des bandes de gel fluorescent. Si l’on analyse une nouvelle enzyme, il est recommandé d’effectuer un gradient de concentrations en protéines pour permettre d’effectuer des mesures ultérieures dans cette plage. De nombreux imageurs de fluorescence ont des fonctions d’intégration de bande intégrées qui peuvent être utilisées à cette fin. Si vous utilisez un programme externe comme ImageJ⁴⁹, assurez-vous que l’image gel est exportée en haute qualité au format tiff.

Modifications et dépannage de la technique
Conception et achat d’oligonucléotides : Les oligonucléotides donnés dans ce protocole sont des points de départ utiles et peuvent être développés, comme suggéré dans la section méthodes, en modifiant les séquences d’oligonucléotides et en incorporant des modifications.

Mise en place d’un test standard et analyse des résultats : Les expériences pilotes sont essentielles pour tester l’activité d’une nouvelle enzyme, car les conditions de réaction optimales varient entre les différentes protéines ; Les paramètres donnés dans le présent protocole ne servent que de point de départ. Des facteurs tels que la concentration enzymatique, la température de réaction, la durée d’incubation, le cofacteur et la composition/pH du tampon peuvent varier au cours du mélange maître et de l’assemblage de la réaction d’essai. Les concentrations de cofacteurs sont particulièrement importantes car un excès de cofacteurs nucléotidiques ou d’ions métalliques peut être inhibiteur, et il est conseillé de tester une gamme de concentrations de chacun. Pour les ADN polymérases, les concentrations recommandées de dNTP varient de 20 à 200 μM au total, mais des concentrations élevées de dNTP diminuent la fidélité⁶¹. De même, les polynucléotides ligases sont généralement dosées avec un cofacteur nucléotidique de 0,1 à 1,0 mM, mais des concentrations excessives provoquent une accumulation d’ADN adénylate et une inhibition de la réaction⁶².

Le protocole standard utilise le Mg comme cation divalent ; cependant, certaines enzymes sont plus actives avec le manganèse (Mn) ou le zinc (Zn). Les mélanges maîtres contenant du Mn ou du Zn doivent être préparés avec un tampon de pH plus faible (<7,5), et les métaux doivent être ajoutés après le chauffage. Les mélanges maîtres doivent être utilisés le même jour pour éviter la précipitation et l’inhibition de l’activité enzymatique.

Des additifs, y compris des agents d’encombrement tels que le polyéthylène glycol (PEG) ou des stabilisants tels que l’albumine sérique bovine, peuvent être utilisés pour augmenter l’activité de certaines enzymes^63,64. Ceux-ci doivent être ajoutés après l’étape de recuit en raison de leur thermolabilité. Tous les réactifs d’origine biologique doivent être de qualité biologie moléculaire pour éviter l’introduction de nucléases contaminantes.

Le volume de tampon d’extinction de formamide utilisé dans ce protocole est adapté à l’ensemble de base des oligonucléotides. Cependant, pour les oligonucléotides plus longs, le volume de formamide doit être augmenté entre 10 μL et 20 μL pour assurer une séparation complète des brins, et les réactions trempées peuvent être refroidies par pression sur de la glace et stockées à 4 °C jusqu’à l’électrophorèse.

Avec certaines enzymes, la liaison étroite de la protéine au substrat/produit peut empêcher la migration des oligonucléotides dans le gel pendant l’électrophorèse, en particulier lorsque l’enzyme est utilisée à des concentrations élevées. Cela se traduira par un manque de bandes produit/substrat sur le gel et souvent une accumulation de matière fluorescente (produit et/ou substrat complexé avec des protéines) dans les puits. Pour perturber ces complexes, le mélange de dosage peut être traité avec de la protéinase K avant l’ajout d’un tampon de trempe, ou du dodécylsulfate de sodium (SDS) peut être ajouté pendant la trempe.

L’activité de l’ADN ligase produit deux bandes discrètes, qui sont simples à quantifier. Il est possible d’utiliser la même méthode pour quantifier l’activité de l’endonucléase sur un substrat endommagé à l’ADN où un seul produit nucléotidique de 20 est prévu, ou des tests EMSA où les états liés/non liés sont clairement distingués. La quantification précise de l’activité de la polymérase et des nucléases processives est difficile par l’intégration de bandes, et en général, il est recommandé d’utiliser le dosage en temps réel avec des sondes ou des balises, comme décrit dans l’introduction.

Dédésadénylation et spécificité des cofacteurs de l’ADN ligase : Une certaine optimisation de ce protocole peut être nécessaire pour supprimer toute activité de fond, qui sera ensuite restaurée par l’ajout du ou des cofacteurs nucléotidiques. Si l’activité de fond de la ligase persiste après la désadénylation (considérée comme une ligature dans le contrôle sans cofacteur), le temps d’incubation de l’étape de désadénylation peut être augmenté ou la concentration de ligase diminuée. Assurez-vous que l’entaille duplex de l’ADN sans marquage est plus concentré que la protéine (> 4:1 ::substrat : protéine). Si l’ajout d’un cofacteur en présence d’ADN marqué ne rétablit pas la ligature pour l’un des cofacteurs testés, il est possible que l’enzyme se soit dénaturée et que l’étape de désadénylation doive être raccourcie. Pour une nouvelle ligase ou un nouveau lot d’enzyme recombinante, il est utile de déterminer l’étendue de la ligature de fond avec l’enzyme adénylée en l’absence de cofacteurs nucléotidiques supplémentaires. Cela implique la mise en place d’une autre réaction où 10 μL de mélange maître non marqué, 10 μL de mélange maître marqué et 2,5 μL d’une enzyme fraîche qui n’a pas été désadénylée sont incubés simultanément.

