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Système pour lésion focale du système nerveux central en système fermé

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DOI :

10.3791/66948

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29 novembre 2024

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1Neuroscience Graduate Program, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit un système d’air de surpression personnalisé conçu pour induire des lésions du système nerveux central (SNC) en système fermé chez la souris, y compris des traumatismes oculaires, cérébraux et de la moelle épinière. L’objectif de ce protocole est de fournir un cadre permettant aux chercheurs d’adapter et d’étendre facilement le système pour leurs études uniques sur les traumatismes du SNC.

Résumé

La prévalence des lésions du système fermé du système nerveux central (SNC) souligne la nécessité d’une meilleure compréhension de ces traumatismes afin d’améliorer les interventions protectrices et thérapeutiques. Des modèles animaux qui reproduisent les lésions du SNC en système fermé sont essentiels à cette recherche. Dans ce contexte, un système d’air de surpression personnalisé a été conçu pour reproduire une gamme de lésions du SNC en système fermé dans des modèles murins, y compris des traumatismes oculaires, cérébraux et de la moelle épinière. À ce jour, le système a été utilisé pour administrer de l’air de surpression dirigé vers les yeux, la tête ou la colonne vertébrale afin de modéliser les lésions du pôle antéropostérieur de l’œil, la neuropathie optique traumatique indirecte (ITON), les lésions cérébrales traumatiques focales et les lésions de la moelle épinière. Cet article fournit un protocole détaillé décrivant la conception et le fonctionnement du système et présente des résultats représentatifs démontrant son efficacité. Le cadre solide présenté ici fournit une base solide pour la recherche en cours sur les traumatismes du SNC. En tirant parti des attributs flexibles du système, les enquêteurs peuvent modifier et contrôler soigneusement l’emplacement, la gravité et le moment des blessures. Cela permet des comparaisons complètes des mécanismes moléculaires et de l’efficacité thérapeutique de plusieurs lésions du SNC en système fermé.

Introduction

Les lésions du système fermé du système nerveux central (SNC) sont des blessures causées par des lésions au cerveau ou à la moelle épinière sans causer de rupture du crâne ou de la colonne vertébrale. Ces blessures comprennent les traumatismes crâniens (TCC) et les lésions de la moelle épinière (LME) et peuvent survenir à la suite de divers incidents, y compris des blessures contondantes (p. ex., chutes, blessures sportives, accidents de la route) et des explosions explosives. Les lésions du SNC en système fermé sont généralement considérées comme moins graves que les lésions pénétrantes du SNC, mais elles se produisent plus souvent. Cependant, à l’instar des blessures pénétrantes, les lésions du SNC en système fermé peuvent entraîner des problèmes de santé à long terme et progressifs, en particulier après des événements répétés 1,2,3,4,5,6. Il est inquiétant de constater que même les lésions subcliniques du SNC en système fermé, qui ne répondent pas aux critères diagnostiques d’un traumatisme crânien ou d’une lésion médullaire après un seul événement 7,8,9,10,11,12,13, peuvent évoluer vers des maladies neurodégénératives chroniques après des lésions répétées 6,14,15,16. Cela souligne la nécessité urgente de mieux comprendre les mécanismes et les conséquences des lésions uniques et répétées du SNC en système fermé.  Ces connaissances sont impératives pour améliorer les approches protectrices et thérapeutiques. Des modèles animaux qui reproduisent les lésions du SNC en système fermé sont essentiels à cette entreprise.

Les modèles animaux actuels de lésions du SNC en système fermé ont joué un rôle déterminant dans l’avancement de notre compréhension de la physiopathologie et des interventions protectrices et thérapeutiques potentielles pour ces traumatismes. Les rongeurs sont particulièrement populaires en raison de leur faible coût, de leur disponibilité, de leur manipulabilité génétique, de leur facilité de manipulation, de leurs tests comportementaux et physiologiques bien établis et de considérations éthiques plus favorables17. Les méthodes courantes pour induire un TCC en système fermé chez les rongeurs comprennent les dispositifs de chute de poids18,19, les dispositifs d’impact cortical contrôlé (CCI)20 et les tubes de choc à air comprimé21. Pour les lésions médullaires, les modèles de traumatisme contondant nécessitent généralement une laminectomie22,23 ou d’autres techniques chirurgicales24 pour accéder directement à la moelle épinière ou à l’espace péridural. Cependant, des modèles de lésions par souffle à fuselage minime à corps fermé ont été mis au point à l’aide de tubes de choc à air comprimé 25. Bien qu’ils fournissent des informations précieuses, chacun de ces modèles présente des limites uniques. Les modèles de perte de poids peuvent présenter une grande variabilité et un contrôle limité de l’emplacement et de la gravité des blessures, ce qui soulève des préoccupations expérimentales et éthiques quant à la cause de blessures graves et incontrôlées26. Les dispositifs CCI offrent une précision mais nécessitent une formation pour fonctionner, peuvent impliquer une craniotomie et peuvent souffrir d’une variabilité mécanique affectant la reproductibilité27. Les tubes à chocs sont généralement moins invasifs, mais peuvent être difficiles à acquérir, complexes à installer et à utiliser, et peuvent créer des conditions de blessure irréalistes et très variables en raison de facteurs environnementaux, de réflexions d’ondes et d’interactions de pression complexes28.

Pour mieux étudier les mécanismes et les effets des lésions uniques et répétées du SNC en système fermé et de leurs traitements, cet article présente une méthode modulaire, conviviale, rentable et non invasive. L’objectif principal de cette approche est de permettre un contrôle précis et une modification souple des paramètres des blessures, y compris l’emplacement, la gravité et le moment. À l’appui de cet objectif, ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour la construction, l’étalonnage et le dépannage d’un système d’air de surpression, qui aborde certaines des limites des dispositifs existants de lésions du SNC en système fermé. Ce système offre non seulement une rentabilité et un temps de configuration minimal, mais il est également très polyvalent, fournissant des résultats cohérents et reproductibles tout en minimisant les problèmes éthiques et en maximisant la pertinence clinique. De plus, la capacité du système à produire une gamme de lésions du SNC en système fermé dans des modèles murins est décrite, ainsi que ses applications potentielles dans des études futures. Notamment, l’objectif de ce manuscrit est de fournir un cadre qui permet aux chercheurs d’acquérir, d’adapter et d’étendre facilement ce système pour leurs besoins spécifiques, faisant ainsi avancer la recherche en cours sur les traumatismes du SNC. Des résultats représentatifs démontrant l’efficacité du système à induire des traumatismes axonaux sont également présentés.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées selon des protocoles approuvés par le29, 30, 31, 32 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Vanderbilt et selon les directives de l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) et de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO). Toutes les souris ont été logées en groupe et maintenues sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures et ont reçu de la nourriture et de l’eau à volonté. Des souris 30,31,33 C57 Bl/6 âgées de trois mois ont été utilisées dans ce protocole.

