Ici, nous présentons une méthode optimisée pour éliminer rapidement une partie des complexes cumulus-ovocytes après le prélèvement des ovules afin d’accélérer le processus d’observation de la FIV, de réduire le temps nécessaire à l’élimination des cellules de la granulosa, de minimiser l’exposition des ovocytes aux éléments externes et de ne pas entraver le développement de l’embryon, améliorant ainsi l’efficacité des procédures de laboratoire de FIV.
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Article de méthode
L’élimination partielle immédiate des complexes cumulus-ovocytes : une approche affinée pour l’observation rapide de la fécondation in vitro
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Malgré les progrès rapides des technologies cliniques et de laboratoire pour la fécondation in vitro (FIV), une proportion importante (10 % à 15 %) des patientes continuent de souffrir de troubles de la fécondation, ce qui entraîne de faibles taux de fécondation et la production d’embryons non viables. La fécondation à court terme implique l’élimination précoce des cellules de la granulosa pour observer l’extrusion du deuxième corps polaire, ce qui permet d’évaluer la fécondation et de prendre des mesures correctives précoces pour remédier aux faibles taux de fécondation et à l’échec complet de la fécondation. Cependant, l’observation de la fécondation à court terme dans la FIV est entravée par des défis tels que des amas non transformés excessivement grands de complexes cumulus-ovocytes et l’adhésion entre les ovules, nécessitant des procédures externes complexes pour l’élimination des cellules de la granulosa, et une durée d’observation prolongée. Pour résoudre ce problème, cette étude propose une méthode d’élimination partielle immédiate des cellules de la granulosa après le prélèvement des ovules. Cette approche simplifie les étapes ultérieures de la fécondation à court terme et le suivi traditionnel de la fécondation, réduit le temps nécessaire à l’extrusion des ovocytes, minimise la probabilité d’impacts environnementaux externes sur les ovocytes et diminue le risque de manquer la fenêtre d’observation critique de la fécondation. Par conséquent, l’étude produit de nouvelles preuves cliniques visant à améliorer l’efficacité opérationnelle des laboratoires embryonnaires dans la FIV.
Introduction
Dans le domaine de la fécondation-transfert d’embryons in vitro (FIV-TE), le taux de fécondation typique se situe entre 60 % et 80 %1. Cependant, environ 4 % à 16 % des cas rencontrent soit un échec complet de la fécondation, soit de faibles taux de fécondation, ce qui pose des défis dans la prédiction 2,3. Pour améliorer les résultats cliniques de la grossesse et réduire les occurrences de non-fécondation complète et de faible fécondation, l’utilisation de la fécondation à court terme dans les procédures de FIV est en hausse4. Cette approche implique l’élimination rapide des cellules de la granulosa pour surveiller l’extrusion du deuxième corps polaire, évaluer l’état de la fécondation et éventuellement effectuer une injection intracytoplasmique corrective de spermatozoïdes (ICSI). La liaison entre le complexe de cellules cumulumétriques de l’ovocyte (OCCC) et l’ovocyte est plus forte lors de la fécondation à court terme par rapport à la fécondation traditionnelle de nuit, ce qui augmente le défi de l’élimination de l’OCCC5. Des facteurs tels qu’un excès de nombre d’ovocytes, de grands complexes d’OCCC ou des adhérences inter-ovocytaires peuvent entraîner des temps d’élimination prolongés des cellules de la granulosa pendant la fécondation à court terme, prolongeant ainsi la période pendant laquelle les ovules restent en dehors de l’incubateur4. Pour optimiser la période d’observation de la fécondation, une approche modifiée post-prélèvement d’ovules a été conçue, impliquant l’exérèse partielle des cellules de la granulosa des ovocytes présentant des complexes OCCC significatifs. Cette technique aide à conserver les cellules de la granulosa entourant les ovocytes, préservant ainsi l’intégrité de la structure précoce de l’ovocyte6 et permettant à ces cellules de continuer à fournir des facteurs vitaux pour la maturation des ovocytes et la liaison ultérieure entre la fécondation et l’embryon7.
