Article de méthode

Technique d’administration intranasale d’agrégats de α-synucléine

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DOI :

10.3791/66943

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8 novembre 2024

 , 
1Department of Neurology, Graduate School of Medicine, Kyoto University

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode d’administration intranasale d’agrégats de α-synucléine. Cette méthode permet de mieux comprendre la propagation de la α-synucléine de la muqueuse olfactive au bulbe olfactif dans la maladie de Parkinson.

Résumé

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la présence de corps de Lewy, qui sont des agrégats de α-synucléine (α-Syn). Récemment, il a été proposé que la maladie se développe et progresse par la propagation de type prion d’agrégats α-Syn à partir du bulbe olfactif (OB) ou du noyau dorsal du nerf vague. Bien que l’origine des agrégats α-Syn dans l’OB reste incertaine, leur propagation à partir de la muqueuse olfactive a été récemment suggérée. Nous avons précédemment montré que l’administration intranasale d’agrégats α-Syn dans un modèle murin induisait une pathologie α-Syn dans l’OB de souris. Dans cette étude, nous présentons une méthode d’administration intranasale d’agrégats α-Syn qui a induit la pathologie α-Syn dans l’OB de souris. L’administration intranasale d’agrégats α-Syn est une méthode très simple et directe, et nous pensons qu’elle sera un outil utile dans la recherche pour élucider l’origine de la pathologie α-Syn dans l’OB et la voie de propagation de α-Syn à travers le système olfactif.

Introduction

La maladie de Parkinson (MP), qui se caractérise par des symptômes moteurs tels que la bradykinésie, les tremblements au repos et la rigidité musculaire, est la deuxième maladie neurodégénérative la plus courante. La MP présente également des symptômes non moteurs, notamment un dysfonctionnement olfactif, des troubles cognitifs, une dépression, des hallucinations, une constipation et une hypotension orthostatique. Ses caractéristiques pathologiques sont la mort cellulaire dopaminergique dans la substance noire et la présence d’agrégats de α-synucléine (α-Syn), appelés corps de Lewy2.

Il convient de noter que α-Syn est une protéine de 140 acides aminés qui existe sous la forme d’un monomère soluble (ou tétramère) dans des conditions normales. Cependant, dans des conditions anormales, le monomère soluble est converti en agrégats insolubles de haut poids moléculaire, y compris des oligomères et des fibrilles. La transition de α-Syn en oligomères et en fibrilles serait impliquée dans la toxicité cellulaire3.

Des études récentes ont suggéré la propagation de type prion des agrégats α-Syn entre les neurones. Sur la base de nombreux examens post-mortem, Braak et al. ont proposé en 2003 l’hypothèse selon laquelle la pathologie à corps de Lewy se propage progressivement dans le cerveau de manière quelque peu stéréotypée (hypothèse de Braak)4,5. En 2008, l’examen post-mortem de patients atteints de la MP ayant reçu une greffe de mésencéphale fœtal a révélé des corps de Lewy dans les neurones dopaminergiques dérivés de tissus fœtaux 6,7. Ces études ont suggéré que les agrégats α-Syn pourraient se propager du cerveau malade aux greffons, soutenant ainsi l’hypothèse de Braak.

À la suite de ces observations, des expériences impliquant des cultures neuronales primaires et l’injection intracérébrale d’agrégats α-Syn chez la souris ont reproduit la propagation d’agrégats semblables à des corps de Lewy, fournissant des preuves supplémentaires de la propagation de α-Syn d’une manière semblable à celle des prions 8,9.

Braak et al. ont montré que la pathologie à corps de Lewy dans la MP commence dans le bulbe olfactif (OB) et/ou le noyau dorsal du nerf vague (dmX)4. Sur la base de l’hypothèse de Braak, plusieurs études ont rapporté l’administration d’agrégats α-Syn ou d’extraits de corps de Lewy à partir de cerveaux MP dans l’OB et le tractus gastro-intestinal d’animaux de laboratoire 10,11,12. En 2018, une étude a démontré que l’administration d’agrégats α-Syn dans l’OB de souris de type sauvage induisait la propagation de la pathologie α-Syn le long de la voie olfactive, entraînant un dysfonctionnement olfactif13. Nous avons précédemment inoculé des agrégats α-Syn dans l’OB de souris transgéniques α-Syn et avons constaté que cela entraînait une atrophie de l’hippocampe et des troubles de la mémoire14.