1. Construction du système

  1. Procurez-vous un pistolet de paintball disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) doté d’un régulateur de pression d’air intégré.
  2. Modifiez le canon (Figure 1A) si nécessaire.
    1. Si le canon d’origine est fenestré avec des ouvertures ou des perforations sur toute sa longueur, l’air comprimé peut s’échapper et se dissiper dans l’air, réduisant ainsi le niveau de pression de sortie maximal. Remplacez-le par l’achat d’un canon solide et non fenêtré pour augmenter la plage de pression de sortie (Figure 1, I).
    2. Si le canon d’origine est long et encombrant, raccourcissez-le en achetant un canon plus court de longueur personnalisée ou en utilisant un coupe-tube ou une scie.
    3. Si le canon d’origine ne produit pas le niveau de pression de sortie souhaité, modifiez le diamètre intérieur (taille de l’alésage) du canon en achetant un canon avec un diamètre d’alésage personnalisé. La diminution du diamètre de la taille de l’alésage d’origine augmentera la plage de pression de sortie, et vice versa.
  3. Modifiez le régulateur (Figure 1B) si nécessaire.
    1. Retirez le capuchon de guidage pour permettre un accès direct à la vis de réglage (Figure 1, II) si le régulateur d’origine est livré avec un capuchon de guidage.
    2. Remplacez la vis à six pans plongeante par une vis à tête plate si la vis de réglage d’origine est livrée avec une douille à tête Allen.
  4. Retirez le chargeur d’alimentation par gravité standard (c’est-à-dire le réservoir pour tenir et alimenter les balles de peinture dans le pistolet) et scellez le tube d’alimentation vertical (Figure 1, III) pour éviter les fuites de pression.
    1. Assurez-vous que le pistolet de paintball est déchargé et que la source d’air (réservoir de CO2 ou d’air comprimé) est déconnectée avant de retirer le chargeur à alimentation par gravité.
    2. Localisez le goulot d’alimentation (Figure 1C) où le chargeur d’alimentation par gravité est fixé. Desserrez la pince du col d’entraînement à l’aide de l’outil approprié.
    3. Retirez le chargeur d’alimentation par gravité standard en le tirant vers le haut.
    4. Insérez un couvercle de goulot d’alimentation ou un bouchon pour sceller l’ouverture. Ceux-ci sont généralement disponibles dans les magasins de paintball ou en ligne et sont conçus pour s’adapter parfaitement au goulot d’alimentation, le scellant.
  5. Assemblez une plate-forme (Figure 1D) pour le pistolet de paintball et une table de positionnement d’animaux x-y.
    1. Construisez la base de la plate-forme en coupant deux morceaux de panneaux de fibres de densité moyenne.
      REMARQUE : Selon la disponibilité et la préférence des matériaux, des matériaux alternatifs (par exemple, le contreplaqué) peuvent également être utilisés.
    2. Coupez un morceau carré plus petit de 1,5 x 1,5 pi.
    3. Coupez un morceau rectangulaire plus grand de 2,5 x 1,5 pi.
    4. Élevez et fixez la plus petite plate-forme de 3,5 pouces au-dessus de la plus grande plate-forme à l’aide de deux 2 x 4 s parallèles.
  6. Fixez le pistolet de paintball modifié à la plate-forme.
    1. Posez le pistolet de paintball sur le côté sur la plus petite plate-forme de sorte que l’extrémité du canon dépasse d’un demi-pouce du bord.
    2. Fixez le pistolet de paintball à l’aide de supports de montage ou de pinces qui s’adaptent au canon et à la crosse du pistolet de paintball.
    3. Fixez un réservoir d’air sous pression (Figure 1E ; voir le tableau des matériaux) au régulateur du pistolet de paintball. Vous pouvez également connecter une conduite à pression directe à partir d’un réservoir d’azote comprimé pour augmenter la plage de niveaux de pression de sortie fiables.
    4. Si vous utilisez un réservoir d’air sous pression, fixez-le au panneau de fibres avec une sangle en tissu durable. Fixez la sangle à l’aide de vis ou de boulons et incluez un mécanisme de réglage pour un serrage et un desserrage faciles.
  7. Fixez une table de positionnement x-y sur le plus grand morceau de panneau de fibres rectangulaire opposé au canon du pistolet de paintball à l’aide de vis ou de boulons (Figure 1F).
    REMARQUE : Une table de positionnement x-y (voir Table des matériaux), également connue sous le nom de platine x-y, peut être achetée auprès de divers fournisseurs, notamment des détaillants en ligne, des fournisseurs industriels et des fournisseurs d’équipements scientifiques. Lors de l’achat d’une table de positionnement x-y, tenez compte de la plage de course, de la capacité de charge, de la précision et du choix entre le réglage manuel ou la commande motorisée. Cette table de positionnement x-y permettra un mouvement et un positionnement précis de l’animal le long de deux axes : l’axe x (horizontalement vers ou loin du canon) et l’axe y (verticalement vers le haut ou vers le bas du canon).
  8. Modifiez la table de positionnement x-y en installant trois pinces en PVC.
    1. Fixez deux pinces en PVC de 1 cm d’épaisseur de chaque côté de l’avant du canon à l’aide de vis ou de boulons. Assurez-vous que les pinces sont suffisamment larges pour accueillir le porte-animal des étapes 1.9 et 1.10 (par exemple, 1,5 po).
    2. Fixez une pince en PVC plus épaisse (4 cm) perpendiculairement et à l’opposé des deux pinces de 1 cm d’épaisseur à l’aide de vis ou de boulons. Assurez-vous que la pince est suffisamment large pour accueillir le transducteur de pression à partir de l’étape 2.4 (par exemple, 1,5 po).
    3. Percez deux trous en haut de la troisième pince et insérez deux vis en plastique pour une stabilisation supplémentaire du transducteur de pression lors de l’étalonnage du système à l’étape 2.
  9. Personnalisez l’intérieur du support pour animaux (Figure 2A).
    1. Achetez et coupez un morceau de tube en PVC (35 mm de diamètre extérieur, 26 mm de diamètre intérieur, 6,75 pouces de long) pour la chambre de confinement intérieure de la souris.
    2. Créez un trou de forme rectangulaire (3 x 5 cm) à 1 pouce de l’extrémité du tube pour exposer la tête et les épaules postérieures supérieures de la souris tandis que le reste du corps reste protégé.
      REMARQUE : Si le site de la lésion du SNC est plus bas sur le dos de la souris (par exemple, la colonne thoracique ou lombaire), agrandissez le trou rectangulaire.
  10. Personnalisez l’extérieur du support d’animal (Figure 2B).
    1. Achetez et coupez un morceau de tube en PVC (44 mm de diamètre extérieur, 35 mm de diamètre intérieur, 6 pouces de long) pour la chambre de confinement extérieure de la souris.
    2. Construire une ouverture d’exposition (figure 2C) à l’intérieur de la chambre de confinement extérieure pour un contrôle précis du site de l’accident du SNC.
    3. Créez une ouverture inverse sur le côté opposé pour insérer le cylindre du transducteur de pression lors de l’étalonnage du système à l’étape 2 (par exemple, un trou de 9 mm).
  11. Modifier l’extérieur du support de l’animal pour permettre l’administration d’une anesthésie gazeuse. Si un anesthésique injectable est utilisé à la place, sautez cette étape.
    1. Scellez une extrémité de l’extérieur du porte-animal à l’aide de ruban adhésif. Assurez-vous d’un ajustement serré pour éviter les fuites de gaz.
    2. Créez un petit trou dans le joint pour insérer la ligne d’anesthésie.
    3. Positionnez la ligne d’anesthésie de manière à introduire l’isoflurane dans l’environnement du tube sans contact direct avec l’animal.