Par conséquent, cette étude se concentre sur les patients subissant un traitement de FIV-ET dans un centre de médecine de la reproduction en tant que participants à la recherche, dans le but d’étudier l’impact d’une méthode d’excision mécanique immédiate des cellules de granulosa partielle sur la durée des procédures de fécondation à court terme et de surveillance de la fécondation pendant la nuit, tout en évaluant les résultats de la fécondation normale et du développement avancé. Cette recherche vise à offrir des informations précieuses pour améliorer les procédures de laboratoire d’embryons dans la FIV.
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Protocole
Toutes les procédures ont été menées conformément aux procédures opérationnelles standard du Département de médecine de la reproduction de l’Hôpital populaire de Meizhou et ont été soumises à l’examen du Comité d’éthique du même département. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de chaque couple participant. L’étude a inclus des participants subissant leur premier cycle de FIV avec clivage ou transfert d’embryon au stade de blastocyste, ainsi que des femmes âgées de 20 à 45 ans. Les critères d’exclusion comprenaient l’utilisation d’ovules ou de spermatozoïdes de donneur et des affections spécifiques telles que des anomalies utérines congénitales ou secondaires (p. ex., utérus cloisonné, utérus unicorne, didelphys utérin), une adénomyose, des fibromes sous-muqueux utérins ou une épaisseur de l’endomètre inférieure à 7 mm le jour du transfert d’embryons. Au total, 115 patients recrutés entre décembre 2023 et février 2024 ont été stratifiés en deux groupes selon qu’une ablation partielle immédiate de l’OCCC avait été effectuée ou non.
1. Préparation avant le prélèvement d’ovocytes
- Placez les boîtes de prélèvement des ovocytes (table des matières) dans l’incubateur à 37 °C pendant la nuit.
- Incuber 12 ml de milieu de manipulation des follicules (Table des matériaux) dans des tubes à essai à fond rond de 14 ml à 37 °C pendant la nuit. Transférez les tubes dans le support de tube à essai préchauffé 30 min avant le prélèvement des ovocytes.
- Préparez le milieu de manipulation des follicules : Ajoutez 9 ml de milieu de manipulation des follicules dans un tube à essai à fond rond de 14 ml (Table des matériaux) et incubez à 37 °C pendant la nuit. Le jour du prélèvement de l’ovocyte, transférez 4,5 ml du milieu dans une boîte de prélèvement d’ovocytes préincubée (tableau des matières) recouverte de 2 ml d’huile de paraffine à 100 %.
- Préparez la solution de rinçage OCCC : Ajoutez 4,5 mL de milieu de fécondation (tableau des matériaux) dans une boîte de prélèvement d’ovocytes et incubez à 37 °C pendant la nuit.
- Préparez le milieu de fertilisation : Ajoutez 1 ml de milieu de fertilisation dans une boîte de 6 cm recouverte d’huile de paraffine à 100 % (Table des matières) et laissez incuber à 37 °C pendant la nuit.
- Préparez les pipettes Pasteur en verre (Table des matières) : Émoussez doucement et arrondissez les pointes en les brûlant sur une lampe à alcool pendant environ 5 s (Figure 1). Fixez une tête d’aspiration à l’extrémité des pipettes Pasteur, en veillant à ce qu’elle puisse toucher le fond du plat sans se rayer. Rincez les pipettes Pasteur en verre et les plats de 10 cm avec un milieu de manipulation des follicules.
2. Prélèvement d’ovocytes et élimination partielle immédiate de l’OCCC
REMARQUE : Utilisez un stéréomicroscope pendant les procédures d’isolement des ovocytes et de retrait de l’OCCC. Pour des résultats optimaux, toutes les procédures doivent être effectuées sur une table chauffante avec contrôle de la température (37 °C), et tout l’équipement doit être préchauffé 30 minutes avant le prélèvement des ovocytes.
- Prélever le liquide folliculaire préovulatoire lors du prélèvement d’ovocytes conformément aux recommandations de l’ESHRE8.
