Mesures par microscopie à force atomique du cartilage dans des membres axolotls intacts et en régénération

Résumé

Dans ce protocole, nous montrons comment préparer le tissu axolotl pour la microscopie à force atomique (AFM) et effectuer des mesures d’indentation dans le cartilage des membres intact et en régénération.

Résumé

Les forces mécaniques fournissent des signaux importants pour le fonctionnement normal des cellules et la formation de motifs dans les tissus en développement, et leur rôle a été largement étudié au cours de l’embryogenèse et de la pathogenèse. En comparaison, on sait peu de choses sur ces signaux pendant la régénération des animaux.

L’axolotl est un organisme modèle important pour l’étude de la régénération, compte tenu de sa capacité à restaurer complètement de nombreux organes et tissus après une blessure, y compris le cartilage et les os manquants. En raison de son rôle crucial en tant que principal tissu de soutien dans le corps des vertébrés, la récupération de la fonction squelettique pendant la régénération nécessite à la fois la restauration des structures manquantes ainsi que de leurs propriétés mécaniques. Ce protocole décrit une méthode de traitement des échantillons de membres d’axolotl pour la microscopie à force atomique (AFM), qui est la référence pour sonder les propriétés mécaniques des cellules et des tissus à haute résolution spatiale.

Tirant parti des capacités de régénération de l’axolotl, cette étude a mesuré la rigidité du cartilage des membres pendant l’homéostasie et deux étapes de la régénération des membres : l’histolyse tissulaire et la condensation du cartilage. Nous montrons que l’AFM est un outil précieux pour mieux comprendre la restructuration dynamique des tissus et les changements mécaniques qui se produisent au cours de la régénération.

Introduction

Le squelette, en particulier le cartilage et les os, constitue le principal support mécanique des tissus mous du corps chez les vertébrés. Par conséquent, tout dommage dans le système squelettique est susceptible de compromettre considérablement la fonctionnalité et même la survie. Chez l’homme, les fractures osseuses sont l’une des blessures traumatiques les plus courantes¹, dont la plupart se réparent en quelques semaines, mais 5% à 10% d’entre elles auront des retards de guérison ou ne se rétabliront jamais complètement ^2,3. De plus, les humains ne sont pas en mesure de récupérer d’une perte osseuse ou cartilagineuse importante ^4,5. Certaines salamandres, cependant, peuvent régénérer une variété de structures corporelles, y compris des membres entiers⁶, ce qui en fait un modèle idéal pour l’étude de la régénération squelettique.

L’axolotl (Ambystoma mexicanum) est un type de salamandre dont la régénération des membres a été largement étudiée. Ce processus se produit en quatre phases séquentielles principales mais qui se chevauchent : 1) la cicatrisation des plaies, 2) l’inflammation/histolyse, 3) la formation d’un blastème et 4) l’excroissance/différenciation du blastème (examiné dans ^7,8). Après l’amputation, les kératinocytes bordant le site de la blessure migrent rapidement, fermant la plaie et formant l’épithélium de la plaie (EH). Au cours de l’inflammation et de l’histolyse qui s’ensuivent, les agents pathogènes sont éliminés, les débris et les cellules endommagées sont éliminés et la matrice extracellulaire (MEC) sous la surface de l’amputation est remodelée⁹. L’histolyse tissulaire est essentielle à la régénération des membres¹⁰, où la sécrétion d’enzymes protéolytiques est cruciale non seulement pour le remodelage global de la MEC, mais aussi pour libérer les cellules à l’origine du blastème et libérer les molécules bioactives séquestrées dans la MEC elle-même⁸. En fait, des études dans de nombreux contextes régénératifs et organismes modèles ont montré que les propriétés matérielles uniques de l’ECM pendant l’histolyse sont capables d’induire des processus de dédifférenciation ou de diriger la migration des cellules vers le site de la blessure (examiné dans¹¹). De plus, la résorption du tissu calcifié au cours des derniers stades de l’histolyse s’est avérée être essentielle à la bonne intégration des éléments squelettiques des membres nouvellement^formés12. Après l’étape d’histolyse, le blastème se forme sous l’épithélium de la plaie (WE) sous la forme d’une accumulation de progéniteurs indifférenciés et multi-lignées résultant de cellules de tissus matures dédifférenciées ou de cellules souches résidentes. Les cellules du blastema prolifèrent et se différencient en tous les types de cellules manquantes. Enfin, la morphogenèse des membres a lieu, où le tissu squelettique est régénéré par la condensation de chondroprogéniteurs dérivés de cellules périskélétales et de fibroblastes dermiques transdifférenciés 13,14,15.

Bien que de nombreux signaux biochimiques régulant les changements dans l’identité cellulaire et la composition de la MEC aient été identifiés 10,13,14,16,17,18, les propriétés mécaniques des tissus au cours des différentes phases de la régénération des membres, ainsi que leur influence sur la régénération, sont restées largement inexplorées. De nombreuses études ont montré que les cellules détectent et intègrent des signaux mécaniques qui régulent leur destin et leur comportement dans plusieurs contextes (examiné dans^19,20). Par conséquent, compléter nos connaissances cellulaires et moléculaires de la régénération des membres par des mesures mécaniques tissulaires améliorera considérablement notre compréhension de ces processus.

Différentes techniques ont été développées pour permettre la caractérisation mécanique et la manipulation de la force des échantillons biologiques²¹. Parmi ces techniques, la microscopie à force atomique (AFM) est devenue la référence en mécanobiologie, dans laquelle les propriétés viscoélastiques des échantillons biologiques sont sondées à haute résolution spatiale en indentation avec un capteur de force ultrasensible, l’AFM cantilever²². Étant donné que cette technique nécessite un contact direct avec l’échantillon, des coupes de tissu sont généralement générées, ce qui peut être difficile dans certains cas. Ainsi, les conditions de préparation doivent être adaptées et optimisées pour chaque échantillon particulier afin qu’il puisse rester aussi proche que possible des conditions physiologiques et qu’un minimum d’artefacts soit généré²³. Ce protocole décrit comment mesurer la rigidité tissulaire des membres axolotls à l’aide de l’AFM, en se concentrant sur les tissus cartilagineux dans des conditions intactes, pendant l’histolyse et dans les stades de condensation du cartilage (Figure 1 et Figure 2). Cette méthode peut également être étendue à la mesure d’autres types de tissus.