2. Étalonnage du système

  1. Connectez un transducteur de pression (Figure 2D ; voir la Table des matériaux pour les options) à un système d’acquisition de données (DAQ) et à un ordinateur pour traduire les relevés de pression physique en données numériques.
    1. Connectez le transducteur de pression au module DAQ (voir le tableau des matériaux), en assurant une polarité correcte et des connexions sécurisées.
    2. Insérez le module DAQ dans un châssis DAQ (voir Tableau des matériaux) pour lui permettre d’être alimenté et de communiquer avec l’ordinateur.
    3. Utilisez un câble USB pour connecter le châssis DAQ à l’ordinateur.
    4. Assurez-vous que l’ordinateur dispose des logiciels et des pilotes nécessaires pour l’interfaçage avec le matériel DAQ et l’acquisition de données (voir la table des matériaux pour les options).
  2. Configurez les paramètres du système DAQ.
    1. Ouvrez le logiciel DAQ installé.
    2. Assurez-vous que le système DAQ est reconnu par l’ordinateur.
    3. Consultez les fiches techniques de spécification et d’étalonnage de votre module/châssis d’acquisition de données et de votre capteur de pression et configurez les paramètres du système d’acquisition de données :
      REMARQUE : Les paramètres DAQ du matériel DAQ utilisé dans ce manuscrit sont accessibles au public sur GitHub. Les lecteurs intéressés peuvent accéder au dépôt à l’adresse https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      1. Entrée analogique : sélectionnez la voie d’entrée physique du module DAQ sur laquelle le capteur de pression est connecté.
      2. Source d’excitation (source Vex) : spécifiez la source d’excitation du module DAQ (par exemple, interne ou externe).
      3. Tension d’excitation (valeur Vex) : Réglez la valeur vex sur la valeur spécifiée par le fabricant du transducteur de pression (par exemple, 5 ou 10 V).
      4. Type de pont : choisissez le type de pont approprié de votre module DAQ (par exemple, pont complet, demi-pont ou quart de pont).
      5. Résistance du pont : Réglez la résistance du pont sur la valeur spécifiée par le fabricant du capteur de pression (par exemple, 350 ).
      6. Facteur d’étalonnage/mise à l’échelle personnalisée : configurez la mise à l’échelle en fonction de la fiche technique d’étalonnage fournie par le fabricant du capteur de pression. Le fabricant étalonne le transducteur de pression en appliquant une unité physique connue (psi) et en mesurant les unités électriques résultantes (mV/V). Créez une courbe d’étalonnage en comparant les unités physiques connues aux unités électriques obtenues.
      7. Taux d’échantillonnage (Hz) : réglez le taux d’échantillonnage suffisamment élevé pour capturer la dynamique des changements de pression sans repliement (par exemple, 1 ou 10 kHz selon la vitesse des changements de pression dans votre expérience).
        REMARQUE : Plus votre forme d’onde d’air de surpression est étroite (c’est-à-dire plus elle change rapidement de pression), plus la gamme de fréquences qu’elle excite est large et donc plus le taux d’échantillonnage doit être élevé. Ceci est particulièrement important dans les expériences impliquant des modèles de lésions du SNC où les changements de pression peuvent se produire rapidement.
  3. Créez un outil numérique dans le logiciel DAQ pour l’acquisition de données.
    REMARQUE : Cet outil numérique sera utilisé pour mesurer, enregistrer, afficher et analyser avec précision les pressions de sortie du système. L’outil numérique utilisé dans ce manuscrit est accessible au public sur GitHub. Les lecteurs intéressés peuvent accéder au dépôt à l’adresse https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.x
    1. Mettez en œuvre des algorithmes de traitement du signal pour filtrer, amplifier ou traiter les données brutes du transducteur.
    2. Ajoutez des outils d’analyse pour calculer des mesures telles que la pression maximale, la pression moyenne et la durée des événements de pression.
    3. Incorporez des éléments visuels (par exemple, des graphiques) pour afficher les données de pression en temps réel et des éléments de contrôle pour démarrer, arrêter et réinitialiser l’acquisition de données.
    4. Enregistrez l’outil numérique.
  4. Mesurer la pression de sortie du système
    1. Insérez le transducteur de pression dans l’épaisse pince de la table x-y et son canon à travers le trou du support d’animal (créé à l’étape 1.10.3).
    2. Ajustez le canon du transducteur de pression jusqu’à ce que la pointe se trouve précisément à l’endroit où se trouve le site de la blessure du SNC.
    3. Fixez le transducteur de pression à l’aide de deux vis en plastique (installées à l’étape 1.8.3).
  5. Exécutez l’outil numérique dans le logiciel d’acquisition de données tout en relâchant la gâchette du pistolet de paintball pour capturer, analyser et visualiser la pression de sortie du système.
  6. Ajustez la vis de réglage jusqu’à ce que la pression de sortie du système atteigne le niveau souhaité.
    REMARQUE : Après avoir modifié le canon du pistolet de paintball pour qu’il soit non fenestré, de 1,5 pouce de longueur et de 6,5 mm de diamètre, le système est capable de fournir de manière fiable des niveaux d’air de surpression dans la plage de 15 à 50 psi à 5 mm de l’avant du canon34. Les niveaux d’air de surpression inférieurs à 15 psi et supérieurs à 50 psi présentent une grande variabilité d’intensité. Pour un affichage complet de la pression de sortie (psi) du système en fonction de la pression d’entrée (psi), de la distance du canon (cm) et du temps (ms), voir la figure 2 de Hines-Beard et al.34. Utilisez de l’azote comprimé au lieu de l’air comprimé pour obtenir de manière fiable des niveaux d’air de surpression supérieurs à 50 psi à l’aide de ce système.

3. Préparation des animaux et exposition à l’air en surpression

  1. Anesthésie la souris avec de l’isoflurane dans une chambre d’induction avec 1,5-3%30,31,32,33 d’isoflurane dans l’oxygène jusqu’à ce qu’elle soit complètement sédative.
    1. Confirmez l’anesthésie en évaluant l’absence de réponse à un pincement de l’orteil.
    2. Fixez la souris dans le support intérieur de l’animal avec sa tête et ses épaules postérieures supérieures exposées à travers l’ouverture rectangulaire, tandis que le dos et les membres postérieurs inférieurs restent protégés.
    3. Soutenez la tête de la souris à l’aide d’un coussin fixé à la partie inférieure intacte du support intérieur de l’animal.
    4. Fixez la souris en appliquant du ruban chirurgical sur le haut des épaules arrière.
    5. Insérez le support intérieur pour animaux dans le support extérieur pour animaux.
    6. Ouvrez la ligne d’anesthésie secondaire pour administrer l’isoflurane à l’intérieur du support pour animaux.
    7. Placez un coussin supplémentaire à l’extrémité du support pour animaux afin d’éviter que l’anesthésique ne s’échappe du tube et que la souris ne bouge lors d’une exposition à l’air sous pression.
  2. Débit d’air de surpression
    1. Alignez l’ouverture circulaire de 4 mm du support extérieur de l’animal directement sur l’œil gauche de la souris.
    2. Positionnez le porte-animal à l’aide des boutons de commande sur la table x-y de manière à ce que son ouverture s’aligne avec le canon du pistolet de paintball et que la surface externe soit à 5 mm de l’extrémité du canon.
      REMARQUE : Ajustez la distance de l’animal par rapport à l’extrémité du canon pour changer le niveau d’air de surpression (psi) et la forme. Éloignez l’animal du canon pour abaisser le niveau d’air de surpression et créer une onde d’air de surpression plus diffuse.
    3. Initier la séquence d’air de surpression pour induire ITON :
      1. Délivrer deux rafales d’air de surpression de 15 psi à un intervalle de 0,5 s, répétées quotidiennement pendant 3 jours 29,30,31,32.
        REMARQUE : Une ITON similaire peut être induite par la distribution de trois rafales consécutives d’air de surpression de 15 psi séparées par des intervalles de 0,5 s23. Le degré d’ITON qui résulte de l’administration de six rafales consécutives d’air de surpression de 15 psi séparées par des intervalles de 0,5 s est indiqué ici dans les résultats représentatifs.
      2. Exposez les souris factices au bruit de l’air de surpression, mais pas à l’air de surpression lui-même en tournant le support de l’animal de manière à ce que l’ouverture ne soit plus face au canon et bloquez l’air avec un bouclier en carton.
  3. Récupération de la souris
    1. Laissez les souris se remettre de l’anesthésie.
      1. Administrez des gouttes ophtalmiques lubrifiantes (voir le tableau des matériaux) pour éviter que les yeux ne se dessèchent à cause de l’anesthésie.
      2. Fournir de la chaleur à l’aide d’un support de chauffage contrôlé (voir tableau des matériaux).
    2. Surveillez visuellement les souris jusqu’à ce qu’elles maintiennent une posture droite et marchent normalement. Permettez-leur d’être en compagnie de leurs compagnons de cage.
    3. Fournissez à toutes les souris exposées à de l’air en surpression de la nourriture de récupération de gel (voir le tableau des matériaux) pendant les 3 premiers jours suivant la blessure pour prévenir la perte de poids.