- Brièvement, utilisez une aiguille de 17 G pour récupérer les ovocytes sous guidage échographique transvaginal. La pression négative appropriée varie de 120 à 140 mmHg.
- Versez le liquide folliculaire recueilli dans le tube à essai à fond rond de 14 ml dans une boîte de 10 cm (Table des matériaux), en maintenant une profondeur de liquide inférieure à 0,5 cm. Placez le plat sur une plate-forme à température constante (37 °C).
- Observer l’OCCC au stéréomicroscope pour confirmer la présence d’ovocytes et évaluer leur maturité.
REMARQUE : La maturité de l’OOOC est évaluée en fonction de la morphologie des cellules du cumulus et de la visibilité de certaines structures ovocytaires9. - Aspirer l’OCCC à l’aide d’une pipette Pasteur à bout émoussé. Inclinez le plat de 10 cm d’environ 15 degrés et étalez tous les grands OCCC. Évitez d’aspirer l’ovocyte et les cellules de la granulosa environnante dans un rayon de 2500 μm. Coupez les cellules de granulosa en excès avec la pipette Pasteur le long de l’axe longitudinal (Figure 2). Les étapes détaillées sont les suivantes :
- Observez à l’œil nu pour voir s’il y a une masse mucoïde translucide grisâtre dans le liquide folliculaire. S’il ne le trouve pas, recherchez rapidement la masse mucoïde translucide grisâtre en la tournant dans le sens des aiguilles d’une montre de l’extérieur vers l’intérieur sous un stéréomicroscope, l’OCCC.
- Confirmer s’il y a des ovocytes dans l’OCCC et faire une évaluation préliminaire de la maturité des ovocytes.
- Ensuite, pré-préparez une pipette d’aspiration en silicone avec une pipette Pasteur ronde polie à la flamme, aspirez l’OCCC et, en même temps, soulevez doucement la boîte de culture à la position 9-10 heures avec l’annulaire gauche de la main tenant la boîte de 10 cm, en inclinant légèrement la boîte de culture d’environ 15° vers la gauche (placer l’annulaire sous la boîte est approximativement l’angle requis).
- Tout en crachant l’OCCC aspiré à la position 11 heures de l’antenne, allongez-le doucement horizontalement vers la droite. Ensuite, observez la taille des cellules de la granulosa autour de l’OCCC élargi. Ensuite, à la position appropriée de l’OCCC allongé horizontalement, utilisez la pipette Pasteur pour effectuer une coupe descendante rapide et douce sur les cellules de granulosa en excès de haut en bas.
- Transférez l’OCCC coupé dans une boîte de collecte contenant une solution de rinçage d’OCCC. Versez le liquide folliculaire restant dans un récipient d’échantillon stérile (Table des matériaux). Répétez ces étapes jusqu’à ce que tous les complexes soient rassemblés.
3. Préparation du sperme et insémination in vitro
- Prélevez les échantillons de sperme par éjaculation le matin du prélèvement des ovocytes. Évaluer la concentration, la motilité et la morphologie des spermatozoïdes au microscope optique conformément au critère10 de l’Organisation mondiale de la santé (OMS, 2010). Ensuite, transférez la pastille de sperme dans un nouveau tube de centrifugation et lavez-la deux fois dans un milieu de fertilisation11. Incuber-les à 6 % de CO2 et 37 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
- Inséminer les OCCC avec 1 x 105 à 3 x 105 spermatozoïdes mobiles par millilitre en une seule gouttelette environ 2-3 h après le prélèvement dans la boîte de fécondation (tableau des matériaux). Ajouter 6 à 8 OCCC et 1 mL du milieu de fertilisation dans la boîte de fertilisation.
REMARQUE : Après avoir lavé l’OCCC collant, ils sont transférés dans la boîte de fertilisation à l’aide d’une pipette Pasteur. Libérez un OCCC à la fois, en soulevant doucement la pipette de la surface du liquide avant de relâcher le suivant, en veillant à ce que chaque OCCC soit placé individuellement dans la boîte pour éviter l’agglutination.