En 2022, nous avons inoculé des agrégats de α-Syn dans l’OB de ouistitis, un petit primate non humain ; cela a entraîné la propagation de la pathologie α-Syn le long de la voie olfactive, une atrophie OB et une hypométabolisation généralisée du glucose cérébral10.

Cependant, si la propagation des agrégats α-Syn se produit à partir de l’OB, une question cruciale se pose : par quel mécanisme les agrégats α-Syn apparaissent-ils initialement ? Saito et al. ont précédemment signalé la présence de corps de Lewy dans la muqueuse nasale15. La présence d’agrégats α-Syn a été détectée dans la muqueuse nasale de patients atteints de MP et d’atrophie multisystématisée (AMS) à l’aide d’une analyse de conversion induite par le tremblement en temps réel (RT-QUIC)16. Notamment, l’analyse d’échantillons de muqueuse nasale de patients atteints de troubles du comportement en sommeil (TCSP), qui est considéré comme un stade prodromique de la MP, a révélé une augmentation des niveaux de α-Syn17. Cette étude a suggéré que la pathologie α-Syn pourrait exister dans la muqueuse nasale même à partir de la phase prodromique de la MP.

Bien que ces résultats suggèrent une voie potentielle de la muqueuse nasale à l’OB, il existe peu de preuves expérimentales à l’appui de ce scénario. Pour combler cette lacune, nous avons administré des agrégats de α-Syn dans la cavité nasale de souris et étudié la propagation de la pathologie α-Syn de la muqueuse nasale à l’OB. Notre approche expérimentale a démontré qu’une administration intranasale à dose unique d’agrégats de α-Syn chez des souris de type sauvage induisait une pathologie α-Syn dans l’OB, fournissant des preuves expérimentales de la voie de propagation de la muqueuse nasale à l’OB.

Protocole

Des souris mâles C57BL/6J âgées de 2 mois ont été utilisées pour cette étude. Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux directives nationales. Le Comité de recherche animale de l’Université de Kyoto a accordé l’approbation éthique et l’autorisation pour cette étude (MedKyo 23 544).

