Dans ce protocole, nous montrons comment préparer le tissu axolotl pour la microscopie à force atomique (AFM) et effectuer des mesures d’indentation dans le cartilage des membres intact et en régénération.
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Article de méthode
Mesures par microscopie à force atomique du cartilage dans des membres axolotls intacts et en régénération
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les forces mécaniques fournissent des signaux importants pour le fonctionnement normal des cellules et la formation de motifs dans les tissus en développement, et leur rôle a été largement étudié au cours de l’embryogenèse et de la pathogenèse. En comparaison, on sait peu de choses sur ces signaux pendant la régénération des animaux.
L’axolotl est un organisme modèle important pour l’étude de la régénération, compte tenu de sa capacité à restaurer complètement de nombreux organes et tissus après une blessure, y compris le cartilage et les os manquants. En raison de son rôle crucial en tant que principal tissu de soutien dans le corps des vertébrés, la récupération de la fonction squelettique pendant la régénération nécessite à la fois la restauration des structures manquantes ainsi que de leurs propriétés mécaniques. Ce protocole décrit une méthode de traitement des échantillons de membres d’axolotl pour la microscopie à force atomique (AFM), qui est la référence pour sonder les propriétés mécaniques des cellules et des tissus à haute résolution spatiale.
Tirant parti des capacités de régénération de l’axolotl, cette étude a mesuré la rigidité du cartilage des membres pendant l’homéostasie et deux étapes de la régénération des membres : l’histolyse tissulaire et la condensation du cartilage. Nous montrons que l’AFM est un outil précieux pour mieux comprendre la restructuration dynamique des tissus et les changements mécaniques qui se produisent au cours de la régénération.
Introduction
Le squelette, en particulier le cartilage et les os, constitue le principal support mécanique des tissus mous du corps chez les vertébrés. Par conséquent, tout dommage dans le système squelettique est susceptible de compromettre considérablement la fonctionnalité et même la survie. Chez l’homme, les fractures osseuses sont l’une des blessures traumatiques les plus courantes1, dont la plupart se réparent en quelques semaines, mais 5% à 10% d’entre elles auront des retards de guérison ou ne se rétabliront jamais complètement 2,3. De plus, les humains ne s....
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Protocole
Les axolotls (Ambystoma mexicanum) ont été cultivés dans l’installation Axolotl du Centre de thérapies régénératives de Dresde (CRTD) de l’Université de technologie de Dresde (TUD). Une description complète des conditions d’élevage se trouve dans lasection 24. Brièvement, les pièces ont été maintenues à 20-22 °C avec un cycle jour/nuit de 12/12 h. Toutes les manipulations et interventions chirurgicales ont été effectuées conformément aux directives du comité d’éthique local et ont été approuvées par la Landesdirektion Sachsen, en Allemagne.
Cette étude a utilisé des axolotls blancs (d/d) pour toutes....
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Résultats
En utilisant le protocole décrit ci-dessus, nous avons mesuré le module de Young apparent des tissus cartilagineux des membres axolotls dans des conditions homéostatiques (« intactes »), au cours de l’histolyse précoce du cartilage et des stades ultérieurs de condensation du cartilage (Figure 1A). Nous avons également sondé les propriétés mécaniques des éléments squelettiques dans différentes régions, y compris leur centre et leur périphérie, comme le montrent les images illustrant la positi.......
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Discussion
Ici, nous démontrons une technique de mesure de la rigidité cartilagineuse dans les membres axolotls avec AFM. Cependant, cette méthode peut également être étendue pour sonder d’autres types de tissus. La préparation des échantillons, qui s’est avérée particulièrement difficile pour les échantillons d’axolotl, est une étape clé pour des mesures AFM réussies. Nous avons constaté que sonder la surface tissulaire qui était encore encastrée dans le bloc d’agarose était le meilleur moyen de p.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts
Remerciements
Nous remercions tous les membres du laboratoire Sandoval-Guzmán pour leur soutien continu et leur accompagnement pendant le développement de ce travail. Nous sommes également reconnaissants à Anja Wagner, Beate Gruhl et Judith Konantz pour leur dévouement aux soins de l’axolotl. Nous remercions également Paul Müller d’avoir fourni des codes pour l’analyse des données AFM. Ce travail a été soutenu par l’installation de microscopie optique de la plate-forme technologique CMCB à l’Université technique de Dresde. AT est membre du Mildred Scheel Early Career Center Dresde P2 financé par l’Aide allemande contre le cancer (Deutsche Krebshilf....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Affinity Designer | Affinity | ; version 1.10.4 | Pour l’assemblage de figures |
| Agarose Low Melt | Roth | 6351.1 | Pour la préparation |
| d’échantillons Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Pour colorer les tissus |
| Axiozoom | Zeiss | Pour imager l’échantillona sous l’AFM | |
| Benzocaïne | Sigma-Aldrich | E1501 | Pour anesthésier les animaux |
| Butorphanol (+)-tartrate sel | Sigma-Aldrich | ; B9156 | Comme analgésique |
| Cantilever | NanoWorld | Arrow TL1 | Pour les mesures d’indentation AFM |
| Configuration Cellhesion 200 équipée d’un étage moteur | JPK/Bruker | Pour les mesures d’indentation AFM | |
| CellSense Entry | Pour l’imagerie dans le stéréoscope Olympus UC90 | ||
| Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate (DPBS, 1x) | Gibco | 14190-144 | Pour nettoyer les échantillons et la section sous vibratome |
| FIJI (ImageJ2) | https://imagej.net/software/fiji | version 2.9.0/1.53t | Pour le traitement d’images |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | (version 8.4.3) | Pour représenter graphiquement et analyser statistiquement les données |
| FBS inactivé par la chaleur | Gibco | 10270-106 | Pour cellule milieu de culture |
| Colle histoacrylique (2-butyl-cyanoacrylate) | Braun | Pour coller l’échantillon sur des boîtes de Pétri | |
| Hoechst 33258 | Abcam | ab228550 | Pour colorer les tissus |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I5500 | Pour milieu de culture cellulaire |
| Microscope confocal inversé | Zeiss | 780 LSM | Pour imager des coupes de tissus |
| Microscope confocaux inversé | Zeiss | 980 LSM | Pour l’imagerie de coupes de tissus |
| Logiciel de traitement de données JPK/ | Bruker JPK/Bruker | SPM 6.4 | Pour l’analyse des courbes force-distance |
| Milieu L15 (Leibovitz) | Sigma | L1518 | Pour milieu de culture cellulaire |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Pour milieu de culture cellulaire |
| Pénicilline/Streptomycine | Gibco | 15140-122 | Pour cellule milieu de culture |
| billes de polystyrène ( 20 & micro ; m de diamètre) ; ) | microParticles | Pour les mesures d’indentation AFM | |
| Pyjibe | écrit par Paul Mü ; ller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe | 0.15.0 | Pour l’analyse viscoélastique |
| Stéréoscope Olympus SX10 | Olympus | SX10 | Pour l’amputation de membres et le montage de tissus |
| Stéréoscope Olympus UC90 | Olympus | UC90 | Pour l’imagerie |
| Vibratome Leica | Leica VT | 1200S | Pour la coupe de tissus |
Références
- Mills, L. A., Aitken, S. A., Simpson, A. H. R. W. The risk of non-union per fracture: current myths and revised figures from a population of over 4 million adults. Acta Orthop. 88 (4), 434-439 (2017).
- Calori, G. M., et al. Non-unions. Clin Cases Miner Bone Metab....
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Réimpressions et autorisations