4. Collecte et traitement des tissus

  1. Euthanasier les souris par injection intrapéritonéale de la solution de travail Avertin.
    1. Préparez le stock Avertin en mélangeant 10 g de 2,2,2,-tribromoéthanol (voir le tableau des matériaux) avec 10 ml de 1-pentanol (voir le tableau des matériaux). Conserver dans l’obscurité à 4 °C.
    2. Préparez la solution de travail Avertin en combinant 1,25 ml de bouillon Avertin, 45 ml d’eau distillée double et 5 ml de 10x PBS (voir le tableau des matériaux) dans un tube de 50 ml. Filtrez, stérilisez le mélange et conservez-le dans l’obscurité à 4 °C.
  2. Perfuser les souris par voie transcardique avec 4% de paraformaldéhyde (voir le tableau des matériaux) dans 1x PBS (voir le tableau des matériaux).
  3. Énucléer l’œil exposé à l’air en surpression à l’aide de pinces fines (voir Tableau des matériaux) et de ciseaux (voir Tableau des matériaux), en veillant à préserver le nerf optique (ON).
  4. Prélever l’ON ainsi que le tissu oculaire énucléé pour une analyse plus approfondie.
  5. Osmicate ON tissu.
    1. Postfix ON tissu pendant la nuit dans 4 % de paraformaldéhyde et 2 % de glutaraldéhyde (voir tableau des matériaux) dans 1x PBS. Si vous travaillez avec un tissu qui n’a pas été perfusé (comme à l’étape 4.2), postfixez pendant 5 jours au lieu de toute la nuit.
    2. Transférez le tissu ON sur une plaque de 12 ou 24 puits (voir le tableau des matériaux) avec 1x PBS à l’aide d’un pinceau (voir le tableau des matériaux) ou d’un bâton en bois pointu.
    3. Dans une hotte, remplacez le 1xPBS par du tétroxyde d’osmium à 2 % (voir la table des matériaux) dans un tampon cacodylate de 0,2 M (la recette est accessible au public sur GitHub. Les lecteurs intéressés peuvent accéder au dépôt à l’adresse https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON) à l’aide d’une pipette de transfert. Incuber sur glace pendant 2 h.
    4. Effectuez trois lavages avec 1x PBS
      1. Éliminer les déchets d’osmium de manière appropriée.
      2. Laissez la plaque dans la hotte pendant deux nuits après le troisième lavage PBS.
  6. Déshydrater les tissus ON dans une série d’éthanol gradué.
    1. Transférez les nerfs dans une nouvelle plaque avec 50% d’éthanol et incubez pendant 30 min.
    2. Remplacer par de l’éthanol à 70 % pendant 30 min.
    3. Remplacer par de l’éthanol à 95 % pendant 30 min.
    4. Remplacer par de l’éthanol à 100 % pendant 30 min.
  7. Intégrez le tissu ON dans epon.
    REMARQUE : La recette Epon est disponible publiquement sur GitHub. Les lecteurs intéressés peuvent accéder au dépôt à l’adresse https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON ; voir la table des matériaux pour les matériaux énumérés dans la recette.
    1. Jour 1 : Transférer le tissu dans un flacon de 2 ml avec de l’oxyde de propylène (voir le tableau des matériaux)/de l’éthanol à 100 % (1:1) et agiter pendant 30 minutes à température ambiante. Remplacez par de l’oxyde de propylène pur et agitez pendant 15 min, en répétant une fois. Remplacer par de l’oxyde de propylène/épon (1:1) et agiter toute la nuit dans la chambre froide.
    2. Jour 2 : Transférer le mouchoir dans une plaque à 12 ou 24 puits avec 100 % d’épon et agiter pendant 4 h à température ambiante. Remplacer par de l’épon frais à 100 % et incuber toute la nuit à température ambiante sous vide.
    3. Jour 3 : Répétez l’incubation de l’épon comme au jour 2.
    4. Jour 4 : Transférez le tissu dans un moule plat avec 100% d’epon, réorientez le tissu et placez-le dans un four à 60 °C pendant 48 h.
  8. Section ON tissu.
    1. Trim se moule sous une lunette de dissection en une double pyramide avec le nerf au centre.
    2. Prélever des sections transversales de 700 nm d’épaisseur à l’aide d’un ultramicrotome et d’un couteau diamanté (voir le tableau des matériaux).
    3. Prélever des sections sur des lames de microscope en verre blanc chargé à l’aide d’eau distillée.
    4. Sécher les lames dans un four à 60 °C jusqu’à ce que l’eau s’évapore. Refroidir à température ambiante.
  9. Tache sur le tissu.
    1. Immerger les lames dans de la paraphénylènediamine à 1 % (PPD) (voir le tableau des matériaux) dans un mélange 1:1 de méthanol et de 2-propanol pendant 28 min.
    2. Rincer les lames en deux mélanges consécutifs de méthanol 1:1 (voir le tableau des matériaux) et de 2-propanol (voir le tableau des matériaux) pendant 1 min chacun.
    3. Rincez les lames dans de l’éthanol à 100 % pendant 1 min et laissez sécher à l’air.
    4. Placez les lames dans une boîte humide et recouvrez les sections de bleu de toluidine à 1 % (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’une pipette de transfert.
    5. Incuber dans un four à 60 °C pendant 20 min.
    6. Rincez les lames avec de l’eau distillée deux fois et laissez sécher à l’air.
  10. Montez et imagez sur du tissu.
    1. La lamelle couvre-objet glisse à l’aide d’un support de montage (voir le tableau des méthodes), en enlevant l’excédent de support.
    2. Laissez les lames sécher pendant la nuit.
    3. Imagez des coupes transversales à l’aide de la microscopie à champ clair avec un objectif à immersion dans l’huile 100x.
  11. Intégrer, sectionner et colorer immunohistochimiquement le tissu rétinien.
    1. Postfixer le tissu oculaire entier dans 4% de paraformaldéhyde pendant 2 à 4 h.
    2. Cryoprotégez l’ensemble du tissu oculaire avec 30% de saccharose (voir tableau des matériaux en 1x PBS pendant la nuit à 4 °C.
    3. Incorporez le tissu oculaire dans un produit de congélation (voir le tableau des matériaux).
    4. Prélever des coupes efficaces de rétine de 10 μm d’épaisseur sur un cryostat et monter les coupes sur des lames de microscope en verre blanc chargé (voir Tableau des matériaux).
    5. Laver les lames dans 1x PBS et incuber dans un tampon bloquant (5% de Triton X-100 et 2% d’albumine sérique bovine (BSA) (voir la table des matériaux) dans 1x PBS) avec 5% de sérum d’âne normal (NDS) (voir la table des matériaux) à température ambiante pendant 30 min.
    6. Incuber les lames pendant la nuit à 4 °C (ou à température ambiante pendant 4 h) dans l’anticorps primaire (voir le tableau des matériaux) dans du Triton X-100 à 0,5 % (voir le tableau des matériaux) dans du 1xPBS (PBT).
    7. Laver les lames dans du PBT et les incuber dans des anticorps secondaires (voir le tableau des matériaux) dans un tampon de blocage avec 5% de NDS.
    8. Lavez les lames en PBT, appliquez le support de montage avec du DAPI (voir le tableau des matériaux), une lamelle et scellez-le avec du vernis à ongles.
    9. Diapositives d’images sur un microscope à épifluorescence.
    10. Si vous quantifiez l’intensité de la fluorescence, assurez-vous que les images sont prises à partir de la même région rétinienne avec des paramètres de grossissement, de gain et d’exposition identiques.
  12. Comptez SUR les axones.
    1. Comptez manuellement le nombre d’axones à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (voir la Table des matériaux) en prélevant 20 % de la section transversale totale du nerf à l’aide d’une superposition de grille fixe pour estimer la densité axonale (axones/mm2).
    2. Mesurez l’aire de la section ON.
      1. Utilisez la fonction Définir l’échelle pour définir les pixels/microns de l’objectif utilisé pour l’image.
      2. Utilisez l’outil de sélection de polygone pour tracer le long de la gaine de myéline du nerf optique, à l’exclusion du système vasculaire.
      3. Mesurez la surface de l’ON à l’aide de la fonction Mesurer .
      4. Déterminez 20 % de l’aire totale en multipliant l’aire mesurée par 0,2.
    3. Superposez la grille fixe sur la section ON.
      1. Téléchargez le plug-in Counting Array.
        REMARQUE : Ce plug-in est disponible publiquement sur GitHub. Les lecteurs intéressés peuvent accéder au dépôt à l’adresse https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      2. Ouvrez le plug-in Tableau de comptage pour superposer une grille fixe au sommet de la section transversale, composée de 9 carrés régulièrement espacés en forme de signe plus.
      3. Modifiez l’aire de chacune des 9 régions en divisant 20 % de l’aire totale de la section efficace de l’Ontario (calculée à l’étape 4.6.2.4) par 9.
      4. Centrez la grille fixe de sorte que le centre du signe plus soit centré au milieu de la section ON.
    4. Comptez séparément les axones vivants et les axones en dégénérescence.
      1. Téléchargez et ouvrez le plug-in Cell Counter.
        REMARQUE : Ce plug-in est disponible publiquement sur GitHub. Les lecteurs intéressés peuvent accéder au dépôt à l’adresse https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      2. Pour chacune des 9 régions, comptez le nombre de profils axonaux vivants et en dégénérescence séparément en visualisant l’état de la gaine de myéline. Assurez-vous que la quantification axonale est effectuée en aveugle au groupe expérimental de l’animal pour éviter les biais.
      3. Pour les axones vivants, recherchez ceux dans lesquels la gaine de myéline apparaît intacte, uniformément colorée et doucement et uniformément encerclée autour de l’axone.
      4. Pour les axones en dégénérescence, recherchez ceux avec un épaississement, un oignon ou un effondrement de la gaine de myéline.
      5. Si l’axone est partiellement coupé par la grille superposée, ne l’incluez dans le décompte des axones que si la lumière est visible.
      6. Assurez-vous que les axones oblongs ne sont pas comptés accidentellement plus d’une fois et ne confondez pas les débris ou la poussière avec un profil axonal en dégénérescence.
    5. Effectuer des analyses statistiques pour vérifier les différences significatives dans le nombre moyen d’axones entre les groupes. S’assurer qu’au moins quatre ON sont inclus dans chaque groupe pour tenir compte de la variabilité normale observée dans les analyses précédentes.
      1. Effectuez un test t sur échantillons indépendants (également connu sous le nom de test t de Student pour les échantillons indépendants) pour évaluer les différences significatives entre les moyennes de deux groupes indépendants.
      2. Effectuer l’alternative non paramétrique, le test U de Mann-Whitney, si les conditions d’un test t d’échantillons indépendants ne peuvent pas être remplies (c’est-à-dire si les données ne sont pas normalement distribuées ou si la taille des échantillons est trop petite).