1. Administration intranasale de fibrilles préformées α-Syn

  1. Préparer une solution de fibrilles α-Syn de souris dans du PBS (4 mg/mL) selon les méthodes précédemment rapportées11. Enveloppez le tube d’un film transparent pour éviter toute contamination.
  2. Sonicate 200 μL de solution de fibrilles α-Syn pour générer des fibrilles préformées α-Syn (PFF) à l’aide d’un sonicateur de type bain-marie (Tableau des matériaux). Remplissez le bain à ultrasons d’eau et ajoutez des glaçons pour refroidir à 4 °C pour la sonication. Fibrilles sonicates pendant un total de 5 minutes, chaque cycle étant composé de 30 s de sonication suivies d’un intervalle de 30 s (un total de cinq cycles).
    REMARQUE : Utilisez des équipements de protection individuelle tels que des gants jetables, un masque et des lunettes de sécurité pour éviter l’exposition au α-Syn.
  3. Préparez une pipette P10 (Table des matériaux) avec une pointe de pipette de 10 μL. Anesthésier chaque souris à l’aide d’une combinaison de chlorhydrate de médétomidine, de midazolam et de butorphanol (MMB) par injection intrapéritonéale (i.p.). L’agent anesthésique combiné MMB contenait du midazolam (0,3 mg/kg), de la médétomidine (4 mg/kg) et du tartrate de butorphanol (5 mg/kg). Utiliser 0,005 mL/g par injection intraveineuse en mélangeant 0,3 mL de midazolam (1 mg/mL), 0,8 mL de médétomidine (5 mg/mL), 1 mL de tartrate de butorphanol (5 mg/mL) et 2,9 mL de solution saline.
  4. Attendez 10 minutes pour vous assurer que les souris ont été complètement anesthésiées. Une anesthésie appropriée peut être confirmée si la souris est en décubitus latéral et ne peut pas se redresser. Une fois anesthésié, appliquez une pommade ophtalmique à l’aide d’un applicateur en coton stérile pour prévenir le dessèchement des yeux.
    REMARQUE : Sans anesthésie, lors de l’administration de doses nasales, il est difficile de garder les souris en décubitus dorsal et d’administrer correctement la solution α-Syn pendant que les souris éternuent. Pour ces raisons, la sédation était nécessaire.
  5. Placez la souris anesthésiée en position couchée. Placez une serviette en papier ou un matériau similaire sous le corps, en veillant à ce que la tête soit légèrement inclinée vers le bas (Figure 1A,B). Ce positionnement empêche la solution α-Syn administrée de s’écouler rapidement dans les poumons ou l’œsophage, facilitant ainsi sa rétention dans la cavité nasale. Les narines sont visibles sur la figure 1C.
  6. Prélever 1 μL de solution de α-Syn (4 mg/mL) dans une pipette P10 et placer la pointe de la pipette près du nez de la souris. Formez lentement une goutte ronde et maintenez-la à l’extrémité de la pointe de la pipette (Figure 1D, flèche rouge). L’administration intranasale est effectuée pour la narine unilatérale, utilisez le côté controlatéral comme côté contrôle.
  7. Approchez la goutte d’un côté des narines de la souris et laissez la souris l’inhaler naturellement. Surveillez l’inhalation et attendez de 30 s à 1 min (figure 1E).
  8. Répétez les étapes 1.6.-1.7. jusqu’à ce qu’un volume total de 20 μL de solution α-Syn soit administré. Après toutes les procédures, jetez les gants et essuyez un banc avec des détergents commerciaux si la surface est contaminée par α-Syn
    REMARQUE : L’ensemble de la procédure doit être effectué dans une enceinte de sécurité afin d’éviter l’inhalation de fibrilles α-Syn par le personnel qui effectue la procédure. Un rapport précédent a montré que le volume de 25 μL est le plus efficace pour l’administration de médicaments par le nez vers le cerveau18. Nous utilisons un volume similaire de 20 μL dans la présente étude. Nous utilisons également la même concentration de PFF que celle pour l’injection dans le OB dans le rapport précédent10, qui est proche des 400 μM (5,6 mg/mL) des PFF19.
  9. Administrer de l’atipamézole (3 mg/kg ; Table des matériaux) par injection intraveineuse pour inverser la médétomidine et faciliter la récupération. Utiliser 0,005 mL/g par injection intraveineuse en mélangeant l’atipamézole (5 mg/mL) 0,6 mL et la solution saline 4,4 mL.
    REMARQUE : Fournir une analgésie parce qu’on ne comprend pas entièrement à quel point l’administration intranasale de α-Syn serait stressante.
  10. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elle ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Une fois la récupération complète, remettez la souris dans la cage.