Protocole

Les axolotls (Ambystoma mexicanum) ont été cultivés dans l’installation Axolotl du Centre de thérapies régénératives de Dresde (CRTD) de l’Université de technologie de Dresde (TUD). Une description complète des conditions d’élevage se trouve dans la^{section 24}. Brièvement, les pièces ont été maintenues à 20-22 °C avec un cycle jour/nuit de 12/12 h. Toutes les manipulations et interventions chirurgicales ont été effectuées conformément aux directives du comité d’éthique local et ont été approuvées par la Landesdirektion Sachsen, en Allemagne.

Cette étude a utilisé des axolotls blancs (d/d) pour toutes les expériences, une souche mutante naturelle dépourvue de pigmentation corporelle (peu ou pas de mélanophores et de xanthophores), avec des iridophores uniquement dans l’iris des yeux. Cette étude a utilisé des axolotls mesurant de 8 à 15 cm du museau à la queue (âgés de 5 à 7 mois) sans biais spécifique au sexe.

1. Préparation

1. Préparez une solution mère de benzocaïne à 10 % (p/v) qui sera utilisée pour l’anesthésie et l’euthanasie des axolotls (voir ci-dessous). Pour cela, mélangez dans une bouteille volumétrique 50 g de benzocaïne avec 100% d’éthanol jusqu’à ce que la limite de 500 ml soit atteinte.
2. Préparez une solution mère de benzocaïne à 0,03 % (p/v).
   1. Pour 1 L, mélanger 50 mL de solution saline 10 fois tamponnée au Tris (TBS) avec 30 mL de benzocaïne à 10 % (p/v) et 5 mL de solutions Holtfreter’s à 4000 % (p/v) avec 915 mL d’eau distillée et mélanger toute la nuit avec un barreau d’agitation magnétique.
   2. Pour 1 L de solution 10x TBS, mélanger 24,2 g de base Trizma et 90 g de NaCl avec 990 mL d’eau désionisée. Bien mélanger avec un barreau magnétique. Ensuite, ajoutez environ 10 ml de HCl concentré (12 M ou 37 %) et ajustez pour obtenir un pH de 8.
   3. Pour 1 L de solution Holtfreter à 4000 % (p/v), mélanger 158,4 g de NaCl, 11,13 g de MgSO₄·7H₂O, 5,36 g de CaCl₂·2H₂O et 2,88 g de KCl avec de l’eau déminéralisée jusqu’à 1 L.
3. Préparer une dilution de benzocaïne de travail à 0,01 % (p/v) dans l’eau du réservoir de stockage pour l’anesthésie en diluant la solution mère à 0,03 % (p/v) 1:3.
   1. Pour 1 L de solution, utilisez 333 mL de la solution mère de benzocaïne plus 666 mL d’eau du réservoir de rétention.
4. Préparez une solution mère de tartrate de butorphanol à 5 mg/mL pour l’analgésie. Pour cela, mélangez 100 mg de sel de butorphanol (+)-tartrate avec 20 mL d’eau ultrapure. Stocker les aliquotes à 4 °C.
5. Le jour de l’amputation, préparer une solution de travail de tartrate de butorphanol de 0,5 mg/L pour réduire la douleur de l’animal après des interventions chirurgicales en diluant la solution mère 1:10.000 dans l’eau du réservoir de rétention.
   1. Pour les animaux de moins de 8 cm de long, mélanger 20 μL de solution mère dans 200 mL d’eau de réservoir.
   2. Pour les gros animaux, mélanger 60 μL de solution mère dans 600 mL d’eau du réservoir de stockage.
6. Préparez une solution saline tamponnée au phosphate d’amphibiens stérile, une solution de PBS à 80 % (v/v), et conservez-la à température ambiante en mélangeant 800 ml de DPBS avec 200 ml d’eau déminéralisée.
7. Préparez une solution mère d’insuline à 1 mg/mL. Pour cela, mélangez 250 mg de poudre d’insuline avec 25 ml de HCl 0,1 M et agitez lentement jusqu’à dissolution. Pendant l’agitation, ajouter 225 mL d’APBS jusqu’à ce que la solution soit claire. Filtrer stérilement et stocker 4 mL d’aliquotes à -20 °C.
8. Préparez le milieu de culture stérile (tous les % (v/v) : milieu L15 à 62,5 %, FBS inactivé à la chaleur à 10 %, pénicilline/streptomycine, 1 % d’insuline, 1 % de L-glutamine) et conservez-le à 4 °C jusqu’au jour de l’utilisation. Le jour de l’expérience, équilibrez en fonction de la RT avant l’utilisation.
   1. Pour 400 ml de milieu de culture, utilisez 250 ml de milieu L15, 40 ml de FBS inactivé par la chaleur, 4 ml de pénicilline/streptomycine, 4 ml de solution d’insuline (de l’étape 1.7), 4 ml de L-glutamine et 98 ml d’eau stérile désionisée. Préparez dans des conditions stériles et un filtre stérile après avoir mélangé tous les composants. Préparez 15 mL d’aliquotes.
9. Préparez de l’agarose à bas point de fusion (lmp) à 2,5 % et 3 % (p/v) dans une solution APBS et chauffez à 70 °C pour dissoudre complètement l’agarose. Préparez les aliquotes dans des tubes de 1,5 mL et conservez-les à 4 °C jusqu’au jour de l’utilisation.
   1. Pour obtenir 20 ml d’agarose lmp à 2,5 % (p/v), mélanger 0,5 g d’agarose lmp avec 20 mL d’APBS dans un tube de 50 mL et chauffer au bain-marie à 70 °C jusqu’à ce que l’agarose soit complètement fondue. La solution doit devenir claire et transparente. Préparez les aliquotes encore chaudes.
   2. Pour 20 mL d’agarose lmp à 3 % (p/v), mélanger 0,6 g d’agarose lmp avec 20 mL d’APBS et procéder comme ci-dessus.
   3. (Facultatif) : Pour 20 mL de 1 % (p/v) d’agarose lmp, mélanger 0,2 g d’agarose lmp avec 20 mL d’APBS et procéder comme ci-dessus.
      REMARQUE : Le temps de fusion dépend de la concentration de l’agarose lmp et peut varier d’environ 15 à 40 min.
10. Pour l’amputation et le montage de tissus, utilisez un stéréoscope à fond clair.
11. Assemblez des boîtes de Pétri en plastique de 100 mm de diamètre, des pinces, un scalpel et des ciseaux chirurgicaux pour les amputations et le prélèvement de tissus.
12. Préparez des boîtes de Pétri en plastique de 35 mm de diamètre pour les mesures d’indentation.
13. Préparez des cylindres de ~1 cm de long et de ~1 cm de diamètre. Pour cela, chauffez un coupe-carton sous la flamme d’un bec Bunsen et coupez un tube de 15 ml avec la lame chauffée.
14. Coupez de petits carrés de 1 cm² de parafilm et rangez-les.
15. Préparez un bloc métallique ou froid à -20 °C en le laissant au congélateur pendant au moins 1 h.
16. Préparez des pipettes Pasteur en plastique.
17. (Facultatif) : Préparez une solution fixatrice de MEMFa (acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique [MOPS] 0,1 M pH 7,4, éthylène glycol-bis (2-aminoéthyléther )-N,N,N′,N′-acide tétraacétique [EGTA] 2 mM, MgSO₄·7H₂O 1 mM, formaldéhyde à 3,7 %). Pour cela, ajoutez 10,465 g de MOPS, 0,123 g de MgSO₄·7H₂O, 2 mL de 0,5 M EDTA pH 8,0, et ajoutez de l’eau jusqu’à 45 mL. Ajouter 5 mL de formaldéhyde à 37 % (p/v) à un volume total de 50 mL.