Résultats

À l’aide du système de production d’air de surpression décrit ici, la neuropathie optique traumatique indirecte (ITON) a été provoquée en exposant l’œil gauche de souris C57Bl/6 mâles adultes (âgées de 3 mois) (n = 4) à six rafales consécutives d’air de surpression de 15 psi séparées par des intervalles de 0,5 s. Des animaux factices (n = 8 ; données tirées de Vest et coll.33) ont été anesthésiés, placés dans le support pour animaux et exposés au son, mais pas à l’air de surpression.

Les nerfs optiques proximaux des animaux fictifs (Figure 3A) semblaient sains avec des axones densément emballés et de taille uniforme entourés de cellules gliales de morphologie et de distribution normales. En comparaison, les nerfs optiques proximaux des souris exposées à ITON (c’est-à-dire 6 rafales consécutives d’air de surpression de 15 psi séparées par des intervalles de 0,5 s) (Figure 3B) semblaient dégénérer avec des signes de perte d’axones, tels qu’un espacement accru entre les axones restants, des signes de dégénérescence axonale, y compris un gonflement, des irrégularités dans la forme des axones et une rupture de la gaine de myéline des axones, et des signes de gliose, y compris l’hypertrophie et l’hyperplasie des cellules gliales. Les tests U de Mann-Whitney ont confirmé une différence significative dans les axones totaux (p = 0,0040) (Figure 3C) et les profils dégénératifs (p = 0,0028) (Figure 3D) entre ITON et les souris fictives. Ces résultats suggèrent que l’ITON diminue significativement le nombre total d’axones et augmente significativement les profils dégénératifs. Des tests U de Mann-Whitney ont été effectués parce que les données du groupe ITON n’avaient pas une taille d’échantillon suffisante pour un test t d’échantillons indépendants.

Une coloration immunohistochimique de coupes efficaces de la rétine avec de l’anti-Iba1 (voir Tableau des matériaux), un marqueur de la microglie (les cellules immunitaires primaires du système nerveux central), a été réalisée sur des souris simulacres (Figure 4A) et ITON (Figure 4B). La coloration a révélé que les microglies étaient dans leur état de repos pour toutes les souris, caractérisées par de petits corps cellulaires avec des processus longs, minces et hautement ramifiés. Notamment, une augmentation du nombre de microglies a été notée chez les souris ITON (figure 4B), suggérant une prolifération microgliale en réponse à une blessure. De plus, chez les souris ITON, on a observé que la microglie s’étendait anormalement dans la couche nucléaire externe (ONL), où résident les corps cellulaires photorécepteurs (Figure 4B). Cela contraste avec les animaux fictifs (Figure 4A), où la microglie était localisée dans la couche de cellules ganglionnaires (GCL), la couche plexiforme interne (IPL), la couche nucléaire interne (INL) et la couche plexiforme externe (OPL) - les couches où la microglie réside généralement dans une rétine saine et non blessée.