2. Préparation de l’échantillon

  1. Sacrifiez les souris traitées à 1, 3, 6 et 12 mois après l’administration intranasale de fibrilles préformées par α-Syn.
    1. Mettez les souris dans la boîte d’induction, administrez du sévoflurane (>6,5 %) et continuez jusqu’à ce qu’un arrêt respiratoire se produise pendant > 60 s. Retirez les souris et effectuez une exsanguination rapide par incision auriculaire droite pour assurer l’euthanasie.
  2. Insérez une aiguille de 25 G (Table des matériaux) dans l’apex du cœur. Perfuser la souris à 4 mL/min avec 15 mL de PBS, puis 15 mL de PFA à 4 % dans du PBS.
  3. Coupez la tête avec des ciseaux et faites une incision de 2 cm dans le cuir chevelu avec un scalpel. Inciser l’os crânien avec des ciseaux sur le côté latéral du bas vers le nez (Figure 2A,B). Pour obtenir les OB, retirez complètement l’os crânien des OB (Figure 2B, cercle jaune).
  4. Retournez la tête, sectionnez les nerfs cérébraux, puis retirez soigneusement le cerveau à l’aide d’une pince (Figure 2C, D). Obtenez le cerveau avec des OB intacts (Figure 2E). Pour obtenir les OB intacts, coupez soigneusement les nerfs olfactifs à l’aide d’une pince pendant que les OB se fixent à l’os du crâne (Figure 2D, cercle jaune).
  5. Placez les échantillons de cerveau dans le PFA à 4 % dans le PBS pendant la nuit à 4 °C. Ne laissez pas les échantillons de cerveau pendant plus de 24 heures.
    REMARQUE : Une fixation excessive réduira la coloration immunohistochimique. Si un entreposage à long terme est nécessaire, conservez les échantillons de cerveau dans de l’éthanol à 70 % ou du PBS contenant 0,1 % d’azoture de sodium pour maintenir la stérilité.

3. Coloration immunohistochimique de l’OB

  1. Parafiniser les échantillons à l’aide d’un processeur de tissu automatique (Table des matériaux) comme décrit ci-dessous.
    1. Immersion dans de l’éthanol à 70 % pendant 120 min, suivie d’une immersion dans de l’éthanol à 100 % pendant 8 fois pendant 60 min. Ensuite, immergez-le dans du xylène à 100 % pendant 3 fois pendant 120 min.
    2. Immerger dans la paraffine à 60 °C pendant 120 min, puis immerger dans la paraffine à 60 °C pendant 240 min.
  2. Intégrez les échantillons dans la paraffine comme décrit ci-dessous.
    1. Intégrer les échantillons dans de la paraffine à 60 °C à l’aide d’un centre modulaire d’enrobage tissulaire (Table des matériaux). Refroidissez-les sur de la glace.
  3. Coupez les échantillons en sections de 8 m d’épaisseur à l’aide d’un microtome (Table des matériaux)18.
  4. Effectuez la déparaffinisation comme décrit ci-dessous.
    1. Immerger dans du xylène à 100 % pendant 5 minutes, puis immerger dans de l’éthanol à 100 % pendant 2 fois pendant 3 minutes.
    2. Immerger dans de l’éthanol à 70 % pendant 3 min. Laver au PBS pendant 3 min.
  5. Effectuez le prélèvement de l’antigène comme décrit ci-dessous.
    1. Immerger dans l’acide formique à 100 % pendant 15 min. Rincer dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 2 min.
    2. Autoclave à 120 °C pendant 10 min. Laissez-le refroidir naturellement.
  6. Immerger dans du peroxyde d’hydrogène à 1 % dans du méthanol pendant 10 min. Laver au PBS pendant 5 min.
  7. Ajouter 500 μL de lait écrémé à 5 % dans du PBS sur les lames et les incuber pendant 30 min à température ambiante.
  8. Placez les 500 μL d’anticorps antiphosphorylés α-Syn (p-α-Syn, 1/10000) dans du PBS sur les lames et incuberez-les pendant une nuit à 4 °C. Lavez 2 fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune.
  9. Incuber avec un polymère immuno-peroxydase universel, anti-Lapin (Table des Matériaux) pendant 1 h à 25 °C. Lavez 2 fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune.
  10. Développer à l’aide du kit de coloration 3,3'-diaminobenzidine (DAB) (Table des matériaux) pendant 5 min selon les instructions du fabricant.
  11. Immerger dans une solution d’hématoxyline pendant 1 min (Tableau des matériaux). Décolorer à l’eau courante pendant 10 min.
  12. Effectuez le montage comme décrit ci-dessous.
    1. Immerger dans de l’éthanol à 70 % pendant 5 min. Immerger dans 100 % éthanol pendant 2x pendant 5 min.
    2. Immerger dans 100 % xylène pendant 2x pendant 5 min. Montage à l’aide d’un support d’enrobage (Table des matériaux). Appliquez les 100 μL d’un milieu d’enrobage sur les lames et recouvrez d’une lamelle en verre.
  13. Acquérez des images à l’aide d’un microscope tout-en-un avec des grossissements de 20x et 40x (Table des matériaux).