2. Réactifs

1. Reportez-vous à la table des matériaux pour connaître les réactifs utilisés pour ce travail, mais d’autres fournisseurs commerciaux peuvent également être utilisés.

3. Amputation de l’axolotl et régénération des membres

1. Avant toutes les procédures expérimentales, anesthésier l’animal avec de la benzocaïne à 0,01 % (p/v) diluée dans de l’eau du réservoir de rétention (étape 1.3) pendant 20 min, en s’assurant que les animaux sont profondément anesthésiés et ne répondent pas aux stimuli tactiles.
2. Retirez l’axolotl de l’anesthésie et posez-le sur une boîte de Pétri de 100 mm contenant un mouchoir en papier imbibé d’eau contenant de l’anesthésie. Orientez le membre perpendiculairement à l’axe du corps et placez la plaque sous le stéréoscope pour une meilleure visualisation.
   REMARQUE : Un stéréoscope avec une lampe compacte à col de cygne a été utilisé ici.
3. Amputez le membre à l’aide d’un scalpel stérile pointu immédiatement distal de la zone calcifiée de la région zeugopodiale (radius/cubitus) (Figure 1A).
   REMARQUE : Conformément au principe de bien-être animal 3R, il est recommandé d’utiliser les membres qui ont été initialement retirés par l’amputation comme témoins intacts.
4. Laissez l’animal sur la coupelle et couvrez-le d’un papier de soie humidifié imbibé d’eau contenant de la benzocaïne pendant 15 minutes pour permettre la coagulation du sang et la fermeture de la plaie.
5. Remettre les animaux dans un réservoir contenant de l’eau fraîche de rétention avec des analgésiques (tartrate de butorphanol, 0,5 mg/L, à partir de l’étape 1.5).
6. Déplacer les animaux dans leur réservoir d’origine contenant de l’eau de rétention fraîche 24 h après le traitement analgésique postopératoire.
7. Laissez les animaux se régénérer jusqu’au stade d’intérêt souhaité.
   REMARQUE : Les membres analysés ont été prélevés le jour de l’amputation pour la phase intacte et 5 jours après l’amputation (dpa) pour la phase d’histolyse chez des animaux âgés de 5 mois. Le stade de condensation du cartilage a été mesuré à 21 dpa chez des animaux âgés de 7 mois.