La coloration immunohistochimique ultérieure avec des anti-PKC-α (voir le tableau des matériaux) et de l’anti-synaptophysine (voir le tableau des matériaux), des marqueurs pour les cellules bipolaires en bâtonnets et les synapses du ruban photorécepteur, respectivement, a révélé des connexions synaptiques intactes chez les souris simulacres (Figure 5A) et ITON (Figure 5B). Plus précisément, les dendrites des cellules bipolaires des bâtonnets ont été observées s’étendant et se chevauchant avec les terminaisons synaptiques des photorécepteurs des bâtonnets. Cette découverte contraste avec une étude antérieure35, qui a montré une rétraction des dendrites des cellules bipolaires des bâtonnets vers leurs corps cellulaires quatre semaines après ITON à partir de deux rafales consécutives de 15 psi d’air de surpression (à 0,5 s d’intervalle) une fois par jour pendant 3 jours. Cette divergence peut être attribuée aux différents points de collecte de tissus entre les deux études. Les échantillons actuels ont été prélevés 2 semaines après l’étude ITON, comparativement à 4 semaines après l’étude précédente. Bien qu’aucune synaptopathie n’ait été détectée dans l’analyse actuelle, nous avons noté l’extension des processus microgliaux dans l’ONL (Figure 4B), où se trouvent les corps cellulaires photorécepteurs. Cette observation suggère que la perturbation des connexions synaptiques entre les cellules bipolaires et les photorécepteurs peut apparaître comme un effet secondaire de la lésion, tandis que la perte d’axones, la dégénérescence axonale et la gliose constituent des effets primaires des dommages.

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Figure 1 : Système de lésion focale du système nerveux central en système fermé. Les rectangles en pointillés de l’image du haut sont agrandis et représentés par B, C et A dans les deux images ci-dessous (comme indiqué par des flèches blanches). (A) Canon personnalisé de 1,5 pouce, non fenêtré (I) à l’extrémité du pistolet de paintball. (B) Régulateur de pression avec capuchon de guidage retiré pour exposer la vis de réglage (II). (C) Goulot d’alimentation avec le chargeur d’alimentation par gravité retiré et un couvercle de goulot d’alimentation installé (III). (D) Plate-forme de base composée d’un morceau de panneau de fibres de 1,5 pi x 1,5 pi élevé au-dessus d’un plus grand morceau de panneau de fibres de 2,5 pi x 1,5 pi. (E) Réservoir d’air comprimé relié au régulateur de pression du pistolet de paintball et fixé à la plate-forme en panneaux de fibres à l’aide d’une sangle durable. (F)x-y table de positionnement d’animaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Support d’animal personnalisé pour l’administration focale de l’air de surpression. (A) L’intérieur du support pour animaux est constitué d’un tube en PVC étroit avec un trou de forme rectangulaire (3 x 5 cm) pour exposer la tête et le haut des épaules postérieures de l’animal. (B) À l’extérieur du support d’animal, il est constitué d’un tube en PVC plus large dans lequel le tube en PVC plus étroit se glisse, protégeant l’ensemble du corps de l’animal à l’écart des tissus exposés à l’intérieur de l’ouverture d’exposition. (C) Ouverture d’exposition pour l’administration focale de l’air de surpression vers le site d’intérêt de la lésion du SNC. (D) Transducteur de pression pour calibrer la pression de sortie du système. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : ITON dû à l’administration focale d’air sous surpression. (A,B) Micrographies représentatives en fond clair de coupes efficaces du nerf optique proximal de (A) simulé et (B) ITON. (C) Quantification du nombre total d’axones. (D) Quantification des profils axonaux dégénératifs. n = 4 pour ITON. n = 9 pour le trompe-l’œil. Les données sur le nombre d’axones pour le groupe placebo ont été tirées de Vest et al.33. **p < 0,005. Les barres d’erreur représentent l’écart-type. Barres d’échelle = 20 μm. Abréviation : ITON = neuropathie optique traumatique indirecte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Prolifération et migration anormales de la microglie dans l’ONL en raison de l’ITON induit par le système. (A,B) Micrographies à fluorescence représentatives de coupes efficaces de la rétine avec marquage anti-Iba1 de la microglie (rouge) provenant d’animaux fictifs et (B) d’animaux ITON. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : ITON = neuropathie optique traumatique indirecte ; GCL = couche de cellules ganglionnaires, INL = couche nucléaire interne, ONL = couche nucléaire externe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Persévération précoce des connexions synaptiques entre les cellules bipolaires en bâtonnets et les photorécepteurs due à l’ITON induit par le système, malgré le potentiel de synaptopathie retardée. (A,B) Micrographies à fluorescence représentatives des coupes efficaces de la rétine avec marquage anti-synaptophysine des synapses du ruban photorécepteur (rouge) et marquage anti-PKC-α des cellules bipolaires en bâtonnets (vert) à partir de (A) simulacres et (B) Sur les animaux. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : ITON = neuropathie optique traumatique indirecte ; PKC = protéine kinase C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ce système d’air de surpression personnalisé est un outil utile pour étudier les lésions du SNC en système fermé dans des modèles murins. Les résultats représentatifs de l’expérience d’exemple démontrent que l’administration focale d’air de surpression à l’aide de ce système peut induire efficacement ITON, entraînant une perte et une dégénérescence axonales importantes. Cela met en évidence la capacité du système à produire des lésions précises et reproductibles du SNC.

L’une des principales forces de ce système est sa personnalisation pour induire une gamme de lésions du SNC. La gravité de la blessure peut être ajustée en modifiant la pression de sortie globale du système, la distance entre l’animal et l’extrémité du canon à l’aide de la platine de positionnement x-y, la taille et la forme de l’ouverture d’exposition, le nombre d’expositions à l’air en surpression et l’intervalle entre les expositions. De plus, l’emplacement de la lésion du SNC peut être ajusté en modifiant l’emplacement de l’ouverture d’exposition à l’intérieur du support d’animal. Cette polyvalence a permis au système de produire un éventail de lésions du SNC en système fermé dans des modèles murins. Initialement, le système a été utilisé pour modéliser les lésions à globe fermé, en se concentrant sur les lésions aux pôles antérieur et postérieur et les déficits associés34,36, y compris les impacts de la réponse du système immunitaire37, les résultats spécifiques à la souche38 et l’efficacité des agents neuroprotecteurs39. Finalement, cette application s’est étendue pour évaluer les séquelles des expositions oculaires répétées afin de modéliser la neuropathie optique traumatique indirecte (ITON)30 et d’explorer l’effet du nombre et de l’intervalle entre les expositions répétées33. Depuis lors, l’application du système s’est étendue au modèle des lésions cérébrales traumatiques légères (TCL) fermées par le biais d’expositions dirigées vers la tête40,41 et des lésions de la moelle épinière à corps fermé (LME) par des expositions dirigées vers le dos42, mettant l’accent sur l’adaptabilité et la polyvalence de l’appareil dans l’étude de divers domaines de lésions du SNC.

Lors de l’utilisation de ce système, il est essentiel de prendre des mesures pour minimiser la variabilité des résultats des blessures afin d’assurer la reproductibilité et la fiabilité des résultats expérimentaux. Les mesures clés comprennent l’étalonnage des niveaux de pression de sortie du système avant et après chaque série de trois expositions afin d’assurer une distribution constante de la pression. Bien que la variabilité soit faible lorsque le système fonctionne entre 15 psi et 50 psi lorsqu’il utilise de l’air comprimé34, un étalonnage cohérent permet de détecter les erreurs inattendues, telles que la batterie faible ou l’air faible. De plus, positionnez chaque animal à la même distance de l’extrémité du canon pour assurer une amplitude de surpression constante, car l’intensité de l’onde de pression diminue avec la distance. Un positionnement uniforme garantit également que chaque animal est touché par la même partie de l’onde. De plus, le fait de fixer uniformément les animaux à l’intérieur du support garantit que les tissus d’intérêt sont ciblés de manière cohérente, en particulier dans les modèles à exposition répétée lorsqu’il y a un risque de mouvement. Enfin, l’uniformité de l’âge, du sexe et du patrimoine génétique des animaux est cruciale, car ces facteurs influencent la réponse aux blessures. Par exemple, des études antérieures utilisant ce système ont comparé les effets de l’air de surpression oculaire sur différentes souches de souris, mettant en évidence des différences significatives dans la réponse aux lésions entre les souris C57Bl/6J36, DBA/2J37 et Balb/c38 . Les souris DBA/2J et Balb/c ont présenté des pathologies du pôle antérieur plus graves, des lésions rétiniennes plus importantes, un stress oxydatif plus élevé et des réponses neuro-inflammatoires plus prononcées par rapport aux souris C57Bl/6J, les souris Balb/c présentant des profils de lésions particulièrement robustes et durables38.