Résultats

La figure 3 montre plusieurs exemples d’agrégats α-Syn dans l’OB. Dans la présente étude, nous avons administré des agrégats de α-Syn dans la narine unilatérale. Les deux cavités nasales sont séparées par la cloison nasale, et chaque OB projette les neurones sensoriels olfactifs dans chaque cavité nasale séparément. Par conséquent, le OB du côté controlatéral peut être utilisé comme contrôle.

La pathologie P-α-Syn n’a pas été observée dans le bloc obstétrique du côté traité après 1 et 3 mois (Figure 3A, B). Des agrégats p-α-Syn de type neurite de Lewy ont été observés dans les glomérules du côté traité après 6 et 12 mois. (Figure 3C, D, F, G). Ces agrégats n’ont pas été observés dans le OB du côté du témoin (figure 3E).

Nous pouvons estimer la pathologie α-Syn en comptant les agrégats α-Syn ou en examinant la taille, etc., en utilisant ImageJ (Table of Materials). Par exemple, nous avons précédemment compté et rapporté le nombre d’agrégats α-Syn dans ce modèle20. Dans l’OB du côté traité, les agrégats de type neurite de Lewy dans l’OB ont augmenté de manière significative sur 12 mois (ANOVA à un facteur, suivie du test de Dunnett, p < 0,01 ; Figure 3H). Dans l’OB du côté du contrôle, il y a peu d’agrégats α-Syn.

Une étude antérieure a montré que les PFF injectés dans le cerveau de la souris étaient dégradés en une semaine, et que le α-Syn endogène de souris était converti en agrégats α-Syn19. Dans la présente étude, l’augmentation de la pathologie α-Syn au fil du temps indique que le α-Syn endogène de souris a été converti en agrégats α-Syn par l’administration intranasale à dose unique de PFF. Ces résultats ont indiqué que la pathologie α-Syn pouvait se propager de la muqueuse olfactive à l’OB.

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Figure 1 : Méthode d’administration de la cavité nasale de la souris. (A) La souris est positionnée en position couchée avec la tête légèrement inclinée vers le bas. (B) Les narines de la souris sont indiquées par des pointes de flèches jaunes. (C, D) La solution de fibrille α-Syn est déposée dans la narine de la souris (C, flèche rouge) et rapidement inhalée (D, flèche rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Aperçu des étapes pour obtenir les bulbes olfactifs intacts. (A) À l’aide de ciseaux, inciser l’os crânien sagittairement et latéralement (ligne pointillée jaune). (B) Retirez complètement l’os crânien sur les bulbes olfactifs (OB). (C) Retournez la tête et retirez soigneusement le cerveau. Sectionner les nerfs cérébraux. (D) Coupez les nerfs olfactifs attachés à l’os crânien. (E) L’ensemble du cerveau avec les OB intacts. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Agrégats P-α-Syn dans les glomérules du bulbe olfactif. (A-G) Immunohistochimie du P-α-Syn (EP1536Y) du côté traité 1, 3, 6 et 12 mois (1 m, 3 m, 6 m et 12 m, respectivement) après l’administration intranasale et (E) du côté témoin 12 mois après l’administration intranasale. (C, D) Des agrégats α-Syn filiformes filiformes en forme de neurite de Lewy apparaissent autour des glomérules. (F, G) Les images agrandies sont des images à fort grossissement de p-α-Syn de type neurite de Lewy 6 et 12 mois après l’administration intranasale. (H) La quantité de dépôt de p-α-Syn de type neurite de Lewy dans l’OB du côté traité et du côté témoin (n = 4-5). Les graphiques montrent la moyenne ± MEB. ANOVA à un facteur suivie d’un test de Dunnett ; **<0,01. Ce chiffre a été modifié par rapport au rapport précédent20. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Dans une étude précédente, l’administration d’agrégats α-Syn dans la cavité nasale des macaques a induit la mort des cellules dopaminergiques et le dépôt de fer dans la substance noire, bien que les agrégats α-Syn n’aient pas été observés21. L’administration quotidienne d’agrégats A53T α-Syn humains dans la cavité nasale de souris transgéniques α-Syn promotrices de prions (souris M83) pendant 28 jours a été signalée pour induire une pathologie α-Syn dans le cerveau et des symptômes moteurs chez les souris 19,22. Dans la présente étude, nous avons démontré qu’une administration à dose unique de α-Syn s’agrège dans la cavité nasale de souris de type sauvage induit une pathologie α-Syn dans l’OB. Cette méthode simple pourrait être considérée comme précieuse pour étudier la propagation de α-Syn de la muqueuse nasale à l’OB.