4. Montage et traitement des tissus pour les mesures

1. Chauffer les tubes de 1,5 mL contenant 2,5 % ou 3 % (p/v) d’agarose lmp (à partir de l’étape 1.9) sur un thermobloc à 70 °C jusqu’à ce que l’agarose soit complètement fondue. Changez les tubes pour un autre thermobloc à 37 °C et laissez la température s’équilibrer avant de l’utiliser.
   REMARQUE : Ici, 2,5 % d’agarose lmp a été utilisé pour mesurer la régénération des tissus et 3 % pour les tissus intacts.
2. Couvrez un côté des cylindres de 1 cm de long (à partir de l’étape 1.13) avec l’un des morceaux de parafilm (étape 1.14) afin qu’ils soient complètement scellés à leur fond.
3. Équilibrer 15 mL d’aliquotes de milieu de culture avec la RT (à partir de l’étape 1.8)
4. Anesthésier les animaux en les immergeant dans de l’eau contenant un anesthésique (benzocaïne à 0,01 % (p/v) diluée dans l’eau du réservoir de rétention) pendant au moins 20 min.
5. Imagez les membres sous un stéréoscope avec un logiciel permettant des mesures quantitatives. Mesurez la longueur de la structure d’intérêt et calculez la quantité de tissu qui doit être retirée de l’extrémité distale du membre jusqu’à ce que la section d’intérêt soit atteinte.
6. Pour régénérer les membres, prélevez-les en coupant avec un scalpel et/ou des ciseaux chirurgicaux au niveau du coude et en disséquant l’excès de tissu du membre. Laissez le tissu dans une solution APBS pendant la préparation de l’étape suivante. Assurez-vous que la coupe est transversale (90°) à l’axe de l’avant-bras pour créer une surface plane. Pour les membres intacts, retirez la main en coupant à travers la région carpienne.
7. Euthanasier les animaux en les exposant à une dose létale d’anesthésie (0,1 % de benzocaïne) pendant au moins 20 min. Pour cela, ajoutez le volume requis de solution de benzocaïne à 10 % (p/v) pour atteindre une concentration de 0,1 % (p/v).
   1. Si les animaux ont été anesthésiés dans 100 ml de solution de benzocaïne à 0,01 % (p/v), ajouter 900 μL de solution de benzocaïne à 10 % (p/v).
8. Rincez les membres en les immergeant dans la solution APBS.
9. Veiller à ce que les pipettes Pasteur et le thermobloc (stabilisé à 37 °C avec des aliquotes d’agarose) soient proches du poste de travail. Sortez le bloc froid du congélateur à -20 °C et placez le cylindre avec l’extrémité recouverte de parafilm vers le bas sur le dessus.
10. Saisissez le membre disséqué et retirez délicatement l’excès de liquide avec du papier de soie. Placez le membre sur une assiette propre, ajoutez l’agarose LMP fondue sur le dessus et déplacez brièvement le membre dans l’agarose pour déplacer tout APBS restant de la surface de la peau.
11. En travaillant rapidement, placez le membre à l’intérieur du cylindre, en vous assurant qu’il est orienté verticalement, la zone d’intérêt étant tournée vers le haut.
12. Tout en tenant doucement le membre avec une pince, ajoutez lmp-agarose à l’intérieur du cylindre jusqu’à ce que le tissu soit complètement recouvert. Retirez délicatement la pince avant que l’agarose ne se solidifie.
13. Retirez le cylindre du bloc froid et laissez l’agarose se solidifier complètement à RT pendant environ 30 s.
14. Apportez immédiatement le bloc d’agarose contenant des tissus à la salle de vibratome, avec des aliquotes de milieu de culture stériles et APBS, à RT.
15. Retirez le parafilm du bas du cylindre et fixez l’agarose contenant le tissu à l’étage du vibratome avec de la colle cyanoacrylate. Assurez-vous que l’agarose et l’échantillon sont collés à la scène.
16. Immergez la platine dans l’APBS pour le sectionnement.
    REMARQUE : Les tissus intacts comprennent l’os / cartilage plus rigide, tandis que les tissus régénérants sont plus mous. Par conséquent, les paramètres du vibratome doivent être ajustés en conséquence. Cette étude a utilisé les paramètres suivants : tissus intacts (amplitude 1,2 mm et vitesse 0,1 mm/s) et tissus en régénération (amplitude 0,9 mm et vitesse 0,4 mm/s).
17. Commencez à sectionner l’agarose par petites étapes (par exemple, par pas de 100 μm) jusqu’à ce que l’extrémité du tissu soit atteinte. Ensuite, sectionnez le bloc de tissu jusqu’à ce que la partie distale du tissu (calculée à l’étape 4.5) soit retirée. De cette façon, un échantillon transversal transversal de la zone d’intérêt sera facilement accessible.
    REMARQUE : La section de tissu retirée contiendra la surface immédiatement adjacente à celle sondée avec AFM et peut servir de référence pour la structure tissulaire. Par conséquent, il peut être utilisé pour une analyse complémentaire directe ou fixé pour une coloration ultérieure (voir rubrique 6).
18. Retirez avec précaution le bloc contenant du tissu de la scène du vibratome à l’aide d’une lame de rasoir et enlevez toute trace de colle. Collez immédiatement le bloc sur une boîte de Pétri en plastique de 35 mm avec de la colle adhésive pour tissus chirurgicaux et ajoutez environ 2 ml de milieu de culture à RT pour vous assurer que le tissu est entièrement couvert.
    REMARQUE : La surface tissulaire exposée dans le bloc d’agarose est la surface à sonder.

5. Mesures avec AFM

1. Au moins 1 jour avant les mesures, préparez le cantilever pour les mesures.
   REMARQUE : Pour ce travail, des porte-à-faux en silicium sans pointe ont été fonctionnalisés avec des billes de polystyrène (diamètre 20 μm), et la liaison bille et porte-à-faux a été laissée à se renforcer pendant au moins 1 jour avant d’être utilisée pour les mesures d’indentation.
   1. Fixez les perles aux porte-à-faux à l’aide de colle époxy avec un temps de traitement de 5 min.
   2. Abaissez rapidement le porte-à-faux avec un contact minimal sur une lame de verre enduite de colle de sorte qu’une petite gouttelette de colle se forme à son extrémité, et mettez-la immédiatement après en contact avec un cordon approprié.
   3. Maintenez le contact cantilever-talon pendant ~10 min avant de soulever le cantilever avec un talon lié de la surface.
2. Calibrez le porte-à-faux avant les mesures.
   REMARQUE : Le cantilever modifié a été étalonné avant chaque série d’expériences par la méthode du bruit thermique à l’aide des procédures intégrées du logiciel AFM.
3. Insérez la boîte de Pétri avec le bloc de tissu (à l’étape 4.18) et le milieu de culture dans le support de la boîte de Pétri de l’AFM et obtenez une image d’ensemble en microscopie à fond clair (Figure 1B).
   REMARQUE : Pour les tests d’indentation, une configuration équipée d’un platine motorisé au-dessus d’un microscope optique droit est utilisée. Montez la tête AFM et positionnez le cantilever sur le tissu et amenez le cantilever à proximité de la surface.
4. Choisissez la région d’intérêt spécifique et enregistrez un ensemble de courbes force-distance (Figure 2A).
   REMARQUE : Des points de consigne de force relative de 2 à 25 nN ont été utilisés afin d’atteindre des profondeurs d’indentation comparables de ~1 à 4 m pour des tissus de rigidité différente, avec une vitesse d’approche et de rétraction de 7,5 m/s, une longueur z de 50 m, une taille de grille de 70 m x 70 m avec 3 points 3.
5. Pour chaque région sondée, acquérez une image de microscopie à fond clair pour associer les valeurs obtenues à chaque région particulière de la section du membre.
6. Pour tous les échantillons, sondez au moins 3 régions différentes par type de tissu.
   REMARQUE : Dans tous les cas, cette étude a mesuré 4 régions au centre du cartilage et 3 régions à la périphérie de la région cartilagineuse et a maintenu le tissu sous le microscope pendant un maximum de 1 h.
7. Une fois les mesures d’indentation terminées, jetez ou fixez le tissu pour une analyse plus approfondie.
   REMARQUE : Les échantillons ont été fixés après la fin des mesures en les plaçant dans des tubes de 2 mL contenant une solution de MEMFa et fixés pendant une nuit à 4 °C. MEMFa (étape 1.17) a été utilisé, mais une solution de formaldéhyde à 4 % (p/v) dans du PBS peut également être utilisée.