Dépannage du système
Si les valeurs de pression sont inhabituellement basses pour un réglage donné du manomètre, appuyez sur la gâchette 5 à 10 fois, permettant à l’air de passer à travers le système et au régulateur de s’ajuster à un nouveau réglage. Il ne doit pas y avoir de fuites dans le réservoir d’air. Le joint torique du réservoir d’air ne doit pas être endommagé ou usé, le réservoir d’air doit avoir suffisamment d’air et la batterie du pistolet ne doit pas être épuisée. La table x-y ne doit pas s’être déplacée de sa position habituelle à partir de l’extrémité du canon et l’ouverture d’exposition à l’air de surpression doit être alignée avec le canon du pistolet et ne pas l’obstruer. Le régulateur doit être solidement fixé à la poignée du pistolet. Si les valeurs de pression sont trop basses malgré l’utilisation du réglage le plus élevé sur le manomètre, le manomètre ne doit pas être augmenté au-delà de 200 psi et le réglage de vitesse sur le pistolet doit être ajusté au réglage maximum. Si les réglages de pression sont incohérents (par exemple, élevée puis basse), assurez-vous que le réservoir d’air a suffisamment d’air, que le détendeur est bien fixé à la poignée du pistolet, qu’il n’y a pas de fuites dans le réservoir d’air et qu’il est bien vissé, et que le joint torique du réservoir d’air n’est pas endommagé ou usé.

Pour comprendre de manière exhaustive toutes les capacités de ce système, il est important de reconnaître ses limites. Imiter des scénarios du monde réel dans un laboratoire reste un défi. Bien que ce système génère de l’air de surpression, il ne reproduit pas la dynamique complexe d’un événement explosif, comme les variations de gradients de pression et de température, la présence de débris et d’ondes réfléchies, et une nature multiphasique. De plus, il n’imite pas une forme d’onde de Friedlander (« onde de choc primaire »), qui se caractérise par un pic de pression brutal et quasi instantané suivi d’une décroissance exponentielle rapide qui descend en dessous de la pression ambiante avant de revenir à la ligne de base43. Au contraire, la forme d’onde produite par ce système représente un profil plus simple et plus symétrique dans lequel il y a une montée et une descente plus progressives de la pression sans phase négative distincte (voir la figure 2C dans Hines-Beard et al.34). De manière quelque peu avantageuse, cette forme d’onde combine des éléments de blessures dues à l’explosion et aux blessures contondantes. L'« impulsion de pression » en forme de cloche produit un impact de surpression constant, semblable à un « mur d’air » frappant le sujet. Pourtant, la surpression d’air fournie par l’onde est également un aspect clé des blessures causées par les explosions. Certains diront que si cette forme d’onde comprend des aspects des deux types de blessures, elle ne rend pas pleinement compte de la complexité de l’un ou l’autre. Cependant, cette « impulsion de pression » cohérente et reproductible est idéale pour les expériences contrôlées en laboratoire afin d’étudier les lésions focales du SNC en système fermé. Nous avons déjà démontré la nature focale de la blessure. Par exemple, l’exposition à un œil ne cause pas de dommages à l’épithélium nasal primaire ou au cerveau44. De plus, lorsqu’il est dirigé sur le côté de la tête de la souris, une petite zone du cerveau est affectée45. Enfin, l’énergie de l’air de surpression de ce système au niveau de pression utilisé pour ITON n’a pas affecté la souris à moins d’être répétée avec un court intervalle de temps33. Ainsi, la pression n’est pas nuisible et ne reproduit donc pas une force d’extrémité de jet. De plus, même avec une exposition répétée de l’air sous surpression à l’œil, il n’y avait aucun effet sur les structures antérieures de l’œil33. Une dégénérescence significative du nerf optique et une perte de vision ne se sont produites qu’en cas d’exposition répétée avec un intervalle d’exposition inférieur à 1 min33.

Comparé à d’autres appareils de laboratoire pour la création de lésions du SNC en système fermé, ce système offre des avantages uniques. Il peut fournir des rafales séquentielles d’air de surpression en succession rapide (intervalles de 0,5 s)33, imitant les conditions dans les environnements professionnels à haut risque où les expositions rapides aux explosions sont un danger courant. Par exemple, le personnel militaire, tant dans les scénarios d’entraînement que de combat, utilise une foule d’armes à feu automatiques capables de tirer rapidement et à plusieurs reprises, y compris des fusils automatiques (par exemple, M16, AK-47), des mitrailleuses (par exemple, M2 de calibre .50), des mitrailleuses Gatling et des miniguns. D’autres armes plus lentes, mais répétitives, utilisées par le personnel militaire comprennent l’artillerie, les mortiers, les grenades et les engins explosifs improvisés (EEI). Les démolisseurs impliqués dans la démolition contrôlée et les mineurs impliqués dans les opérations de dynamitage pour briser la roche et extraire des minéraux subissent également des explosions séquentielles en succession rapide. Enfin, les travailleurs de la construction utilisant des outils pneumatiques, des batteurs de pieux ou d’autres équipements lourds générant de puissantes forces de percussion peuvent subir des impacts rapides et répétés qui imitent les expositions aux explosions. Notamment, l’administration rapide d’air de surpression n’est pas possible avec des dispositifs tels que les tubes de choc qui nécessitent une reconfiguration ou une repressurisation importante entre chaque événement. Les tubes de choc utilisent des diaphragmes qui éclatent pour générer des ondes de choc, et après chaque rafale, le diaphragme doit être remplacé. Ce processus prend du temps, car le tube de choc doit être ouvert, le diaphragme usé retiré, un nouveau diaphragme installé et le système doit laisser le temps de se réinitialiser et de repressuriser. Ainsi, en particulier pour les études portant sur les lésions du SNC après une exposition rapide et répétée à l’explosion, un système qui ne nécessite pas de reconfiguration ou de repressurisation importante entre chaque événement est idéal.