Une sonication suffisante des fibrilles α-Syn dans cette méthode est cruciale, car des rapports précédents ont montré que la petite taille des agrégats fragmentés de α-Syn est la plus efficace pour déclencher la pathologie α-Syn23,24. Une sonication insuffisante des fibrilles α-Syn entraînera une faible propagation vers le OB. Comme différents sonicateurs ont une puissance de sonication variable, l’optimisation de ce processus est nécessaire. La posture couchée de la souris lorsque la solution α-Syn est administrée dans les narines de la souris est également cruciale. Si la tête de la souris est surélevée, la solution α-Syn s’écoulera dans les poumons et l’œsophage. Une posture inappropriée peut entraîner une mort inattendue ou une propagation insuffisante de α-Syn.

Dans la présente étude, i.p. a utilisé une combinaison d’agents anesthésiques MMB pour l’anesthésie. Il a été rapporté que l’anesthésie combinée MMB fournissait une bonne sédation et une bonne analgésie, et que son effet pouvait être rapidement inversé par l’atipamézole23. Étant donné que l’anesthésie par inhalation nécessite de couvrir les narines avec un masque pour maintenir l’anesthésie, il est plus difficile d’administrer la solution α-Syn par voie intranasale. De plus, le modèle de roténone a été largement étudié et constitue un modèle très utile25. Cependant, il s’agit d’un modèle induit par un médicament et peut avoir des mécanismes pathologiques différents de ceux de la maladie de Parkinson idiopathique (iPD)25. Comme ce modèle a induit la propagation de α-Syn, nous pensons qu’il est plus proche de l’iPD.

Notre étude a également suggéré que les agrégats exogènes de α-Syn pourraient se transmettre par la muqueuse nasale. Par conséquent, lorsque les chercheurs mènent des expériences avec des agrégats α-Syn, des précautions doivent être prises pour éviter l’inhalation d’agrégats α-Syn. Par exemple, des aérosols α-Syn pourraient être générés pendant l’étape de sonication. Nous recommandons l’utilisation d’un sonicateur de type scellé ou la sonication dans une enceinte de sécurité. De plus, les souris peuvent éternuer, générant potentiellement des aérosols α-Syn. Pour atténuer ce risque, toutes les opérations doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité. De plus, les chercheurs doivent utiliser des équipements de protection individuelle tels que des gants jetables, des masques et des lunettes de sécurité pour prévenir l’exposition à α-Syn. Après toutes les procédures, les chercheurs doivent essuyer un banc avec des détergents commerciaux si la surface est contaminée par α-Syn. Des rapports précédents ont montré que les détergents commerciaux et les SDS détachaient les agrégats des surfaces contaminées26,27.

Dans cette étude, des coupes de paraffine ont été utilisées pour évaluer la pathologie α-Syn dans l’OB, car la petite structure de l’OB est mieux préservée dans les coupes de paraffine par rapport à celle des coupes congelées. Cette étude a montré que la pathologie α-Syn était induite dans l’OB ; cependant, la pathologie α-Syn observée était légère et limitée et était principalement représentée par des agrégats filiformes connus sous le nom de neurites de Lewy dans les glomérules.