6. (Facultatif) Traitement de sections de tissus adjacentes

1. Si les coupes de tissus adjacentes sont utilisées pour une coloration ultérieure, placez-les immédiatement après la section dans un petit tube de 2 mL contenant un fixateur et fixez-les pendant la nuit à 4 °C.
   1. Pour révéler l’architecture tissulaire grâce au marquage du cytosquelette d’actine et des noyaux, laver 3 fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune pour éliminer le fixateur et colorer avec une solution contenant de la phalloïdine conjuguée Alexa Fluor 488 (1:250) et du Hoechst 33258 (1:10000) dans du PBS pendant 1 h à RT sur une plate-forme à bascule.
   2. Ensuite, immobiliser les échantillons colorés sur des boîtes à fond de verre à l’aide de 1 % (p/v) d’agarose lmp stabilisée à 37 °C (à partir de l’étape 1.9). Assurez-vous que la surface d’intérêt fait face au verre. Une fois que l’agarose se solidifie, recouvrez les échantillons de PBS pour éviter la déshydratation.
      REMARQUE : Les échantillons intacts et d’histolyse sont imagés à l’aide d’un microscope confocal inversé (grossissement de 10x et coupes optiques de 8 μm). Les images de la figure 1C sont des projections maximales de 8 sections optiques.
2. Si la section de tissu adjacente est utilisée pour une analyse en aval immédiat nécessitant des tissus frais (comme l’extraction d’ARN, l’incubation avec des colorants vivants, etc.), assurez-vous de travailler rapidement et d’utiliser un milieu de culture cellulaire (à partir de l’étape 1.8) pour garantir la plus grande intégrité possible des tissus.

7. Analyse et affichage des données

1. Pour calculer le module de Young apparent, analysez les courbes force-distance à l’aide du modèle Hertz/Sneddon (Eq.1) pour un pénétrateur sphérique à l’aide du logiciel de traitement de données JPK/Bruker, en supposant un coefficient de Poisson de 0,5.
   (Équation 1)
   Où R : rayon du pénétrateur, E : module d’élasticité, ν : coefficient de Poisson, a : rayon de la surface de contact circulaire entre le pénétrateur et l’échantillon, δ : profondeur d’indentation.
2. Pour l’analyse viscoélastique, analysez les parties d’approche des courbes force-indentation dans PyJibe 0.15.0 avec l’extension « Modèle de Hertz corrigé pour la viscoélasticité à l’aide de Kelvin-Voigt-Maxwell (KVM) » (écrit par Paul Müller, https://github.com/AFM-analysis/PyJibe)²⁵. La fonction d’ajustement est basée sur un modèle décrit par Abuhattum et ^al.26, intégrant des éléments du modèle Kelvin-Voigt-Maxwell.
   1. Pré-traitez les courbes d’indentation de force pour estimer le point de contact à l’aide d’un ajustement par morceaux avec une ligne (ligne de base) et d’une fonction d’ajustement polynomial pour la pièce d’approche.
   2. Ajustez les courbes force-indentation au « modèle Hertz corrigé pour la viscoélasticité à l’aide du modèle Kelvin-Voigt-Maxwell (KVM) ». À partir de l’ajustement, obtenez le module de Young non détendu, le module de Young apparent et la viscosité apparente. Le modèle donne également à Maxwell des temps de relaxation et d’indentation.
      REMARQUE : Dans plusieurs courbes d’indentation de force analysées (en particulier le tissu intact), les temps de relaxation de Maxwell étaient significativement plus grands ou plus petits que le temps d’indentation, ce qui indique respectivement un comportement plutôt élastique ou un comportement mécanique de Kelvin-Voigt.
3. Exportez toutes les mesures vers une feuille de calcul et calculez les modules de Young apparents médians par type de tissu et par échantillon.
4. Tracez et analysez statistiquement les données à l’aide d’un logiciel approprié.
   REMARQUE : Le prisme GraphPad est utilisé ici, et lors de la description des résultats, l’étude fait référence à la moyenne ± SD des modules de Young apparents médians par échantillon (illustré à la figure 2D-F).
5. Affichez des tranches optiques à partir d’images confocales en les projetant avec la fonction de projection maximale Fidji. Ajustez la luminosité et le contraste de chaque canal individuel pour une visualisation optimale des colorations fluorescentes.
6. Générez un panneau de figures avec le logiciel approprié.
   REMARQUE : Affinity Designer est utilisé pour générer les panneaux, et le modèle de la Figure 1A est dessiné à l’aide d’Affinity Designer.