Les applications futures de ce système modulatoire, convivial et rentable sont prometteuses. Tirant parti de ses attributs adaptables et uniques, ce système ouvre plusieurs pistes prometteuses pour de futures études thérapeutiques précliniques. Sa capacité à fournir des rafales rapides et séquentielles d’air en surpression peut être exploitée pour étudier les effets cumulatifs d’expositions répétées à des explosions, ce qui est pertinent pour comprendre l’encéphalopathie traumatique chronique et d’autres maladies neurodégénératives à long terme. De plus, ce système peut être utilisé pour explorer l’efficacité de diverses interventions pharmacologiques visant à atténuer les lésions du SNC en système fermé, y compris le moment et le dosage des médicaments neuroprotecteurs pour déterminer les fenêtres de traitement optimales. De plus, la précision du système dans l’imitation des aspects des mécanismes de blessures contondantes et explosives permet de développer des modèles de blessures complets qui reflètent les traumatismes complexes vécus par les individus dans des scénarios réels. Cela peut faciliter la mise à l’essai de thérapies multimodales qui s’attaquent aux aspects mondiaux courants des blessures, tels que l’inflammation, le stress oxydatif et la mort neuronale. Dans l’ensemble, ce dispositif offre une plate-forme polyvalente et puissante pour faire progresser notre compréhension des lésions du SNC en système fermé et développer des interventions thérapeutiques efficaces.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le financement du NIH NEI P30 EY008126, de la subvention de découverte Potocsnak en médecine régénérative, du fonds du major-général à la retraite Stephen L. Jones, MD et des fonds non affectés (VEI) de Research Prevent Blindness, Inc.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1-PentanolFisher ScientificAC160600250Utilisé pour faire la solution Avertin  ;
2,2,2-tribomoéthanolSigma AldrichRéf. T48402Utilisé pour faire la solution Avertin  ;
Plaques à 24 puits avec couvercleVWR76520-634Plaque à 24 puits
2-Propanol  ;Fisher ScientificA451-1  ;
Module d’entrée analogique pont 50 kéch./s/voie  ;National InstrumentsNI-9237Module DAQ
Albumine bovine fraction V (BSA)  ;Research Products International  ;N° A30075BSA
Anticorps primaire anti-Iba1 (polyclonal de chèvre)  ;Abcam  ;AB5076Marqueur pour la microglie, utilisé à une concentration de 1:500
Anticorps primaire anti-synaptophysine (monoclonal de souris)  ;Abcam  ;AB8049Marqueur pour les synapses du ruban photorécepteur, utilisé à une concentration de 1:20
Araldite GY 502  ;Sciences de la microscopie électronique10900
Tampon cacodylateSciences de la microscopie électronique11652
Cartouche filtrante à charbonSystèmes E-ZEZ-258Collecte des déchets anesthésiques
Transparent H20 DietGel 76AEffacer H2O  ;72-07-5022Utilisé après l’explosion pour aider à la récupération des animaux
Châssis CompactDAQNational InstrumentsUSB-9162Châssis DAQ
Air compriméGaz A-LGSMCA300Utilisé pour remplir le réservoir d’air sous pression
DAPI Fluoromount-G  ;Biotech du SudSupports de montage avec DAPI
Couteau diamantMicro Star Technologies, groupe de Bruker Nano, Inc.  ;Pour sectionner les nerfs optiques, 3 mm/45 degrés/Style H  ;
Anticorps secondaire adsorbé à haute fréquence croisée Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alex Fluor 594Invitrogen (Fournisseur : Fisher Scientific)A-11058Anticorps secondaire pour la microglie, utilisé à une concentration de 1:200
Anticorps secondaire anti-souris IgG (H+L) à adsorption croisée élevée Donkey, Alex Fluor 594Invitrogen (Fournisseur : Fisher Scientific)A-21203Anticorps secondaire pour les synapses du ruban photorécepteur, utilisé à une concentration de 1:200
Anticorps secondaire adsorbé à haute fréquence IgG (H+L) anti-Rabbit Anti-Rabbit IgG (H+L), Alex Fluor 488Invitrogen (Fournisseur : Fisher Scientific)A-21206Anticorps secondaire pour les cellules bipolaires en bâtonnet, utilisé à une concentration de 1:200
Sérum d’âne  ;Sigma Aldrich  ;D9662PDN
Pince Dumont #3Outils scientifiques fins11231-30Pince fine pour l’énucléation de l’œil entier  ;
Éthanol (200 proof)  ;KOPTEC (Fournisseur : VWR)  ;89125-188Éthanol  ;
Fluoromount-G  ;Invitrogen (Fournisseur : Fisher Scientific)00-4958-02Supports de montage
Gel ophtalmique Genteal TearsConvoitise72359Lubrifiant pour les yeux pour éviter le dessèchement des yeux pendant/après l’anesthésie
GlutaraldéhydeSciences de la microscopie électronique16200
Cylindre gradué 1000 mLFisher Scientific08-572G
Cylindre gradué 250 mLFisher Scientific08-572E
Cylindre gradué 500 mLFisher Scientific08-572F
Coussin chauffant  ;Braintree ScientificAP-R 26ESupport de chauffage contrôlé
Station de remplissage à haute pressionNinja PaintballLe VPHF2Utilisé pour remplir le réservoir d’air sous pression
ImageJInstituts nationaux de la santé  ;Logiciel d’analyse d’images
Inverser MiniEmpire PaintballPistolet de paintball
L’isofluraneConvoitise29405Anesthésique par inhalation
Vaporisateur d’isofluraneVetEquip901806Anesthésie animale
Pompe MasterflexCole-ParmerUtilisé pour la perfusion animale
Méthanol  ;Sigma Aldrich322415-2L  ;
Lames de microscopeGlobe Scientific1358 WLames de microscope en verre blanc
NI Measurement and Automation Explorer (NI MAX)  ;National InstrumentsLogiciel de configuration des paramètres du système DAQ
Pilotes NI-DAQmx  ;National InstrumentsPilote pour l’interacing avec système DAQ  ;
Microscope Nikon Eclipse Ni-ENikon Instruments
Tétroxyde d’osmium 2 %Sciences de la microscopie électronique19152
Paraformaldéhyde 32 %Sciences de la microscopie électroniqueRéférence 15714-SPFA dilué à 4 %
Paraphénylènediamine  ;Sigma AldrichP6001
PBS (10x), pH 7,4Thermo Fisher Scientific70011044PBS dilué à 1x
Oxyde de propylène  ;Sciences de la microscopie électronique20401
PROV3 48 L, 48 in3 Réservoir en aluminium 3000 psiNinja PaintballRéservoir d’air sous pression
Bouteille de stockage multimédia réutilisable Pyrex 1000 mLFisher ScientificRéférence 06-414-1D
Bouteille de stockage réutilisable en Pyrex 500 mLFisher ScientificRéférence 06-414-1C
Bouteilles de stockage réutilisables Pyrex 250 mLFisher ScientificRéférence 06-414-1B
Anticorps primaire recombinant anti-PKC-a (monoclonal de lapin)  ;Abcam  ;AB32376Marqueur pour cellules bipolaires en bâtonnet, utilisé à une concentration de 1:500
Résine 812Sciences de la microscopie électronique14900
Série TJE Transducteur de pression, 100 psi  ;Honeywell  ;Référence 060-0708-10TJGTenez compte de la plage lors de la sélection du transducteur de pression pour optimiser la résolution des mesures  ;
SaccharoseSigma AldrichRéf. S5016
Transducteur de pression Super TJE, 7500 psi  ;Honeywell  ;Tenez compte de la plage lors de la sélection du transducteur de pression pour optimiser la résolution des mesures  ;
Combo seringue/aiguilleConvoitise  ;60728Seringue/aiguille pour effectuer des injections IP
Composé OCT Tissue-PlusFisher Scientific23-730-571  ;Support de congélation  ;
Bleu toluidineFisher ScientificRéf. BP107-10
Triton X-100Sigma AldrichRéf. T8787
UniSlide XY TableVelmex  ;Série AXY40Table de positionnement XY  ;
Pinceau Université - Série 233- Rond, Taille 000Winsor et Newton.Pinceau
Ciseaux à ressort Vannas - Tranchant de 2,5 mmOutils scientifiques fins15000-08Ciseaux pour l’énucléation de l’œil entier
Instrument virtuelNational Instruments  ;Outil numérique pour les logiciels d’acquisition de données  ;

Références

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