Il convient de noter que des changements comportementaux apparents chez les souris expérimentales n’ont pas été observés dans la présente étude. La pathologie α-Syn induite par cette méthode peut être insuffisante pour induire des modifications du phénotype comportemental. Des investigations plus approfondies sont nécessaires pour élucider les conditions spécifiques conduisant à une pathologie grave et à des changements de comportement. À l’avenir, si nous pouvions établir un moyen plus efficace de propagation de la muqueuse nasale à l’OB, cette méthode simple fournirait une autre façon d’évaluer la propagation de α-Syn sans technique chirurgicale.

De plus, nous avons utilisé l’OB du côté controlatéral chez les souris traitées comme contrôle. Cependant, une propagation rétrograde du noyau olfactif antérieur ou du cortex piriforme vers l’OB controlatéral pourrait se produire dans un suivi à plus long terme. Dans ce cas, des souris non traitées ont été utilisées comme témoin.

Bien que cette méthode simple fournisse des informations précieuses sur la propagation de α-Syn de la muqueuse nasale à l’OB, d’autres études sont nécessaires pour comprendre de manière exhaustive les mécanismes sous-jacents à la MP.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Toutes les expériences ont été soutenues par Rie Hikawa. Nous remercions Yasuko Matsuzawa pour la paperasse. Cette étude a été financée par JSPS KAKENHI (M.S., No. JP19K23779, JP20K16493 et JP20H00663).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microscope à fluorescence tout-en-un BZ-X710KEYENCEN/AMicroscope tout-en-un
Ampicilline Sel de sodiumNacalai tesque02739-32
Bioruptor IISonicbioBR2006ASonicbio Sonicator à bain d’eau.
Butorphanol tartrateMeiji Seika PharmaWAK-52850
Tube en celluloseMISUMIUC20-32-100
DeepWellMaximizerTAITECMBR-022UPShaker
DynaCompetent Cells Zip BL21(DE3)BioDynamics Laboratory Inc.DS255Cellule compétente
EntellanSigma-Aldrich107961Milieu de montage rapide pour la microscopie
Graefe Pince extra fine incurvée denteléeFST11152-10  ;forceps
Ciseaux fins durcisFST14090-09ciseaux
Histofine Souris à coloration simple MAX-PO (R)Nichirei Bioscience414341Immuno-peroxydase universelle Polymère, anti-Lapin
ImageJ ver 1.52pNANAhttps://imagej.net/
innova4200New Brunswickscientific 9105085Agitateur d’incubateur
Isopropyl-&beta ;- D-thiogalactopyranosideNacalai tesque19742-94
LB bouillon, LennoxNacalai tesque20066-24
Leica EG 1150 HLeica14 0388 86 108Centre modulaire d’enrobage de tissus
Leica TP 1020Leica14 0422 85108Processeur automatique de tissus  ;
MedetomidineFuji Film135-17473
Microm HM325 Microtome rotatifThermo Scientific902100
MidazolamMaruishi Seiyaku4987-211-76210-0
Nouvelle hématoxyline Type GMuto65-9197-38Solution d’hématoxyline
Aiguille ailée normale pour veine type D, 25GTERUMONN2332R25G Aiguille
Optima TLX UltracentrifugeuseBeckman Couler8043-30-1197Ultracentrifugeuse
P10 pipetteGilsonFA10002P
ParaffineLeica39601095
paraformaldéhydeNacalai tesque30525-89-4
Peroxidase Stain DAB KitNacalai tesque25985-50
Pirece BCA Protein Assay KitsThermo Scientific23225Dosage BCA
pRK172Addgene#134504Plasmide
Q-Sepharose Fast Flow.  ;cytiva17051001Résine échangeuse d’ions

Références

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Agr gats d alpha synucl inebulbe olfactifmaladie de Parkinsonpropagation de type prionmod le murinmuqueuse olfactivefibrilles pr form escorps de Lewytrouble neurod g n ratif
Technique d’administration intranasale d’agrégats de α-synucléine
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