Résultats

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, nous avons mesuré le module de Young apparent des tissus cartilagineux des membres axolotls dans des conditions homéostatiques (« intactes »), au cours de l’histolyse précoce du cartilage et des stades ultérieurs de condensation du cartilage (Figure 1A). Nous avons également sondé les propriétés mécaniques des éléments squelettiques dans différentes régions, y compris leur centre et leur périphérie, comme le montrent les images illustrant la position en porte-à-faux (Figure 1B). Pour montrer l’architecture tissulaire et la corréler avec des mesures de rigidité, des coupes tissulaires transversales ou le bloc tissulaire où les mesures ont été effectuées ont été fixées et colorées pour les filaments d’actine et les noyaux avec la phalloïdine conjuguée Alexa Fluor 488 et Hoechst, respectivement (Figure 1C). Dans les membres intacts, le rayon est nettement plus grand que le cubitus, mais les deux éléments squelettiques cartilagineux ont une morphologie similaire, avec des noyaux ronds uniformément répartis au centre, entourés d’un anneau de noyaux aplatis correspondant au périchondre²⁴. Au cours de la phase d’histolyse, des changements spectaculaires dans l’architecture tissulaire ont été détectés, avec des noyaux désorganisés et moins densément emballés à l’intérieur des éléments squelettiques. Lors de la phase ultérieure de condensation du cartilage, les noyaux se réorganisent, avec une délimitation claire entre le cartilage nouvellement formé et les tissus environnants en régénération. Cependant, à ce stade, la plupart des noyaux sont aplatis et il n’y a pas de différences morphologiques claires entre le centre et la périphérie.

Lorsque des sections transversales des deux éléments squelettiques présents dans la région zeugopodiale (radius et cubitus) ont été mesurées, des modules de Young apparents indiscernables dans les membres intacts ont été détectés, avec des valeurs médianes de 10,95 ± 11,69 kPa et de 15,71 ± 6,49 kPa, respectivement (Figure 2D, à gauche), ce qui correspond à leurs similitudes anatomiques (Figure 1C). Il est intéressant de noter que l’analyse du centre du cartilage par rapport à la périphérie a montré que, dans des conditions intactes, les modules de Young apparents au centre étaient plus élevés qu’à la périphérie, avec des valeurs médianes de 16,48 ± 6,86 kPa contre 7,53 ± 4,63 kPa, respectivement (Figure 2E, à gauche). Le jour 5 après l’amputation, correspondant à la phase d’histolyse, les modules de Young apparents dans le radius et le cubitus ont considérablement diminué (0,03 ± 0,02 kPa et 0,13 ± 0,09 kPa, respectivement, Figure 2D, à droite), mais les différences entre le centre et la périphérie ont également disparu, avec des modules de Young médians de 0,11 ± 0,07 kPa et 0,27 ± 0,34 kPa, respectivement (Figure 2E, à droite). Lors de l’analyse des propriétés du cartilage au cours d’une étape ultérieure de régénération, au moment où le cartilage commence à se condenser, une augmentation significative des modules de Young apparents a été détectée, atteignant des valeurs intermédiaires entre les phases intacte et histolytique (0,77 ± 0,29 kPa, Figure 2F).

Comme on peut le voir dans les exemples de courbes fournis (Figure 2B), une hystérésis s’est produite entre la plupart des paires de courbes d’approche et de rétraction, indiquant une réponse viscoélastique du tissu sous la force. Nous avons ensuite entrepris d’analyser plus en détail les propriétés viscoélastiques des différents tissus. Étant donné que les mesures oscillatoires sur plusieurs fréquences sont chronophages et quelque peu critiques en ce qui concerne la préservation de l’intégrité des tissus, en particulier lors de la cartographie de plusieurs régions tissulaires, nous avons utilisé une méthode précédemment publiée par Abuhattum et al. qui permet d’ajuster la partie approche des courbes force-distance avant la rétraction immédiate du porte-à-faux²⁶. Le modèle est basé sur des éléments du modèle Kelvin-Voigt Maxwell et a déjà été appliqué pour l’analyse des propriétés viscoélastiques des cellules et des hydrogels²⁶, ainsi que du tissu pancréatique²⁷. Les modules médians non relâchés (intacts : 23,05 kPa, histolyse : 0,20 kPa et cartilage de condensation : 1,60 kPa) et les modules de Young apparents (intacts : 17,54 kPa, histolyse : 0,07 kPa et cartilage de condensation : 1,54 kPa) calculés pour les tissus aux différents stades de régénération ont révélé des différences significatives (Figure 2G-H). Dans l’ensemble, une réponse principalement élastique des tissus à la déformation a été observée à la vitesse de déformation choisie, comme en témoigne la grande similitude des modules élastiques non relâchés et apparents (Figure 2G,H). Des valeurs médianes de viscosité apparente significativement plus faibles ont été obtenues pour le stade histolytique (0,72 Pa·s) par rapport aux stades du cartilage intact (2,06 Pa·s) et condensant (2,32 Pa·s) (Figure 2I). Comme prévu, les modules de Young apparents de l’analyse PyJjibe (Figure 2H) étaient en fort accord avec les valeurs obtenues par le logiciel de traitement de données JPK (Figure 2F).

En conclusion, la caractérisation mécanique reflète une restructuration tissulaire dynamique au cours du processus de régénération. Ces mesures sont conformes aux observations anatomiques, où la rigidité tissulaire diminue en même temps que les altérations observées de l’architecture tissulaire (Figure 1C) et est progressivement récupérée au cours de la régénération.