4. Élimination des cumulus
- Pour une fertilisation à court terme, suivez les étapes décrites ci-dessous.
- Co-incuber des OCCC avec des spermatozoïdes pendant 4 à 6 h. Après l’incubation, retirez mécaniquement les cellules cumulus entourant les ovocytes.
- Aspirez les ovocytes à l’aide d’une pipette d’un diamètre intérieur légèrement inférieur à celui des ovocytes pour assurer l’élimination complète des cellules des cumulus.
- Confirmez la fécondation en observant la présence de deux globules polaires. Les ovocytes présentant un deuxième corps polaire sont considérés comme fécondés.
- Identifiez les cas qui ne montrent pas le deuxième corps polaire comme des échecs de fécondation, nécessitant une ICSI de secours.
- Pour une fécondation régulière, après 18 à 20 h de co-incubation, prélever les cumulus à l’aide des pipettes pour l’évaluation de la fécondation.
5. Culture d’embryons
- Cultivez et surveillez les ovocytes fécondés pendant 3 à 5 jours après le prélèvement des ovocytes. Évaluer la fécondation 20 h après l’insémination pour déterminer le nombre de pronoyaux. Par la suite, cultivez chaque zygote individuellement dans une gouttelette de milieu et transférez les embryons après la fécondation dans un milieu de clivage.
REMARQUE : Au troisième jour, un embryon idéal doit être composé d’au moins six blastomères de taille égale et présenter un taux de fragmentation inférieur ou égal à 10 %12. - La décision de procéder à une culture de blastocyste dépend des préférences du patient et des circonstances spécifiques, telles que la quantité et la qualité des embryons obtenus au jour 3. Transférez les embryons du jour 3 dans le milieu de blastocyste et évaluez-les le jour 5. Utilisez le système de notation de Gardner pour évaluer les blastocystes, les blastocystes de haute qualité ayant des scores de ≥ 4 BB13.
6. Mesure des résultats et analyse statistique
- Déclarer les données continues comme la moyenne ± l’écart-type et exprimer les données ordinales sous forme de proportions. Effectuez une analyse statistique à l’aide du test t de Student ou du test du chi carré dans un logiciel d’analyse de données approprié (ici, IBM SPSS Statistics). Considérer qu’un niveau de signification de P < 0,05 est statistiquement significatif.
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Résultats
Dans le groupe subissant de courtes procédures de co-incubation, les patients qui ont reçu une aide refuge ont été exclus. Sur 47 patientes ayant bénéficié d’une insémination de courte durée, aucune différence significative n’a été observée en termes d’âge des patientes et de nombre d’ovocytes prélevés (Tableau 1). L’ablation partielle immédiate de l’OCCC a entraîné un relâchement de l’OCCC restant autour des ovocytes (Figure 3), facilitant la détection d’un deuxième corps p...
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Discussion
L’élimination partielle immédiate des cellules de la granulosa peut accélérer le processus de désintégration précoce de la fécondation à court terme, réduire le temps d’observation du deuxième corps polaire dans la fécondation à court terme et la FIV conventionnelle et ne pas compromettre le développement embryonnaire ultérieur. À l’heure actuelle, les laboratoires du monde entier emploient diverses stratégies pour atténuer les troubles de la fécondation et les faibles taux de réussite. ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Remerciements
Les auteurs expriment leur gratitude au personnel du Département de médecine de la reproduction de l’Hôpital populaire de Meizhou dans le Guangdong, en Chine, pour leur participation active à cette étude.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| G-IVFT PLUS | Vitrolife | 10136 | |
| OVOIL | Vitrolife | 10029 | |
| G-MOPS PLUS | Vitrolife | 10130 | |
| Falcon 3003 parabole | Corning | 353003 | |
| Falcon 3001 Antenne | Corning | 353001 | |
| Falcon 2001 tube | Corning | 352001 | |
| Falcon 4013 tasse | Corning | 354013 | |
| Falcon 3037 plat | Corning | 351058 | |
| Pasteur pipette | Darwin | D1150-5P |
Références
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Réimpressions et autorisations