Utilisez des substrats à double marquage : Ce protocole nécessite la conception et l’achat d’un oligonucléotide avec une fraction fluorescente qui a un spectre d’excitation/émission différent de celui du fluorophore utilisé à l’origine, puis l’assemblage de celui-ci en un duplex de sorte que les deux fluorophores orthogonaux marquent différentes parties du substrat. En cas de doute, un certain nombre de visionneuses spectrales en ligne sont disponibles pour vérifier les spectres d’excitation et d’émission, par exemple, FPbase Spectra Viewer et BD Spectrum Viewer, qui peuvent être utilisés pour vérifier à la fois la compatibilité de la paire de fluorophores et les paramètres d’imageur les plus appropriés. Les paramètres spécifiques utilisés pour visualiser le gel dépendront du modèle de l’imageur et du ou des fluorophores utilisés. L’image composite enregistrera le signal des deux canaux sur le gel unique, et la bande où les deux fluorophores sont attachés au même produit s’affichera comme une couleur intermédiaire. Des images distinctes de canaux individuels peuvent être analysées pour quantifier l’étendue de la ligature ou de la dégradation sur des brins marqués différentiellement.

Limites de la technique
Bien que le travail avec des substrats marqués par fluorescence présente de nombreux avantages, tels que de faibles risques pour la santé, il existe certaines limites à prendre en compte lors de l’utilisation de ces types de substrats marqués. L’un d’eux est le coût relativement élevé de la commande de ces oligonucléotides avec des marqueurs fluorophores ou des modifications, telles que l’ajout de bases endommagées, par rapport au radiomarquage interne. Une autre est que des équipements et des logiciels d’imagerie spécialisés sont nécessaires pour la détection des brins marqués. Cependant, ces fonctionnalités sont maintenant incluses dans la plupart des nouveaux systèmes d’imagerie en gel. Il faut également tenir compte du potentiel des fluorophores à modifier les propriétés de liaison des protéines d’interaction cibles. La fluorescéine et son dérivé FAM sont couramment utilisés pour marquer les oligonucléotides et sont sensibles aux changements de pH et à l’extinction des nucléobases⁶⁵. Ces limites doivent être soigneusement prises en compte lors du choix du type et de l’emplacement des fluorophores sur l’oligonucléotide pour la conception duplex.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
30 % Acrylamide/Bis Solution (29:1)	BioRad	1610156
Adénosine triphosphate (ATP)	Nombreux fournisseurs
Persulfate d’ammonium (APS)	Nombreux fournisseurs
Centrifugeuse de paillasse	De nombreux fournisseurs
Borate	De nombreux fournisseurs
Bleu de bromophénol	Beaucoup fournisseurs
Dithiothreitol (DTT)	De nombreux fournisseurs
d’électrophorèse avec bain d’eau en circulation	De nombreux fournisseurs
d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	De nombreux fournisseurs
Imageur de fluorescence, par exemple iBright FL1000	Thermo Fisher Scientific	A32752
Formamide	Beaucoup fournisseurs
Système de coulée	de gel De nombreux fournisseurs
Bloc chauffant	De nombreux fournisseurs
Chlorure de magnésium	De nombreux fournisseurs		D’autres ions métalliques peuvent être préférés en fonction de la protéine étudiée
Tubes de microcentrifugation (1,5 mL)	Nombreux fournisseurs
Micropipettes et pointes	De nombreux fournisseurs		1 mL, 0,2 mL, 0,02 mL, 0,002 mL
Nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+)	Nombreux fournisseurs
Oligonucléotides	Integrated DNA Technologies	NA	Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,  ; Genscript et d’autres fournissent également ces
pipettes de pâturage	De nombreux fournisseurs
Thermocycleur PCR	De nombreux fournisseurs
tubes PCR	De nombreux fournisseurs
RNAse away	ThermoFisher	7002PK	Uniquement nécessaire lors de l’utilisation d’oligos d’ARN
RNase AWAY	Merck	83931-250ML	Tensioactif pour l’élimination de l’ARNase contamination sur les surfaces
Eau sans RNAse	New England Biolabs	B1500L	Uniquement nécessaire pour travailler avec des oligos d’ARN
Chlorure	de sodium De nombreux fournisseurs
SUPERase IN Inhibiteur de RNase	Thermo Fisher Scientific	AM2694	Inhibiteur d’ARNase à large spectre (à base de protéines)
SYBR Gold	Thermo Fisher Scientific	S11494	Cela peut être utilisé pour post-coloration des gels et visualiser des oligonucléotides non marqués
Tétraméthyléthylènediamine (TMED)	De nombreux fournisseurs
Tris, ou tris(hydroxyméthyl)aminométhane	De nombreux fournisseurs
Eau ultrapure (Milli-Q)	Merck
urée De	nombreux fournisseurs
Vortex	De nombreux fournisseurs