Figure 1 : Mesures d’indentation du cartilage d’un membre axolotl pendant la régénération. (A) Représentation schématique des étapes de régénération. La ligne pointillée indique le site approximatif de la section transversale générée par le vibratome où les mesures ont été effectuées. (B) Images représentatives des mesures du centre (en haut) et de la périphérie (en bas) dans le cartilage des membres. La pointe noire est le cantilever. Barre d’échelle : 100 μm. (C) Architecture tissulaire des membres intacts (à gauche), des tissus en cours d’histolyse (au milieu) et du cartilage en condensation (à droite). Vert : noyaux (Hoechst), magenta : filaments d’actine (Phalloidin). Barre d’échelle : 500 μm. C’Région agrandie délimitée dans le panneau. Barre d’échelle : 100 μm. Les grilles d’indentation de 70 μm x 70 μm sont indiquées par des carrés pointillés blancs (centre) et jaunes (périphérie). Dans les panneaux B et C, les lettres R et U indiquent respectivement le Rayon et le Cubitus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Mesure de la rigidité du cartilage lors de la régénération d’un membre axolotl avec AFM. (A) Schémas de l’expérience d’indentation AFM montrés comme la force en fonction du temps (ci-dessus) et la force en fonction de la distance entre le pénétrateur et l’échantillon (ci-dessous). Les courbes d’approche et de rétraction sont affichées en bleu et en rouge, respectivement. Le point de contact est indiqué par une ligne pointillée verticale noire. Les courbes force-indentation ont été ajustées dans la partie d’approche de la courbe, soit à l’aide du modèle Hertz/Sneddon (logiciel de traitement de données JPK et Pyjibe), soit à l’aide de l’extension du modèle KVM viscoélastique dans Pyjibe. (B) Courbes force-distance représentatives des mesures AFM dans les membres intacts et en régénération pendant les stades d’histolyse et de condensation du cartilage. Le pourcentage de courbes analysables (c’est-à-dire sans artefacts) est indiqué dans le coin supérieur droit de chaque courbe. (C) Exemples d’artefacts typiques dans les courbes d’indentation de force, par exemple, en raison d’un contact inapproprié du pénétrateur avec la surface. Les exemples présentés correspondent à des membres intacts, mais des types équivalents d’artefacts ont été observés dans toutes les conditions. Pour B-C : Des courbes force-distance représentatives ont été ajustées et affichées à l’aide de Pyjibe. La courbe bleu clair représente la partie d’approche de la courbe, et la courbe rouge clair est la partie rétraction. La ligne bleue plus foncée est l’ajustement Hertz/Sneddon appliqué pour un pénétrateur sphérique. Les valeurs résiduelles respectives de l’ajustement sont indiquées ci-dessous pour les courbes force-distance inférieures. Les valeurs résiduelles tracées représentent la différence entre les valeurs d’ajustement et de force réelle. (D) Modules apparents de Young du radius et des centres du cubitus mesurés dans des membres intacts et subissant une histolyse. (E) Modules de Young apparents du centre du cartilage par rapport à la périphérie (Peri) dans les membres intacts et pendant l’histolyse. (F) Modules de Young apparents mesurés pour le centre du cartilage aux stades analysés de la régénération. Pour D-F : Chaque point est dérivé d’une courbe force-distance analysée avec succès, et les points plus grands correspondent aux valeurs médianes par échantillon. Les modules de Young apparents ont été obtenus à l’aide de l’ajustement du modèle Hertz/Sneddon du logiciel JPK Bruker. (G-I) Le module non relâché (G), le module de Young apparent (H) et la viscosité apparente (I) calculés à l’aide de PyJibe (extension KVM) à partir de mesures du centre du cartilage aux stades analysés de la régénération. Chaque point est dérivé d’une courbe force-distance analysée avec succès. Les lignes correspondent aux valeurs médianes de toutes les mesures par condition. Pour D-I : Kruskal-Wallis avec le test de comparaisons multiples de Dunn. Des lettres différentes représentent des conditions statistiquement différentes les unes des autres (p < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ici, nous démontrons une technique de mesure de la rigidité cartilagineuse dans les membres axolotls avec AFM. Cependant, cette méthode peut également être étendue pour sonder d’autres types de tissus. La préparation des échantillons, qui s’est avérée particulièrement difficile pour les échantillons d’axolotl, est une étape clé pour des mesures AFM réussies. Nous avons constaté que sonder la surface tissulaire qui était encore encastrée dans le bloc d’agarose était le meilleur moyen de préserver l’intégrité des tissus. En effet, la peau de l’axolotl sécrète des niveaux élevés de mucus à la surface de l’épiderme, ce qui empêche l’enrobage stable de la section de tissu tranchée dans l’agarose.

Certains échantillons peuvent présenter des défis supplémentaires, tels qu’une adhérence élevée. Nous avons rencontré ce problème, en particulier dans des échantillons en phase d’histolyse, qui étaient relativement conformes et adhésifs. Sur ces échantillons, nous avons également observé plusieurs courbes force-distance où la partie d’indentation avait un aspect « déchiqueté », indiquant que le cordon déformait la surface de l’échantillon de manière non continue (Figure 2C), par exemple, en raison de la flexion de la surface sous contrainte. De telles courbes force-distance ont dû être écartées car elles ne pouvaient pas être montées sur le modèle Hertz-Sneddon. Pour réduire l’adhérence, la passivation du pénétrateur peut être utile²⁸, c’est-à-dire en enrobant le cordon du pénétrateur avec des agents qui réduisent son adhérence, tels que le polyéthylèneglycol (PEG) ou l’albumine sérique bovine. De plus, d’autres modèles pour l’ajustement des courbes force-distance peuvent être utilisés, par exemple le modèle JKR (Johnson-Kendall-Roberts)²⁹. Étant donné que les tissus analysés ici ont montré des variations relativement importantes des modules d’élasticité de plus d’un ordre de grandeur pour les régions tissulaires adjacentes et les différentes conditions testées, le choix d’un seul porte-à-faux/pénétrateur idéal (constante de ressort/taille de pénétrateur) a rendu difficile la sélection d’un seul porte-à-faux/pénétrateur idéal. Les variations assez importantes de la rigidité des tissus ont également nécessité une adaptation de la force de contact appliquée afin de maintenir la profondeur d’indentation comparable et dans une plage appropriée (environ 5 % à 25 % du diamètre du pénétrateur).

Un autre paramètre essentiel pour préserver les propriétés mécaniques du tissu aussi physiologiquement que possible est de maintenir une intégrité maximale du tissu. Cela a été assuré par la mesure d’échantillons frais qui ont été immédiatement traités après la collecte et maintenus à une température appropriée sous un milieu de culture cellulaire au pH stabilisé.

Récemment, d’autres groupes ont effectué des mesures de micro-indentation dans des éléments squelettiques d’axolotl en utilisant d’autres méthodes de traitement des échantillons³⁰. Cependant, dans ces expériences, le tissu a été congelé au préalable et les morceaux de squelette en régénération ont été disséqués manuellement de leurs tissus environnants pour les mesurer in situ. Jusqu’à preuve empirique, il n’est pas clair si ces manipulations ont un effet sur l’intégrité du tissu cartilagineux et les propriétés mécaniques. Des analyses de muscles salamandres et de blastèmes ont également été rapportées^31,32. Dans ces cas, cependant, la peau a été enlevée et les échantillons n’ont pas été sectionnés ; Ainsi, seules des informations provenant de la surface immédiatement sous l’épithélium retiré ont été obtenues. Bien que ce type de quantification soit précis, il fournit plutôt des informations sur la surface latérale du muscle, ignorant ainsi les informations mécaniques des couches musculaires internes. Nous avons utilisé un pénétrateur de 20 μm, ce qui signifie que les mesures n’étaient pas en vrac comme les mesures de microindentation rapportées 30,31,32, mais plutôt à l’échelle cellulaire et extracellulaire. Par conséquent, nous obtenons une résolution qui reflète les signaux mécaniques auxquels les cellules sont réellement exposées, tout en révélant l’hétérogénéité tissulaire (Figure 2D-I).

Dans les mesures, des valeurs inférieures des modules apparents de Young à la périphérie des éléments squelettiques intacts ont été détectées, ce qui implique que le périchondre de l’axolotl est plus conforme que le cartilage. Cependant, nous ne pouvons pas exclure que les tissus adjacents aux éléments squelettiques aient également été sondés en raison du réglage de la grille de 70 μm x 70 μm. Au cours de la phase histolytique, de telles différences n’ont pas été observées, ce qui suggère que l’histolyse dans les membres régénérateurs de l’axolotl peut progresser de manière équivalente dans le cartilage, son périchondre environnant et les tissus voisins. Le radius et le cubitus partagent une structure similaire mais présentent des différences anatomiques importantes, telles que le radius ayant un diamètre plus grand et le cubitus étant plus long²⁴. Néanmoins, une analyse comparative de leur rigidité n’a pas été rapportée jusqu’à présent, sauf pour leur réponse à une charge mécanique à des fins médicales³³. Ici, nous décrivons les mesures d’indentation en coupes transversales de ces deux éléments squelettiques dans les membres intacts et en régénération. Nous montrons qu’il n’existe pas de différences significatives de rigidité entre les rayons et les cubitus dans les membres axolotls, ce qui est en accord avec les densités minérales osseuses équivalentes détectées chez les homologues humains³⁴. Cependant, une tendance des modules de Young apparents plus faibles dans le rayon, en particulier pendant l’histolyse, a été observée. Pour déterminer si cette observation est significative sur le plan biologique, il serait préférable d’utiliser un plus grand nombre d’échantillons. Sur la base des données obtenues dans cette étude, nous proposons un minimum de 5 échantillons par condition. Au cours de la phase d’histolyse, les deux éléments squelettiques deviennent plus conformes, ce qui est en accord avec le remodelage ECM décrit pour se produire à ce stade⁹. Enfin, les mesures obtenues dans cette étude impliquent que la rigidité du cartilage augmente progressivement au cours de la phase ultérieure de condensation du cartilage. Ces observations concordent avec les mesures d’indentation récemment rapportées dans les os intacts et le cartilage de condensation²⁹, ainsi qu’avec l’évaluation in vivo des propriétés mécaniques du cartilage avec la microscopie confocale Brillouin³⁵.

Dans l’ensemble, ces travaux élargissent le potentiel de l’AFM en tant qu’outil précieux pour étudier les propriétés mécaniques des membres de l’axolotl. Avec cette technique, nous visons à compléter nos connaissances sur l’expression des gènes et les trajectoires de transdifférenciation cellulaire^16,13 afin de mieux comprendre comment la mécanique tissulaire façonne et influence le processus de régénération.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Affinity Designer	Affinity	; version 1.10.4	Pour l’assemblage de figures
Agarose Low Melt	Roth	6351.1	Pour la préparation
d’échantillons Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	Pour colorer les tissus
Axiozoom	Zeiss		Pour imager l’échantillona sous l’AFM
Benzocaïne	Sigma-Aldrich	E1501	Pour anesthésier les animaux
Butorphanol (+)-tartrate sel	Sigma-Aldrich	; B9156	Comme analgésique
Cantilever	NanoWorld	Arrow TL1	Pour les mesures d’indentation AFM
Configuration Cellhesion 200 équipée d’un étage moteur	JPK/Bruker		Pour les mesures d’indentation AFM
CellSense Entry			Pour l’imagerie dans le stéréoscope Olympus UC90
Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate (DPBS, 1x)	Gibco	14190-144	Pour nettoyer les échantillons et la section sous vibratome
FIJI (ImageJ2)	https://imagej.net/software/fiji	version 2.9.0/1.53t	Pour le traitement d’images
GraphPad Prism	GraphPad Software	(version 8.4.3)	Pour représenter graphiquement et analyser statistiquement les données
FBS inactivé par la chaleur	Gibco	10270-106	Pour cellule milieu de culture
Colle histoacrylique (2-butyl-cyanoacrylate)	Braun		Pour coller l’échantillon sur des boîtes de Pétri
Hoechst 33258	Abcam	ab228550	Pour colorer les tissus
Insuline	Sigma-Aldrich	I5500	Pour milieu de culture cellulaire
Microscope confocal inversé	Zeiss	780 LSM	Pour imager des coupes de tissus
Microscope confocaux inversé	Zeiss	980 LSM	Pour l’imagerie de coupes de tissus
Logiciel de traitement de données JPK/	Bruker JPK/Bruker	SPM 6.4	Pour l’analyse des courbes force-distance
Milieu L15 (Leibovitz)	Sigma	L1518	Pour milieu de culture cellulaire
L-Glutamine	Gibco	25030-024	Pour milieu de culture cellulaire
Pénicilline/Streptomycine	Gibco	15140-122	Pour cellule milieu de culture
billes de polystyrène ( 20 & micro ; m de diamètre) ; )	microParticles		Pour les mesures d’indentation AFM
Pyjibe	écrit par Paul Mü ; ller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe	0.15.0	Pour l’analyse viscoélastique
Stéréoscope Olympus SX10	Olympus	SX10	Pour l’amputation de membres et le montage de tissus
Stéréoscope Olympus UC90	Olympus	UC90	Pour l’imagerie
Vibratome Leica	Leica VT	1200S	Pour la coupe de tissus